专利名称：芍药中甙类化合物单体、提取和分离的方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体地说是一种芍药中甙类化合物单体，及其提取和分离的方法。所述的芍药中甙类化合物单体，包括芍药甙单体、芍药内酯甙(albiflorin)单体、苯甲酰芍药甙(benzoylpaeoniflorin)单体和羥基芍药甙(oxypaeoniflorin)单体，其中芍药甙单体含量在90％以上，符合一类植物类新药的纯度要求。
背景技术：
白芍或赤芍是一种常用的中药，临床应用已经有几千年的历史，在《神农本草经》中就列为中品，具有平肝止痛，养血调经，敛阴止汗的攻效，主冶头痛眩晕，胁痛，腹痛，四肢挛痛，血虚委黄，月经不调，自汗，盗汗。随着现代化学和药理的研究，它的化学成分和药理作用都已比较清楚，但它的甙类化合物中的主要成分芍药甙(paeoniflorin)只有标准品供药品检验之用，并没有形成大规模商品化的生产。现有的一个二类新药也只是一个芍药的提取物，其含芍药总甙大于50％。徐淑云等人曾报道白芍有效成份的提取工艺(CN 88104779.9)，白芍用乙醇提取、浓缩、稀释中和、碳酸氢钠溶液提取，再乙酸乙酯萃取，浓缩干燥，得率约3％，芍药甙含量大于60％。赵新先等人报道了一种提取白芍总甙的新方法(CN 97101960.6)，白芍用40-95％醇-水溶液加热回流，浓缩过滤，滤液用稀碱调至pH3-9，醇脂溶液萃取，浓缩干燥，收率为5-7％。但上述二种方法所获产品都是芍药总甙的混和物，并不是单体化合物。
发明内容
本发明目的是提供一种芍药中甙类化合物单体。包括芍药甙单体、芍药内酯甙单体、苯甲酰召药甙单体和/或羥基芍药甙单体，其中芍药甙单体含量在90％
以上，以符合一类植物类新药的纯度要求。
本发明的另一目的是提供一种上述芍药中甙类化合物单体的纯化提取方法，尤其是指含量在90％以上芍药甙单体的纯化提取方法。是为了解决现有提取、纯化技术中所存在的问题，本发明的方法主要应用分配色谱的方法。
本发明是一种芍药中甙类化合物单体。所述的芍药中甙类化合物单体是指芍药甙单体、芍药内酯甙单体、苯甲酰召药甙单体或羥基芍药甙的单体，其中芍药甙单体纯度(含量)在90％以上，符合一类植物类新药的纯度要求。
本发明的一种上述芍药中甙类化合物单体的纯化提取方法。是以白芍或赤芍为原料，将白芍或赤芍放到醇水溶液中溶胀，加热回流0.5～5小时，过滤，浓缩至浸膏，用丙酮溶液超声提取，提取液浓缩，浓缩物中拌入硅胶粉，浓缩成干样，然后上真空色谱柱，再用有机溶剂洗脱，得到芍药甙的初品，合并初品，纯度大约在75％左右，同上重复做成干样，用硅胶柱分离，用有机溶剂体系洗脱，可加入适量的水，如加入0-5％重量的水，作1-6次分配色谱，得到芍药甙(paeoniflorin)的纯度可以在90％左右，得率约在1.2％左右。可以用本方法进一步分离得到芍药甙的标准品。
同时，分配色谱时先于芍药甙成分下柱的组份中可以进行1-6次反复的柱色谱的分离得到苯甲酰芍药甙(benzoylpaeoniflorin)；后于芍药甙成分下柱的组份再进行1-6次反复的色谱后，分别得到芍药内酯甙(albiflorin)和羟基芍药甙(oxypaeoniflorin)。苯甲酰芍药甙、芍药内酯甙和羟基芍药甙可以供控制芍药甙中杂质含量之用。
上述真空色谱和分配色谱时，均以含0-5％重量的水的有机溶剂的梯度洗脱为好。
白芍甙类成分分离纯化的典型流程如附图中
图1所示。
