专利名称：大量生产金属硫蛋白的方法
金属硫蛋白有广泛的可诱导性，如接触有毒金属，激素，细胞毒素，及一些物理或化学应激的病理、生理条件如饥饿、寒冷、电离辐射等均能使金属硫蛋白在培养细胞或动物或人体内的含量升高。显然，金属硫蛋白与应急蛋白质一样有应急的特性。本发明涉及的大量生产金属硫蛋白的方法是一种新型的能大量生产金属硫蛋白的方法。被动的、反复多次的、大量的、可接受的、使动物接触锌化合物而不是有毒的镉化合物产生大量的金属硫蛋白，而产生的金属硫蛋白是对人体有益无害的结合锌的锌金属硫蛋白是本发明的目的。
为了进一步说明和理解本发明，以下将详细描述本发明。
1957年Margoshes和Vallee在研究金属的生物学作用时，从积蓄Cd的器官马肾中分离出一种新的蛋白质，它含有丰富的巯基，能螯合大量金属离子。(Margoshes，M &Vallee，B.L.J.Am.Chem.Soc.79，41813-14，1957)1987年对该类蛋白质进行了明确的定义，称之为金属硫蛋白，简称MT(Metallothionein，)金属硫蛋白是指一类低分子量高巯基含量，能大量结合重金属离子的性能独特的蛋白质。它符合以下特征(1)低分子量(2)高金属含量(3)特征氨基酸组成(高半胱氨酸含量、不含芳香族氨基酸和组氨酸)(4)独特的氨基酸序列结构(半胱氨残酸基分布有特征性，如cys-x-cys)(5)金属硫醇盐的光谱特征(6)金属硫醇盐族结构金属硫蛋白含有61个氨基酸残基，其中有20个半胱氨酸残基，占氨基酸残基总量的33％。MT氨基酸序列具有如下特征，氨基末端都是乙酰蛋氨酸，羧基末端都是丙氨酸，所有20个Cys在多肽链中的相对位置不变。其中10个Cys残基是以5个Cys-x-Cys单位存在，7个Cys以Cys-Cys-x-Cys-Cys和Cys-Cys-x-Cys两种形式存在，另一个特点是其含有较多的赖氨酸(6-8个)和丝氨酸(7-10个)，缺乏芳香族氨基酸和组氨酸。
金属硫蛋白不含α-螺旋，无β-折叠，它以一种僵硬的构象存在，具有很强的抗热变性和抵抗胰酶消化的能力。其理化性质①分子量为6000-7000，②等电点在PH3.9-4.6范围，③与一般金属结合蛋白不同，由于MT的高金属含量及其可变性，蛋白纯的MT中结合的金属种类及各自含量都经常发生变化，但金属的总摩尔含量是相对恒定的，通常含7当量Zn(II)/Cd(II)，④重金离子与MT结合的相对亲和程度同与典型硫醇结合时一致，即Zn(II)＜Pb(II)＜Cd(II)＜Cu(I)＜Ag(II)，Hg(II)，Bi(II)。
MT广泛存在于动物体内，其结构的相似性表达了具有相似的生理功能。如MT的氨基酸顺序为兔MT-1 AC-MDPNCSCAABGSCTCATSCRCKECKCTSCKKSCCSCCPAGCTKCAOGCICKGASDKCSCCAMT-2 AC-MDPNCSCAADGSCTCATSCKCKECKCTSCKKSCCSCCPSGCAKCAOGCICKGASDKCSCCA马MT AC-MDPNCSCPTGGSCTCAGSCKCKECRCTSCKKSCCSSCCPGGCARCAQGCVCKGASDKCCSCA研究表明MT片断或人工合成的片断同样具有MT所特有的功能
1、H2N-K-C-T-C-C-A-OH2、H2N-A-C-K-D-C-K-C-T-OH3、H2N-S-C-T-C-T-S-S-C-A-OH4、H2N-G-C-S-K-C-A-Q-G-C-V-OH5、H2N-G-C-V-K-G-A-A-D-K-C-T-C-A-OHMT独特的结构决定了它具有极为重要的生理功能。
