一种强化植物修复镉污染土壤的生物菌肥及应用的制作方法

本发明属于环境工程
技术领域：
，具体来说，涉及到植物修复土壤镉污染领域。
背景技术：
：近年全国土壤污染日益严重，2014年环境保护部和国土资源部公布《全国土壤污染状况调查公报》显示全国耕地土壤点位污染物超标率为19.4％，主要污染物为镉、镍、铜等，其中土壤镉超标率达7.0％。由于镉的难降解性和高积累性，通过急性或慢性毒性作用积累于生物体内，较低浓度就能对植物产生毒害。目前在镉污染土壤修复技术中，植物修复技术因其成本低、绿色净化、环保安全、无二次污染等优点受到人们的重视。植物修复技术是一种原位修复技术，对土壤扰动小，可永久解决土壤污染问题，并可大面积修复受污染土壤。此外，与其他修复技术相比，植物修复技术成本较低。植物修复技术本身也存在着超积累植物具有个体矮小、生长缓慢、根系扩张深度有限、对重金属的选择性、从根部到茎叶的重金属低转移率等缺陷。植物修复效率提高依赖于根际微生物和植物本身之间的相互作用。一些实验数据表明植物根部能够跟大量不同微生物相互作用，这些相互作用构成了植物修复程度的主要决定因素。因此，利用植物和微生物相互作用来修复重金属污染的土壤是一个值得考虑的策略。耐性菌株和植物旺盛生长活动的根系分泌物相互作用，降低了土壤环境的ph值，促进了细菌的生长和土壤重金属的活化，同时根系分泌为土壤提供了微生物生长所需的碳源和能源物质，从而促进了根际微生物的生长和活性。一定程度上活化土壤中的铅镉，从而有利于富集植物对重金属的吸收。杨卓(2009)等研究表明，添加接种由胶质芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌组成的混合微生物制剂，能增加印度芥菜的生物量，活化土壤中的铅镉锌，增强印度芥菜对重金属的提取量，提高了修复效果。靳治国(2010)利用瓶培养法富集技术，从土壤中分别筛出耐pb的绿色木霉菌、耐cd的淡紫拟青霄菌，其明显促进了龙葵的生长，同时增加了龙葵整个植株体对pb、cd的吸收量。罗雅(2012)在耐性细菌强化香根草修复试验中添加耐性菌株后对香根草生长量和cd污染的修复有促进作用。微生物菌与植物相互作用来修复重金属污染的土壤时，需要考虑很多因素，比如菌株之间的拮抗作用，土壤环境影响，与不同植物联合作用差异巨大等。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种微生物和植物联合修复镉污染土壤的生物菌肥，解决现有的微生物菌与植物相互作用来修复重金属污染的土壤时，菌株之间的拮抗作用，与不同植物联合作用差异巨大的问题。本发明的技术方案为：一种强化植物修复镉污染土壤的生物菌肥，它由铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)、多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)和胶质芽孢杆菌(bacillusmucilaginosuskrassilnikov)组成，铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、多粘类芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌的比例为3︰2︰3︰1。进一步地，所述植物为籽粒苋、龙葵或商陆。当然，该生物菌肥中也可以包括其它非菌类成分，比如载体、培养基成分等。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1、本发明中所选的铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、多粘类芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌四种微生物以特定的比例组合，除了能活化土壤重金属镉，改变土壤中镉的有效性外，还能产生植物生长调节物质、分泌抗生素类(iaa和铁载体)物质，促进植物生长，从而提高植物对镉污染土壤的修复效率。