一种黑色生物活性陶瓷粉体及其应用的制作方法

本发明涉及一种黑色生物活性陶瓷粉体及其在制备治疗肿瘤材料与修复组织缺损材料中的用途，属生物材料领域。

背景技术：

恶性肿瘤已经成为导致人类死亡的第二原因(仅次于心血管疾病)，寻求有效的治疗方法一直是困扰现代医学的全球性难题^[1,2]。目前治疗实体瘤常用的临床治疗方法是手术切除并辅以放射治疗(放疗)和化学治疗(化疗)^[3]。因为手术切除很难完全清除肿瘤细胞，故通常会借助传统化疗和放疗手段，而放疗和化疗对病人会造成很大的毒副作用^[4,5]。相较于传统治疗方式，光热治疗具有治疗时间短，治疗效果明显，对正常组织杀伤性低等优点^[7,^8]。此外，手术切除肿瘤后会造成大块组织缺损，机体很难自愈，需要再植入异体组织、人工组织或假体进行缺损修复和组织功能重建^[9]。我们以前的研究表明，将具有光热效应的纳米材料与组织工程材料相结合，可以制备出兼具肿瘤治疗和组织修复的双功能材料^[10,11]，但是这些纳米材料一般不可降解，植入体内后的长期安全性仍有待考察。而通常情况下，组织工程基体材料(如生物高分子材料、生物活性陶瓷粉体等)本身具备生物安全、可降解的特点。

参考文献：

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技术实现要素：

针对上述问题，本发明利用镁热还原法提供的了一种黑色生物活性陶瓷粉体及其在制备治疗肿瘤材料与修复组织缺损材料中的应用。

第一方面，本发明提供了一种黑色生物活性陶瓷粉体，将白色生物活性陶瓷粉体和mg粉混合并置于惰性气氛中，在500～800℃下镁热还原反应1～12小时，再经酸洗后，得到黑色生物活性陶瓷粉体；所述白色生物活性陶瓷粉体为硅酸盐生物活性陶瓷粉体或/和磷酸盐生物活性陶瓷粉体，优选选自casio3、mgsio3、ca3(po4)2和ca5(po4)3(oh)中的至少一种。

在本公开中，利用镁热还原法，对白色生物活性陶瓷粉体(传统的硅酸盐生物活性陶瓷粉体或/和磷酸盐生物活性陶瓷粉体)在500～800℃下镁热还原反应1～12小时，以制备出一种新型的黑色生物活性陶瓷材料。具体来说，镁热还原反应过程中，mg将较高氧化态的si元素和p元素还原成较低氧化态，从而使得在白色生物活性陶瓷粉体的晶体内部存在大量的氧空位和结构缺陷(附图3)，出现较低化学价态的si、p元素，降解速率逐渐变缓。经过镁热反应处理的硅酸盐和磷酸盐陶瓷粉中的+4价的si或+5价的p元素被mg还原，导致内部晶格中两种原子低价态的出现(图17和图18)，同时晶体内有序排列的原子出现错位，因而增加其对可见光的吸收度，由白色转变为深色。

较佳的，所述白色生物活性陶瓷粉体和mg粉的质量比为1:(0.1～1)。在本发明中，通过改变还原剂mg粉的使用量，可以制备出颜色深浅不一、色彩纷呈的黑色生物活性陶瓷粉体，这里黑色是相对于白色而言，指代非白色(附图1)。譬如，保持casio3陶瓷粉体质量为1g，称取0.1、0.2、0.4、0.6或0.8gmg粉，混合后置于ar气氛炉内，在650℃保温4h后可制备出深灰色的casio3陶瓷粉体。当mg粉质量低于0.4g时，随着mg粉量增加，产物颜色逐渐变深，mg粉量为0.4g时颜色最深，随后mg剂量的增加颜色却出现变浅的现象。有趣的是对于其它陶瓷粉体，颜色变化也有相似的趋势，均在mg粉为0.4g时出现色彩转折点。对不同温度处理后的bcs4和bcs8粉体做xrd物相分析(图18)，结果表明粉体的主要物相为硅灰石相(casio3，pdf#27-0088)，随着温度的升高和镁粉量的增加，晶体结晶度逐渐降低，出现含有低价态si元素的物相(si、casi2)。类似地，对黑色硅酸镁(bms)、磷酸三钙(bcp)及羟基磷灰石(bhap)进行物相分析，发现粉体的结晶度都随着镁粉量的增加而降低，且有含低价的si和p元素的物相出现(图17)。bcs和bcp粉体的xps分析结果显示si2p和p2p峰位向低场偏移，说明si和p得到电子，进一步证实了低价态si和p元素的存在(图2)。以上结果充分说明，经过镁热反应处理的硅酸盐和磷酸盐陶瓷粉中的+4价的si或+5价的p元素被mg还原，导致内部晶格中两种原子低价态的出现，同时晶体内有序排列的原子出现错位，因而增加其对可见光的吸收度，由白色转变为深色。

