用于植物中产生性能的手段和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及农业领域，甚至更特别地涉及改 善植物产量的领域。本发明提供可以用来增强植物和作物中产量的嵌合基因和构建体。
[0002] 发明简介
[0003] 自农业和园艺学伊始，作物栽培中就存在改善植物性状的需要。育种策略促进了 多种作物特性以经受生物性和非生物胁迫、改善养分使用效率及改变作物其他内在具体参 数，即通过应用技术进步增加产量。在正在到来的数年中，人类的重大挑战将是在不进一步 削弱地球环境系统的完整性情况下满足未来的食物需要。农业系统已经是全球环境劣化的 主要力量，但是人口增长和高热量和高肉类膳食消费量日益增加预计使人类食物消费量到 2050年为止翻一番。作为对这些压力的回应，日益关注'可持续强化'作为表现欠佳背景下 增加产量的手段，同时减少农业系统的环境影响。如今，常规的作物及园艺学改良手段利用 选择性育种技术以鉴定具有受欢迎特性的植物。分子生物学进展已经允改以特定方式改良 植物的种质。例如，修饰单个基因在几种情况下导致产量或产量相关性状显著增长。
[0004] 细胞色素 P450单加氧酶属于参与多种类型的分子生物合成和脱毒的血红素依 赖性酶超家族。众多细胞色素 P450介导的反应产生在植物中控制细胞扩展所必需的产 物。CYP78A5基因是在营养性和生殖性苗顶端分生组织的周围区域中强烈表达的细胞色素 P450 单加氧酶基因 （Zondlo SC 和 Irish VF (1999) The Plant Journal 19(3)，259-268)。 CYP78A5的过量表达影响多种细胞类型，造成茎扭曲和扭结及花发育缺陷。此外，CYP78A5 的组成型过量表达在转化的植物中导致更小的叶。在本发明中，我们令人惊讶地显示，其中 玉米CYP78A5受玉米GA2氧化酶启动子控制的嵌合基因构建体在玉米中导致叶尺寸增加超 过30%。这种新性状可以用于在植物、尤其作物如例如禾谷植物中增加产量。
[0005] MM
[0006] 图1 :从GRMZM2G031724衍生的GA2氧化酶启动子的序列，attBl和attB2位点加 下划线（SEQ ID N0:1)
[0007] 图2 :从KLUH基因（GRMZM2G167986)的序列、附加的attBl和attB2位点加下划 线（SEQ ID NO:2)
[0008] 图3 :pBb42GW7载体的结构
[0009] 图4 :含有GA2氧化酶启动子和KLUH基因的表达克隆的结构。
[0010] 图5 :"与KLUH基因（GRMZM2G167986)有效连接的GA2氧化酶启动子 (GRMZM2G031724)"的所得嵌合基因序列（SEQIDN0 :3)，所述嵌合基因合并入植物表达载 体中。
[0011] 图6 :140_04中的叶伸长率。R代表转基因（抗性）植物，S代表非转基因（敏感） 植物。
[0012] 图7 :140_05中的叶伸长率。R代表转基因（抗性）植物，S代表非转基因（敏感） 植物。
[0013] S 8:140 01的叶4的对比KLUH表达结果。R代表转基因植物，S表示非转基因植 物。
[0014] 图9 :139_01的叶4的对比KLUH表达结果。R代表转基因植物，S表示非转基因植 物。
[0015] 图10:GA2ox: :KLUH中的分裂区尺寸时程。柱状图显示裂区的尺寸如何在叶4生长 期间改变。线性曲线显示叶4在相同时间点时的叶伸长率。S表示野生型（左侧柱状图）； R表示转基因 GA2〇X: :KLUH的抗性植物（右侧柱状图）。星号表示〈0. 01
[0016] 图11:杂夺GA20X: :KLUH xUBIL: :GA200X和其相应亲本的表型。A.在播种后30 天的籽苗。箭头表示叶4 ;B.在115天时充分长成的植物；C.生长速率或LER(Y-轴：mm/h 和X-轴叶4生长天数）。
[0017] 胤II:在轻度干旱胁迫下携带嵌合基因 GA2ox: :KLUH的转基因玉米植物的生长。 W表示在充分浇水条件下的植物；D表示在轻度干旱胁迫下的植物。R和S指抗性植物和敏 感植物。
[0018] 发明详沐
[0019] 正在生长的玉米叶提供了一种研究细胞分裂和细胞扩张在器官尺寸控制中作用 的优异模型系统，因为这两种过程在生长区内部空间上独立地发生。在玉米籽苗中，第四叶 一旦从周围较老叶的鞘钻出后就以最大速率生长。其生长区位于叶基部，这意味着该叶不 得不从叶鞘中剖取，以取得生长区。以这种方式，第四叶的生长区可以容易地按高空间分离 度（high spatial resolution)采样，原因在于正在生长的玉米叶尺寸相对大。
