专利名称：海洋芋螺镇痛多肽的制备方法
芋螺属腹足纲软体动物，全世界约有500种，遍布世界各暖海区，我国有芋螺60-70种，主要分布在西沙群岛、海南岛及台湾海域。芋螺喜食海水中的蠕虫及其他软体动物和鱼类，根据其习性可分为食鱼、食虫、食螺三种芋螺。芋螺毒素由毒液管和毒囊内壁的毒腺分泌，多为基因编码的多肽，由12～40个氨基酸，2～3对二硫键组成。这类活性多肽对不同的离子通道及通道亚型具有高度选择性作用，按其作用靶位可分为α、ω、μ、δ、κ及μ/o等类型。目前已发现芋螺毒素在疾病治疗及诊断等方面具有广阔的应用前景，其中ω-芋螺毒素MVIIA为N型钙通道抑制剂，具有强烈的镇痛作用，活性比吗啡大千倍，且不致瘾，由Neurex公司开发用于镇痛及神经保护，已进入Ⅱ-Ⅲ期临床试验，见Scott Bowersox等，Drug of Future，1998，23(2)152-160。
SO3芋螺多肽是通过对我国南海的线纹芋螺(Conus Striatus)毒管基因克隆(卢柏松等，科学通报，44(16)1737-1739，1999)并经肽合成而得到的，其氨基酸的序列为CKAAGKPCSRIAYNCCTGSCRSGKC(C端酰胺化)，含三对二硫键。应用热板法、光热辐射法及化学刺激法测定了其对小鼠的镇痛活性的半数有效剂量为0.75μg/kg(ED50)，ED50比半数致死剂量LD50小18000倍，活性比吗啡大千倍以上。对大鼠脊髓鞘内慢性套管给药0.5μk/kg痛阈提高50％，给药1.2μg/kg，痛阈提高100％，且作用时间4小时以上，具有良好的药物发展前景。
中国专利申请99106070.9(CN1237584A)公开了14种芋螺毒素肽及其基因克隆方法，其中还具体公开了一种肽的大肠杆菌表达和另一种肽的化学合成方法。该申请公开的化学合成方法直接延用了肽合成领域的常规技术，不适于以高收率高活性获得较大规模的肽。
本发明的目的就是试图提供一种收率高适于工业应用的制备活性芋螺多肽的方法，使得这类多肽的临床应用成为可能。
本发明的发明人对芋螺多肽的制备工艺进行了广泛的研究，发现了一些特别适合于该类多肽的工艺条件，从而完成了本发明。
本发明提供一种制备活性芋螺多肽的方法，其包括线性肽的合成、线性肽的折叠和肽纯化步骤，其特征在于所述肽折叠是在0.1-2M氯化钠或硫酸钠存在下在氧化还原系统中进行的。
本发明线性肽的合成，可以采用本领域技术人员已知的任何方法完成。这些方法例如(但不限于)克隆表达法、化学合成法，后者包括液相合成和固相合成。关于固相合成，又分为仪器自动合成和手工合成。关于芋螺多肽的克隆表达方法及仪器固相合成参见本申请人的另一专利申请99106070.9(CN1237584A)。本文也给出了SO3线性肽仪器合成的实施例。简言之，线性肽的仪器合成采用商业购买的Rink树脂和Fmoc氨基酸在肽合成仪上进行。对于SO3的Ile15、Alg16和Lys20三个氨基酸采用双偶合法连接，其余氨基酸均采用单偶合法连接。所得树脂-肽缀合物用含酚、二巯基乙酸、苯甲硫醚、水和三氟乙酸的裂解试剂裂解并脱保护。所得游离肽经乙醚沉淀、过滤、再于葡聚糖凝胶上纯化得到基本纯的线性肽。
由于仪器合成的产量有限，申请人研究了适于工业生产的手工合成方法。该方法还是基于固相合成的原理，从Rink树脂及Fmoc氨基酸开始，以DCC-HOBt作为活化剂和以哌啶作为脱保护剂合成的。其中各种氨基酸采用的保护基分别为Trt(Cys)、Boc(Lys)、Pmc(Arg)、tBu(Ser、Tyr、Thr)、OtBu(Asp)。采用手工合成不仅一批可合成大量肽(数克到数百克或更多)，节约大量溶剂，且主要消耗溶剂廉价易得。
线性肽的折叠是肽合成中的重要步骤，因为只有呈正确折叠的构象形式时肽才具有其生物活性，而无论是经原核细胞的表达还是经化学合成的肽都是无活性的包涵体、线性肽等形式。线性肽的折叠是肽合成的一个必经步骤，其效率直接影响肽合成的收率。申请人现令人惊异地发现，在0.1-2M的氯化钠或硫酸钠存在下在氧化还原系统中进行线性肽的折叠，与现有技术相比，芋螺多肽的折叠效率有显著提高。
