专利名称：产生新型、高度化学保护性的十字花科植物种质的制作方法
背景技术：
本发明是在美国政府的支持下、使用NIH拨款1PO1 CA44530完成，美国政府在本发明中拥有某些权利。
1．发明领域本发明涉及产生新型、高度化学防护(chemoprotectant)的十字花科植物种质的方法。具体地说，本发明涉及产生新型、高度化学防护的嫩茎花椰菜种质和花椰菜种质的方法。本发明涉及产生含有显著量化学保护性(chemoprotective)化合物的种质，所述化学保护性化合物调节参与致癌剂代谢的哺乳动物酶。这些化合物诱导2相(Phase 2)酶的活性，而不诱导激活致癌剂的1相(Phase 1)酶的生物学显著活性。更具体地说，所述新型种质含有提高的烷基芥子油苷(alkylglucosinolate)/吲哚芥子油苷(indole glucosinolate)比例。
本发明还提供了在一定条件下萌发十字花科的种子和籽苗的方法，所述条件增加对抗一定范围的人类病原体的抗生素活性并增加所述籽苗的化学防护活性。
2．相关技术的描述人们已经普遍认识到，饮食对于控制发展中的癌症的风险起很大作用，并且增加水果和蔬菜的消费降低人类中的癌症发生率。目前相信主要的保护机制依赖于植物中化学成分的存在，当将所述化学成分传递给哺乳动物细胞时，提高使致癌剂解毒的2相酶的水平。
2．相酶通过使在其它情况下会损伤DNA的亲电子形式的致癌剂解毒而起作用。提高2相酶水平的化合物被命名为“选择性诱导物”。2相酶的选择性诱导物被称为单功能诱导物。这意味着它们仅诱导2相酶，而不显著诱导1相酶活性。与此相比，同时诱导2相酶和1相酶的化合物被称为双功能诱导物。(见Prochaska和Talalay(1988)Cancer Res.48:4776-4782)。单功能诱导物几乎全是亲电子试剂并属于至少9个不同的化学类别。(见Prestera等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2963-2969；Khachick等(1999),ANTIOXIDANT FOODSUPPLEMENTS IN HUMAN HEALTH,Packer,L.等(编辑)第203-229页，Academic Press,San Diego)。几乎所有这些诱导物所共同拥有的唯一明显的共同特性是它们与硫羟基反应的能力。
因此，单功能诱导物是降低哺乳动物对致癌剂的毒性效应和肿瘤性转化效应的敏感性的化学保护性试剂。化学保护剂可以来自于植物或者是合成化合物。已经产生了天然出现的诱导物的合成类似物，并且显示这些合成类似物阻断动物中的化学致癌作用。(见Posner等(1994)J.Med.Chem.37:170-176；Zhang等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3147-3150；Zhang等(1994)Cancer Res.(Suppl)54:1976s-1981s)。
已经开发出测量植物提取物增加或诱导2相酶活性的潜能的高效方法(Prochaska和Santamaria(1988)Anal.Biochem.169:328-336和Prochaska等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2394-2398)。此外，这些方法已经用于分离植物中引起诱导物活性的化合物，以及用于评估这些化合物和它们的合成类似物的抗致癌活性(Zhang等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2399-2403和Posner等(1994)J.Med.Chem.17:170-176)。
这些方法已经鉴定十字花科植物为诱导物活性的可能来源。然而，根据变种以及生长和收获条件，各个植株间的诱导物活性水平是高度易变的。
现在知道十字花科植物的大部分诱导物活性是源于异硫氰酸酯以及它们的生物发生前体芥子油苷的存在以及其量。芥子油苷通过黑芥子酶(一种葡糖硫苷葡糖水解酶)转化为异硫氰酸酯。黑芥子酶和芥子油苷一般在细胞中是分离开的。假如细胞受到损伤，导致细胞区室化的破坏，则黑芥子酶与芥子油苷接触并将它们转化成异硫氰酸酯。
虽然芥子油苷本身并不是哺乳动物2相酶的诱导物，但它们通过黑芥子酶活性的转化产物是哺乳动物2相酶的诱导物。因此，在QR活性的鼠肝癌细胞生物测定中，异硫氰酸酯产物正是2相酶的有效单功能诱导物。
然而，并非所有的芥子油苷都产生2相酶诱导物异硫氰酸酯。某些芥子油苷(如烷基硫代烷基芥子油苷(alkylthioalkyl glucosinolate))产生有效的化学保护剂，即异硫氰酸酯。其它芥子油苷(如吲哚芥子油苷)产生如吲哚-3-甲醇和吲哚-3-乙腈的化合物，而这些化合物由于一些原因是有问题的。第一，这样的化合物是双功能诱导物；也就是说，它们同时诱导2相酶和1相酶。1相酶可以激活异生素，因此产生致癌剂。(Prochaska和Talalay(1988)Cancer Res.48:4776-4782)。第二，所述吲哚芥子油苷仅仅是2相酶的弱诱导物(Fahey JW等(1998)，FUNCTIONAL FOODS FOR DISEASE PREVENTION I的第2章。Shibamoto T.等(编辑)，第16-22页，ACS Symposium Series 701,AmChem Soc,Washington DC)。第三，这些化合物本身作为肿瘤促进剂起作用(Kim DJ等(1997)Carcinogenesis 18(2):377-381)。最后，这些化合物在胃中遭遇的酸性条件下会形成缩合产物，所述缩合产物是与二氧芑(TCDD)非常相似的有力致癌剂(Bjeldanes LF等(1991)ProcNat Acad Sci USA 88:9543-9547)。
因此，诱导物活性的量取决于十字花科植物中存在的芥子油苷的质量以及数量。例如，市场阶段(market stage)的嫩茎花椰菜和花椰菜中含有目前在蔬菜中鉴定到的最高水平的烷基硫代烷基芥子油苷、4-甲基亚磺酰丁基芥子油苷和3-甲基亚磺酰丙基芥子油苷。然而，它们还含有相似水平的吲哚芥子油苷、芸苔葡糖硫苷(吲哚基-3-甲基芥子油苷)、新葡糖蔓菁苷和4-羟基芸苔葡糖硫苷。另一方面，嫩茎花椰菜和花椰菜萌发的种子、籽苗和幼小的小植株含有浓度比市场阶段蔬菜高的芥子油苷。在籽苗中存在的芥子油苷的量在某种程度上取决于吸涨和萌发时芥子油苷从种子的渗漏。
种子吸涨和萌发、以及引发、渗透调节(osmocoditioning)、matri-conditioning等等过程虽然主要与水到种子和幼苗中的净流入量有关，但一般也涉及化学药品从萌发中的种子的渗漏或沥滤。虽然一些渗漏是不可避免的，但从种子渗漏的化学物质的量可以通过种子所放置的环境来调节。此外，渗漏的量还与种子批的质量以及种子的类型有关。
十字花科的种子的沥滤液可以显示有效的抗生素活性。该活性不仅有效对抗一定范围的人类病原体，而且有效对抗其它在商品绿色籽苗(如豆籽苗和绿色多叶籽苗)生产系统中普遍生长旺盛或共存、因此有效污染这些系统的微生物。萌发中的十字花科植物种子的抗生素活性，在种子和幼苗以及由它们得到的沥滤液中，与种子的芥子油苷含量有关。绿色籽苗工业的主要原材料，即苜蓿种子的沥滤液实际上刺激大肠杆菌(Escherichia coli)的生长，但十字花科种子(如嫩茎花椰菜、花椰菜、羽衣甘蓝、日本萝卜、甘蓝、芝麻菜)的沥滤液含有抑制大肠杆菌生长的芥子油苷以及它们的异硫氰酸酯同类物(congener)(如萝卜苷(glucoraphanin)和1-异硫氰酸基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷)。因此，萝卜苷和它的异硫氰酸酯同类物1-异硫氰酸基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷不仅在哺乳动物中诱导使异生素解毒的2相酶、具有化学保护性，而且它们还是抗微生物剂。
然而，吸涨期间的渗漏降低了种子和籽苗的芥子油苷含量，因此降低了它们的抗生素活性以及抗致癌活性。此外，目前的商品绿色籽苗生产系统也导致沥滤物有仅仅非常低的抗生素活性。
因此，本领域内有需要鉴定特定的十字花科植物，所述植物产生用于化学保护的高水平的2相酶诱导物活性。还有需要鉴定产生已知谱系的2相酶活性特异性诱导物的植物，以增加失活所靶向的特定致癌剂或多类致癌剂的有效性。此外，有需要产生包含提高水平的2相酶诱导物活性的种质，并且有需要开发有效和高效地操作在特定变种和系中所产生的诱导物谱系的方法。最后，有需要获得在萌发和抽芽时显示芥子油苷渗漏降低的种子和籽苗。还有需要为商品绿色籽苗生产开发方法，所述方法导致沥滤液中抗生素产生增加，而并不显著降低在市售籽苗组织中存在的化学防护活性。
因此，最理想的是获得拥有一致的化学防护活性质量和数量的十字花科植物变种。还最好获得这样的十字花科植物变种所述十字花科植物变种在抽芽过程中产生高水平的抗生素活性，因此降低了所述籽苗会被人类病原体污染的风险。还最好获得也拥有高质量化学防护活性的十字花科植物变种。这样的十字花科植物变种包括开放传粉和近交的嫩茎花椰菜系和花椰菜系，这些系含有相对于吲哚芥子油苷水平来说高水平的烷基硫代烷基芥子油苷。