[0020] 在本发明中，我们已经证实众多转录物在构成一个区的不同样品内部显示差异性 表达，这提示生长区内部的差异。类似地，与更远端部分相比，生长调节激素茁长素和细胞 分裂素在分裂区的基部更高（Nelissen等人，2012, Curr. Biol)。已进行的高分辨率转录 组研究允许我们鉴定在整个生长区具有极不同表达谱的基因。在本发明中，我们构建了嵌 合基因，所述嵌合基因包含与KLUH基因的核苷酸序列有效连接的植物GA2氧化酶基因启动 子。在我们的例举实施方案中，我们显示这种嵌合基因-在植物中表达时-导致30%的 叶尺寸增加。在不将本发明限于特定机制，我们认为这种嵌合基因在植物中表达时发挥其 有益作用的一种方式是，在生长区中延长了 KLUH基因或具有至少55%氨基酸同一性的功 能同源物的表达（即，在正在分裂的细胞中使KLUH基因表达保持活跃的时间比KLUH基因 在其自身启动子控制下表达的时间更长）。进一步根据我们的非限制假设，认为KLUH在生 长区内部的扩展（或延长）表达（如与KLUH基因在其自身启动子控制下的表达相比）导 致刺激额外的分裂并因此导致更高的作物产量。
[0021] 因此在第一实施方案中，本发明提供一种嵌合基因构建体，所述嵌合基因构建体 包含以下有效连接的DNA元件：a)植物GA2氧化酶基因的启动子区，b)编码植物CYP78A5 蛋白或具有至少55%氨基酸同一性的功能性直向同源物的DNA区域和c)包含在植物细胞 中有功能的转录终止信号和多聚腺苷化信号的3'末端区。
[0022] 在一个具体实施方案中，植物GA2氧化酶基因的启动子区在正在分裂的细胞中有 活性。在又一个具体实施方案中，植物GA2氧化酶基因的启动子区在植物器官（例如，叶） 的生长区中有活性。在又一个具体实施方案中，植物GA2氧化酶基因的启动子区在叶的生 长区中有活性。在又一个具体实施方案中，植物GA2氧化酶启动子在活跃分裂的植物组织 中有活性。在另一个具体实施方案中，植物GA2氧化酶启动子在穗轴（例如玉蜀黍（Zea mays)穗轴）中有活性。在又一个具体实施方案中，植物GA2氧化酶启动子在苗顶端分生组 织（SAM)中有活性。在又一个具体实施方案中，植物GA2氧化酶启动子在植物胚中有活性。
[0023] 可以理解，植物GA2氧化酶基因的启动子（例如器官特异性（如在叶、穗轴、胚或 SAM中））是该基因起始密码子上游的由约1000-2500bp、优选地1000-2000bp、更优选地 1000-1500bp组成的片段。GA2氧化酶是在本领域中称作赤霉素2-氧化酶。图1中描述了 GA2氧化酶启动子的代表性非限制性例子。在本发明的实施例7中描述了 GA2氧化酶启动 子的其他例子。
[0024] 植物KLUH基因在本领域又命名为CYP78A5。CYP78A5是一种细胞色素 P450氧化 酶。图2中描述了来自玉米的CYP78A5的代表性非限制成员。在本发明的实施例8中描述 了 CYP78A5直向同源物基因的其他例子。
[0025] 在本发明中，词"KLUH"或"CYP78A5"互换使用。术语"KLUH样"或"CYP78A5样"用 来限定KLUH(或CYP78A5)的功能性直向同源物。根据现有技术（Nelson DR(2006)，Methods Mol Biol, 320:1-10)，具有至少55%氨基酸同一性的KLUH(或CYP78A5)直向同源物属于相 同的细胞色素 P450氧化酶功能性聚类，并且因此在植物中具有相同功能。因此在一个具体 实施方案中，编码植物CYP78A5蛋白或具有至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至 少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%氨基酸同一性的功能性直向同源物的 DNA区域可以在本发明中用来嵌合基因。
[0026] 可以理解，特定嵌合基因可以用作不同植物物种中的性状并且植物特异性GA2氧 化酶启动子在多于一个植物物种中有活性。
[0027] 在本发明中，"植物GA2氧化酶启动子"包含调节元件，其介导KLUH编码序列区段 或具有至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%同一性的功能性直向同源物在植物细胞中的表达。为了在植物中表达，核 酸分子必须有效连接于合适的植物GA2氧化酶启动子，所述启动子使KLUH基因或具有至 少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少 95 %蛋白质同一性的功能性直向同源物在正确时间点并以要求的空间表达模式在生长区 (或细胞分裂区）中表达。
