专利名称：紫杉醇和厚叶蕨醇的层析分离方法
技术领域：
本发明涉及分离紫杉醇和紫杉醇类似物厚叶蕨醇(cephalomannin)，该分离由红豆杉属植物(Taxus)的植物提取物或其细胞培养物开始。具体地讲，是通过正相硅胶柱上用层析方法将厚叶蕨醇与紫杉醇分离。
紫杉醇的主要天然来源是太平洋浆果紫杉(短叶红豆杉)的树皮。还已发现紫杉醇存在于其它浆果紫杉的地上部分和根中，包括欧洲浆果紫杉(金黄欧洲红豆杉)、亚洲浆果紫杉(西藏红豆杉和中国红豆杉)，以及为观赏目的培育的紫杉树(例如，密生红豆杉)。
从天然来源中分离紫杉醇的方法复杂且成本高，这部分因为在植物材料中的浓度较低，还因为它的一种同类物厚叶蕨醇的存在。紫杉醇和厚叶蕨醇的浓度及其之间的比率依目标植物的种类和部位随植物材料而变化。一般来说，现已发现紫杉醇和厚叶蕨醇的含量范围分别为0.001％至0.08％和0.001％至0.22％(K.M.Witherup等，J.Nat.Prod.，53，1249，1990；R.G.Kelsey等，J.Nat.Prod.，55，912，1992；N.C.Wheeler等，J.Nat.Prod.，55，432，1992)。具体地讲，作为可再生的植物材料，密生红豆杉类是制备紫杉醇最常用的原料，与其它种相比其中含有的厚叶蕨醇的浓度最高。
即使是基于紫杉细胞培养物的紫杉醇制备技术，最近其已得到实质性的提高，避免了对成本高的植物材料的常规提取，除紫杉醇外，仍得到了相当量的厚叶蕨醇。
紫杉醇和厚叶蕨醇之间结构的差别仅在于化合物的侧链部分，因此给出了相似的化学性质。因此，这两种化合物具有非常相似的层析性质，因此将这些相关化合物彻底分离非常困难。人们已提出了一些层析方法，这些方法主要基于使用反相色谱或高成本的键合相柱(J.H.Cardellina，J.Liq.Chromatogr.，14，659，1991；S.L.Richheimer等，Anal.Chem.64，2323，1992；E.R.M.Wickremesinhe等，J.LiqChromatogr.，16，3263，1993；K.M.Witherup等，J.Liq.Chromatogr.，12，2117，1989)，但是这些方法不易于大的商业规模操作。因此，分离紫杉醇和厚叶蕨醇的方法仍具有极其重要的实践上的意义。
过去，基于这两种化合物对氧化剂的不同反应性，曾有人提出了紫杉醇和厚叶蕨醇的分离方法。发现存在于厚叶蕨醇的甲基巴豆酸残基的双键可以被四氧化锇氧化(D.G.I.Kingston等，J.Nat.Prod.，55，259，1992)或被臭氧氧化(J.T.Beckvermit等，J.Org.Chem.，61，9038，1996)，而紫杉醇在这些氧化反应期间不进行任何转变。另一研究考虑用溴处理紫杉醇和厚叶蕨醇的混合物(J.M.Rimoldi等，J.Nat.Prod.，59，167，1996)。用溴处理，在受控的温度和时间条件下进行，形成了二溴厚叶蕨醇，而紫杉醇不受此化学试剂的影响。但是，这些方法的缺点是使用如四氧化锇这样的毒性试剂，且在无论如何导致了厚叶蕨醇被破坏和转变为其衍生物，而只有通过困难的合成方法才能由这样的衍生物再生为厚叶蕨醇。因此，仍需要找到低成本的、简单、安全和有效的分离厚叶蕨醇和紫杉醇的方法。因此，本发明的主要目的是提供从其混合物或紫杉提取物中分离紫杉醇和厚叶蕨醇的简单方法。
本发明的原料可以只是任何比例的厚叶蕨醇和紫杉醇的混合物，或者是鲜或干的红豆杉的根、叶、枝、种子或其混合物的提取物。本发明的方法还可以包括由细胞培养物获得的提取物。这些原料是本领域技术人员已知的，故不需要在本文中进一步叙述。
所述提取物可以是粗或者纯的提取物，后者已经过常规溶剂处理并进行了初步的色谱纯化。这些技术也是本领域技术人员熟知的，故不需要在本文中进一步叙述。取决于用于制备的试验条件，原料可以是固体、浆状物或者半固体胶状物。在其溶解于本文中描述的溶剂之一后，该物质可以直接进行柱层析。
本发明的层析纯化，根据其组分使用占原料重量约50至100份的普通、正相硅胶。
用本发明溶剂进行的柱层析是快速的，不需要高压，在正常重力条件下进行。
表1显示了厚叶蕨醇和紫杉醇在薄层层析分析中用硅胶和本发明的系列溶剂的行为，使这两种化合物的分离是令人满意的。
表1紫杉醇和厚叶蕨醇在硅胶板上的Rf溶剂 R1R2紫杉醇厚叶蕨醇甲酸正丁酯H n-C4H90.17 0.12甲酸异丁酯H i-C4H90.20 0.15甲酸叔丁酯H t-C4H90.20 0.13甲酸正丁酯CH3n-C4H90.36 0.28甲酸仲丁酯CH3s-C4H90.35 0.24乙酸异丁酯CH3i-C4H90.31 0.19乙酸叔丁酯CH3t-C4H90.19 0.09乙酸苄基酯CH3PhCH20.28 0.16用本发明描述的溶剂在正相硅胶柱上通过层析分离紫杉醇和厚叶蕨醇有许多优点。
首先，通过柱层析得到了实际上不含厚叶蕨醇的紫杉醇，以及几乎不含紫杉醇的厚叶蕨醇。其次，正相硅胶的使用比文献中描述的反相硅胶的使用提供了相当的经济上的益处，第三，用一种溶剂进行柱洗脱允许其快速回收循环，不需要采取工业的连续制备相关操作中的分级蒸馏。原料中与紫杉醇和厚叶蕨醇同时存在的任何其它组分均可通过层析纯化除去。
将洗脱的级分真空蒸发至干，并用适宜的溶剂将残余物结晶，以所需的晶型获得紫杉醇和厚叶蕨醇。