在本发明的方法中，氯化钠或硫酸钠的浓度为0.1-2M，优选0.2-1M，最优选为约0.5M。
在一个实施方案中，本发明方法所用的氧化还原系统为含有半胱氨酸和胱氨酸的缓冲液。在该实施方案中，半胱氨酸与胱氨酸的摩尔比优选为20∶1至2∶1，优选15∶1至5∶1，最优选约10∶1。
在另一个实施方案中，本发明方法所用的氧化还原系统为含有二硫苏糖醇的缓冲液。
在一个优选的实施方案中，本发明方法所用的氧化还原系统为含有还原型和氧化型谷胱甘肽的缓冲液。在此实施方案中，还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的摩尔比优选为20∶1至2∶1，更优选是15∶1至5∶1，最优选约10∶1。
在上述实施方案中，所述缓冲液优选为醋酸铵缓冲液或磷酸盐缓冲液或者Tris·HCl缓冲液。缓冲液的pH值为约7.0-8.2。
折叠效率的测定是通过HPLC测定的，通过测定正确折叠主峰面积与全部折叠峰的总面积之间的比例，可确定折叠效率。
折叠好的芋螺多肽溶液需要进一步浓缩、纯化及必要时的盐形式的转换，才有形成适于药用的产品。当然，本发明包括采用本发明方法折叠后的各种形式的芋螺多肽产品，无论其是否经过浓缩、纯化或盐形式的转换。所述浓缩、纯化和盐的转换可采用本领域技术人员已知的任何方法进行。现有技术中报道的芋螺多肽的浓缩纯化是采用冻干-HPLC纯化工艺。即多肽折叠溶液中乙酸酸化后冻干，然后用HPLC纯化。此工艺不适于大规模生产。因此，本申请人研究开发出HPLC浓缩、离子交换浓缩、常压反相浓缩或超滤浓缩加HPLC纯化的方法。优选HPLC及离子交换浓缩浓缩法。
最后，为了制备成临床应用的制剂，若产品呈三氟乙酸盐形式，则还需进行盐形式的转换。典型地，将含三氟乙酸的肽溶于乙酸中，通过葡聚糖凝胶柱，再用乙酸洗脱，然后收集目标成分并冻干可得乙酸盐形式的纯化肽。当然根据临床应用的需要，本领域技术人员能将这种多肽转变成各种适宜的盐形式。
本发明方法获得的活性多肽适于以肽的常规形式给药，优选以注射途径给药。对于多肽无菌注射液的制备，可将纯化肽溶于无菌生理盐水，经过滤除菌，然后用生理盐水稀释到适当浓度，分装在不同规格的安瓿中并密封。
上述本发明方法特别适用于称为SO3的芋螺多肽，其氨基酸序列如下CKAAGKPCSRIAYNCCTGSCRSGKC(C端酰胺化)。
下面以SO3多肽为例以实施例的方式进一步说明本发明。实施例1 SO3线性肽的合成方法A仪器合成采用Fmoc/HoBt/DCC方法，利用Rink树脂及Fmoc氨基酸，合成步骤参考仪器合成手册进行。为反应完全，在哌啶脱保护及偶合时间上分别适当延长，哌啶的第一个脱保护，3min延长为5min，第二次脱保护由15min改为30min，偶合时间上增加20min。Ile15、Arg16、Lys20三个氨基酸较难以接上，采用双偶合方法，其余采用单偶合。
合成量为0.25mol，得肽-树脂1.50g，总偶合率为95％。1.5g肽树脂在如下裂解试剂中进行脱去保护基1.5g苯酚，0.5mL 1，2-二巯基乙醇，1mL苯甲基硫醚，1mL蒸馏水，20mL三氟乙酸，搅拌2.5h，过滤，用2mL三氟乙酸洗涤，再用无水二氯乙烷洗涤，滤液在旋转蒸发器上蒸至8mL，加入大量冰冷乙醚，立即产生沉淀，过滤，用乙醚洗涤四次，然后用20％的乙酸溶解粗肽，冷冻干燥，得粗肽610mg。