还最好获得显示在萌发和抽芽时芥子油苷渗漏降低的十字花科植物种子和籽苗。也最好获得商品绿色籽苗生产方法，该方法导致沥滤液中抗生素产生增加，而并不显著降低在市售籽苗组织中存在的化学防护活性。
发明简述使用本发明的技术，通过产生新型种质，可以增强十字花科的蔬菜、种子和籽苗的抗肿瘤质量。
因此，本发明的一个目标是提供产生新型十字花科种质(尤其是嫩茎花椰菜种质和花椰菜种质)的方法，所述种质含有显著量的癌症化学保护化合物。
本发明的另一个目标是提供产生新型十字花科植物种质(尤其是嫩茎花椰菜种质和花椰菜种质)的方法，所述种质含有大量2相酶诱导物，并且基本不含有1相酶诱导物。
本发明的再一个目标是提供产生十字花科植物种质(尤其是嫩茎花椰菜种质和花椰菜种质)的方法，所述种质含有大量2相酶诱导潜力以及无毒水平的吲哚芥子油苷和它们的降解产物。这样的种质在最终用于市场销售和随后的使用的合适组织中含有提高的吲哚芥子油苷/烷基芥子油苷比例。这样的组织包括种子、籽苗和市场阶段的头状花序(heads)。
本发明的另一个目的是提供这样的方法通过选择提高的烷基硫代烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例，创造新型近交或双单倍体十字花科植物种质，尤其是嫩茎花椰菜种质和花椰菜种质。
本发明的再一个目的是提供含有提高的烷基硫代烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的新型近交或双单倍体十字花科植物种质，尤其是嫩茎花椰菜种质和花椰菜种质。
本发明的另一个目的是提供产生新型十字花科植物种质(尤其是嫩茎花椰菜种质和花椰菜种质)的方法，所述十字花科植物种质具有沥滤能力降低、芥子油苷含量提高的种子。
本发明的再一个目的是提供这样的方法在一定条件下使十字花科种子和籽苗萌发，所述条件增加对抗一定范围人类病原体的抗生素活性，并且增加所述籽苗的化学防护活性。
通过提供产生具有增强的化学防护特性的新型十字花科植物种质(尤其是嫩茎花椰菜种质和花椰菜种质)的方法，达到这些目的和其它目的，所述方法包括(1)提供双单倍体植株的群体，并(2)选择具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的单株。或者或此外，所述单株也产生萌发和抽芽时种子物质渗漏降低、导致芥子油苷含量提高的种子。可以通过花药培养技术从亲本植株获得双单倍体植株的群体。
所述选择步骤可以包括筛选每株植株以确定它的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例。此外，所述筛选步骤可以包括这样的步骤从植株制备提取物、并测定所述提取物中烷基芥子油苷和吲哚芥子油苷的量。最后，所述筛选步骤可以包括筛选由每株植株产生的种子，以测定从种子渗漏的物质的量，并测定在所述种子本身和这样的渗漏物中存在的芥子油苷含量。
还提供产生具有增强的化学防护特性的新型自交十字花科植物种质(尤其是嫩茎花椰菜种质和花椰菜种质)的方法，所述方法包括(1)提供双单倍体植株的群体，并(2)选择具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的单株，然后(3)使选定的植株自交，并选择来自自交植株的具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的后代。或者，或者此外，所述单株也产生沥滤能力降低、导致芥子油苷含量提高的种子。来自所述自交植株的后代也产生种子物质的渗漏降低的种子。
还提供了创造具有增强的化学防护特性的新型近交十字花科植物种质的方法，所述方法包括以下步骤(1)提供诱变处理植株的群体，然后(2)选择具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的单株。或者，或者此外，所述单株也产生沥滤能力降低、导致芥子油苷含量提高的种子。
还提供了这样的十字花科植物变种所述十字花科植物变种含有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例，其中所述提高的比例比在产生出所述变种的亲本植株中观察到的所述比例大约10％，更优选20％，最优选30％或更多。或者，或者此外，所述十字花科植物变种产生萌发和抽芽时种子物质的渗漏降低的种子。
还提供了这样的方法通过以一定的水对干种子的比例使种子吸涨并萌发，在一定条件下萌发十字花科种子和籽苗的方法，所述条件增加在抽芽环境中的抗生素活性并增加所述籽苗的化学防护活性，所述水对干种子的比例刚好足以允许所述籽苗在正常的商业化抽芽期中的正常生长，而并不导致从所述籽苗的任何明显的流出。
因此，本发明涉及选择植株的方法，所述方法包括测定植物组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例，如果该比例是特定数值，则选择该植株。所述植株最好是双单倍体植株，例如通过花药培养技术获得的双单倍体植株，或者所述植株是经诱变处理的植株，如用化学诱变剂(如甲基磺酸乙酯)诱变的植株，其中所述植株在所述测定步骤前经过诱变处理。
所述植株有利地是十字花科植物如嫩茎花椰菜，最好属于由以下选出的栽培品种Saga、DeCicco、珠穆朗玛峰(Everest)、翡翠城(Emerald City)、Packman、Corvet、Dandy Early、皇帝(Emperor)、Mariner、绿彗星(Green Comet)、Green Valiant、Arcadia、CalabreseCaravel、Chancellor、Citation、巡洋舰(Cmiser)、早紫萌芽红箭(EarlyPurple Sprouting,Red Arrow)、Eureka、Excelsior、大帆船(Galleon)、Ginga、Goliath、绿公爵(Green Duke)、绿色地带(Greenbelt)、意大利萌芽(Italian Sprouting)、HiSierra、晚紫萌芽(Late Purple Sprouting)、晚冬萌芽白星(Late Winter Sprouting White Star)、Legend、Leprechaun、马拉松(Marathon)、水手(Mariner)、Minaret(Romanesco)、杰出典范(Paragon)、爱国者(Patriot)、Premium Crop、Rapine(Spring Raab)、Rosalind、Salade(Fan Raab)、武士(Samurai)、Shogun、短跑选手(Sprinter)、苏丹(Sultan)、Taiko、和Trixie、以及海盗(Viking)。
或者，所述植株是十字花科植物如花椰菜，最好属于由以下选出的栽培品种Alverda、Amazing、Andes、勃艮第王后(BurgundyQueen)、Candid Charm、Cashmere、圣诞白(Christmas White)、Dominant、Elby、雪球(Snowball)以及雪球的选择物、Fremont、Incline、Milkyway Minuteman、Rushmore、S-207、Serrano、Sierra Nevada、Siria、雪冠(Snow Crown)、雪片(Snow Flake)、Snow Grace、Snowbred、Solide、Taipan、紫罗兰王后(Violet Queen)、白男爵(White Baron)、白主教(WhiteBishop)、White Contessa、白晕(White Corona)、白鸽(White Dove)、白色闪光(White Flash)、白狐(White Fox)、白骑士(White Knight)、白光(White Light)、白王后(White Queen)、白岩(White Rock)、白帆船(White Sails)、白夏(White Summer)、白顶(White Top)、和Yukon。
本发明还涉及产生后代植株的方法，所述方法包括测定有潜力的亲本植株的一种组织中的烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷含量的比例，如果该比例是特定的数值，则选择所述有潜力的亲本植株，并从所述选出的植株产生后代植株。有利地是，所述后代植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例高于所述选定植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例，并且所述后代植株的所述组织以及所述选定植株的所述组织属于同一类型。本发明也涉及通过这种方法产生的后代植株。
在优选的实施方案中，所述后代植株的所述组织中的该比例比所述选定植株的所述组织中的该比例至少高10％、20％、30％、50％或100％。在另一优选实施方案中，所述后代植株的所述组织中的该比例是所述选定植株的所述组织中的该比例的至少10倍或100倍。而在另一个优选的实施方案中，所述后代植株的所述组织中的该比例比所述选定植株的所述组织中的该比例高10％到高100％、高20％到高80％、或高30％到高60％。在再一优选实施方案中，所述后代植株的所述组织中的该比例是所述选定植株的所述组织中的该比例的10倍到100倍之间、或25倍到75倍之间。所述后代植株有利地是通过使所述选定植株自交产生，或者所述后代植株是杂种植株。