芍药甙单体的纯化提取方法中，所述的醇水溶液中醇的浓度在30％～95％，白芍或赤芍与醇水溶液的重量比为1∶1～10，较好的比例为1∶3～10，进一步提高比例对结果没有影响；浸膏与丙酮的重量比为1∶1～20，合适时比例为1∶2～10；浓缩物与硅胶粉的重量比为1∶1～6；真空色谱柱时，通常真空度为0.02～0.098Mpa，洗脱所用的有机溶剂是低碳链的卤代烷、低碳链的醇、低碳链的酯，或其中二类溶剂的混合物。低碳链的卤代烷指卤代甲烷、卤代乙烷等，如三氨甲烷、二氯甲烷、二溴乙烷、三氯甲烷等，低碳链的醇指C1-3的醇，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇，低碳链的酯指C1-5的酯，如甲酸甲酯或乙酯、乙酸甲酯或乙酯等。当使用低碳链的卤代烷和低碳链的醇或低碳链的酯的混合溶剂时，低碳链的卤代烷、低碳链的醇或低碳链的酯、及水的重量比为1∶1∶0-5。
上述色谱时，先于芍药甙成分下柱的组份，含有苯甲酰芍药甙，合并后，进行反复的柱色谱的梯度分离，有机溶剂作分配色谱，低碳链的卤代烷和低碳链的醇的的重量比为50-15∶1，从50∶1，25∶1，20∶1，15∶1的梯度比为好，可加入1％的水，可以得到苯甲酰芍药甙(benzoylpaeoniflorin)的成分。
后于芍药甙成分下柱的组份中含有芍药内酯甙和羟基芍药甙的成分，合并后，反复上硅胶柱色谱后，用低碳链的卤代烷和低碳链的醇的混合溶剂梯度洗脱，推荐低碳链的卤代烷与低碳链的醇的重量比15-1∶1，以15∶1，10∶1，8∶1，5∶1，4∶1，3∶1，2∶1的梯度比为好，可以分别得到芍药内酯甙(albiflorin)和羟基芍药甙(oxypaeoniflorin)的成分。
芍药甙是芍药中的最主要的活性成分，其他的甙类成分是次要的成分或者可以说是杂质成分，根据新药申报的要求必需控制其含量限度，所以上述方法提取分离的芍药内酯甙，苯甲酰芍药甙，羟基芍药甙可以作为标准对照品控制芍药甙的杂质含量。
本发明应用分配色谱的方法，可以大量分离得到芍药甙成分，含量在90％以上，可以符合一类植物类新药的纯度要求，同时可以进一步分离得到芍药内酯甙(albiflorin)，苯甲酰召药甙(benzoylpaeoniflorin)和羥基芍药甙(oxypaeoniflorin)。方法简单可行，成本较低，得率较高，易于掌握，适合工业化生产。
具体实施例方式
通过下述实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例1取生白芍或赤芍1kg饮片，用30％乙醇液加热提取两次，每次提取1小时，过滤，回收乙醇至无醇味，得芍药浸膏约400克左右，取100克浸膏，用三倍量的丙酮超声提取30分钟，提取两次，合并丙酮提取液，拌入适量的硅胶粉(3～5倍量)，做成干样，上真空色谱柱，用二氯甲烷或二氯乙烷和甲醇或乙醇体系的溶剂梯度洗脱(重量比为50∶1，25∶1，15∶1，10∶1，8∶1，5∶1，2.5∶1，1∶1)，得到芍药甙的初品，纯度大约在75％左右，再把这些初品合并起来，与适量硅胶拌匀，做成干样，用硅胶柱分离，用二氯甲烷和甲醇的体系，加入1％的水，作分配色谱，梯度洗脱，二氯甲烷或二氯乙烷与甲醇或乙醇的比例从20∶1，15∶1，12∶1，10∶1，8∶1，5∶1，得到芍药甙(paeoniflorin)，纯度在90％左右，得率约在1.2％～1.5％。可以用本方法进一步分离得到芍药甙的标准品。
先于芍药甙成分下柱的组份，含有苯甲酰芍药甙，合并后，可以再进行反复的柱色谱的梯度分离，二氯甲烷或二氯乙烷与甲醇或乙醇的重量比从50∶1，25∶1，20∶1，15∶1，加入1％的水作分配色谱，得到苯甲酰芍药甙(benzoylpaeoniflorin)的成分。后于芍药甙成分下柱的组份中含有芍药内酯甙和羟基芍药甙的成分，合并后，反复上硅胶柱色谱后，梯度洗脱，二氯甲烷与甲醇的重量比从15∶1，10∶1，8∶1，5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，得到芍药内酯甙(albiflorin)和羟基芍药甙(oxypaeoniflorin)的成分。
