一种固态发酵复合鱼下脚料和烟草废弃物有机肥及生产方法和应用

1.本发明属于肥料领域，具体涉及一种固态发酵复合鱼下脚料和烟草废弃物有机肥及生产方法和应用。


背景技术：

2.在农业生产中，有机肥在农业市场广受青睐，国内外施用的有机肥多以有机废弃物为源制备富含有机质的高效肥。在水产品加工过程中，未被利用的鱼类副产物占40-55％，包括鱼头、鱼骨、鱼尾、鱼皮、鱼内脏等。鱼下脚料中含有大量的优质蛋白及多种活性物质，目前，鱼下脚料主要用于制备生物活性肽、加工动物饲料、鱼蛋白肥料、用于氮源培养基等。
3.随着我国对绿色农业发展的重视，开发其它农业有机废物转化有机高效土壤肥料成为了现代农业可持续发展的新途径。因此，水产品下脚料资源的转化逐渐成为热点，丰富的低值鱼类资源及水产品加工下脚料等可成为重要的绿色生态有机肥源，能增加水产品加工业的附加值和避免环境污染。
4.鱼蛋白肥料作为一种功能型肥料，受到种植者的关注。该肥料因含有小分子多肽、氨基酸、牛磺酸、维生素等多种活性物质及丰富的钙、镁等中微量元素。鱼废物可以加工成稳定的液体或固体形式的肥料，并与其他材料结合生产鱼堆肥或作为厌氧消化的基质,具有改善土壤微生物活性和土壤结构以及刺激根系生长来改善土壤的潜力。
5.烟草废弃物中含有大量植物易于吸收的钾、磷等营养元素，是制备育苗基质的绿色、成本低廉的资源，也可用于制作活性炭、有机肥料及鸡饲料。而烟草废弃物中有烟碱存在,直接还田处理会导致植物生长指标降低，还会造成环境污染，利用微生物发酵技术处理烟草废弃物可减少废弃物中有害成分，同时有利于土壤结构的改良和养分的补充。
6.鱼类下脚料含有丰富的营养物质如矿物质、脂肪、蛋白质等，目前关于鱼类下脚料利用多集中在制备液体鱼蛋白肥料农业，鱼类下脚料与植物废弃秸秆为发酵底物的研究较少。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种固态发酵复合鱼下脚料和烟草废弃物有机肥及生产方法，利用鱼下脚料和烟草废弃物，经过微生物发酵后，废弃物中蛋白质、脂质和纤维素等大分子被分解，进而转化成植物可直接吸收利用的营养物质。
8.本发明还有一个目的在于提供一种固态发酵复合鱼下脚料和烟草废弃物有机肥的应用，用于农作物肥料，直接作为基肥施用。本发明制备的发酵有机肥能促进作物生长，提高土壤养分，为有机废弃物的高值化利用提供新的方向，使之用于农业中农作物的有机肥料。
9.本发明具体技术方案如下：
10.一种固态发酵复合鱼下脚料和烟草废弃物有机肥的生产方法，为：利用鱼下脚料和烟草废弃物混合为发酵基质，混入无机盐和无机氮源，高温灭菌后，接种混合菌剂，进行固态发酵，制成的固态有机肥。
11.所述鱼下脚料为：鱼头、鱼内脏、鱼鳍、鱼尾、鱼骨或其残留鱼肉混合物，经121℃高温灭菌、组织搅碎机搅碎、50℃干燥处理，即得；所述鱼下脚料为鲫鱼、草鱼或鲢鱼的鱼下脚料。
12.所述烟草废弃物为卷烟厂废弃的烟叶、烟梗任意一种或两种的混合物，50℃烘箱干燥后粉碎至颗粒状。
13.所述烟草废弃物质量为鱼下脚料和烟草废弃物总质量的5-40％；优选的烟草废弃物质量为鱼下脚料和烟草废弃物总质量的30％；
14.所述无机盐用量为鱼下脚料和烟草废弃物总质量的0.5-1.5％，优选为0.5％；
15.所述无机盐选自磷酸氢二钾k2hpo4、磷酸二氢钾kh2po4或氯化钠nacl；优选的为氯化钠nacl；
16.所述无机氮源用量为鱼下脚料和烟草废弃物总质量的0.5-2.0％，优选为1.0％；
17.所述无机氮源选自硝酸铵nh4no3或硝酸钠nano3；优选的为硝酸铵nh4no3；
18.所述混合菌剂接菌量以鱼下脚料和烟草废弃物总质量计，为1