较佳的，所述镁热还原反应的升温速率为1～10℃/分钟。

较佳的，所述惰性气氛为氩气、氮气和氦气中的至少一种。

第二方面，本发明提供了一种黑色生物活性陶瓷复合膜材料，将上述的黑色生物活性陶瓷粉体、粘结剂和溶剂混合，再经真空抽滤和干燥后，得到所述黑色生物活性陶瓷复合膜材料；所述粘结剂为壳聚糖、明胶、海藻酸钠、甲壳素、透明质酸、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乳酸等生物高分子材料中的至少一种。

较佳的，所述黑色生物活性陶瓷粉体和粘结剂的质量比为1：(0.1～2)。随着陶瓷粉体含量增加，复合膜颜色逐渐变深，表面粗糙度增加，光热效果更佳，释放的离子含量也增加。

较佳的，所述溶剂为乙酸、盐酸、硝酸、磷酸等酸性溶液中的至少一种。

较佳的，将壳聚糖的乙酸溶液和黑色生物活性陶瓷粉体的水悬浮液混合，再加入氨水后，调节ph，使得壳聚糖沉降，经真空抽滤和干燥，得到所述黑色生物活性陶瓷复合膜材料。

第三方面，本发明提供了一种黑色生物活性陶瓷块体材料，所述黑色生物活性陶瓷块体材料的制备方法包括：

将上黑色生物活性陶瓷粉体压制成型，得到坯体；

将所得坯体置于惰性气氛中，在500～1000℃下烧结1～24小时，得到所述黑色生物活性陶瓷块体材料。

较佳的，所述坯体中还加入粘结剂，所述粘结剂为壳聚糖、甲壳素、明胶、海藻酸钠、透明质酸、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乳酸等生物高分子材料中的至少一种；优选地，所述黑色生物活性陶瓷粉体和粘结剂的质量比为1：(0.1～1.2)。

第四方面，本发明提供了上述的黑色生物活性陶瓷粉体在制备治疗肿瘤材料与修复组织缺损材料中的应用。

本公开中，通过体内外实验证实，所得黑色生物活性陶瓷粉体在浅表层肿瘤的治疗、慢性皮肤创面修复、骨组织再生等方面表现出不错的效果。这种多功能的生物组织工程材料的设计及研发可能在生物医学应用方面有广阔的应用前景。

第五方面，本发明提供了上述黑色生物活性陶瓷复合膜材料在制备治疗肿瘤材料与修复组织缺损材料中的应用。

第六方面，本发明提供了上述黑色生物活性陶瓷块体材料在制备治疗肿瘤材料与修复组织缺损材料中的应用。

在本公开中，以黑色生物活性陶瓷粉体作为主要成分，制备出的黑色生物活性陶瓷粉体、陶瓷复合膜和陶瓷块体材料，用作肿瘤性组织缺损修复材料具有良好的生物安全、光热抗肿瘤、创面修复和骨组织再生等多种功能。

有益效果：

本发明通过镁热还原的制备方法，得到一系列黑色生物活性陶瓷粉体材料，具有制备工艺简单、条件易控制、材料性能稳定等优点；

本发明以黑色生物活性陶瓷粉体作为活性成分，制备出黑色生物活性陶瓷复合膜材料和黑色生物活性陶瓷块体材料，以便于软、硬组织的实际应用。通过对该黑色生物活性陶瓷材料的体外、体内抗肿瘤效果以及体外细胞活性和体内组织再生活性等性能进行系统地评估，以确定其是否具备肿瘤治疗、创面修复和骨组织再生等多重功效，有望作为多功能植入材料用于临床应用。

附图说明

图1为采用不同质量的镁粉(0g、0.1g、0.2g、0.4g、0.6g、0.8g)处理1g白色生物活性陶瓷(casio3、mgsio3、ca3(po4)2及ca5(po4)3(oh))粉体后，通过镁热反应制备出的黑色生物活性陶瓷(casio3、mgsio3、ca3(po4)2及ca5(po4)3(oh))粉体的数码照片；从图1中可知，经过镁热还原处理后，原本白色的生物陶瓷粉体转变为黑色，通过改变mg粉量，可以轻松实现对生物陶瓷粉体外观颜色的有效调控，进而制备出多种颜色的黑色生物活性陶瓷粉体材料；