[0028] 为了鉴定功能等同的植物GA2氧化酶启动子（例如在其他植物属或其他植物物种 中），可以通过以下方式分析候选GA2氧化酶启动子的启动子强度和/或表达模式：将启动 子与报道基因有效连接并分析报道基因在植物中的表达水平和模式。合适的熟知报道基 因包括例如葡糖醛酸糖苷酶；半乳糖苷酶或任何萦光蛋白。启动子活性通过测量 β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。备选地，也可以使用本领域已知 的方法，如具有放射自显影图密度计分析的Northern印迹法、定量实时PCR或RT-PCR (Heid 等人，1996Genome Methods 6 :986-994)，通过定量mRNA水平或通过核酸的mRNA水平与持 家基因（如18SrRNA)的mRNA水平比较，分析启动子强度。
[0029] 如本文中所用的术语"有效连接"指启动子序列（这里，GA2氧化酶启动子）与目 的基因（这里，KLUH基因或如上文定义的其功能同源物）之间功能性连接，从而GA2氧化 酶启动子序列能够启动目的KLUH基因（或其功能同源物）转录。
[0030] "嵌合基因"或"嵌合构建体"是重组核酸序列，其中启动子或调节性核酸序列与编 码mRNA的核酸序列有效连接或结合，从而调节性核酸序列能够调节所结合的核酸编码序 列的转录或表达。嵌合基因的调节性核酸序列正常情况下并非如自然界中那样的与结合的 核酸序列有效连接。
[0031] 术语"终止子"包括这样的控制序列，其是位于转录单位末端的DNA序列，所述DNA 序列发出将初级转录物3'加工和多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以从天然基 因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。待添加的终止子可以源自例如胭脂碱合酶基因 或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一种植物基因或较不优选地来自任何其他真核基因。
[0032] 在又一个实施方案中，本发明提供包含嵌合基因构建体的重组载体，所述嵌合基 因构建体包含以下有效连接的DNA元件：a)植物GA2氧化酶基因的启动子区，b)编码植物 CYP78A5蛋白或具有至少55%氨基酸同一性的功能性直向同源物的DNA区域和c)包含在 植物细胞中有功能的转录终止信号和多聚腺苷化信号的3'末端区。
[0033] 在又一个实施方案中本发明提供包含嵌合基因构建体的植物、植物细胞或植物种 子，所述嵌合基因构建体包含以下有效连接的DNA元件：a)植物GA2氧化酶基因的启动子 区，b)编码植物CYP78A5蛋白或具有至少55%氨基酸同一性的功能性直向同源物的DNA区 域和c)包含在植物细胞中有功能的转录终止信号和多聚腺苷化信号的3'末端区，或提供 包含含有嵌合基因构建体的重组载体的植物、植物细胞或植物种子，所述嵌合基因构建体 包含以下有效连接的DNA元件：a)植物GA2氧化酶基因的启动子区，b)编码植物CYP78A5 蛋白或具有至少55%氨基酸同一性的功能性直向同源物的DNA区域和c)包含在植物细胞 中有功能的转录终止信号和多聚腺苷化信号的3'末端区。
[0034] 在又一个实施方案中，本发明提供本发明嵌合基因或重组载体增加植物产量的用 途。
[0035] 在又一个实施方案中，本发明提供本发明嵌合基因或重组载体增加植物的籽苗生 长势的用途。
[0036] 在又一个实施方案中，本发明提供本发明嵌合基因或重组载体增加植物耐旱性的 用途。在一个具体实施方案中，嵌合基因或包含本发明嵌合基因的重组载体用来增加玉米 的耐旱性。
[0037] 在一个具体实施方案中，嵌合基因或包含本发明嵌合基因的重组载体用于作物 中。
[0038] 在另一个具体实施方案中，作物是禾谷植物。
[0039] 在又一个具体实施方案中，作物是草类。
[0040] 在又一个实施方案中，本发明提供一种产生与相应野生型植物相比产量增加的植 物的方法，其中所述方法包括引入或转化本发明的嵌合基因或重组载体。
[0041] 在又一个具体实施方案中，本发明的嵌合基因与有利地增加植物产量的其他嵌合 基因组合。具体例子是相同玉米植物中嵌合GA2ox启动