×
10
10
ꢀ‑5×
10
10
cfu/g；优选为4
×
10
10
cfu/g；
19.所述混合菌剂为枯草芽孢杆菌、红酵母和米根霉的混合菌；枯草芽孢杆菌、红酵母和米根霉的菌株活菌总数比例为2:1:3；
20.所述固态发酵，发酵温度为30℃-36℃；发酵时间为20天；优选34℃；
21.本发明提供的一种固态发酵复合鱼下脚料和烟草废弃物有机肥，采用上述方法制备得到。
22.本发明提供的一种固态发酵复合鱼下脚料和烟草废弃物有机肥的应用，用于农作物肥料。
23.所述固态发酵复合鱼下脚料和烟草废弃物有机肥的应用方法为：将固态发酵复合鱼下脚料和烟草废弃物有机肥和土壤混合，混合比例为10-30g/kg土壤。
24.所述固态发酵复合鱼下脚料和烟草废弃物有机肥尤其适用于作为上海青和辣椒的肥料，能促进其生长，提高叶绿素含量。
25.所述固态发酵复合鱼下脚料和烟草废弃物有机肥能提高土壤的铵态氮、有效磷、速效钾含量，土壤的铵态氮含量提高到55-360mg/kg，有效磷含量提高到82-190mg/kg、速效钾含量提高到36-105mg/kg；提高土壤中的脲酶活性3.0-3.6mg/g、蔗糖酶活性1.5mg/g-1.9mg/g、过氧化氢酶活性3.5(u/h
·
g)-4.00(u/h
·
g)。
26.本发明制备的生物有机肥对改良土壤，对农作物培育壮苗具有良好效果。
27.本发明利用微生物发酵技术，以低廉的复合鱼下脚料和烟草废弃物为发酵底物，混入无机盐和无机氮源，制成固体发酵培养基，向其接种枯草芽孢杆菌、红酵母和米根霉的复合菌剂进行固态发酵后可获得发酵有机肥，成本低、制备方法简便，具有增加蔬菜产量提高品质及增加土壤养分等功能。
28.本发明采用的枯草芽孢杆菌、红酵母和米根霉混合菌株发酵存在协调互作优势：在发酵试验中，酵母菌和米根霉同步糖化发酵，米根霉可产生纤维素酶，利用发酵基质中的
纤维素、淀粉等生成糖，而红酵母则利用糖进行生长代谢，减轻了产物抑制效应，又促进了酵母的生长，提高了发酵率。枯草芽孢杆菌可产生多种生物活性物质，如消化酶、维生素、有机酸、小肽和促生长因子等。因此，利用菌种的协同作用提高对底物的利用效率，优于单菌种发酵。且，本发明采用有机废弃物固态发酵法制成有机肥，使用的鱼下脚料中富含蛋白、脂质等营养物质，烟草废弃物中含有大量植物易于吸收的钾、磷等营养元素，是绿色、成本低廉的肥料资源，且易于获取，同时可增加水产品加工业的附加值和避免环境污染。利用混合微生物以固态条件发酵鱼下脚料和烟草废弃物，添加0.5％氯化钠和1％硝酸铵，以混合菌株枯草芽孢杆菌、红酵母、米根霉为发酵菌剂，在固态发酵的条件为烟草废弃物添加量30％、接菌量4
×
10
10
cfu/g、发酵温度34℃，经发酵周期20天后可获得有机肥，发酵方法操作简单。
29.经过本发明方法固态发酵有机肥的肥效高，发酵有机肥作为基肥施用时，施加基肥为20g/kg时，青菜和辣椒的苗高分别为4.5cm和5.3cm，增加了95.65％和32.5％；其鲜重比不施加发酵肥的对照组的鲜重分别增加0.129g和0.1627g，干重增加0.006g和0.0042g。青菜与辣椒的叶绿素含量分别为17.124mg/g和16.278mg/g，与对照组相比提高了18.53％和195.4％，存在显著差异。发酵有机肥作为基肥施用后，土壤中铵态氮含量为355mg/kg、有效磷172.33mg/kg、速效钾36.63mg/kg，与对照组相比显著提高。此外，土壤中脲酶、过氧化氢酶和蔗糖酶的酶活性也有所提高，而土壤酶活性是评价土壤理化性质和肥力状况的重要指标，可间接地反应出土壤中某些营养物质的转化情况，可见发酵有机肥能增加土壤养分，为植物提供营养物质。