图2为本发明所得黑色生物活性陶瓷粉体的xps分析，包括：白色硅酸钙(wcs)和黑色硅酸钙(bcs)粉体的xps全谱分析(a)和si2p电子的xps高分辨谱(b)、白色磷酸钙(wcp)和黑色磷酸钙(bcp)粉体的xps全谱分析(c)和p2p电子的xps高分辨谱(d)。从图2中可知，si2p和p2p峰位向低场偏移，说明si和p得到电子，证实了低价态si和p元素的存在；

图3为wcs的和bcs4颗粒的高分辨透射电镜照片及几何相位分析(gpa)图，其中a为wcs的高分辨透射电镜照片；b为wcs的几何相位分析(gpa)图；c为bcs4的高分辨透射电镜照片，d为bcs4的几何相位分析(gpa)图；从图3中可见，与wcs相比，bcs4晶体内部晶格畸变严重，存在大量的结构缺陷；

图4为wcs、bcs1、bcs2、bcs4、bcs6及bcs8陶瓷粉体浸泡在tris-hcl溶液中，在特定时间点的ca离子(a)、si离子(b)及mg离子(c)的累计释放量。从图4中可知，增加mg量后，bcs粉体的ca释放量减少，mg释放量增加，而si释放量没有明显的变化(虽然反应物镁粉和生成的氧化镁绝大部分经过酸洗去除，但不排除有少量镁进入硅酸钙晶格体系中，取代钙离子与硅氧键合)；

图5为采用0.20w/cm²的808nm激光照射生物活性材料表面的温度随时间变化曲线，a为照射白色或黑色生物活性陶瓷粉体(即wcs、wms、wcp和whap或bcs、bms、bcp和bhap粉体(其加入mg粉量均为0.4g，烧结温度为650℃))5min内粉体表面的温度随时间变化曲线；b为不同镁粉量处理得到的bcs粉体照射5min的温度-时间曲线，c为不同镁热反应温度处理的bcs4粉体(加入mg含量分别对应0.4g)激光照射5min的温度-时间曲线；d为不同功率(0.10、0.15、0.20、0.25和0.30w/cm²)下的808nm激光照射bcs4粉体5min的温度-时间曲线；从图5中可知镁热还原处理可以使本身不具备光热性能的生物活性陶瓷粉体获得优异的光热升温特性。通过改变镁热还原反应中mg粉使用量、反应温度和近红外激光功率，可以对bcs粉体的光热性能实现有效调控；

图6为将皮肤癌细胞(b16f10细胞)接种至实施例1制备的纯cts、wcs-cts以及bcs-cts复合膜表面经近红外光照射(808nm，0.50w/cm²，15min)后的共聚焦染色照片(a，其中细胞骨架呈红色，细胞核呈蓝色)、以及将b16f10细胞与纯cts、wcs-cts以及bcs-cts复合膜共同培养经近红外光照射(808nm，0.50w/cm²，15min)后的活/死细胞荧光染色照片(b，绿色表示细胞存活，红色表示细胞死亡)。从图6中可以看出激光照射下的bcs-cts复合膜同样能造成其表面和附近的肿瘤细胞大部分死亡，其它组没有这种抗肿瘤效果；

图7为以0.30w/cm²功率密度的nir激光(808nm)照射贴敷在b16f10肿瘤创口处的实施例1制备的wcs-cts和bcs-cts复合膜15min，实时监控肿瘤部位温度变化的红外热成像图片(a)及相应的温度-时间关系曲线(b)；ctrl(空白对照组，创口无材料覆盖)、cts、wcs-cts、bcs-cts、wcs-cts+nir及bcs-cts+nir组在第0和15天b16f10裸鼠的数码照片(c)、15天之内肿瘤体积变化曲线(d)。从图7的结果表明，实验组(bcs-cts+nir)不仅肿瘤没有出现复发，且原本在肿瘤部位制造的皮肤创面也基本愈合。而其它对照组的肿瘤生长不受控制，创口也没有愈合；

图8为经过15天的不同处理后，不同放大倍数的b16f10肿瘤性创口部位的微观组织切片h&e染色结果，可以看出，bcs-cts+nir组的表皮完整再生，下方组织为接近正常皮肤愈合增殖期的肉芽组织，而在对照组不完整的表皮下，充盈着活力旺盛的肿瘤细胞和丰富的血管网络；

图9为人源皮肤成纤维细胞(hdf)(a)和人源脐静脉内皮细胞(huvec)(b)分别与实施例1制备纯cts、wcs-cts或bcs-cts复合膜共同培养1、3及5天后的cck8活性图，从图9中结果表明，在5天的培养期间，与纯cts和wcs-cts复合膜相比，bcs-cts复合膜显示出促进两种细胞增殖的效果；