上述610mg粗肽溶于10％的乙酸中，将冷冻干燥后的粗肽溶于10％的乙酸中，过Sephadex G-25(26×400mm)，10％乙酸洗脱，254nm记录，收集主峰并冻干，得较纯肽500mg。方法B手工合成选用Rink树脂及Fmoc保护氨基酸(保护基分别是(Trt(Cys)，Boc(Lys)，Pmc(Arg)，t-Bu(Ser，Tyr，Thr)，OtBu(Asp))，DCC-HOBt为活化剂，哌啶脱保护。接肽方法NMP1×1min30％哌啶/DMF 1×530％哌啶/DMF 1×40NMP2×1CH2Cl21×1MeOH(i-PrOH) 2×1CH2Cl23×1NMP1×1Fmoc-AA/HBTU，DIEA 1～2hNMP2×1minMeOH 2×1CH2Cl22×1NMP1×1检测(重缩合、封闭、下一循环)合成量为1.88mmol，得肽-树脂10g，偶合率为79.4％。
肽树脂裂解6g肽-树脂置于裂解试剂(3g苯酚，1mL 1，2-二巯基乙醇，2mL苯甲基硫醚，2mL蒸馏水，40mL三氟乙酸)，其余步骤同方法A。得粗肽4.2g。
3.2g粗肽溶于10％的乙酸中，将冷冻干燥后的粗肽溶于10％的乙酸中，过Sephadex G-25(36×700mm)，10％乙酸洗脱，254nm记录，收集主峰并冻干，得较纯肽2.8g。实施例2 氧化折叠在4～8℃将线性肽溶于含氧化还原剂及络合剂(EDTA)的缓冲液中(pH7.9左右)，用HPLC检测折叠过程。折叠完成后，用乙酸酸化缓冲液pH为一定值，然后用各种纯化方法进行纯化。方法A在半胱氨酸存在下氧化0.1～2.0mol/L醋酸铵或0.05～0.1mol/L的磷酸盐或Tris·HCl缓冲液(pH均为7.0-8.2)中加入0.8～7.2mmol/L的半胱氨酸及0.08～0.72的胱氨酸、1mmol/L的乙二胺四乙酸钠、2～0.1mol/L氯化钠或2～0.1mol/L硫酸钠及0.2～2mg/ml SO3，4-8℃下搅拌1-5天，折叠效率为10-50％。
A1．0.5mol/L醋酸铵(pH为7.9)缓冲液中加入1.0mmol/L半胱氨酸及0.1mmol/L的胱氨酸、1mmol/L的乙二胺四乙酸钠、0.5mol/L氯化钠或2mol/L硫酸钠及0.2mg/ml SO3，4℃下搅拌2天，折叠效率为35％。
A2．0.05mol/L的磷酸盐(pH为7.9)缓冲液中加入1.0mmol/L的半胱氨酸及0.2mmol/L的胱氨酸、1mmol/L的乙二胺四乙酸钠、0.2mol/L氯化钠或0.5mol/L硫酸钠及0.2mg/ml SO3，4℃下搅拌2天，折叠效率为30％。
A3．0.1mmol/L Tris·HCl缓冲液(pH7.9)中加入1.0mmol/L的半胱氨酸及0.1mmol/L的胱氨酸、1mmol/L的乙二胺四乙酸钠、1mol/L氯化钠或2mol/L硫酸钠及0.2mg/ml SO3，4℃下搅拌3天，折叠效率为30％。方法B在还原性谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽存在下氧化0.1～2.0mol/L醋酸铵或0.05～0.1mol/L的磷酸盐或Tris·HCl缓冲液(pH均为7.0-8.2)中加入0.8～7.2mmol/L的还原性谷胱甘肽及0.08～0.72的氧化型谷胱甘肽、1mmol/L的乙二胺四乙酸钠、2～0.1mol/L氯化钠或2～0.1mol/L硫酸钠及0.2～2mg/ml SO3、4-8℃下搅拌1-5天，折叠效率为10-60％。
B1．0.5mol/L醋酸铵(pH为7.9)缓冲液中加入1.0mmol/L的还原性谷胱甘肽及0.1mmol/L的氧化型谷胱甘肽、1mmol/L的乙二胺四乙酸钠、0.5mol/L氯化钠或2mol/L硫酸钠及0.2mg/ml SO3，4℃下搅拌3天，折叠效率为40％。
B2．0.05mol/L磷酸盐(pH为7.9)缓冲液中加入1.0mmol/L的还原性谷胱甘肽及0.1mmol/L的氧化型谷胱甘肽、1mmol/L的乙二胺四乙酸钠、0.5mol/L氯化钠或1mol/L硫酸钠及0.2mg/ml SO3，4℃下搅拌3天，折叠效率为30％。