实施例2取生白芍1kg饮片，用95％乙醇液加热提取两次，每次提取3小时，过滤，回收乙醇至无醇味，得芍药浸膏约400克左右，取100克浸膏，用五倍量的丙酮超声提取60分钟，提取两次，合并丙酮提取液，拌入适量的硅胶粉(3～5倍量)，做成干样，上真空色谱柱，用二氯甲烷和甲醇或乙酸乙酯体系的溶剂梯度洗脱(重量比50∶1，25∶1，15∶1，10∶1，8∶1，5∶1，2.5∶1，1∶1)，可以得到芍药甙的初品，纯度大约在75％左右，再把这些初品合并起来，与适量硅胶拌匀，做成干样，用硅胶柱分离，用二氯甲烷和甲醇的体系，加入1％的水，作分配色谱，梯度洗脱(二氯甲烷与甲醇的重量比20∶1，15∶1，12∶1，10∶1，8∶1，5∶1)，可以得到芍药甙(paeoniflorin)，纯度在90％左右，得率约在1.2％～1.5％。可以用本方法进一步分离得到芍药甙的标准品。先于芍药甙成分下柱的组份，含有苯甲酰芍药甙，合并后，可以再进行反复的柱色谱的梯度分离，二氯甲烷与甲醇的重量比50∶1，25∶1，20∶1，15∶1，加入1％的水作分配色谱，可以得到苯甲酰芍药甙(benzoylpaeoniflorin)的成分。后于芍药甙成分下柱的组份中含有芍药内酯甙和羟基芍药甙的成分，合并后，反复上硅胶柱色谱后，梯度洗脱，二氯甲烷与甲醇的比例从15∶1，10∶1，8∶1，5∶1，4∶1，3∶1，2∶1可以得到芍药内酯甙(albiflorin)和羟基芍药甙(oxypaeoniflorin)的成分。
实施例3 对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的影响受试物芍药甙(NN002)阳性对照乙酰水杨酸致炎物角叉菜胶实验动物Wistar大鼠，体重250g-300g，雌雄各半。
实验方法排水法(陈奇主编中药药理研究方法学人民卫生出版社1993年)测定鼠爪体积。
取48只大鼠，雌雄各半，体重250g-300g，随机分为6组，每组8只，即生理盐水对照组、乙酰水杨酸对照组、NN00210mg/kg、50mg/kg剂量组。
除乙酰水杨酸对照组以150mg/kg剂量在致炎前1小时灌胃给药一次外，其余实验组均腹腔注射给药，每天一次，连续5天。
末次给药后1小时足跖皮下注射1％角叉菜胶(0.1m1/只)致大鼠足跖肿胀，用毛细管放大装置测足跖容积，以足跖致炎前后容积差值为炎症肿胀度。并于注射后1小时开始测定足跖容积变化，连续观察7小时。
观察指标肿胀率％＝(致炎后足容积一致炎前足容积)/致炎前足容积×100％；抑制率％＝(对照组平均肿胀率一给药组平均肿胀率)/对照组平均肿胀率×100％统计方法数据输入Excel表，采用成组t检验进行显著性检验。
实验结果
表1受试物对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的作用
注*，P＜0.05；**P＜0.01。括号内数字为肿胀抑制率由表1可知，乙酰水杨酸自1小时起至7小时的实验全过程均对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀呈抑制作用，抑制率约在30-70％，与生理盐水对照组相比，在2、3小时有统计学显著性差异(p＜0.05)，4、5小时有统计学非常显著性差异(p＜0.01)；NN002在4小时后呈现对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀有抑制作用的趋势，抑制率最高约40％，与对照组相比，其10mg/kg×5d组在5、7小时，50mg/kg×5d组在4、5、7小时对肿胀的抑制作用有统计学显著性差(p＜0.05)。