图10为hdf细胞(a)和huvec细胞(b)接种在实施例1制备纯cts、wcs-cts或bcs-cts复合膜上，粘附24h后的共聚焦荧光染色照片(红色：细胞骨架；蓝色：细胞核)；从图10中可以看出，hdf细胞和huvec细胞在三种膜材料表面都可以粘附铺展，且伸出大量的细胞伪足，细胞活力旺盛；

图11在实施例1制备纯cts、wcs-cts或bcs-cts复合膜作用12h后，hdf细胞划痕的代表性光学照片(细胞着紫色)(a)及相应相对创面面积的统计结果(*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001)(b)；由图11中可以看出，bcs-cts复合膜具有加速细胞迁移的作用；

图12为在第0、3、6、9和12天时空白对照组(ctrl)、纯cts、实施例1制备wcs-cts以及bcs-cts组皮肤创面的代表性照片(a)及相对创面面积数据的统计结果(*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001)(b)；从图12中可知，与空白对照组和cts组相比，经过wcs-cts和bcs-cts复合膜处理后的创口愈合速度加快，整个观察期间两组之间没有显著性差异；

图13为在第12天时空白对照组(ctrl)、纯cts、实施例1制备wcs-cts以及bcs-cts组皮肤组织切片的(a、b)h&e染色、(c)cd31染色(新生血管呈棕色颗粒状)及(d)α-sma染色(成熟血管呈棕色颗粒状)照片。结果显示，在bcs-cts组的痂层下，新生组织中的表皮完整再生，内部出现较为成熟的血管网络和处于发育期的皮肤附属器官，而其它组的表皮不完整且血管数目较少；

图14为兔骨髓间充质干细胞(rbmsc)与不同mg量热处理的黑色casio3粉体(a，bcs1、bcs2、bcs4、bcs6、bcs8粉体)和wcs、bcs1、bcs2、bcs4、bcs6或bcs8陶瓷块体(b)培养1、3、5天的cck8活性；从图14中可知bcs材料表现出促进增殖的效果，其中以bcs4陶瓷粉体和陶瓷块体组的效果最为明显；

图15为将rbmsc接种在(a，b)wcs、(c，d)bcs1、(e，f)bcs2、(g，h)bcs4、(i，j)bcs6或(k，l)bcs8陶瓷块体材料表面，培养3天后的(a、c、e、g、i及k)低倍和(b、d、f、h、j及l)高倍的荧光染色照片(红色：细胞骨架；蓝色：细胞核)；从图15中可知，所有生物陶瓷材料表面的细胞密度明显增多，细胞之间相互连接成束状，bcs4陶瓷块体表面细胞更是堆积成多层，完全覆盖材料；

图16为植入wcs、bcs、wcp和bcp陶瓷圆柱体到兔子股骨缺损部位，四周(4w)和八周(8w)时的micro-ct扫描图像(a)和vangieson染色照片(b)(红色为骨组织，黑色为植入陶瓷块体材料)，从图16中可以看到，与白色生物活性陶瓷块体(wcs、wcp)相比，黑色生物活性陶瓷块体(bcs、bcp)被新生骨组织全部包围，两者之间结合更为紧密，尤其是8周时的bcs组，骨缺损区域体积明显小于其它组，由此可见黑色生物活性陶瓷材料具有更佳的诱导骨组织再生活性；

图17为采用不同质量的镁粉处理后，通过镁热反应制备出的黑色硅酸钙(a)、黑色硅酸镁(b)、黑色磷酸三钙(c)和黑色羟基磷灰石粉体(d)的xrd图谱，从图中可知随着镁粉量的增加，晶体结晶度逐渐降低，出现含有低价态si元素的物相(si)。类似地，对黑色硅酸镁(bms)、磷酸三钙(bcp)及羟基磷灰石(bhap)进行物相分析，发现粉体的结晶度都随着镁粉量的增加而降低；

图18为不同温度(550℃、600℃、650℃、700℃或750℃)下通过镁热反应制备出的bcs4粉体(a)和bcs8粉体(b)的xrd图谱，从图中可知对不同温度处理后的bcs4和bcs8粉体做xrd物相分析，结果表明粉体的主要物相为硅灰石相(casio3，pdf#27-0088)，随着温度的升高和镁粉量的增加，晶体结晶度逐渐降低，出现含有低价态si元素的物相(si、casi2)。

具体实施方式

以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

在本公开中，采用商用白色生物活性陶瓷粉体(包括β-硅酸钙(casio3)、硅酸镁(mgsio3)、β-磷酸三钙(ca3(po4)2，β-tcp)、羟基磷灰石(ca5(po4)3(oh)，hap))、镁粉(mg)作为原材料，先利用镁热还原法，制备出一系列黑色生物活性陶瓷粉体。