2、本发明中所选的铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、多粘类芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌四种微生物以特定的比例组合，拮抗作用小，能保证每种微生物在镉胁迫条件下都能有效生长，从而保证修复效率。3、本发明中所选的铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、多粘类芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌四种微生物以特定的比例组合，与不同植物联合均能取得很好的修复效果。附图说明图1为优势微生物组合镉胁迫下耐性分析。具体实施方式通过下面制备流程对本发明作进一步详细阐述。表1本发明涉及的微生物材料信息如下以上菌株均为市售菌株，通过公众途径均可购买。一、镉胁迫下微生物正交组合实验筛选设计正交组合实验设计4因素3水平，共10个实验；设计镉的浓度为：25mg/l，培养基选用lb液体培养基(lb液体培养基(1l)：胰蛋白胨10.0g，酵母提取液2.0g，氯化钠10g，ph＝7.0)。表2微生物正交组合表如下序号铜绿假单胞菌阴沟肠杆菌多粘类芽孢杆菌胶质芽孢杆菌10.1ml0.1ml0.1ml0.1ml20.1ml0.2ml0.2ml0.2ml30.1ml0.3ml0.3ml0.3ml40.2ml0.1ml0.2ml0.3ml50.2ml0.2ml0.3ml0.1ml60.2ml0.3ml0.1ml0.2ml70.3ml0.1ml0.2ml0.3ml80.3ml0.2ml0.3ml0.1ml90.3ml0.3ml0.1ml0.2ml100ml0ml0ml0ml根据紫外分光光度计od600吸光值来检测微生物组合菌液浓度，吲哚乙酸和产铁载体能力可判定各微生物组合协同或拮抗作用，进而筛选出镉胁迫下共生效果最佳的优势微生物组合。1、镉胁迫下微生物组合共生效果的影响本研究为了分析4种微生物组合共生效果，通过对25ml/l镉胁迫下正交组合实验获得10个正交试验组用于探究微生物的共生效果，如图1所示，发现2号、4号、8号、9号和10号在0d630吸光值均呈上升趋势，证明这5个正交组合在镉胁迫下共生效果明显优于其他组合，在25mg/l镉胁迫下，上述5种组合均体现出较强的镉耐受能力和抗性，可以在镉胁迫下良好的生长。相反25mg/l镉胁迫下其余5组微生物组合均呈先上升后下降趋势，证明这5个组合在刚开始阶段共生效果良好，后期出现拮抗作用，抑制了微生物的生长，体现出了较差的镉耐受能力，无法共同生长，这些原因均导致其不易于后期应用，故而这些正交组合实验组不可选。2、优势微生物组合iaa、铁载体分泌情况(1)优势微生物组合iaa分泌情况植物根际促生细菌能在代谢过程中产生植物激素，其是促进植物生长的重要因素。吲哚乙酸(iaa)是植物体内最为普遍的生长激素，有多种生物功效，包括促进细胞伸长和细胞分化，进而促进植物生长发育，在细菌、真菌、藻类、蕨类和种子植物普遍存在。本研究以吲哚乙酸(iaa)标准液的浓度为横坐标(x)，od530为纵坐标(y)绘制准曲线，得到a组(pc)回归方程为：y＝0.0518x+0.0083(r2＝0.9949)；b组(s2)回归方程为：y＝0.0519x+0.106(r2＝0.9467)。本研究以优势微生物组合iaa分泌情况为研究对象，iaa越大，对植物生长的促进效果越好。结果表明5个组合微生物均能产iaa。本研究发现2号、8号和9号优势微生物组合分泌iaa的能力比4号和10号强，分别为19.37mg/l、37.93mg/l和19.32mg/l。即2号、8号和9号组合为优势微生物菌株组合，而4和10号则相对较低分别为13.52mg/l和11.78mg/l，对植物生长的促进效果较小，不易于后期应用。表3优势微生物组合iaa分泌能力测定组合序号iaa浓度(mg/l)219.37413.52837.93919.321011.78(2)优势微生物组合铁载体分泌情况产生铁载体被认为是植物根际促生细菌直接和间接促进植物生长的有效途径之一，也是判断菌株促生能力强弱的指标之一。