专利名称：高纯度植物单分子喜树碱的分离提取方法及其装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及天然药用植物喜树深加工领域，尤其涉及一种高纯度植物单分子喜树碱的分离提取方法及其装置。
背景技术：
喜树碱(Camptothecin，简写CPT)是从中国特有的珙桐科(Nyssaceae)旱莲属植物喜树(Camptotheca acuminata)中提取出来的一种五元环生物碱，是喜树中最主要的一类生物碱。自从1966年Wall首次报道关于生物碱喜树碱的分离、结构测定及强抗肿瘤活性以来，人们对生物碱喜树碱的研究产生了浓厚的兴趣。临床应用研究表明，这类生物碱具有较强的细胞毒活性，可通过作用于DNA拓扑异构酶I(topoisomerase I，topo I)抑制DNA复制、转录以及有丝分裂，而topoI是一种与细胞分裂密切相关的一种酶，阻断这种酶的产生即可阻止癌细胞的生长，可用于治疗多种恶性肿瘤，如骨癌、肝癌、膀胱癌和白血病等。
目前，国内从天然植物喜树中直接获得生物碱喜树碱粗提物的提取工艺较为简单，一般说来，粗提物产品的纯度比较低，虽然通过柱层析和重结晶精制，其纯度可进一步提高，甚至可高达98％左右，但得率大幅度下降，而且由于采用了层析柱，设备投资较大，操作烦琐，柱层析时还会使喜树碱容易被不可逆吸附在柱填料上而损失，并且由于喜树碱的不稳定性，在固体填料上还会发生降解反应，因而分离效率较低。为了更好地开发和利用我国丰富的喜树资源，对有效地分离喜树碱化合物的提取方法提出了更高的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离效率高、操作简便的高纯度植物单分子喜树碱的分离提取方法及其装置。
从植物喜树碱粗提物中分离高纯度植物单分子喜树碱的方法，它以行星式多层螺旋管离心分配色谱仪作为分离装置，并按以下步骤进行1)配置构成固定相、流动相的溶剂系统，待静止分层后，将上、下两相分开备用，以上相为固定相，下相为流动相；将配制好的固定相泵入或用气压方式压入并充满主机工作鼓，部分流动相溶解喜树碱粗提物；2)开启离心分配色谱仪，使其主机转动，然后以预定的流量泵入上述溶解的喜树碱粗提物和流动相；
3)收集洗脱液，根据检测谱图在流动相中收集单分子的喜树碱组分，所构成的两相溶剂系统由常温常压下呈液态的卤代烷烃、脂肪醇和水或磷酸钾缓冲溶液组成。
4)收集到的单分子喜树碱组分要立即进行减压浓缩、重结晶、双重水洗涤、冻干，然后置于干燥容器中，在避光的低温冷藏柜中保存。
行星式多层螺旋管离心分配色谱仪分离装置具有主机箱体、可旋转的多个主机工作鼓及与工作鼓连结的聚四氟乙烯(PTFE)引入引出管，每个工作鼓的旁侧还配置着可旋转的用来解绞引入引出管的解绞框架，引入引出管与每个工作鼓及其旁侧解绞框架依次按串联方式相连结，并最后通过主机中心轴引出机外。主机固定框架与电机的动力输出轴联结并带动主机固定框架转动，电机的转速可由变频控制器控制，中心轴的轴承设在主机固定框架上，中心轴同轴齿轮直接与每个工作鼓旋转轴同轴齿轮共享齿接，而中心轴同轴齿轮与每个解绞框架旋转轴同轴齿轮则通过一过桥齿轮联结。
所构成的两相溶剂系统由常温常压下呈液态的卤代烷烃、脂肪醇和水或磷酸钾缓冲溶液组成。卤代烷烃可以是二氯甲烷、三氯甲烷(氯仿)、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷中的任一种或任意种以任意比例混合的混合物，所述卤代烷烃以二氯甲烷、三氯甲烷(氯仿)、四氯化碳或上述任意两者等容积的混合物为最佳；脂肪醇可以是甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇中的任一种，所述脂肪醇以甲醇为最佳；卤代烷烃与脂肪醇的容积比为1∶0.0～1.2，其最佳比例为1∶0.4～1.0；水或磷酸钾缓冲溶液的用量应至少保证使上下相分层，其中磷酸钾缓冲溶液中钾盐的浓度范围可以为0.03～0.25mol/L，其最佳的浓度范围为0.07～0.2mol/L。