在本发明一实施方式中，经过镁热还原处理后，原本白色的生物陶瓷粉体转变为黑色，通过改变mg粉量和热处理温度，可以轻松实现对生物陶瓷粉体外观颜色的有效调控，进而制备出多种颜色的黑色生物活性陶瓷粉体材料。该黑色生物活性陶瓷粉体的晶体内部存在大量的氧空位和结构缺陷(参见附图3)，出现较低化学价态的si、p元素(参见图17和图18)，赋予其在近红外激光照射下同时具备光热升温的特性(附图5)。可导致材料周围的皮肤癌细胞和骨肿瘤细胞死亡，从而有效抑制体内肿瘤的生长(附图6-8)。另一方面，经过镁热还原处理后，黑色生物活性陶瓷材料的降解速率减缓(附图4)，更加有利于正常的皮肤细胞和成骨细胞的粘附、增殖和迁移，对于体内皮肤组织和骨组织再生都有一定的促进作用(附图9-16)。这种多功能的新型生物活性材料在肿瘤治疗、组织工程和再生医学应用领域具有广阔的发展前景。

在本发明一实施方式中，将白色生物活性陶瓷粉体(casio3、mgsio3、ca3(po4)2、ca5(po4)3(oh)等)和mg粉混合，导入坩埚舟内。然后置于惰性气氛炉中，升温至一定温度(500-800℃)，并保温1-12h，再经酸洗和真空干燥，可制得黑色生物活性陶瓷粉体。白色生物活性陶瓷粉体和mg粉以质量比为1:(0.1-1)。镁粉量的增加，晶体结晶度逐渐降低，出现含有低价态si元素的物相(si)。类似地，对黑色硅酸镁(bms)、磷酸三钙(bcp)及羟基磷灰石(bhap)进行物相分析，发现粉体的结晶度都随着镁粉量的增加而降低。其中，升温的速率为1-10℃/min。

在本发明另一实施方式中，以所得黑色生物活性陶瓷粉体作为主要成分，制备出适合应用于软、硬组织的两种组织工程材料，即黑色生物活性陶瓷复合膜和块体材料，分别用于软、硬组织修复两方面的应用。

黑色生物活性陶瓷复合膜的制备。以黑色生物活性陶瓷粉体、粘结剂、和溶剂等作为原料进行混合，经真空抽滤和干燥后，得到黑色生物活性陶瓷复合膜材料。其中粘结剂可为壳聚糖(cts)、明胶、海藻酸钠、甲壳素、透明质酸、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乳酸等生物高分子材料等。其中，黑色生物活性陶瓷粉体与粘结剂的质量比可为1：(0.1-2)。溶剂可为乙酸、盐酸、磷酸、硝酸等酸性溶液。

作为一个黑色生物活性陶瓷复合膜的制备示例，包括：将黑色生物活性陶瓷粉体分散在壳聚糖的酸性溶液中，控制黑色生物活性陶瓷粉体与壳聚糖的质量比为1：0.1-2，搅拌均匀后进行真空抽滤。其中，真空抽滤时间为1-10min。随后再进行干燥处理，制备出黑色生物活性陶瓷复合膜材料。干燥方式可为冷冻干燥，时长为6-48h。

黑色生物活性陶瓷块体材料的制备。将黑色生物活性陶瓷粉体进行压片处理，得到坯体。其中，压力为0.1-10mpa。随后将坯体放入惰性气氛炉中进行煅烧成型，可制备得到，黑色生物活性陶瓷块体材料。烧结(煅烧)的温度可为500-1000℃，保温时间为1-24h。所得块体材料的外形可为圆柱体、立方体等。所得陶瓷块体材料中也可加入粘结剂。粘结剂可为壳聚糖(cts)、明胶、海藻酸钠、甲壳素、透明质酸、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙二醇和聚乳酸等生物高分子材料。其中，黑色生物活性陶瓷粉体与粘结剂的质量比可为1：(0.1-2)。