本发明还涉及十字花科植株，如嫩茎花椰菜植株或花椰菜植株，其中所述植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例大于6、10、25、50、100或1000。在优选的实施方案中，所述植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例在6到1000之间、10到500之间、25到250之间或50到100之间。
本发明还涉及选择种子或籽苗的方法，所述方法包括(a)向种子或籽苗加一定量的水，(b)测定所述种子或籽苗的沥滤物中芥子油苷的含量，并(c)假如该浓度是特定值，则选定所述种子或籽苗。
本发明还涉及产生后代植株的方法，所述方法包括(a)向种子或籽苗加一定量的水，(b)测定所述种子或籽苗的沥滤物中芥子油苷的含量，并(c)假如该浓度是特定值，则选定所述种子或籽苗，然后(d)由所述选定的种子或籽苗产生后代植株。
本发明还涉及抑制或防止微生物在能够维持微生物生长的环境中生长的方法，所述方法包括以抑制微生物生长的量给予所述环境十字花科种子沥滤液或十字花科籽苗沥滤液。所述微生物有利地是细菌，如埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠杆菌)或葡萄球菌属(Staphylococcus)(如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))。所述沥滤液最好是嫩茎花椰菜沥滤液或花椰菜沥滤液。理想的是，所述沥滤液含有芥子油苷或异硫氰酸酯。
本发明还涉及制备籽苗的方法，所述方法包括(a)提供一定量的种子，(b)向所述种子加每g种子0.6到1.0g的水，(c)使接受浇水的种子萌发并形成籽苗，然后(d)每24小时向所述籽苗加每株籽苗5到9mg的水直至24到120小时，由此制备籽苗。步骤(b)最好包括向所述种子加每g种子0.7到0.9g(最好0.8g)的水。步骤(d)最好包括每24小时向所述籽苗加每株籽苗.6到.8mg(理想的是.7mg)的水直至24到120小时。步骤(d)最好包括每24小时向所述籽苗加每株籽苗.5到.9mg的水直至48到120小时(理想的是72小时)。所述籽苗有利地是十字花科籽苗，如嫩茎花椰菜籽苗或花椰菜籽苗。
本发明的其他目标、特性和好处将通过下面的详细描述而变得明显。然而，应当理解所述详细描述和特定具体实施例当指明本发明的优选实施方案时，是仅作为例证给出，因为通过该详细描述，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域内的技术人员将变得显而易见。
附图简述
图1显示了嫩茎花椰菜籽苗沥滤液和苜蓿籽苗沥滤液对于大肠杆菌在0.1X Luria肉汤上生长的效应。
图2显示了在萌发期间不同时间收集到的嫩茎花椰菜籽苗沥滤液对于大肠杆菌生长的效应。
图3显示了在从嫩茎花椰菜籽苗收集到的沥滤液中芥子油苷和异硫氰酸酯浓度对大肠杆菌在0.1X Luria肉汤上生长的效应。
图4显示了在萌发期间不同时间收集到的苜蓿籽苗沥滤液对于大肠杆菌生长的效应。
优选实施方案的详细描述1．定义在下面的描述中，将广泛地使用许多术语。提供下面的定义以利于理解本发明。
花药培养是体外培养花药以获得单倍体植株或纯合再生植株。当包含小孢子或未成熟花粉粒的花药在合适条件下在营养培养基上生长时，所述花药产生胚，所述胚又能再生成植株。由于所培养的小孢子细胞和未成熟花粉粒来自于进行了减数分裂的细胞，所以它们的染色体数目是亲本植株染色体数目的一半，因此由这些培养细胞再生的植株是单倍体。
化学保护剂或化学防护剂是降低哺乳动物对于致癌剂的毒性效应和肿瘤性转化效应的敏感性的合成的或天然出现的化学试剂。
双单倍体是通过使单倍体植株的染色体含量加倍而产生的双倍体植株。单倍体植株一般从花药培养获得；或者人工使染色体加倍，如通过秋水仙素处理使染色体加倍，或者使染色体自发加倍。双单倍体在所有基因座(genetic loci)上都是纯合的。
提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例是这样的比例该比例大于在约70％、优选80％、最优选90％的测试植株群体中观察到的所述比例，或者比衍生出所述测试植株的亲本中观察到的所述比例大、最好大20％。或者提高的比例是并不天然出现的比例，因为该比例是人工诱导的，如在组织培养期间通过诱变处理或体细胞克隆变异诱导的，并且该比例显著大于衍生出所述测试植株的植株群体中一般出现的所述比例。
芥子油苷的分布型是确定在植株中测到的芥子油苷的类型以及每种芥子油苷类型的量。通过测定烷基芥子油苷和吲哚芥子油苷的量并确定烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例，可以确定芥子油苷分布型。
诱导物活性或2相酶诱导活性是化合物诱导2相酶活性的能力的量度。(见Prochaska和Santamaria(1988)Anal.Biochem.169:328-336和Prochaska等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2394-2398)。
近交系或繁育系(breeding line)是纯合或接近纯合的植物系。一般地说，通过常规的植物培育技术产生这样的系；然而，最近可以通过组织培养技术、如产生双单倍体而获得这样的系。近交系用于产生杂种。
诱导物潜力或2相酶诱导潜力是植物组织中诱导物活性的混合量的量度，所述诱导物活性由异硫氰酸酯加上能够被黑芥子酶转化成异硫氰酸酯的芥子油苷提供。芥子油苷本身并不是哺乳动物2相酶的直接诱导物；而它们的代谢产物异硫氰酸酯是诱导物。
栽培品种或变种是一群相似的植株，它们属于同一物种，并且通过结构特征和生产性能可以与同一物种内的其它变种区分开来。变种的两个基本特征是同一性和能生殖性。同一性是必需的，以便可以识别变种并与该作物物种内的其它变种区分开来。区分特征可以是形态学特征、颜色标记、生理功能、病害反应或生产性能。大多数农业变种在鉴别该变种的那些特征上是纯合的。能生殖性是必需的，由此鉴别该变种的特征会在后代中再现。一个变种来自于一个品系；由单基因型或基因型的混合物增殖得到的群体被称为品系、试验系或系。一旦鉴定该品系是优良的，人们就为其命名、使其增殖并使其作为“栽培变种”或“栽培品种”在商业上可得。词语“变种”和“栽培品种”可互换使用，虽然栽培品种一般用于科学文献中，而变种是美国农场主和种子贸易使用的术语。2．描述十字花科植物在降低人类的癌症发生率中提供的主要保护机制依赖于植物组织中微量化学成分的存在，当所述微量化学成分传递给哺乳动物细胞时，提高使致癌剂解毒的2相酶的水平。现在已经发现，可以通过产生具有提高的化学防护活性的新型近交系而增加十字花科植物的抗致癌活性。所述增强的化学保护活性是源于提高的烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例。例如，可以通过定量提高特定烷基芥子油苷(如烷基硫代烷基芥子油苷)的水平、或定量降低吲哚芥子油苷的水平而获得这样的提高的比例。也可以通过产生新型近交十字花科植物系而增强市售籽苗组织的化学防护活性，其中所述新型自交十字花科植物系产生种子物质渗漏降低的种子。
此外，已经发现假如使供应给发育中的十字花科植物籽苗的水量最小化，或使其降低到保持发育中的籽苗湿润但并不湿透的水平，则在沥滤物中这样的抗生素的浓度提高，以致对抗潜在污染的微生物的抑制效应得到增强，所述潜在污染的微生物包括人类病原体和食物中毒生物(food poisoning organism)，例如大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)物种以及李斯特菌属(Listeria)物种。另一方面，用减少的水培养这样的籽苗导致芥子油苷以及其它无机离子和有机化合物的沥滤减少，这导致在最终消费的植物组织中这些化合物的水平提高。因此，例如，在用更少量的水萌发的籽苗组织中可以提高表现出癌预防特性的萝卜苷的水平。
产生这样的新型种质的方法包括将用于鉴定和选择具有提高的烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例的植物组织的新型筛选技术与常规和非常规培育技术结合起来。这样的方法尤其导致具有提高的烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例的十字花科植物变种，更具体地说是嫩茎花椰菜变种和花椰菜变种。或者，或者此外，筛选包括评估在萌发和抽芽时种子物质渗漏减少的种子，尤其是芥子油苷从种子的渗漏减少的种子。