由于采用了上述技术方案，分离过程是在离心分配色谱仪的主机工作鼓中连续进行的，操作简便易行，有机溶剂负载量少，它不用任何固态的支撑物或载体，与柱层析等色谱方法比较，不存在固态载体所造成的样品吸附损耗、沾污和变性等问题。主机工作鼓作为分配色谱的分离柱，可按分离需要设置，以调节分离柱的不同容量；在主机运行状况下，多个工作鼓以行星式同时绕主机中心轴旋转，因而扩大了柱容量。此外，采用引入引出管穿过主机中心轴与工作鼓连接以及工作鼓与解绞管相互串接的解绞方式，避免了采用旋转密封接头容易泄漏和样品沾染的技术缺陷。所提取的喜树碱组分，经减压浓缩、重结晶、双重水洗涤、冻干，最后可获得无溶剂残留和农药残留的高纯度单分子喜树碱产品，其有效含量高达98％以上，是一种分离效率高、操作简便的提取方法。本方法适用于从各种规格的喜树碱粗提物中来分离制备高纯度的单分子喜树碱，其单台设备的制备量可高达二百克。
附图是行星式多层螺旋管离心分配色谱仪分离装置示意图。
图中，1主机箱体、2主机中心轴、3主机工作鼓、4引入引出管、5解绞框架、6主机固定框架、7三相电机、8变频控制器、9电机固定架、10，11，12中心轴轴承、13解绞管旋转轴轴承、14工作鼓旋转轴轴承、15，17中心轴同轴齿轮、16工作鼓旋转轴同轴齿轮、18过桥齿轮、19解绞框架旋转轴同轴齿轮、20地脚。
具体实施例方式
行星式多层螺旋管离心分配色谱仪分离装置包括主机箱体1、可旋转的多个主机工作鼓3及与工作鼓连结的聚四氟乙烯(PTFE)引入引出管4，每个工作鼓的旁侧还配置着可旋转的用来解绞引入引出管的解绞框架5，引入引出管与每个工作鼓及其旁侧解绞框架依次按串联方式相连结，并最后通过主机中心轴2引出机外。主机固定框架6与电机7的动力输出轴联结并带动主机固定框架转动，电机的转速可由变频控制器8控制。中心轴的轴承11、12设在主机固定框架上，中心轴同轴齿轮15直接与每个工作鼓旋转轴同轴齿轮16共享齿接，而中心轴同轴齿轮17与每个解绞框架旋转轴同轴齿轮19则通过一过桥齿轮18联结。
在主机运行状态下，绕其中心轴旋转的主机工作鼓的角速度为2ω，解绞框架只是绕中心轴按ω的角速度作反方向转动。
工作鼓配置数量为2～8个，采用各种规格的聚四氟乙烯(PTFE)管、不锈钢管或紫铜管多层缠绕，根据缠绕管管径的大小可设计成不同容量的工作鼓柱容量。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
取三氯甲烷(氯仿)150L、甲醇60L、水30L，于300L的混合釜中混匀，静置分层后，将上下两相分开备用。以上相作为固定相，将上相以50ml/min的流速泵入或用气压方式压入并充满主机工作鼓。称取喜树碱粗提物160克，用1000mL的下相溶液溶解，过滤备用。开启离心分配色谱仪，调整主机转速400rpm，然后以8mL/min的流量泵入下相(下相作为流动相)1小时使整个系统建立动态平衡，再以50ml/min的流量泵入上述溶解的喜树碱粗提物，待进样后改用余下的下相并以8mL/min的流量洗脱主机工作鼓内的喜树碱组分。根据检测谱图在洗脱的流动相中收集喜树碱组分，并确定其流出的时间段。分离收集的喜树碱组分经减压脱溶浓缩、重结晶、双重水洗涤、冻干，最后可得单分子喜树碱26g，其HPLC纯度高达98％以上。
取三氯甲烷(氯仿)40L、四氯化碳40L、甲醇60L、水20L，于300L的混合釜中混匀，静置分层后，将上下两相分开备用。以上相作为固定相，将上相以80ml/min的流速泵入或用气压方式压入并充满主机工作鼓。称取喜树碱粗提物250克，用2000mL的下相溶液溶解，过滤备用。开启离心分配色谱仪，调整主机转速400rpm，然后以20mL/min的流量泵入上述溶解的喜树碱粗提物，进样后维持流量不变，泵入下相(下相作为流动相)洗脱主机工作鼓内的喜树碱组分。根据检测谱图在洗脱的流动相中定时收集喜树碱组分，其流出时间段的确定同实施例1。同样，分离收集的喜树碱组分经一系列后处理，最后得单分子喜树碱约75g，其HPLC纯度高达98％以上。
取三氯甲烷(氯仿)400L、甲醇320L、水80L，于1000L的混合釜中混匀，静置分层后，将上下两相分开备用。以上相作为固定相，将上相以100ml/min的流速泵入或用气压方式压入并充满主机工作鼓。称取喜树碱粗提物550克，用3500mL的下相溶液溶解，过滤备用。以下同实施例3。最后可得单分子喜树碱约200g，其HPLC纯度高达98％以上。
权利要求