1、参予体内Zn、Cu等微量金属元素的代谢功能体外实验已经证实做为平衡调节因子，MT能在含Zn和Cu的金属结合酶或蛋白合成时供给金属离子；当细胞里Cu、Zn含量积累时，新合成的MT又能螯合过剩的金属离子。人体正常组织中MT与Zn浓度之间有明显的线性关系。ZnMT是肝中存在的主要化学形式。食物中Zn含量增加时，肝、肾和小肠中MTmRNA水平会明显增加；而饮食中缺Zn或MT合成受阻时，肝脏对Zn的摄入减少，机体出现缺Zn症状，所有这些结果表明MT可能参予Zn的代谢。大鼠在用大量Cu盐喂养时，差不多一半的Cu被肝脏吸收进入新合成的MT中。新生的动物肝脏中Cu含量比成年者高，并在大量的CuMT实验结果表明，MT在肠道中对Cu的代谢起着重要作用。Webb和Cain明确指出MT的初始功能是维持体内Zn和Cu的平衡。
2、重金属解毒功能MT的重金属解毒功能表现为高度智能化，即毒性越大的金属与MT的结合力越强。即Zn(II)＜Pb(II)＜Cd(II)＜Cu(I)＜Ag(II)，Hg(II)，Bi(II)。
3、清除自由基，抗辐射功能许多实验直接研究了MT与自由基的关系，实验证明MT能高效消除·OH自由基，对其他过氧自由基也有较强的消除作用。MT是已知的内源性自由基清除剂中清除·OH能力最强的，为GSH的1000倍。比SOD的活性更强。MT能修复DNA(基因)损伤，当MT浓度达13μM时能完全抑制·OH自由基对DNA降解，而GSH浓度达10mM时才能取得同等抑制效果。MT所具有的对自由基极强的清除能力，也表现在抗辐射方面，更重要的是它通过参与体内的自由基清除，从而维持机体内有利无害的生理性低水平的稳态平衡的自由基浓度发挥着重要的作用。
4.防治多种疾病目前已证明与自由基致病有关的疾病有动脉粥样硬化，脑血管病，冠心病，心肌梗塞，肝炎，脂肪肝，肝硬化，消化道炎症，溃疡，口腔及咽喉炎症，肺气肿，支气管哮喘，风湿病，红斑狼疮，类风湿性关节炎，肾炎，白内障等等。显然MT对上述疾病具有防治的作用。最新的研究证实，MT在预防和治疗糖尿病及其并发症方面发挥着积极的作用。
5.肿瘤的防治许多肿瘤与含氧自由基诱发DNA损伤及脂质过氧化有关。MT可以清除含氧自由基，因而可能防止癌症的形成与扩散。与此同时，MT能通过提高肿瘤组织对化放疗的敏感性以及降低化放疗的副作用和增加化放疗用量达到癌症的辅助治疗作用。
(J.H.R.Kagi and Y.Kojimn，Exper.Suppl.52，32-35，1987)(Vallee.BL，Neurochem-Int.1995 Jul；27(1)23-33)由于金属硫蛋白具有广泛的应用前景，因此大量生产金属硫蛋白的方法的发明具有极其重要的药用价值。同时也提高了动物肉资源开发的价值。
大量生产金属硫蛋白的方法其特征是用人工的方法使动物接触锌化合物后被诱导产生大量的金属硫蛋白。操作简便，接触可以是反复皮下注射或口服或腹腔注射。诱导剂可以是ZnCl2(1-4H2O)，ZnAc，ZnSO4(7H2O)，ZnO，和Zn(OH)2一种或多种。诱导剂量为1-500mg/Kg/每次，注射两次后动物即可产生金属硫蛋白。所得到的动物脏器，金属硫蛋白的含量为100μg-10mg/g。其中肝、肾和脑组织的含量较高。动物为可用于宰杀的动物如鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、兔等。而且宰杀后的动物肌肉组织中含有金属硫蛋白和锌，可用于加工成保健食品。