在本公开中，通过光学显微镜、sem、eds、xrd、xps、icp等方式对黑色生物活性陶瓷材料进行表征。

在本公开中，所得黑色生物活性陶瓷材料(包括，黑色生物活性陶瓷粉体、黑色生物活性复合膜材料和黑色生物活性陶瓷块体材料)在近红外激光照射下同时具备光热升温的特性，在较低功率(0.1-0.5w/cm²)的近红外光照射下，黑色生物活性陶瓷材料表现出显著的光热效应，可导致材料周围的皮肤癌细胞和骨肿瘤细胞死亡，抑制体内肿瘤组织生长。通过体内皮肤癌和骨肿瘤两种肿瘤性皮肤创面模型证实，黑色生物活性陶瓷复合膜材料在治疗早期结合近红外光照射，可完全清除肿瘤细胞，在治疗后期肿瘤没有出现复发，且原先制造的创面也逐渐愈合。此外，该材料对于正常皮肤细胞的粘附、增殖和迁移都能起到一定的促进作用，提高了慢性皮肤创面的愈合速度及愈合质量。黑色生物陶瓷块体材料可以促进成骨细胞的活性，对于体内大块骨组织缺损的修复也有一定的促进作用。由此可见，黑色生物活性陶瓷材料兼具光热抗肿瘤和促组织再生双重功效，在浅表层肿瘤的治疗、慢性皮肤创面修复、骨组织再生等方面表现出不错的效果。这种多功能的生物组织工程材料的设计及研发可能在生物医学应用方面有广阔的应用前景。

黑色生物活性陶瓷材料的性能评价。

2.1黑色生物活性陶瓷材料的光热性能

利用808nm近红外光照射不同化学成分的黑色生物活性陶瓷材料，利用热成像仪实时监控温度变化。通过改变mg粉使用量、反应温度和近红外激光功率，可以对黑色生物活性陶瓷材料的光热性能进行调控。结果显示，黑色生物活性陶瓷材料在较低功率下、极短时间内，温度显著升高，具有良好的光热性能。

2.2黑色生物活性陶瓷材料的体外抗肿瘤能力

将鼠源皮肤黑色素细胞b16f10和鼠源骨肉瘤细胞lm8种植在纯高分子膜(cts)、白色(wcs-cts)和黑色生物活性陶瓷复合膜(bcs-cts)材料上，待细胞基本铺满后，利用808nm近红外光对三种膜材料光照15分钟。对细胞进行荧光染色，在共聚焦显微镜下观察材料表面的细胞在光照前后形貌的变化，并采用cck8法检测细胞的存活率的变化。结果显示bcs-cts组光照后肿瘤细胞显著减少，而cts和wcs-cts组光照前后细胞数量没有显著变化。说明复合黑色生物活性陶瓷后，利用其优异的光热性能，可以有效杀死皮肤和骨肿瘤细胞。

2.3黑色生物活性陶瓷材料的体内抗肿瘤和修复肿瘤性创面的效果

构建裸鼠皮下黑色素瘤和骨肉瘤模型，待肿瘤长大到一定尺寸后，在肿瘤部位制造一个10mm的全皮伤口，贴附cts、wcs-cts及bcs-cts膜材料进行光热治疗。前四天每天进行光照处理15min，后期不进行光照，记录15天内肿瘤的体积变化，治疗结束后取出肿瘤及周围的皮肤组织进行分析。结果表明，bcs-cts组不仅肿瘤没有出现复发，且原本在肿瘤部位制造的皮肤创面也基本愈合。而cts和wcs-cts组的肿瘤生长不受控制，创口也没有愈合。说明近红外光照射下的bcs-cts复合膜具有优异的体内抗肿瘤效果，并证实黑色生物活性陶瓷材料用于治疗和修复肿瘤性皮肤创面的可行性。

2.4黑色生物活性陶瓷材料的体外皮肤修复活性

将皮肤成纤维细胞(hdf)和脐静脉内皮细胞(huvec)分别种植在cts、wcs-cts及bcs-cts膜材料表面上，培养24小时后进行染色，观察细胞细胞形态和粘附情况。让细胞与膜材料共同培养，测试1、3、5天细胞的增殖情况。为测定黑色生物活性陶瓷材料对正常细胞迁移的影响，进行了hdf和huvec细胞划痕实验。结果表明，hdf和huvec细胞都能够在膜材料上进行很好的黏附和铺展，与纯cts和wcs-cts复合膜相比，bcs-cts复合膜显示出促进两种细胞增殖和迁移的作用。以上结果表明，黑色硅酸钙粉体与壳聚糖复合膜材料支持正常皮肤细胞的粘附、增殖、迁移等行为，表现出较好的体外组织再生活性。

2.5黑色生物活性陶瓷材料的体内皮肤修复活性

本发明证实黑色生物活性陶瓷材料有促进体内慢性创面愈合的能力。为探究bcs-cts复合膜对于慢性皮肤修复愈合的作用，将复合膜直接贴敷在创口部位，进行时间周期为12天的小鼠创面修复实验。第12天时，空白对照组、cts、wcs-cts和bcs-cts组的相对创面面积分别为15.6％、7.9％、4.6％和4.8％。对新生皮肤组织切片进行染色分析，结果显示，在bcs-cts组的痂层下，新生组织中的表皮完整再生，内部出现较为成熟的血管网络和处于发育期的皮肤附属器官，而其它组的表皮不完整且血管数目较少。由此可见，bcs-cts复合膜既能加快慢性皮肤创面的愈合速度，又可以提高其愈合质量，在皮肤组织再生领域具有广阔的应用前景。