铁载体能有效的提高土壤金属活性，促进植物根际有益物质的吸收，提高植物自身的生长状况进而更好的提高铀耐受能力。由于检测液吸光值(ar)数值较大，其a/ar值越小，菌株产铁载体能力越强。如表所见，2号和8号a/ar值相对较低，分别为1.24和1.62。本研究发现微生物能正常分泌铁载体，而耐受性越强产铁载体越多，体现出较强的铁载体分泌能力，更能满足植物和微生物对铁的需求，抑制了有害微生物的生长繁殖。表4优势微生物组合产铁载体能力分析组合序号铁载体浓度(mg/l)21.2481.6291.93综上对iaa和铁载体分泌物的能力的判定，最终发现8号(铜绿假单胞菌0.3ml、阴沟肠杆菌0.2ml、多粘类芽孢杆菌0.3ml和胶质芽孢杆菌0.1ml)分泌情况均高于其他组，可有效促进镉胁迫下植物的生长，可作为植物-微生物联合修复的应用材料。二、本发明的强化植物修复镉污染土壤的生物菌肥的制备分别对铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、多粘类芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌进行振荡培养。菌株(od600＝0.8)以0.2ml的菌种接种量接种到液体营养琼脂培养基中，150rpm28℃振荡培养1d至对数生长期，将菌液转移至无菌离心瓶中8500rpm离心10min收集菌体，并使用去蒸馏水反复清洗，最终将离心的菌体用无菌蒸馏水洗净后稀释至0d600≈1.0(菌液浓度约为108cfu/ml)。将菌体铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、多粘类芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌按照体积比3︰2︰3︰1进行混合，得到本发明的生物菌肥。三、本发明的强化植物修复镉污染土壤的生物菌肥的应用：实验用土均来自农田沙土，经自然风干，磨碎过20目筛。以cdcl2·2.5h2o水溶液的形式污染土壤，保持土壤湿润平衡2周，使土壤重金属镉污染水平为100mg/kg。实施例中所用镉污染土壤均按上述步骤制成。将平衡好的土壤装入花盆，盆口直径50cm，高30cm，装土壤20kg；每个实施例各12盆。具体步骤：各实施例均设两个处理(a、b组)，每种处理3次重复求平均值。将株高约8cm籽粒苋、龙葵和商陆幼苗分别移栽至相对应花盆，每盆仅一株幼苗。各实施例a组每盆1周植株根部加10ml无菌水，b组每盆1周植株根部加10ml生物菌肥，连续处理4次，每天观察、自然生长，整个生长过程不作施肥处理。45天后收获，检测各实施例植株干重和重金属镉含量。实施例1(实验材料：籽粒苋)表5实验结果试验后收获籽粒苋，将植株依次分为根、茎和叶，烘箱恒温105℃烘干，测量植株各组织干重和重金属含量，如表5所示，结果表明：施加本发明的生物菌肥组(b组)籽粒苋植株与未施加组(a组)相比，其地上部分干重、地下部分干重、转移系数和富集系数分别增加99.15％、57.19％、35.16％和45.76％。实施例2(实验材料：龙葵)表6实验结果试验后收获龙葵，将植株依次分为根、茎和叶，烘箱恒温105℃烘干，测量植株各组织干重和重金属含量，如表6所示，结果表明：施加本发明的生物菌肥组(b组)龙葵植株与未施加组(a组)相比，其地上部分干重、地下部分干重、转移系数和富集系数分别增加50.09％、29.16％、28.2％和62.5％。实施例3(实验材料：商陆)表7实验结果试验后收获商陆植株，将植株依次分为根、茎和叶，烘箱恒温105℃烘干，测其植株各组织干重和重金属含量，如表7所示，结果表明：施加本发明的生物菌肥组(b组)商陆植株与未施加组(a组)相比，其地上部分干重、地下部分干重、转移系数和富集系数分别增加46.83％、63.56％、41.39％和66.67％。以上3个实施例充分证明本发明的生物菌肥可提高籽粒苋、龙葵和商陆三种植物修复镉污染土壤的效率，其主要是本发明的生物菌肥可通过分泌植物生长激素，增强植株地上和地下部位生物量，提升植物体内重金属转移和富集含量，达到提高镉污染土壤的修复效率。当前第1页12