在所述要求保护的方法中用于产生具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的植株的十字花科植物来自于十字花科、Brassiceae族和Brassicinae亚族。所述十字花科植物最好来自于甘蓝(Brassicaoleracea)种群并且其中包括acephala(羽衣甘蓝、甘蓝、culy cale)、medullosa(marowstem kale)、ramosa(thousand head kale)、alboglabra(芥蓝)、botrytis(、花椰菜、嫩茎花椰菜)、costata(葡萄牙卷叶菜)、gemmifera(抱子甘蓝)、gongylodes(球茎甘蓝)、italica(嫩茎花椰菜)、palmifolia(Jersey kale)、sabauda(皱叶甘蓝)、sabellica(羽衣甘蓝)、selensia(羽衣甘蓝)以及capitata(甘蓝)。在所述要求保护的方法中用于产生具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的植株的其它十字花科植物其中包括Lepidium sativum(独行菜)、白芥(Sinapis alba)和S.niger(芥菜)、萝卜(Raphanus sativum)(radish daikon)、Eruca satica(芝麻菜)以及它们的变种间、种间或属间杂种。筛选芥子油苷分布型为筛选大量单株以选择那些具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的植株，有必要开发用于分离、鉴定和定量在植物提取物中存在的不同类型芥子油苷的改进的技术。
使各种芥子油苷分离开来是困难的，因为这些分子带有高电荷并且是水溶性的；不同分子的分离取决于极性较小的侧链的特性。已经开发出许多不尽理想的色谱方法以用于芥子油苷的离析和分离。(见，例如，Betz,JM和Fox,WD(1994)FOOD PHYTOCHEMICALSFOR CANCER PREVENTION.I.FRUITS AND VEGETABLES,Huang,MT等(编辑)ACS Symposium Series,546,第181-196页,Am Chem Soc,Washington,DC；Heaney,RK和Fenwick,GR(1987)GLUCOSINOLATES IN RAPESEEDS:ANALYTICAL ASPECTS,Wathelet,JP(编辑),第177-191页,Nijhoff Dordrecht,荷兰；Wathelet,JP(1987)GLUCOSINOLATES IN RAPESEEDS:ANALYTICALASPECTS,Nijhoff Dordrecht，荷兰)。这些色谱方法包括离子交换、气液色谱法(GLC)以及高压液相色谱法(HPLC)，它们中的大部分涉及通过酶促脱硫酸盐(sulfate removal)和/或硅烷化的化学改性。
最近发展出一种分析植物提取物中芥子油苷含量的简单和直接的策略；该策略涉及广泛可得的技术的新组合。(Prestera，T等(1996)Anal.Biochem.239:168-179；通过引用完整地结合到本文中。)该分析策略也提供了不必借助衍生作用而鉴定和定量植物提取物中的芥子油苷的有力技术。
将植物组织于维持在约-50℃的干冰/乙醇浴中用10倍体积的二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和乙腈(三溶剂)的等体积混合物匀浆，制备植物提取物。根据样品大小，在玻璃匀浆器、Brinkmann Polytron匀浆器或Waring Blender中匀浆样品。其它提取溶剂包括沸腾的乙醇、沸水、冰冷的水以及乙腈。例如，也可以将收获的植物组织浸入沸水中，然后是短时间的匀浆，由此制备植物提取物。在所有情况下，离心匀浆物，可选地过滤上清以去处剩余的颗粒。可以将得到的粗水性提取物保存在-20℃到-80℃直至进行分析。
然后通过序贯分析来分离、鉴定和定量来自粗植物提取物的完整芥子油苷。该程序包括在过量这些抗衡离子的存在下进行芥子油苷的疏水性四烷基铵盐的反相离子对色谱(PIC)，将这些芥子油苷盐转化成它们的铵盐，然后进行直接阴离子快速原子轰击(FAB)光谱分析和氨化学电离(CI)质谱法分析，最后进行高分辨率核磁共振(3HNMR)波谱法。Prestera,T等(1996)Anal.Biochem.239:168-179提供了细节，该文献通过引用完整地结合到本文中。
最好在一台配备有光电二级管阵列检测器的Waters HPLC系统上，使用含5mM十四烷基溴化铵的乙腈/水(1∶1，体积比)以3ml/分钟的流速在反相柱(Whatman Partisil 10 ODS-2；250×4mm)上色谱分析植物提取物(见Prestera,T.等(1996)Anal.Biochem.239:168-179)。使用黑芥子苷(烯丙基芥子油苷(allyl glucosinolate))作为标准。烷基硫代芥子油苷，如萝卜苷、芸苔葡糖硫苷和新葡糖蔓菁苷在235nm处的相对积分吸收面积(relative integrated absorbance area)分别是等摩尔量的黑芥子苷在235 nm处的相对积分吸收面积的1.00倍、1.22倍和2.70倍(Fahey JW等(1997)Proc.Natl.Acad Sci.USA 94:10367-10372；Shapiro TA等(1998)Cancer Epidemiol.Biomark.Prevent.7:1091-1100)。
根据培育程序的目标从组织取样；因此，取样的组织可以包括市场阶段的头状花序(在它们开放前是花芽)、叶组织、种子组织和/或籽苗组织。当要培育市场阶段头状花序内所需的芥子油苷分布型时，最好在花芽开放前从花芽组织取样。筛选种子沥滤液可以根据萌发和抽芽期间种子物质渗漏的量、尤其是释放到所述沥滤液中的芥子油苷的量和类型来筛选各个植株的种子。
根据发芽工业中一般使用的方法，首先消毒种子，通常用在水中有约20％漂白剂的漂白剂溶液进行消毒，然后用水彻底清洗种子。随后将种子置于萌发容器内；这样的室可以包括扁平的托盘，所述托盘可以是倾斜的，或者这样的室可以是适于运输和销售的容器。后一种容器类型一般是在底部包括水垫的塑料盒或塑料罐。这些容器容许光线通过，同时提供机械保护的屏障。这样的托盘或容器最好设计或改造或制造成允许清洗萌发中的种子并收集得到的清洗溶液或沥滤液，同时促进正常商业化生长期间籽苗的正常生长。已知许多培育籽苗的方法，如美国专利第3,733,745号、美国专利第3,643,376号、美国专利第3,945,148号、美国专利第4,130,964号、美国专利第4,292,760号或美国专利第4,086,725号所例证。
然后用定量的水以确定间隔清洗所述种子确定时间；随后收集这些清洗水或沥滤液，并测定所述沥滤液中种子物质的含量。可以使用各种众所周知的测定渗漏的或释放的种子物质的方法，包括总干重和测定释放的蛋白质和糖。此外，此外或用另一种方法，可以如上所述测定释放的芥子油苷的量和分布型。选择育种程序的目的将决定哪些植株进入筛选程序以及选择哪些植株进行进一步的培育。其它要考虑的因素是从哪些组织、在哪个阶段取样；因此，一些程序目标在于市售蔬菜产品，如嫩茎花椰菜和花椰菜的头状花序或小花，而其它程序的目的在于小生境(niche)市场产品如籽苗或更成熟的植株部分，由这些部分可以制备所需质量的茶、渗出物、煎剂或提取物。
根据种质的类型和随后的培育策略，可以筛选不同类型的植株群体。最好筛选纯合植株的群体；这样的纯合植株最有可能通过组织培养技术产生出来，但也可以通过常规培育技术产生出它们。其它适于筛选的优选植物群体包括那些已经接受诱变处理的植株。
可用于产生纯合植株的组织培养技术包括在营养培养基上体外培养包含小孢子或未成熟花粉粒的花药用于产生单倍体小植株。然后通过适当程序使回收的单倍体小植株的染色体数目加倍，产生完全纯合的二倍体植株，即双单倍体植株。
增殖通过筛选程序选定为所需要的双单倍体植株，并进一步评估其农学特性。或者，立即利用所述植株增殖物作为杂交培育中的近交系以使植株异花受精。与常规培育程序所需的时间相比，通过该程序产生栽培品种或近交系所需的时间减少了几个世代。
用于嫩茎花椰菜组织的花药培养技术是本领域内众所周知的(Keller,WA等(1975)Can.J.Genet.Cytol.17:655-666；Keller,WA和Armstrong,KC(1988)Euphytica 32:151-159；Arnison,PG等(1990)Plant Cell,Tissue and Organ Culture 20:147-155；Arnison,PG等(1990)Plant Cell,Tissue and Organ Culture 20:217-222；Chiang,MS(1985)Can.J.Plant Sci.65:1033-1037)。一般来说，该技术涉及在花出现前从主花序选择芽、表面消毒所述芽、然后接种所述组织到培养基上。从小孢子产生胚，随后将所述胚再生成植株。在已报道的培养条件下，约一半植株是双单倍体，而其余是单倍体、四倍体及以其它倍性。可以通过DNA流式细胞术鉴定双单倍体(Arumaganathan,K.和Earle,ED(1991)Agronomie 11:727-736)。可以通过合适处理使单倍体植株内的染色体数目加倍，或者染色体数目可以自发加倍，所述处理如使用秋水仙素用本领域内众所周知的方法处理。
可以通过减少或剔除吲哚芥子油苷的合成或通过提高烷基芥子油苷的合成来改变芥子油苷的分布型。有几种达到该目的的技术。例如，一种方法是仅仅利用组织培养期间发生的体细胞克隆变异。另一种方法是对植物进行诱变处理，以增加具有所需芥子油苷分布型的植株出现的频率。而另一种方法是失活或剔除涉及吲哚芥子油苷合成的基因，例如通过将DNA插入这些基因中。