B3．0.1mol/L Tris·HCl(pH为7.9)缓冲液中加入1.0mmol/L的还原性谷胱甘肽及0.1mmol/L的氧化型谷胱甘肽、1mmol/L的乙二胺四乙酸钠、0.5mol/L氯化钠或2mol/L硫酸钠及0.2mg/ml SO3，4℃下搅拌3天，折叠效率为30％方法C在二硫苏糖醇存在下氧化0.1～2.0mol/L醋酸铵或0.05～0.1mol/L的磷酸盐或Tris·HCl缓冲液(pH均为7.0-8.2)中加入0.8～2.2mmol/L的二硫苏糖醇、1mmol/L的乙二胺四乙酸钠、2～0.1mol/L氯化钠或2～0.1mol/L硫酸钠及0.2～2mg/ml SO3，4-8℃下搅拌3-5天，折叠效率为10-30％。
C1．0.5mol/L醋酸铵缓冲液(pH为7.9)中加入1.2mmol/L的二硫苏糖醇、1mmol/L的乙二胺四乙酸钠、0.5mol/L氯化钠或1mol/L硫酸钠及0.2mg/ml SO3，4℃下搅拌5天，折叠效率为20％。
C2．0.05mol/L的磷酸盐缓冲液(pH为7.9)中加入1.2mmol/L的二硫苏糖醇、1mmol/L的乙二胺四乙酸钠、0.5mol/L氯化钠或1mol/L硫酸钠及0.2mg/ml SO3，4℃下搅拌5天，折叠效率为25％。
C3．0.1mol/L Tris·HCl缓冲液(pH为7.9)中加入1.2mmol/L的二硫苏糖醇、1mmol/L的乙二胺四乙酸钠、1.0mol/L氯化钠或1mol/L硫酸钠及0.2mg/ml SO3，4℃下搅拌5天，折叠效率为25％。对比实施例不加氯化钠或硫酸钠情况下折叠0.1～0.5mol/L醋酸铵或0.05～0.1mol/L的磷酸盐或Tris·HCl缓冲液(pH均为7.0-8.2)中加入0.8～7.2mmol/L的半胱氨酸及0.08～0.72的胱氨酸或0.8～7.2mmol/L的还原性谷胱甘肽及0.08～0.72的氧化型谷胱甘肽、1mmol/L的乙二胺四乙酸钠及0.2～2mg/ml SO3，4-8℃下搅拌1-5天，折叠效率为5-20％。
此外增加磷酸盐或Tris·HCl浓度将导致折叠溶液产生沉淀，导致产率下降。
增加醋酸铵浓度也可达到较高产率，但中和缓冲液需消耗大量醋酸，此外大量的醋酸给后面的纯化带来麻烦，并需稀释。
在实施例2方法A、B和C的相同条件但不加氯化钠或硫酸铵的情况下折叠，折叠效率见下表
实施例3 SO3的纯化方法A冻干-HPLC纯化工艺SO3折叠完成后，加乙酸酸化，冻干，然后HPLC纯化(C18，21.1×250mm，洗脱液A为0.1％的三氟乙酸，洗脱液B为100％的乙腈，梯度为1-40min，10-30％B，流速为8ml/min)。收率15％。方法BHPLC浓缩-HPLC纯化工艺SO3折叠完成后，加乙酸(2000ml缓冲液，加乙酸100ml)调pH＜4.5，过滤，上反相柱吸附(C18柱，30×250mm)，柱流速3-5ml/min，吸附结束后用水冲洗，然后进行梯度洗脱(洗脱液A为0.1％的三氟乙酸，洗脱液B为100％的乙腈，梯度为1-40min，10-40％B，流速为8ml/min)，收集主峰及其他峰，冻干，多聚体可用纯乙腈洗脱，从收集液减压蒸去乙腈，冻干。
将冻干的主峰，再次进行反相HPLC分离(C18柱，21.1×250mm，洗脱液A为0.1％的三氟乙酸，洗脱液B为100％的乙腈，梯度为1-40min，10-30％B，流速为8ml/min)。经高压反相浓缩及初步纯化后，该步纯化所得主峰，纯度在50-90％之间，再经一步高压反相纯化，产品纯度可达99％以上，收率达15～20％。方法C离子交换浓缩-HPLC纯化工艺SO3折叠完成后，加乙酸(2000ml缓冲液，加乙酸40ml)，调pH5.0-5.2，过滤，稀释至NH4Ac浓度为0.22M，上BiO-Rex70离子柱(H+)，流速5ml/min，吸附结束后，用水冲洗，然后用50％乙酸洗脱，旋转蒸发去除乙酸，冻干。