30.与现有技术相比，本发明以混合鱼下脚料和烟草废弃物为主要原料，利用微生物固态发酵制成供植物生长所需的有机肥料，为水产和烟草工业的废弃物处理带来新的方法，解决废弃物造成环境压力的问题。
附图说明
31.图1为蛋白酶活检测平板；
32.图2为脂酶酶活检测平板；
33.图3为纤维素酶活检测平板；
34.图4为不同无机氮源、无机盐对活菌总数的影响；a为不同无机氮源对活菌总数的影响；b为不同无机盐对活菌总数的影响；
35.图5为氯化钠和硝酸铵的含量对活菌总数的影响；
36.图6为不同发酵条件对发酵底物的影响；
37.图7为发酵过程中有机质、有效磷、速效钾、纤维素含量变化趋势；a为有机质含量，b为有效磷含量、c为速效钾含量，d为纤维素含量；
38.图8为发酵肥对青菜生长的影响；
39.图9为发酵肥对辣椒生长的影响；
40.图10为发酵肥对蔬菜叶绿素含量的影响；
41.图11为发酵肥对土壤脲酶活性的影响；
42.图12为发酵肥对土壤蔗糖酶活性的影响；
43.图13为发酵肥对土壤过氧化氢酶活性的影响。
具体实施方式
44.下面结合以下实施例对本发明进一步说明。
45.实施例1
46.一种固态发酵复合鱼下脚料和烟草废弃物有机肥的生产方法，为：利用鱼下脚料和烟草废弃物混合为发酵基质，混入无机盐和无机氮源，高温灭菌后，接种混合菌剂，进行固态发酵，制成的固态有机肥。
47.所述鱼下脚料为：鱼头、鱼内脏、鱼鳍、鱼尾、鱼骨或其残留鱼肉混合物，经高温灭菌、搅碎、干燥处理，即得；所述鱼下脚料为鲫鱼、草鱼或鲢鱼的鱼下脚料。所述烟草废弃物为卷烟厂废弃的烟叶或烟梗任意一种或两种的混合物，50℃烘箱干燥后粉碎至颗粒状。实施例1所用的鱼下脚料和烟草废弃物基本理化性质见表1。
48.表1鱼下脚料和烟草废弃物基本理化性质
[0049][0050]
所述烟草废弃物质量为鱼下脚料和烟草废弃物总质量的30％；所述无机盐选自氯化钠nacl；所述无机氮源选自硝酸铵nh4no3；所述无机盐用量为鱼下脚料和烟草废弃物总质量的0.5％；所述无机氮源用量为鱼下脚料和烟草废弃物总质量的1.0％；所述混合菌剂接菌4.0
×
10
10
cfu/g；所述混合菌剂为枯草芽孢杆菌、红酵母和米根霉的混合菌；枯草芽孢杆菌、红酵母和米根霉的菌株比例为2:1:3；所述固态发酵，发酵温度为34℃，进行20天发酵。
[0051]
实施例2
[0052]
对枯草芽孢杆菌、红酵母和米根霉的菌株的活化及酶活检测，具体如下：
[0053]
发酵菌株的活化：
[0054]
枯草芽孢杆菌bacillus subtilis、红酵母rhodotorula taiwanensis、米根霉rhizopus oryzae为市售菌株，菌株在lb或pda固体培养基上划线培养，挑取单菌落接种液体培养基中，培养24h后，作为发酵液。
[0055]
发酵菌株的酶活性检测：
[0056]
酶活性测定采用水解圈检测方法，在蛋白酶、酯酶和纤维素酶酶活检测培养基上打孔(直径1cm)，分别接入200μl上述发酵液到平板孔中，每种菌株重复3皿，红酵母和米根霉在28℃，枯草芽孢杆菌在35℃培养。培养5d后，纤维素培养基用1mg/ml的刚果红染色1h，倒掉染液后，1mol/l nacl溶液浸泡1h，观察有无透明圈产生。结果如图1-图3所示。
[0057]
由图1、2和3所示，平板上有明显的水解圈，菌株枯草芽孢杆菌和米根霉有产蛋白酶、酯酶和纤维素酶的能力，红酵母具有产蛋白酶和酯酶的能力。也进一步说明了本发明采用枯草芽孢杆菌、红酵母和米根霉，能够发酵鱼下脚料和烟草废弃物。
[0058]
实施例3
[0059]