2.6黑色生物活性陶瓷材料的体外成骨活性

为探究黑色硅酸钙陶瓷材料的成骨活性，将兔源骨髓间充质干细胞(rbmsc)与不同mg量处理的硅酸钙粉体或陶瓷块体((bcs1、bcs2、bcs4、bcs6及bcs8)共同培养5天。结果显示，黑色陶瓷材料组(bcs)表现出促进增殖的效果，其中以bcs4陶瓷粉体和陶瓷块体组的效果最为明显。将rbmsc细胞直接接种到bcs4陶瓷块体表面培养1天，可以看到所有bcs块体材料上粘附的细胞数量都比wcs多，细胞紧紧贴敷在材料表面，并伸出较长的伪足深入材料孔隙内，其中bcs4陶瓷块体表面的细胞不仅数量最多且细胞伸展状态更好。3天之后，所有材料表面的细胞密度明显增多，细胞之间相互连接成束状，bcs4陶瓷块体表面细胞更是堆积成多层，完全覆盖材料。因此，本实验制备的bcs材料可以为成骨细胞提供一个较为理想的生活环境。

2.7黑色生物活性陶瓷材料的体内成骨活性

本发明证实黑色生物活性陶瓷材料有促进体内成骨的能力。为评估黑色生物活性陶瓷材料的体内成骨活性，将黑色陶瓷块体植入新西兰白兔的股骨缺损部位。第4、8周取出组织，进行micro-ct分析和vangieson染色分析，可以看到，与白色生物活性陶瓷块体(wcs、wcp)相比，黑色生物活性陶瓷块体(bcs、bcp)被新生骨组织全部包围，两者之间结合更为紧密，尤其是8周时的bcs组，骨缺损区域体积明显小于其它组，由此可见黑色生物活性陶瓷材料具有更佳的诱导骨组织再生活性。此外还能发现，各生物陶瓷块体材料的降解速率有所不同，黑色生物活性陶瓷材料降解速率有所减缓，暗示着镁热还原处理具有调节陶瓷材料的降解速率的作用。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1：

取1g白色casio3陶瓷粉体(wcs)分别和不同质量的mg粉(0.1g、0.4g、0.6g、0.8g、)混合均匀，随后导入氧化铝坩埚舟内；

将坩埚舟置于氩气气氛炉中，并分别以2℃/min升温至一定温度550℃、600℃、650℃、700℃、或750℃)，保温4h。自然冷却至室温，再经酸洗和真空干燥，获得黑色硅酸钙陶瓷粉体。其中，在650℃下反应得到的黑色硅酸钙陶瓷粉体可分别记为bcs1、bcs4、bcs6、bcs8粉体；

将250mg壳聚糖粉体溶解于50ml乙酸溶液中，得到酸性cts溶液(5wt.％)；

称取250mgbcs4粉体分散在10mlh2o中，得到bcs悬浮液；(3)将50mlcts溶液与10mlbcs悬浮液混合，不停搅拌，逐滴加入2ml氨水，得到bcs-cts悬浮液；

吸取6mlbcs-cts悬浮液，选择直径为5cm的滤纸，真空抽滤2min；

冷冻真空干燥24h，制备出bcs-cts复合膜。

类似地，制备纯cts膜(纯壳聚糖膜)和白色硅酸钙复合壳聚糖膜(wcs-cts)作为对照。

将纯cts膜、wcs-cts和bcs-cts复合膜暴露在808nmnir光下，调整激光功率为0.30w/cm²，保持激光头与复合膜距离为20cm，照射5min，通过红外热成像仪实时监控材料表面的温度变化情况，截取不同时刻的膜表面温度对应的红外热成像图片，绘出干状态下的温度-时间变化曲线。

将纯cts膜、wcs-cts和bcs-cts复合膜放入48孔板内，加入200μlh2o淹过材料，进行激光照射(808nm，0.30w/cm²，10min)，同样用热像仪记录温度随时间变化的情况，并截取不同时刻的红外热成像图片，绘制温度-时间变化曲线。

然后进行抗肿瘤和皮肤组织再生等体内外生物学性能的评价，同发明内容中的性能评价。

实施例2：

取1g白色casio3陶瓷粉体(wcs)和mg粉(0.2g)混合均匀，随后导入氧化铝坩埚舟内；

将坩埚舟置于氩气气氛炉中，以2℃/min升温至一定温度550℃、600℃、650℃、700℃、或750℃)，保温4h。自然冷却至室温，再经酸洗和真空干燥，获得黑色硅酸钙陶瓷粉体；