冻干的主峰用高压反相制备柱(C18柱，21.1×250mm，洗脱液A为0.1％的三氟乙酸，洗脱液B为100％的乙腈，梯度为1-40min，10-30％B，流速为8ml/min)进行分离。SO3经离子交换层析后，纯化所得主峰，纯度为50％-70％，主峰收率为20-30％，进一步反相纯化可得99％的产品。方法D常压反相浓缩-HPLC纯化工艺SO3折叠完成后，加乙酸(2000ml缓冲液，加乙酸100ml)调pH＜4.5，过滤，上Source RPC30或Poros反相柱吸附(1.5×50)，柱流速3-5ml/min，吸附结束后用水冲洗，然后进行梯度洗脱，收集主峰及其他峰，冻干，多聚体可用纯乙腈洗脱，从收集液减压蒸去乙腈，冻干。
将冻干的主峰进行反相HPLC分离(C18柱21.1×250mm，洗脱液A为0.1％的三氟乙酸，洗脱液B为100％的乙腈，梯度为1-40min，10-30％B，流速为8ml/min)。制备的SO3产率为15-25％(相对线性肽)。方法E超滤浓缩-HPLC纯化工艺SO3折叠完成后，调pH为3.5，稀释一倍，用YM1(截留分子量为1000Da)超滤膜过滤，压力0.35Mpa，然后用水稀释，再超滤，收集母液，冻干。干粉用HPLC纯化(C18柱，21.1×250mm，洗脱液A为0.1％的三氟乙酸，洗脱液B为100％的乙腈，梯度为1-40min，10-30％B，流速为8ml/min)。制备的SO3产率为15-20％(相对线性肽)。实施例4 SO3纯品的缓冲液交换及制剂将500mg含有三氟乙酸的SO3肽溶解于20％的乙酸中，过Sephadex G-25柱(26×400mm)，用20％乙酸洗脱，于254nm记录，收集主峰并冻干，得含醋酸的纯肽420mg。然后在无菌间用少量高压灭菌生理盐水溶解，用灭菌的0.2μm聚醚砜滤膜过滤除菌，以生理盐水稀释，分装成不同规格制剂。
权利要求
1．一种制备活性芋螺肽的方法，包括线性肽的合成、线性肽折叠和肽纯化，其特征在于所述线性肽折叠是在0.1-2M氯化钠或硫酸钠存在下在氧化还原系统中进行的。
2．权利要求1的方法，其中氯化钠或硫酸钠的浓度为0.2-1M。
3．权利要求2的方法，其中氯化钠或硫酸钠的浓度为约0.5M。
4．权利要求1的方法，其中所述氧化还原系统为含有半胱氨酸和胱氨酸的缓冲液。
5．权利要求1的方法，其中所述氧化还原系统为含有还原型及氧化型谷胱甘肽的缓冲液。
6．权利要求1的方法，其中所述氧化还原系统为含有二硫苏糖醇的缓冲液。
7．权利要求1的方法，其中所述芋螺多肽为具有如下序列的称为SO3的多肽CKAAGKPCSRIAYNCCTGSCRSGKC(C端酰胺化)。
8．权利要求1的方法，其中线性肽的合成是利用肽合成仪的自动合成或手工合成。
9．权利要求8的方法，其中线性肽的合成是采用固相手工合成法。
10．权利要求1的方法，其中肽的纯化包括肽折叠溶液的浓缩和HPLC纯化和必要时的盐的转换。
11．权利要求10的方法，其中浓缩步骤采用冻干法、HPLC浓缩法、离子交换浓缩法、常压反相浓缩法或超滤浓缩法。
12．权利要求11的方法，其中浓缩步骤采用HPLC浓缩法。
13．权利要求10的方法，其中盐转换为肽的三氟乙酸盐转换为乙酸盐。
全文摘要
本发明公开了一种制备活性芋螺多肽的方法,包括线性肽的合成、线性肽折叠和肽纯化,其特征在于所述线性肽折叠是在0.1-2M氯化钠或硫酸钠存在下在氧化还原系统中进行的。据本发明方法可以获得高效率高活性的芋螺多肽,适于规模化生产。
文档编号C07K14/435GK1296012SQ0012852
公开日2001年5月23日 申请日期2000年11月24日 优先权日2000年11月24日
发明者戴秋云, 黄培堂, 周艳荣, 刘凤云 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所