实验结论与分析抗炎药物、抗风湿性关节炎药物的药效学评价一般选用以血管通透性为主要改变的急性炎症模型，角叉菜胶为常用的致炎剂，其所致肿胀模型可靠，差异性小，敏感性及重复性高。测定肿胀程度的排水法简便、稳定且灵敏度高。本实验采用上述常用模型评价NN002对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的作用。
初步实验结果提示，在所用的剂量范围内，NN002对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀有抑制作用，其作用较乙酰水杨酸慢而持久。
权利要求
1.一种从芍药中提取纯化所得的甙类化合物单体，其特征是所述的芍药中甙类化合物单体是芍药甙单体、芍药内酯甙单体、苯甲酰芍药甙单体或羥基芍药甙的单体，其中芍药甙单体纯度在90％以上。
2.如权利要求1所述的一种从芍药中纯化提取甙类化合物单体的方法，其特征是采用如下方法1)将白芍或赤芍放到醇水溶液中溶胀，加热回流0.5～5小时，过滤，浓缩至浸膏，用丙酮溶液超声提取，提取液浓缩，浓缩物中拌入硅胶粉，浓缩成干样，然后上真空色谱柱，再用有机溶剂洗脱，得到芍药甙的初品，合并初品重复做成干样，用硅胶柱分离，再进行1-6次分配色谱，得芍药甙单体；2)分配色谱时先于芍药甙成分下柱的组份进行1-6次反复的柱色谱的分离得到苯甲酰芍药甙；3)后于芍药甙成分下柱的组份再进行1-6次反复的色谱后，分别得到芍药内酯甙和羟基芍药甙；上述硅胶柱分离或分配色谱中均用含0-5％重量的水的有机溶剂体系洗脱。
3.如权利要求2所述的一种从芍药中纯化提取芍药甙的方法，其特征是所述的醇水溶液中醇水溶液中醇的浓度在30％～95％，白芍或赤芍与醇水溶液的重量比为1∶1～10。
4.如权利要求2所述的一种从芍药中纯化提取芍药甙的方法，其特征是所述的浸膏与丙酮的重量比为1∶1～20；浓缩物与硅胶粉的重量比为1∶1～6。
5.如权利要求2所述的一种从芍药中纯化提取芍药甙的方法，其特征是所述的硅胶柱分离或分配色谱中均用含0-5％重量的水的有机溶剂体系进行梯度洗脱。
6.如权利要求2所述的一种从芍药中纯化提取芍药甙的方法，其特征是所述的洗脱所用的有机溶剂是低碳链的卤代烷、低碳链的醇、低碳链的酯，或其中二类溶剂的混合物。低碳链的卤代烷指卤代甲烷、卤代乙烷等，如三氯甲烷、二氯甲烷、二溴乙烷、三溴甲烷等，低碳链的醇指C1-3的醇，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇，低碳链的酯指C1-5的酯，如甲酸甲酯或乙酯、乙酸甲酯或乙酯等。
7.如权利要求2所述的一种从芍药中纯化提取芍药甙的方法，其特征是所述的洗脱使用低碳链的卤代烷和低碳链的醇或低碳链的酯的混合溶剂时，低碳链的卤代烷、低碳链的醇或低碳链的酯、及水的重量比为1∶1∶0-5。
全文摘要
本发明涉及一种芍药中甙类化合物单体、及其提取和分离的方法。所述的芍药中甙类化合物单体，包括芍药甙单体、芍药内酯甙单体、苯甲酰召药甙单体和羟基芍药甙单体，其中芍药甙单体含量90％以上，符合一类植物类新药的纯度要求。该方法系将白芍或赤芍在醇水溶液中溶胀，加热回流，浓缩至浸膏，用丙酮溶液超声提取，浓缩，拌入胶粉，浓缩成干样，上真空色谱柱，洗脱，得初品，同上重复做成干样，用硅胶柱分离，洗脱，分配色谱。方法简单可行，成本较低，得率较高，适合工业化生产。
文档编号C07H17/065GK1420122SQ0211097
公开日2003年5月28日 申请日期2002年3月7日 优先权日2002年3月7日
发明者朱静建, 江寒沁 申请人:上海中药创新研究中心