采用0.2gmg粉在650℃下反应得到的所得的黑色硅酸钙陶瓷粉体，记为bcs2粉体；

将250mg壳聚糖粉体溶解于50ml乙酸溶液中，得到酸性cts溶液(5wt.％)；

称取250mgbcs2粉体分散在10mlh2o中，得到bcs悬浮液；(3)将50mlcts溶液与10mlbcs悬浮液混合，不停搅拌，逐滴加入2ml氨水，得到bcs-cts悬浮液；

吸取6mlbcs-cts悬浮液，选择直径为5cm的滤纸，真空抽滤2min；

冷冻真空干燥24h，制备出bcs-cts复合膜。

类似地，制备纯cts膜和白色硅酸钙复合壳聚糖膜(wcs-cts)作为对照。

将纯cts膜、wcs-cts和bcs-cts复合膜暴露在808nmnir光下，调整激光功率为0.20w/cm²，保持激光头与复合膜距离为20cm，照射5min，通过红外热成像仪实时监控材料表面的温度变化情况，截取不同时刻的膜表面温度对应的红外热成像图片，绘出干状态下的温度-时间变化曲线；

将纯cts膜、wcs-cts和bcs-cts复合膜放入48孔板内，加入200μlh2o淹过材料，进行激光照射(808nm，0.20w/cm²，10min)，同样用热像仪记录温度随时间变化的情况，并截取不同时刻的红外热成像图片，绘制温度-时间变化曲线。

然后进行抗肿瘤和皮肤组织再生等体内外生物学性能的评价，同发明内容中的性能评价。

实施例3：

取1g白色ca3(po3)2陶瓷粉体(wcp)分别和不同质量的mg粉(0g、0.1g、0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、)混合均匀，随后导入氧化铝坩埚舟内；

将坩埚舟置于氩气气氛炉中，以2℃/min升温至一定温度550℃、600℃、650℃、700℃、或750℃)，保温4h。自然冷却至室温，再经酸洗和真空干燥，获得黑色磷酸钙陶瓷粉体。

采用0.4gmg粉所得的黑色磷酸钙陶瓷粉体记为bcp4粉体；

称取一定量的bcp4粉体，使用压片机压成直径为6mm的圆柱体。800℃氩气炉中煅烧5h，使陶瓷块具备一定的强度，得到bcp4陶瓷块体材料。

作为对照，称取等质量的白色陶瓷粉体(bcp)，压片后同样经过800℃氩气炉煅烧成型，得到bcp陶瓷块体材料。

然后进行体内外骨组织再生活性的评估，同发明内容中的性能评价。

实施例4：

将bcs1、bcs2、bcs4、bcs6、bcs8粉体作为原料，在2mpa下压成直径为6mm的圆柱体形状的坯体。然后在800℃氩气炉中煅烧5h，使具备一定的强度的陶瓷块体材料(分别计为bcs1、bcs2、bcs4、bcs6、bcs8)。作为对照，称取等质量的白色陶瓷粉体(wcs)，压片后同样经过800℃氩气炉煅烧成型。样品密封保存在样品盒中，注意轻取轻放(计为wcs)。类似地，制备出wcp和bcp陶瓷块体，用于体外骨组织再生实验。

实施例5：

取1g白色mgsio3陶瓷粉体(wms)分别和不同质量的mg粉(0g、0.1g、0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、)混合均匀，随后导入氧化铝坩埚舟内；

将坩埚舟置于氩气气氛炉中，以2℃/min升温至一定温度550℃、600℃、650℃、700℃、或750℃)，保温4h。自然冷却至室温，再经酸洗和真空干燥，获得黑色硅酸镁陶瓷粉体。图1中为所得黑色硅酸镁陶瓷粉体的颜色变化，图17中b为黑色硅酸镁陶瓷粉体的物相变化。

实施例6：

取1g白色ca5(po4)3(oh)陶瓷粉体(whap)分别和不同质量的mg粉(0g、0.1g、0.2g、0.4g、0.6g、0.8g、)混合均匀，随后导入氧化铝坩埚舟内；

将坩埚舟置于氩气气氛炉中，以2℃/min升温至一定温度550℃、600℃、650℃、700℃、或750℃)，保温4h。自然冷却至室温，再经酸洗和真空干燥，获得黑色羟基磷灰石陶瓷粉体。图1中有黑色羟基磷灰石陶瓷粉体颜色变化，图17中d为黑色羟基磷灰石陶瓷粉体物相变化。