按照实施例1的方法，改变培养基、无机氮源、无机盐的添加量和原料选择、调整烟草废弃物用量比、混合菌剂中枯草芽孢杆菌、红酵母和米根霉的菌株比例、接菌量、发酵温度等，对比发酵结果，具体如下：
[0060]
1)发酵基质作为培养基对菌株数量的变化
[0061]
在实施例2发酵液的基础上，在lb、pda和以鱼下脚料和烟草组成的混合发酵基质的液体培养基中分别接入5％的单菌发酵液和混合菌液(枯草芽孢杆菌：红酵母：米根霉的比例1：1：1)，培养2天后，采用稀释涂布平板法计算微生物总数。
[0062]
表2不同培养基中菌种的数量变化
[0063][0064]
表2中，细菌是枯草芽孢杆菌，真菌是红酵母和米根霉。
[0065]
2)发酵基质优化
[0066]
在实施例1发酵基质的基础上，分别添加含氮量相同的无机氮源((nh4)2so4、nh4no3、nh4cl、和nano3)与无机盐(k2hpo4、kh2po4、mgso4和nacl)，枯草芽孢杆菌、红酵母、米根霉的比例为1:1:1接种混合菌株；接菌量4
×
10
10
cfu/g，34℃发酵3d，采用平板计数法计算微生物总数，设置添加量为0、0.5％、1％、1.5％、2％，结果如图4、图5所示，在相同的成分和条件下，以硝酸铵为无机氮源、氯化钠为无机盐离子，活菌总数分别为3.3
×
108cfu/ml、2.21
×
108cfu/ml，并改变其浓度探究对菌种生长的影响，随着氯化钠含量的增加，活菌数的数量呈下降趋势；而活菌总数随着硝酸铵含量的增加而増加，在1％含量时，活菌总数最大为4.2
×
108cfu/ml，当大于1％时，活菌总数开始下降，因此在发酵基质中添加0.5％氯化钠和1％硝酸铵。进一步证明最适合菌种生长的无机氮源和无机盐为nh4no3和nacl，本发明选择的nh4no3和nacl最优。
[0067]
3)烟草添加量对发酵效果的影响
[0068]
称取发酵底物为20g，将烟草的添加量设为(5％、10％、20％、30％、40％)。置于50ml三角瓶中，灭菌后接入混合菌剂，接菌量4
×
10
10
cfu/g，枯草芽孢杆菌、红酵母、米根霉的比例为2:1:3，34℃培养3d。
[0069]
4)接菌量对发酵效果影响
[0070]
称取发酵底物20g，烟草含量在30％，置于50ml三角瓶中。灭菌后接种菌株枯草芽孢杆菌、红酵母、米根霉的比例为2:1:3，终浓度为1、2、3、4、5
×
10
10
cfu/g，34℃培养3d。
[0071]
5)各菌株比例对发酵效果的影响
[0072]
称取发酵底物20g，烟草含量在30％，置于50ml三角瓶中。灭菌后接种菌株枯草芽孢杆菌、红酵母、米根霉，将枯草芽孢杆菌、红酵母、米根霉的比例设置为2:1:1、2:1:2、2:1:3、2:1:4、2:1:5，34℃发酵3d。
[0073]
6)温度对发酵效果影响的探究
[0074]
发酵菌株中，芽孢杆菌最适生长温度为30-37℃，红酵母最适生长温度为27-36℃。米根霉的最适温度为28-37℃，故选择26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃进行实验对比。
[0075]
按照以上方法发酵后，根据发酵液中可溶性肽含量来判断各因素对发酵效果的影
响，结果如图6所示。可以看出，在混合菌株的固态发酵中，可溶性肽的含量先是随着烟草添加量的增加而上升的(图6中a)，当达到40％，含量最低，其原因有可能是烟草中的烟碱成分对菌株有抑制作用，影响菌株生长及酶活性。接菌量在4
×
10
10