诱变处理包括电离辐射和化学诱变剂，而后者是目前优选的。最广泛使用的化学药品是甲基磺酸乙酯(EMS)。虽然最一般的是处理种子，但也可以处理花药、生活植株或植株的部分，所述部分包括芽、根和休眠插条。处理一般包括将所述植物或所述植物的部分浸泡在化学诱变剂的溶液中。然后用经过处理的所述植物材料产生完整的植株，随后对所述植株进行筛选和选择程序。植物诱变方法是本领域内众所周知的。例如，见Malmberg,R.L.，“植物突变体的产生和分析，以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为重点”，METHODS INPLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY,B.R.Glick和J.E.Thompson，编辑(CRC Press,Boca Raton 1993)。
通过使用来自宿主植物或来自异种来源的可动DNA序列(如T-DNA或转座子)进行DNA插入、而失活或剔除涉及吲哚芥子油苷合成的基因是本领域内众所周知的技术(Koncz等，1992)。可以使用已知方法,通过农杆菌属(Agrobacterium)进行T-DNA插入(Hoekema等，1983；美国专利第5,149,645号)，可以通过众所周知的方法完成转座子插入(Fedoroff等，1984；美国专利第4,732,856号和美国专利第5,013,658号)。所使用的转座因子可以是自主转座子、非自主转座子或自主/非自主转座子系统，如玉米Ac/Ds转座子系统。
选出用于筛选的植株最好是那些具有所需农学特性的植株。然而，如果选出用于筛选的植株不太合乎要求，那么就可以通过常规培育技术将所需芥子油苷分布型的性状引入商业上所需的变种。
同时优选在相似条件下培养所述选出用于筛选的植株，并在发育的相似阶段收获所述植株。这便利了不同单株间的比较，因为已知芥子油苷的数量和质量由于不同的植物组织以及由于不同的发育阶段而不同，并且由于不同的培养条件而不同。选出用于筛选的植物部分包括种子、籽苗和小花。选择的组织取决于所产生的种质的最终市场。根据用于筛选的组织的选择，可以选择不同的单株，因为在一株植株内，每种组织内的芥子油苷分布型可能不同，并且看起来在不同组织的分布型间没有相关性。例如，一株植株有拥有所需芥子油苷分布型的市场阶段头状花序组织，该植株可能有这样的籽苗所述籽苗拥有并非所需、或低于所需的芥子油苷分布型，或者具有与其它栽培品种相比非常低的总烷基硫代烷基芥子油苷水平。
选择那些在用于终端市场的合适组织中显示出所需芥子油苷分布型的植株以进行随后的开发。优选的分布型是提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例。提高的比例是这样的比例该比例大于在约70％、优选80％、最优选90％的测试植株群体中观察到的所述比例。或者提高的比例是这样的比例该比例比亲本植株中观察到的所述比例大，优选大10％、更优选大至少20％、最优选大至少30％。或者提高的比例是并不天然出现的比例，因为该比例是人工诱导的，如通过诱变处理或在组织培养期间的体细胞克隆变异而诱导，并且该比例显著大于衍生出所述处理植株的植株群体中一般出现的所述比例。
或者或此外，选择产生这样的种子的那些植株进行进一步的开发所述种子在萌发和抽芽期间种子物质的渗漏降低，尤其是芥子油苷渗漏降低。渗漏降低定义为当与亲本植株中观察到的渗漏相比、或与从中获得所述单株的植株群体中观察到的渗漏相比时显著的降低。显著的降低是与亲本植株中观察到的渗漏相比，至少10％、优选30％、最优选50％或更多的降低。或者，显著的渗漏降低是在仅10％、优选5％、最优选1％的所述植株群体中观察到的渗漏。或者显著的降低是并不天然出现的降低，因为该降低是人工诱导的，如通过诱变处理或在组织培养期间的体细胞克隆变异而诱导，并且该降低是比衍生出所述处理植株的植株群体中一般出现的渗漏更小量的渗漏。植株培育一旦选择了拥有所需芥子油苷分布型的单株，就用它们进行进一步的开发。提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例可以出现在市场阶段的头状花序、籽苗、种子或其它植物部分。可以应用下面培育程序于根据芥子油苷分布型而筛选的双单倍体植株、诱变植株或其它来源的植株。
一般来说，根据提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷的比例的性状(如上所述)筛选所述选定植株的后代来进行培育，其中所述比例在所需植物发育阶段的所需植物部分产生。通过增强该性状或将该性状与其它重要的农学特征组合，进一步产生带有该性状的植株。因此，可以直接用带有选定性状的植株建立新变种，或可以用它们作为来源以将所述性状转移进其它农学上所需的变种。
在所要求保护的方法中特别有用的嫩茎花椰菜变种是Saga、DeCicco、珠穆朗玛峰(Everest)、翡翠城(Emerald City)、Packman、Corvet、Dandy Early、皇帝(Emperor)、Mariner、绿彗星(Green Comet)、Green Valiant、Arcadia、Calabrese Caravel、Chancellor、Citation、巡洋舰(Cruiser)、早紫萌芽(Early Purple Sprouting)、红箭(Red Arrow)、Eureka、Excelsior、大帆船(Galleon)、Ginga、Goliath、绿公爵(GreenDuke)、绿色地带(Greenbelt)、意大利萌芽(Italian Sprouting)、晚紫萌芽(Late Purple Sprouting)、晚冬萌芽白星(Late Winter Sprouting WhiteStar)、Legend、Leprechaun、马拉松(Marathon)、水手(Mariner)、Minaret(Romanesco)、杰出典范(Paragon)、爱国者(Patriot)、Premium Crop、Rapine(Spring Raab)、Rosalind、Salade(Fall Raab)、武士(Samurai)、Shogun、短跑选手(Sprinter)、苏丹(Sultan)、Taiko、晚紫萌芽(Late PurpleSprouting)、明星(Light Star)和Trixie。然而，许多其它嫩茎花椰菜变种是合适的。
特别有用的花椰菜变种是Alverda、Amazing、Andes、勃艮第王后(Burgundy Queen)、Candid Charm、Cashmere、圣诞白(ChristmasWhite)、Dominant、Elby、雪球(Snowball)以及雪球的选择物、Fremont、Incline、Milkyway Minuteman、Rushmore、S-207、Serrano、SierraNevada、Siria、雪冠(Snow Crown)、雪片(Snow Flake)、Snow Grace、Snowbred、Solide、Taipan、紫罗兰王后(Violet Queen)、白男爵(WhiteBaron)、白主教(White Bishop)、White Contessa、白晕(White Corona)、白鸽(White Dove)、白色闪光(White Flash)、白狐(White Fox)、白骑士(White Knight)、白光(White Light)、白王后(White Queen)、白岩(WhiteRock)、白帆船(White Sails)、白夏(White Summer)、白顶(White Top)、和Yukon。然而，许多其它花椰菜变种是合适的。
所述培育程序的目的是确保所选择的芥子油苷分布型性状是稳定的，确保所选择的芥子油苷分布型性状存在于具有所需农学性状的植株中或可以转移到这样的植株中，并确保所选择的植株可以用于产生可以产生适合市场销售的杂种种子的变种或系。
为确保所述增强的芥子油苷性状是稳定的，从所述选定的植株获得F1代。虽然几种方法是可行的，但优选使所述选定的植株自体受粉以建立可以根据芥子油苷分布型进行筛选的F1子代。因为嫩茎花椰菜和花椰菜是自交不亲和性植物，所以可以通过几种技术人工使所述选定的植株自体受粉。一种技术是“蕾期授粉法”，该技术涉及在开花前1-2天将花粉置于未成熟的柱头上。用镊子小心地打开芽并将来自成熟花的花粉置于未成熟的柱头上。另一种技术是用NaCl或CO2预处理成熟柱头。在传粉前使成熟柱头暴露于15％NaCl10-15分钟，或在传粉前使成熟柱头暴露于提高的CO2水平(最好是5％CO2)几小时。
收集得到的F1种子，将所述种子培养成为成熟植株，然后根据芥子油苷分布型筛选所述成熟植株。选择那些增强的芥子油苷分布型的性状稳定的植株进行进一步的培育。这样的培育包括由所选定的植株产生近交系，或通过选择其它农学性状或通过使所述性状渐渗入其它所需的系或变种而进一步产生所选定的植株。用于杂交、选择和培育十字花科(Cruciferae)新变种的策略是众所周知的。(见Brassica Crops and Wild Allies:Biology & Breeding；S.Tsunoda等(编辑)，Japan Scientific Societies Press,Tokyo第1-354页(1980))。