1.一种高纯度植物单分子喜树碱的分离提取方法，其特征在于它以行星式多层螺旋管离心分配色谱仪作为分离装置，并按以下步骤进行1)配置构成固定相、流动相的溶剂系统，待静止分层后，将上、下两相分开备用，以上相为固定相，下相为流动相；将配制好的固定相泵入或用气压方式压入并充满主机工作鼓，部分流动相溶解喜树碱粗提物；2)开启离心分配色谱仪，使其主机转动，然后以预定的流量泵入上述溶解的喜树碱粗提物和流动相；3)收集洗脱液，根据检测谱图在流动相中收集单分子的喜树碱组分，所构成的两相溶剂系统由常温常压下呈液态的卤代烷烃、脂肪醇和水或磷酸钾缓冲溶液组成。4)收集到的单分子喜树碱组分要立即进行减压浓缩、重结晶、双重水洗涤、冻干，然后置于干燥容器中，在避光的低温冷藏柜中保存。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度植物单分子喜树碱的分离提取方法，其特征在于所说的卤代烷烃为二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷中的任一种或任意种以任意比例混合的混合物。
3.根据权利要求2所述的一种高纯度植物单分子喜树碱的分离提取方法，其特征在于所说卤代烷烃为二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳或上述任意两者等容积的混合物。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度植物单分子喜树碱的分离提取方法，其特征在于所说的脂肪醇是甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇中的任一种，卤代烷烃与脂肪醇的容积比为1∶0.0～1.2，水或磷酸钾缓冲溶液的用量应至少保证使上下相分层，其中磷酸钾缓冲溶液中钾盐的浓度范围可以为0.03～0.25mol/L。
5.根据权利要求4所述的一种高纯度植物单分子喜树碱的分离提取方法，其特征在于所说脂肪醇为甲醇，卤代烷烃与脂肪醇容积比的比例为1∶0.4～1.0，所述磷酸钾缓冲溶液中钾盐的浓度范围为0.07～0.2mol/L。
6.一种行星式多层螺旋管离心分配色谱仪分离装置，其特征在于它具有主机箱体[1]、可旋转的多个主机工作鼓[3]及与工作鼓连结的聚四氟乙烯(PTFE)引入引出管[4]，每个工作鼓的旁侧还配置着可旋转的用来解绞引入引出管的解绞框架[5]，引入引出管与每个工作鼓及其旁侧解绞框架依次按串联方式相连结，并最后通过主机中心轴[2]引出机外。主机固定框架[6]与电机[7]的动力输出轴联结并带动主机固定框架转动，电机的转速可由变频控制器[8]控制，中心轴的轴承[11]、[12]设在主机固定框架上，中心轴同轴齿轮[15]直接与每个工作鼓旋转轴同轴齿轮[16]共享齿接，而中心轴同轴齿轮[17]与每个解绞框架旋转轴同轴齿轮[19]则通过一过桥齿轮[18]联结。
7.根据权利要求6所述的一种行星式多层螺旋管离心分配色谱仪分离装置，其特征在于所说的主机工作鼓配置数量为2～8个。
8.根据权利要求6所述的一种行星式多层螺旋管离心分配色谱仪分离装置，其特征在于所说的工作鼓采用聚四氟乙烯管、不锈钢管或紫铜管多层缠绕。
9.根据权利要求6所述的一种行星式多层螺旋管离心分配色谱仪分离装置，其特征在于在主机运行状态下，绕其中心轴旋转的主机工作鼓的角速度为2ω，解绞框架只是绕中心轴按ω的角速度作反方向转动。
全文摘要
本发明公开了一种高纯度植物单分子喜树碱的分离提取方法及其装置。它以行星式多层螺旋管离心分配色谱仪作为分离设备,其中包括配制构成固定相、流动相的溶剂系统;将配制好的固定相泵入或用气压方式压入并充满主机工作鼓;使其主机转动,然后以预定的流量泵入溶解的喜树碱粗提物和流动相;根据检测谱图在流动相中收集单分子的喜树碱组分。所构成的两相溶剂系统由常温常压下呈液态的卤代烷烃、脂肪醇和水或磷酸钾缓冲溶液组成,并以上相为固定相,下相为流动相。本发明提供的分离提取方法,操作简便易行,有机溶剂负载量少,分离效率高,其单台设备的制备量可高达二百克。所获得无溶剂残留和农药残留的高纯度单分子喜树碱产品,其有效含量高达98%以上。
文档编号C07D491/00GK1373131SQ0211109
公开日2002年10月9日 申请日期2002年3月18日 优先权日2002年3月18日
发明者陈平 申请人:浙江大学