因此，通过增加所得量的收率，并创立此抗肿瘤药的廉价的制备方法，本发明描述的方法为制备大量的不含厚叶蕨醇的紫杉醇提供了简单的解决方案。
实施例1由含厚叶蕨醇的密生红豆杉提取物中分离紫杉醇通过HPLC分析，发现由620kg密生红豆杉(全植物)按照V.Senilh等描述的方法(J.Nat.Prod.47，131，1984)制备的290g提取物含有183g紫杉醇和81g厚叶蕨醇。将此提取物溶解于3.5升乙酸叔丁酯中，并加样到含60kg硅胶的柱上。共洗脱出1200升的叔丁基。用350升溶剂洗脱后，得到400升含紫杉醇和少于3％厚叶蕨醇的级分，以及200升含厚叶蕨醇和少于3％紫杉醇的另一种级分。将这两种级分分别真空浓缩至干，并用己烷-丙酮将此残余物结晶。于是，获得了154g紫杉醇和70g厚叶蕨醇，它们的HPLC纯度大于99％，且它们的理化数值和光谱值与文献(G.N.Chmurny等，J.Nat.Prod.55，414，1992；C.J.Falzone等，Tetrahedron Letters，33，1169，1992；V.Senilh等，J.Nat.Prod.47，131，1984)的记载相符。
实施例2从其混合物中分离紫杉醇和厚叶蕨醇将含70g紫杉醇和30g厚叶蕨醇的混合物溶解于1.5升甲酸叔丁酯中，并上样到含10kg悬浮于同样溶剂的硅胶上。将此柱用甲酸叔丁酯洗脱，并在HPLC/TLC分析后合并级分。分别将含紫杉醇和厚叶蕨醇的级分浓缩至干，并用适当比例的丙酮和庚烷将这些残余物结晶，得到HPLC纯度超过99％的紫杉醇和厚叶蕨醇。
权利要求
1.分离紫杉醇和厚叶蕨醇的方法，其中包括获得含紫杉醇和厚叶蕨醇的原料；将原料溶解于具有如下结构式的溶剂中以形成混合物 其中R1是氢原子或甲基，而R2为含有4至7个碳原子的烷基或芳基烷基。将此混合物进行柱层析以获得紫杉醇的洗脱级分、厚叶蕨醇的洗脱级分和一种残余物；并分别干燥紫杉醇和厚叶蕨醇级分以分别获得独立的紫杉醇和厚叶蕨醇的结晶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述原料含有任何比例的厚叶蕨醇和紫杉醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述原料是鲜和干的红豆杉的根、叶、枝、种子或其混合物的提取物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述原料是得自红豆杉属物质的细胞培养物的提取物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述原料是固体、浆状物和半固体胶状物形式。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶剂结构包括R1为氢原子或甲基，而R2为正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
7.分离紫杉醇和厚叶蕨醇的方法，其中包括获得含紫杉醇和厚叶蕨醇的原料；将此原料溶解于下式结构的溶剂中以形成混合物 其中R1是氢原子或甲基，而R2为含有4至7个碳原子的烷基或芳烷基；将所述混合物用正相硅胶柱用上式的单一溶剂作为洗脱剂进行柱层析，得到紫杉醇的洗脱级分、厚叶蕨醇的洗脱级分和一种残余物；及分别干燥紫杉醇和厚叶蕨醇级分，以分别获得独立的紫杉醇和厚叶蕨醇的结晶形式。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述式的溶剂包括R1为氢原子或甲基，而R2为正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述硅胶的用量为原料的约50至100重量份。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述原料含有任何比例的厚叶蕨醇和紫杉醇。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述原料是鲜或干的红豆杉根、叶、枝、种子或其混合物的提取物。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述原料是由红豆杉属物质的细胞培养物获得的提取物。
13.根据权利要求7所述的方法，其中所述原料是固体、浆状物或半固体浆状物的形式。
14.权利要求7所述的方法，其中所述式的溶剂包括R1为氢原子或甲基，而R2是正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
全文摘要
分离紫杉醇和厚叶蕨醇以及其它相关化合物的方法，其中包括获得含紫杉醇和厚叶蕨醇的原料；将原料溶解于任何一种特定的溶剂如甲酸丁酯和乙酸丁酯中以形成混合物；将此混合物进行柱层析以获得紫杉醇的洗脱级分、厚叶蕨醇的洗脱级分和一种残余物；并分别干燥紫杉醇和厚叶蕨醇级分以分别获得独立的紫杉醇和厚叶蕨醇的结晶。
文档编号C07D305/14GK1396917SQ01804134
公开日2003年2月12日 申请日期2001年11月9日 优先权日2000年11月28日
发明者B·加贝塔, G·齐尼 申请人:因德纳有限公司