cfu/g时可溶性肽含量最高(图6中b)，超过此接菌量时，菌株没有充分与底物结合，所以发酵效果较次，接种量太多导致菌种间生长竞争，生长过快导致营养缺乏，所以发酵液中可溶性肽含量也不高。混合菌株枯草芽孢杆菌：红酵母：米根霉的最适比例为2:1:3。适宜的温度有利于微生物的正常代谢活动，当温度较低时，微生物体内的酶类等物质代谢缓慢，微生物的生长代谢随之变缓，可溶性肽含量较低；当温度升至34℃时，可溶性肽含量达到最高峰，此时最适合微生物的生长代谢的条件，之后随着温度的升高，有些菌种不适宜而生命活动减缓甚至消失，微生物发酵作用随之减缓，导致可溶性肽含量的下降。
[0076]
7)复合菌株发酵的正交试验对比
[0077]
按照实施例1的方法，选取烟草添加量、接菌量、温度为变量进行对比，对比条件如表1，证明本发明实施例1的发酵条件最优。
[0078]
表3发酵工艺优化
[0079][0080]
表4发酵工艺优化的正交试验设计结果
[0081]
[0082][0083]
注：表中数据为平均值
±
标准差。ki值为因素i水平所对应的试验指标之和。
[0084]
在混合菌株比例为枯草芽孢杆菌:红酵母:米根霉的最佳配比为2:1:3时，从表3的极差分析结果可以看出，以可溶性肽含量为指标主次因素顺序为b＞c＞a；最优水平组合为a2b2c3，即烟草废弃物添加量30％、接菌量4
×
10
10
cfu/g、发酵温度34℃、经试验验证本发明实施例1设置的条件是最优的。
[0085]
实施例4
[0086]
一种固态发酵复合鱼下脚料和烟草废弃物有机肥的应用，用于农作物肥料。
[0087]
首先，按照实施例1方法发酵，每2天采集样品，采样前充分混匀。每个样品风干后用于铵态氮、有效磷、速效钾和有机质分析。纤维素的测定采用浓硫酸水解法；可溶性肽的测定采用福林酚法；含水率、ph、全氮和有机质测定方法参照中华人民共和国农业行业标准(ny525-2012)有机肥料行业标准；铵态氮、有效磷和速效钾测定采用tfc各型浓度直读土壤化肥速测仪。结果如图7所示。
[0088]
在发酵周期20d中，有机质含量呈逐渐下降趋势(图7中a)，后下降了34.27％，表示有机废物经过较充分的发酵，有机质易被分解和利用。有效磷和有效钾钾含量都显著增加(图7中b、7中c)，分别增加了137.2％、193.63％，到发酵结束时，有机质、有效磷、有效钾的含量分别为47.26％、3.76％、7.78％，都高于我国有机肥质量标准(ny525-2012)。而发酵产物中的纤维素也在发酵过程中降解了65.15％。发酵肥理化质量检测如表5所示。
[0089]
表5发酵肥理化质量检测结果
[0090]
检验项目检验结果ny525-2012氨基态氮0.51 p2o5(％)3.755 n(％)16.037 k2o(％)7.784 总养分(n+p2o5+k2o)(干基)/％27.576≥5.0水分/％7.26≤30颜色褐色褐色或灰褐色
[0091]
根据以上结果，说明本发明方法发酵后，有机肥有效成分较高，适合作为农作物有机肥。
[0092]
将以上发酵后的有机肥应用：
[0093]
试验设置4个处理，分别为ck:不添加肥的园土；t1:施肥量10g/kg；t2:施肥量为20g/kg；t3:施肥量30g/kg。按照以上比例，将实施例1制备的有机肥与园土混合一次性作为基肥施用。每个处理组分别播种20粒青菜和辣椒种子，每个处理组设置3个重复。置于光照恒温培养箱中生长。光照培养箱条件为光照强度5000lx，光暗比12h:12h，25℃。培养15d后测量蔬菜的茎长、鲜重、干重和叶绿素等，得到最适宜的作物播种施肥量。
[0094]