从由花药培养获得的双单倍体植株衍生的那些植株产生了“瞬时近交体(instant inbreds)”，因为双单倍体已经在每一个基因座上是纯合的。在培育中使用这些植株可以在2年内产生近交系，而不是常规培育程序所需的5年(Ockendon,D.J.(1986),GENETICMANIPULATION IN PLANT BREEDING,Horn,J.等(编辑)De Gruyter,New York，第265-272页)。这样的系本身可以用作新的栽培品种，或作为产生杂种的亲本。
然而，所述近交亲本是难以维持的，因为它们是自交不亲和的。因此，使用不同方法来克服自交不亲和性系统。一组这样的方法涉及产生种子。这些方法包括改变营养条件(Stout,A.B.(1931)Am J Bot18:686-695)、花粉移植(Kroh,M.(1966)(用十字花科对不亲和机制的特征鉴定的贡献)，Züchter第36卷:185-189)、破坏柱头(Linskens,H.F.和Kroh,M.(1967)Handb Pflanzenphysiol第18卷506-530)、化学处理(Tatebe,T.(1968)J Jpn Soc Hortic Sci.37:227-230)、CO2处理(Nakanishii等(1968)Plant Cell Physiol 10:925-927)、高温(Gonai,H.和Hinata,K.(1971)L Jpn J Breed 21:195-198)以及电处理(Roggen等(1972)L Euphytica 21:181-184)。然而，常规使用的方法是在自交不亲和性起作用前对芽受粉，或“蕾期授粉法”(Wiering,D.(1958)Euphytica 7:223-227)。
然而，通过这些方法产生种子是艰巨并且昂贵的。第二组克服自交不亲和系统的方法涉及无性繁殖以维持近交系。这些方法包括从植物营养部分(如茎、叶和肋状外植体(rib explant))繁殖(Johnson等，(1970)Hort Sci 13:246-247)、从茎插条和整个或部分籽苗芽繁殖(Nieuwhof,M.(1969)WORLD CROPS SERIES,Hill,London)以及从根插条繁殖(North,C.(1953)Ann Appl Biol 40:250-261)。这些方法也可以用于繁殖由田间试验选出的植株。
通过常规培育技术将增强的芥子油苷分布型的性状渐渗入具有优良农学性能的系。这样的技术包括轮回选择(Vello等(1977)；ESALQ,Piracicaba,Brazil，第742页；(1978)Plant Breed Abstract第48卷，第7062页)以及通过为一致性的近交并组合近交系成为综合系的加性遗传变异(Honma,S.(1965)J Am Soc Hortic Sci 87:295-298)。通过培育F1杂种栽培品种，利用杂种优势(Legg等(1968)J Am Soc Hortic Sci 92:432-437)。使用目前在茎椰菜(calabrese)中可用的胞质雄性不育性(cms)(Dickson,M.H.(1975)HortSci 10:535)培育杂种。
可以将同样的培育技术应用于产生产生这样的种子的系所述种子在萌发和抽芽期间，种子物质(特别是芥子油苷)的渗漏降低。伴随种子物质渗漏降低的种子萌发另一种使种子萌发和抽芽期间种子物质(特别是芥子油苷)的渗漏最小化的方法是以一定的水对干种子的比例使种子吸涨并萌发，所述水对干种子的比例刚好足以允许所述籽苗在正常的商业化抽芽周期中的正常生长，而并不导致从所述籽苗的任何水流出。使种子暴露于更少量的水降低了萌发和抽芽期间种子物质(特别是芥子油苷)从种子渗漏的量。渗漏减少导致芥子油苷的滞留量增加，产生具有增强的化学防护性质的籽苗。此外，水体积的减少导致释放的芥子油苷的浓度提高，因此增加它们在抽芽环境中的抗生素有效性。
如前所述使种子萌发，首先对它们进行表面消毒，然后使它们在正常商业化萌发和抽芽过程中暴露于一定量的水一定时期。优选的最小水体积是允许正常生长并且不允许任何水从膨胀和抽芽的种子“流出”或滴下的水量。在一般商业实践中，该量一般是每克干种子6ml水；也可以使用高达每克干种子15 ml的水。商业化的萌发周期一般是2-5天，并且该周期取决于所需植物种子和籽苗的类型。
实施例1双单倍体植株的产生双单倍体由Dr.Mark W.Farnham，美国农业部，Charleston,SouthCarolina从几个嫩茎花椰菜变种制备，所述嫩茎花椰菜变种包括珠穆朗玛峰(Everest)、HiSierra、马拉松(Marathon)、苏丹(Sultan)和海盗(Viking)，如Famham,M.W.,J.AmER.Soc.Hort.Sci.123:73-77(1998)所述，该文献通过引用结合到本文中。遵循Keller,WA(1984):CELLCULTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS，第1卷(Academic Press,New York)，第302-310页)中所述的技术，通过花药培养获得所述植株，所述技术在下面概述。
在受控制的环境条件下从种子培养出植株。在茎延伸之前和任何花出现之前，从发育中的主花序选择芽。将所述芽表面消毒、打开、并从丝上分离下花药。然后将所述花药成组种植在培养皿中以琼脂固化的营养培养基上。在黑暗中培育花药直到从花药发育出胚状体。然后将所述胚状体转移到连续光照下使其变绿。
将带有健康根系的幼小的小植株种植在盆中并在温室中健化。随后将所述植株种植在田中，使其发育成成熟植株。从成熟的再生植株上收获市场阶段的头状花序，并如下面所述测定芥子油苷含量。
实施例2筛选双单倍体植株从双单倍体植株(DH植株)以及从由谱系筛选程序获得的植株(F4植株)和由杂种植株(F1植株)获得的植株获取组织。所述F4植株来源于通过使来自栽培品种Marathon、Everest、High Sierra和Futura的亲本自交产生出的分离群体。各个F4植株由单一F2和F3选择产生得到，所述F4植株根据园艺学特性以及尤其是嫩茎花椰菜头状花序质量而作为最佳单株选择出来。通过使或者来自有性杂交或者来自DH植株的两亲本杂交，产生F1杂种。
基本如以前所述测定嫩茎花椰菜头状花序的芥子油苷含量。然后测定每个组织样品的烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例。
实施例3筛选结果植株的选择筛选DH植株、F4植株和F1植株的结果显示于表1。
表1烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例
测定了几个嫩茎花椰菜栽培品种的烷基芥子油苷浓度对吲哚芥子油苷浓度的比例。显示的结果包括针对几种不同单株类型测定的比例，所述不同单株类型包括通过花药培养产生的双单倍体(“DH”)；通过使或者来自有性杂交或者来自DH植株的两亲本杂交产生的杂种植株(“F1”)；以及得自谱系选择程序的植株(“F4”)。这些F4植株来源于通过使来自指定栽培品种的亲本植株自交而产生的分离群体；所测试的植株是经过4轮自交的单株。
如可以从表1中看出的，来自两个栽培品种的双单倍体植株拥有显著高于其它受测试植株中存在的烷基芥子油苷对引哚芥子油苷的比例。因此，两株来自HiSierra的双单倍体具有的比例比在另一株受测试植株中见到的最高值高至少20％。同样，三株来自海盗的单株具有的比例比在另一株受测试植株中见到的最高值高至少10％。选择这些单株进行进一步的培育。
此外，在温室中，将来自European Sprouting Calabrese Broccoli(JHU#740)同一批种子的约100粒种子种植在Jiffy Mix中。培养7天后，用外科剪刀从每株小植株剪下约40％单个、扩展的子叶，并将剪下的部分立即投入-80℃的三溶剂中以进行随后的匀浆以及离子对色谱HPLC以测定芥子油苷含量。这些样品中的烷基芥子油苷吲哚芥子油苷比例列于表2。所述样品显示了约300倍范围的烷基芥子油苷吲哚芥子油苷比例。
表2烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例
1萝卜苷+Glucoiberin+Glucoerucin2羟基芸苔葡糖硫苷+芸苔葡糖硫苷+新葡糖蔓菁苷实施例4培育选定的植株如以前所述，使作为具有所需烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例而选出的双单倍体单株自体受粉，最好是通过蕾期授粉法而自体受粉。收集后代种子或F1代并种植在田间，然后根据芥子油苷水平进行筛选。在这种情况下，收获用于筛选的组织是市场阶段的嫩茎花椰菜头状花序。将性状稳定的那些植株作为起源于单株植株的近交系维持。如以前所述，通过人工授粉或通过无性繁殖维持所述植株。
当所述近交系在农学上可接受时，可以将该近交系直接用于生产市售嫩茎花椰菜头状花序。或者，可以用所述近交系生产杂种种子。优选用于产生所述杂种种子的另一亲本也是表达高烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的近交系。最后，可以将所述近交系用作提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的性状的来源，所述性状可以通过常规培育技术转移到其它嫩茎花椰菜变种中。