本发明的具体方法是选择健康的动物如家兔，称重，在规定的时间内，如每天一次或隔天一次，皮下注射锌化合物ZnAc，至少两次，锌化合物可以是ZnCl2(1-4H2O)，ZnAc，ZnSO4(7H2O)，ZnO，和Zn(OH)2一种或多种，锌化合物的量为1-500mg/Kg/每次，一般地在注射四次后，动物产生MT的能力达到高峰，宰杀后取其肝，脑等组织经本领域技术人员熟知的生物化学方法的分离提取和纯化，可得到金属硫蛋白。一般地，每克肝组织可得到100μg-10mg的金属硫蛋白。而且宰杀后的兔肌肉组织中含有金属硫蛋白和锌，可用于加工成保健食品。
实施例1选择健康的猪10头，称重，隔天一次，肌肉注射锌化合物ZnCl2(1-4H2O)，量为25mg/Kg/每次，同时，每天在饲料中加50mg/kg的ZnCl2(1-4H2O)，于第9天，行腹腔注射量为100mg/kg，宰杀，取其肝组织经分离提取和纯化，测得金属硫蛋白为1.4mg/g肝组织。而且宰杀后的猪肌肉组织中含有金属硫蛋白和锌，可用于加工成保健肉食品。
实施例2选择健康的羊10头，称重，隔天一次，皮下注射锌化合物ZnSO4(7H2O)，量为20mg/Kg/每次，三次后，于第4次行腹腔注射量为100mg/kg，宰杀，取其肝组织经分离提取和纯化，测得金属硫蛋白为1.0mg/g肝组织。而且宰杀后的羊肌肉组织中含有金属硫蛋白和锌，可用于加工成保健食品。
实施例3选择健康的家兔，称重，每天一次，皮下注射锌化合物Zn(OH)2，量为10mg/Kg/每次，三次后，于第4，第5次皮下注射ZnSO4(7H2O)，25mg/Kg/每次，第6次行腹腔注射量为100mg/kg，宰杀，取其肝组织经分离提取和纯化，测得金属硫蛋白为2.7mg/g肝组织。而且宰杀后的兔肌肉组织中含有金属硫蛋白和锌，可用于加工成保健食品。
实施例4选择健康的牛2头，称重，隔天一次，肌肉注射锌化合物ZnCl2(1-4H2O)，量为25mg/Kg/每次，四次后，于第5次行腹腔注射量为90mg/kg，宰杀，取其肝组织经分离提取和纯化，测得金属硫蛋白为0.8mg/g肝组织。而且宰杀后的牛肌肉组织中含有金属硫蛋白和锌，可用于加工成保健食品。
权利要求
1.大量生产金属硫蛋白的方法其特征是用人工的方法使动物接触锌化合物后被诱导产生大量的金属硫蛋白。
2.根据权利要求1所述，大量生产金属硫蛋白的方法其特征是诱导剂可以是ZnCl2(1-4H2O)，ZnAc，ZnSO4(7H2O)，ZnO，和Zn(OH)2。
3.根据权利要求1和2所述，大量生产金属硫蛋白的方法其特征是诱导剂量为1-500mg/Kg/每次，反复皮下注射或口服或肌肉注射或腹腔注射，注射两次后动物即可产生金属硫蛋白。
4.根据权利要求1、2和3所述，大量生产金属硫蛋白的方法其特征是所得到的动物脏器，金属硫蛋白的含量为100μg-10mg/g。其中肝、肾和脑组织的含量较高。
5.根据权利要求1、2、3和4所述，大量生产金属硫蛋白的方法其特征是动物为可用于宰杀的动物(如鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、兔等)。
6.根据权利要求1、2、3、4和5所述，大量生产金属硫蛋白的方法其特征是宰杀后的动物肌肉组织中含有金属硫蛋白和锌。
全文摘要
本发明提供一种制作方法,该方法采用锌化合物诱导活体动物,可以使动物产生大量的金属硫蛋白,动物被宰杀后,可从其肝脏,脑,肾,血液,肌肉组织经生物化学方法分离提取纯化出金属硫蛋白及其亚型,其中金属硫蛋白含量为100μg－10mg/g,肝、肾、脑组织中含量较高,可应用于生物制药工业和保健食品行业,发挥其特有的生物药理学功能。
文档编号C07K1/00GK1376719SQ0111002
公开日2002年10月30日 申请日期2001年3月26日 优先权日2001年3月26日
发明者刘彦斌 申请人:刘彦斌