并将不同处理的土壤样品风干，用于土壤理化性质及酶活的测定。土壤脲酶活性采用苯酚-次氯酸钠比色法测定；土壤过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定；土壤蔗糖酶活采用3,5-二硝基水杨酸比色法。
[0095]
1)不同施肥量对蔬菜茎长、鲜重和干重的影响
[0096]
由表6、图8和图9可以看出，发酵肥对蔬菜的生长有明显的促进作用。相比于对照组，在发酵肥作为基肥时的处理组t1、t2、t3组均可提高青菜种子的发芽率，促进青菜和辣椒种子的茎长、鲜重和干重。t2组施加基肥为20g/kg时效果最好。青菜和辣椒的苗高分别为4.5cm和5.3cm，增加了95.65％和32.5％；其鲜重比不施加发酵肥的鲜重分别增加0.129g和0.1627g，干重增加0.006g和0.0042g。可见施用发酵肥后，蔬菜的生长效果优于土壤基质。
[0097]
表6发酵肥对蔬菜茎长、鲜重、干重的影响
[0098][0099]
注：表中数据为平均值
±
标准差；*表示不同处理间差异达到5％显著水平。下同。
[0100]
2)不同施肥量对蔬菜叶绿素含量的影响
[0101]
叶绿素含量常作为评定植物适应环境能力和生长状况的一个重要指标。由图9可知，不同施肥量对蔬菜叶片叶绿素的含量影响不同。随着施肥量的增加，叶绿素含量呈上升的趋势，达到20g/kg时，叶绿素的含量最高，青菜与辣椒的叶绿素含量分别为17.124mg/g和16.278mg/g，与对照组相比提高了18.53％和195.4％，存在显著差异。
[0102]
3)发酵肥对土壤养分的影响
[0103]
表7不同处理的土壤种植蔬菜后土壤氮磷钾的检测结果
[0104][0105]
土壤为植物提供生理活动所需要的矿物质元素，氮肥可以提高植物的光合速率，增加植物体内抗氧化物酶的活性，促进植物生长；磷和钾能调节植物的代谢过程，促使植物良好发育。对不同处理组的土壤养分进行测定，如表5所示，施肥的t1、t2、t3处理组均可明显提高土壤中铵态氮、有效磷、速效钾的含量。随着施肥量的增加，在20g/kg/亩的t2组中铵态氮含量最高；速效钾在t2组最少,可见施用有机肥为土壤提供养分，而在微生物的作用下，分解释放出植物所需的各种元素，加快肥料的转化率，提高肥料的转化程度，增强肥效，为植物提供营养来源。
[0106]
4)发酵肥对土壤酶活的影响
[0107]
土壤中的脲酶是氮素循环的关键酶类，能促进尿素的水解，形成的nh3是植物的氮源之一，其活性可反映土壤的供氮能力和水平。对不同处理组的土壤脲酶活性测定，并进行分析结果，如图11所示，t2处理组脲酶活性最高为3.565mg/g，显著高于对照组，t1、t3组脲酶活性分别为2.890mg/g和3.342mg/g，与对照组差别不显著。
[0108]
蔗糖酶来自植物根系和微生物，能催化蔗糖水解成葡萄糖和蔗糖，对土壤的碳和氮循环起到重要的作用。由图12可见，未添加发酵肥的园土中，蔗糖酶活性为0.527mg/g，处理组t1、t2、t3的蔗糖酶活性分别为1.760mg/g、1.863mg/g、1.570mg/g，与对照组相比，添加不同量的发酵肥后蔗糖酶活大大增加，其中t2处理组的酶活性最大，随着添加发酵肥的量增大，蔗糖酶活有下降趋势，但仍有显著差异。
[0109]
过氧化氢是生物呼吸过程中有机物发生生物化学氧化反应而产生的，其积累会对生物和土壤产生毒害作用，而土壤中的过氧化氢酶能酶促过氧化氢分解为水和氧，从而解除过氧化氢的毒害作用。由图13可见，随着发酵肥的增加，过氧化氢酶活性先增加后下降，t1、t2组的过氧化氢酶活性分别为4.00(u/h
·
g)和3.591(u/h
·
g)，与对照组相比，分别提高了25.74％和12.89％，差异显著。