实施例5具有高水平化学防护剂的植株的应用显示所需的芥子油苷分布型的植株(如通过提高的烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例显示)可用于多种用途。所述植株的不同部分可以作为饮食部分而被消费。这些包括市场阶段的头状花序、种子和籽苗。这些植株部分如果未经加工就被直接消费，或者如果所述植株材料经过加工并与其它食物组合使用，这些植株部分就被间接消费。因此，例如，市场阶段的嫩茎花椰菜或花椰菜头状花序或者经过烹饪或未经烹饪被直接消费。
可以将种子直接加入食品中。所述种子可以用于许多不同食物，如色拉、面包和其它焙烤食品。或者，将所述种子磨成粉或粗粉以用作食品或饮料添加剂。将所述粉或粗粉加入面包、其它焙烤食品或健康饮料或混合饮料(shake)。可以将所述粉加入药丸、胶囊或其它可摄取的制剂。
还可使所述种子发芽以产生同样用于多种用途的籽苗。可以将所述籽苗立即加入食品，如新鲜的色拉、三明治或饮料。可以使所述籽苗脱水并加入药丸、胶囊或食品添加剂。或者，制备所述籽苗的无毒溶剂提取物用于制成汤、茶等。一般在无营养的固体支持物上、并且常常是在适于运输和销售的容器中培养籽苗。通常在二叶期(第一对真叶)或更早收获所述籽苗。在种子萌发后，根据生长温度和其它非生物因子，培养所述籽苗1到20天，然后在二叶期或更早收获所述籽苗。
所述种子或籽苗的无毒溶剂提取物可用作有益健康的浸剂或汤。使用无毒溶剂提取所述种子以制备汤、茶或其它饮料和浸剂。用冷水、温水、或最好是热水或沸水提取所述籽苗。如果需要，在提取后，可以除去残留在所述提取物内的种子或籽苗残余物。所述提取物可以直接摄取，或可以对其进行进一步的处理。例如，可以将其蒸发以产生干燥的提取制品。可以将其冷却、冷冻或冻干。可以将其与含有有活性的黑芥子酶的十字花科植物蔬菜混合。这将在摄取前快速将芥子油苷转化成异硫氰酸酯。含有有活性的黑芥子酶的合适蔬菜是萝卜属(Raphanus)，尤其是日本萝卜，即一种萝卜。
实施例6高水平芥子油苷以及它们的异硫氰酸酯同类物在种子和籽苗沥滤液中的展示根据籽苗工业普遍接受的方法，将约600g嫩茎花椰菜种子和苜蓿种子浸入含25％商业化漂白制备物(例如Clorox)的水溶液消毒15分钟后，将它们置于商业化风格的盘型发芽车(sprout cart)上分开但临近的盘上，然后用水彻底清洗所述种子。然后将所述种子置于倾斜的发芽盘上，用上方弥雾喷嘴的喷雾再次清洗，然后使其静置1小时，在此之后经由上方的雾传递水直到每发芽盘约流出并收集约200ml液体。使用每小时六次20秒喷雾继续喷雾直到下一个收集时期，此时再次静置所述盘1小时，然后用新鲜的水清洗下沥滤液并收集所述沥滤液。分析所述沥滤液(该沥滤液在pH6.8呈淡黄色)中存在的芥子油苷的量和类型。
在来自嫩茎花椰菜种子和籽苗的水/清洗水(统称为“沥滤液”)中的异硫氰酸水平从种子消毒处理后第一小时培养后的约13μM增加到培养第七小时后的约192μM。萝卜苷(1-异硫氰酸基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷的前体)的水平在第七小时达到约0.33mM，并且回收的芥子油苷包含99.4％萝卜苷和0.6％新葡糖蔓菁苷。与此相比，在以同样方式处理的苜蓿种子/籽苗中没有这些化合物的踪迹。
来自每小时嫩茎花椰菜沥滤液收集物的总溶解固体(干重)的回收率在3.9mg/ml到5.2mg/ml之间。来自所述种子的萝卜苷的总回收率高达81.5nmol/g种子/小时。如果沥滤持续半天，则它含约1μmol萝卜苷或包含在这些实验中使用的种子中总萝卜苷含量的约20％。
实施例7嫩茎花椰菜种子和籽苗沥滤液对细菌生长的生长抑制效应如实施例6中所述制备的沥滤液对于大肠杆菌菌株DH10B在肉汤培养基中的生长有有力的抑制效应。在使用从多种籽苗制备物收集到的沥滤液完成的多个实验中观察到这种效应。1．来自已萌发的嫩茎花椰菜和苜蓿的种子/籽苗的沥滤液对细菌在正常营养培养基和低营养培养基上生长的效应在完全Luria肉汤(“1X LB”，一种培养这样的微生物的标准培养基)以及低营养培养基(或0.1X LB)上监测细菌生长。通过将干成分(对于全强度的培养基，是10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物以及10g/LNaCl)加入合适体积的沥滤液中，制备培养基，所述沥滤液来自如实施例6中所述消毒种子后制备的收集物。一旦溶解了干的1X或0.1 LB成分，用NaOH将pH调到pH 7.5，然后对所述培养基进行过滤除菌并用所述培养基培养大肠杆菌。
嫩茎花椰菜籽苗沥滤液具有切实的抑制效应。惊人的是，这种效应甚至在低营养培养基背景(0.1X LB)中更显著，而该背景实际上更代表抽芽过程期间存在的实际“营养条件”(图1)。与此相比，从苜蓿籽苗获得的沥滤液没有观察到抑制效应。虽然初始试验表明嫩茎花椰菜籽苗沥滤液的这种生长抑制活性在冻干以及加热到50℃时是稳定的，但在与琼脂基质混合时该活性看起来迅速丧失。2．在萌发期间的不同时间从嫩茎花椰菜种子/籽苗获得的沥滤液对细菌生长的效应如实施例6中所述制备沥滤液，并如实施例7.1.所述监测大肠杆菌在0.1X LB上的生长。用在嫩茎花椰菜种子萌发第一小时、第四小时和第七小时后收集到的沥滤液制备0.1X LB。
嫩茎花椰菜种子/籽苗沥滤液对细菌生长有有力的抑制效应，该效应随着萌发的时间而增加(图2)。差异性效果与沥滤液的异硫氰酸酯含量和芥子油苷-异硫氰酸酯含量轶相关(图3)，并且该效应在嫩茎花椰菜籽苗生长的第三天消失。如实施例6中一样，苜蓿种子沥滤液对细菌生长有刺激效应(用第7小时的沥滤液观察到最终细菌滴度增加34％)。没有一种苜蓿籽苗沥滤液显示对细菌的任何生长抑制效应(图4)。3．来自萌发后4小时和7小时的嫩茎花椰菜种子/籽苗沥滤液(汇集)对葡萄球菌属物种生长的效应金黄色葡萄球菌和一种未鉴定的葡萄球菌属物种的生长被来自萌发后4小时和7小时的嫩茎花椰菜种子/籽苗沥滤液(汇集)的25％稀释液抑制50％，所述沥滤液如实施例6中所述收集。在半固体(琼脂)基质中，使用Tripticase Soy(高蛋白生长培养基)以及标准的最小抑制浓度测定系统进行这些测试。由于抗生素活性看起来在基于琼脂的测试系统中迅速丧失，这些结果可能代表这些化合物可能的生长抑制效应范围的下界。
虽然上面的描述提及具体的优选实施方案，但应当理解本发明并不是如此有限的。对于那些本领域内的一般技术人员来说，对于所公开的实施方案可以作出各种修改，并且这样的修改处于由下面的权利要求书定义的本发明的范围内。本说明书中提到的所有出版物和专利申请指示出本发明所属领域内技术人员的水平。
所有出版物和专利申请通过引用结合到本文中，就如同明确和单独地指出每个单独的出版物或专利申请都通过引用完整地结合的同等程度。
权利要求
1．选择植物的方法，包括(a)测定一株植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例，然后(b)如果该比例是特定数值，则选择该植株。
2．权利要求1的方法，其中所述植株是双单倍体植株。
3．权利要求2的方法，其中所述双单倍体植株通过花药培养技术获得。
4．权利要求1的方法，其中所述植株是诱变处理的植株。
5．权利要求4的方法，其中在(a)前用化学诱变剂诱变处理所述植株。
6．权利要求5的方法，其中所述化学诱变剂是甲基磺酸乙酯。
7．权利要求1的方法，其中所述植株是十字花科植物。
8．权利要求7的方法，其中所述植株是嫩茎花椰菜植株。
9．权利要求8的方法，其中所述植株属于由以下选出的栽培品种Saga、DeCicco、珠穆朗玛峰(Everest)、翡翠城(Emerald City)、Packman、Corvet、Dandy Early、皇帝(Emperor)、Mariner、绿彗星(GreenComet)、Green Valiant、Arcadia、Calabrese Caravel、Chancellor、Citation、巡洋舰(Cruiser)、早紫萌芽红箭(Early Purple Sprouting,Red Arrow)、Eureka、Excelsior、大帆船(Galleon)、Ginga、Goliath、绿公爵(GreenDuke)、绿色地带(Greenbelt)、意大利萌芽(Italian Sprouting)、HiSierra、晚紫萌芽(Late Purple Sprouting)、晚冬萌芽白星(Late Winter SproutingWhite Star)、Legend、Leprechaum、马拉松(Marathon)、水手(Mariner)、Minaret (Romanesco)、杰出典范(Paragon)、爱国者(Patriot)、PremiumCrop、Rapine(Spring Raab)、Rosalind、Salade(Fall Raab)、武士(Samurai)、Shogun、短跑选手(Sprinter)、苏丹(Sultan)、Taiko、和Trixie、以及海盗(Viking)。
10．权利要求8的方法，其中所述植株属于由以下选出的栽培品种海盗(Viking)、珠穆朗玛峰(Everest)、HiSierra和马拉松(Marathon)。
11．权利要求7的方法，其中所述植株是花椰菜植株。
12．权利要求11的方法，其中所述植株属于由以下选出的栽培品种Alverda、Amazing、Andes、勃艮第王后(Burgundy Queen)、CandidCharm、Cashmere、圣诞白(Christmas White)、Dominant、Elby、雪球(Snowball)以及雪球的选择物、Fremont、Incline、Milkyway Minuteman、Rushmore、S-207、Serrano、Sierra Nevada、Siria、雪冠(Snow Crown)、雪片(Snow Flake)、Snow Grace、Snowbred、Solide、Taipan、紫罗兰王后(Violet Queen)、白男爵(White Baron)、白主教(White Bishop)、WhiteContessa、白晕(White Corona)、白鸽(White Dove)、白色闪光(WhiteFlash)、白狐(White Fox)、白骑士(White Knight)、白光(White Light)、白王后(White Queen)、白岩(White Rock)、白帆船(White Sails)、白夏(White Summer)、白顶(White Top)、和Yukon。
13．产生后代植株的方法，所述方法包括(a)测定一株有潜力的亲本植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例，然后(b)如果该比例是特定数值，则选择该有潜力的亲本植株，并(c)从所选定的植株产生后代植株。
14．权利要求13的方法，其中所述后代植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例高于所述选定植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例，并且其中所述后代植株的所述组织与所述选定植株的所述组织是同一类型。
15．通过权利要求13的方法产生的后代植株，其中所述后代植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例高于所述选定植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例，并且其中所述后代植株的所述组织与所述选定植株的所述组织是同一类型。
16．权利要求15的后代植株，其中所述后代植株的所述组织中的所述比例比所述选定植株的所述组织中的所述比例至少大10％。
17．权利要求16的后代植株，其中所述后代植株的所述组织中的所述比例比所述选定植株的所述组织中的所述比例至少大20％。
18．权利要求17的后代植株，其中所述后代植株的所述组织中的所述比例比所述选定植株的所述组织中的所述比例至少大30％。
19．权利要求18的后代植株，其中所述后代植株的所述组织中的所述比例比所述选定植株的所述组织中的所述比例至少大50％。
20．权利要求19的后代植株，其中所述后代植株的所述组织中的所述比例比所述选定植株的所述组织中的所述比例至少大100％。
21．权利要求20的后代植株，其中所述后代植株的所述组织中的所述比例是所述选定植株的所述组织中的所述比例的至少10倍。
22．权利要求21的后代植株，其中所述后代植株的所述组织中的所述比例是所述选定植株的所述组织中的所述比例的至少100倍。
23．权利要求16的后代植株，其中所述后代植株的所述组织中的所述比例比所述选定植株的所述组织中的所述比例大10％到100％。
24．权利要求23的后代植株，其中所述后代植株的所述组织中的所述比例比所述选定植株的所述组织中的所述比例大20％到80％。
25．权利要求24的后代植株，其中所述后代植株的所述组织中的所述比例比所述选定植株的所述组织中的所述比例大30％到60％。
26．权利要求21的后代植株，其中所述后代植株的所述组织中的所述比例是所述选定植株的所述组织中的所述比例的10倍到100倍。
27．权利要求26的后代植株，其中所述后代植株的所述组织中的所述比例是所述选定植株的所述组织中的所述比例的25倍到75倍。
28．权利要求15的后代植株，其中后代所述植株通过使所述选定的植株自交而产生。
29．权利要求15的后代植株，其中所述后代植株是杂种植株。
30．十字花科植物的植株，其中所述植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例大于6。
31．权利要求30的植株，其中所述植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例大于10。
32．权利要求31的植株，其中所述植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例大于25。
33．权利要求32的植株，其中所述植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例大于50。
34．权利要求33的植株，其中所述植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例大于100。
35．权利要求34的植株，其中所述植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例大于1000。
36．权利要求30的植株，其中所述植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例在6到1000之间。
37．权利要求36的植株，其中所述植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例在10到500之间。
38．权利要求37的植株，其中所述植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例在25到250之间。
39．权利要求38的植株，其中所述植株的一种组织中烷基芥子油苷对吲哚芥子油苷的比例在50到100之间。
40．权利要求30的植株，其中所述植株是嫩茎花椰菜植株。
41．权利要求30的植株，其中所述植株是花椰菜植株。
42．选择种子或籽苗的方法，所述方法包括(a)向种子或籽苗加一定量的水，(b)测定所述种子或籽苗的沥滤液中一种芥子油苷的浓度，然后(c)假如该浓度是一个特定值，则选定所述种子或籽苗。
43．产生后代植株的方法，所述方法包括(a)向种子或籽苗加一定量的水，(b)测定所述种子或籽苗的沥滤液中一种芥子油苷的浓度，(c)假如该浓度是一个特定值，则选定所述种子或籽苗，然后(d)由所述选定的种子或籽苗产生后代植株。
44．在能够维持微生物生长的环境中抑制微生物生长的方法，所述方法包括以抑制微生物生长的量给予所述环境十字花科种子沥滤液或十字花科籽苗沥滤液。
45．权利要求44的方法，包括以抑制微生物生长的量给予所述环境十字花科籽苗沥滤液。
46．权利要求44的方法，其中所述方法防止微生物生长。
47．权利要求44的方法，其中所述微生物是一种细菌。
48．权利要求44的方法，其中所述微生物是埃希氏菌属物种。
49．权利要求44的方法，其中所述微生物是大肠杆菌。
50．权利要求44的方法，其中所述微生物是葡萄球菌属物种。
51．权利要求44的方法，其中所述微生物是金黄色葡萄球菌。
52．权利要求44的方法，其中所述沥滤液是嫩茎花椰菜沥滤液。
53．权利要求44的方法，其中所述沥滤液是花椰菜沥滤液。
54．权利要求44的方法，其中所述沥滤液含有芥子油苷。
55．制备籽苗的方法，所述方法包括(a)提供一定量的种子，(b)向所述种子加每g种子0.6到1.0g的水，(c)使所述加水的种子萌发并形成籽苗，然后(d)向所述籽苗加每株籽苗每24小时5到9mg之间的水直至24到120小时，由此制备所述籽苗。
56．权利要求55的方法，其中(b)包括向所述种子加每g种子0.7到0.9g的水。
57．权利要求55的方法，其中(b)包括向所述种子加每g种子0.8g的水。
58．权利要求55的方法，其中(d)包括向所述籽苗加每株籽苗每24小时6到8mg之间的水直至24到120小时。
59．权利要求55的方法，其中(d)包括向所述籽苗加每株籽苗每24小时7mg的水直至24到120小时。
60．权利要求55的方法，其中(d)包括向所述籽苗加每株籽苗每24小时5到9mg之间的水直至48到96小时。
61．权利要求55的方法，其中(d)包括向所述籽苗加每株籽苗每24小时7mg的水直至72小时。
62．权利要求55的方法，其中所述籽苗是十字花科植物的籽苗。
63．权利要求55的方法，其中所述籽苗是嫩茎花椰菜籽苗。
64．权利要求55的方法，其中所述籽苗是花椰菜籽苗。
全文摘要
产生具有高水平癌症化学防护剂的十字花科植物种质(尤其是嫩茎花椰菜种质和花椰菜种质)的方法,包括根据芥子油苷分布型筛选植株群体,并选择具有提高的烷基芥子油苷/吲哚芥子油苷比例的单株。用所选定的植株的随后培育产生具有所需芥子油苷分布型的变种、系以及植株。通过以限制的水体积萌发种子,培养十字花科植物的籽苗以增强所述籽苗的化学防护活性的方法。产生十字花科植物种质的方法,所述十字花科植物种质产生种子物质渗漏降低的种子,所述方法包括根据产生渗漏降低的种子筛选植株群体并选择产生这样的种子的单株。
文档编号C12N15/09GK1314781SQ99810066
公开日2001年9月26日 申请日期1999年7月1日 优先权日1998年7月1日
发明者J·W·费伊 申请人:约翰斯霍普金斯医学院