专利名称：Hcv包膜蛋白颗粒∶用于疫苗接种的用途的制作方法
技术领域：
本发明是基于这样的发现HCV包膜蛋白在处于异种亚型1a或亚型1b HCV株慢性感染的黑猩猩中诱导有益的免疫应答。更具体地说，本发明涉及这样的发现包膜蛋白的免疫原性高并导致既刺激细胞免疫应答，也刺激体液免疫应答。而且，本发明还涉及这样的发现通过烷化作用封闭半胱氨酸产生免疫原性甚至更高的蛋白。此外，本发明的包膜蛋白可以加入到具有高免疫原性和免疫反应性的颗粒中。进一步证实这样的颗粒可以加入其它蛋白。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)感染是发达国家和发展中国家存在的主要健康问题。据估计，约有1-5％的世界人口受到丙型肝炎病毒的影响。HCV感染似乎是输注性肝炎最重要的原因，并常常发展为慢性肝损害。而且有证据表明，HCV诱发肝细胞癌。所以，迫切需要可靠的诊断方法和有效的治疗药物。也需要对HCV污染的血液制品敏感和特异性的筛选方法以及对HCV培养的改良方法。
HCV是约有9,600个碱基的正链RNA病毒，它编码至少三种结构蛋白和6种非结构蛋白。根据序列同源性，结构蛋白在功能上分为唯一的核心蛋白和两种包膜蛋白E1和E2。E1由192个氨基酸组成，并根据HCV基因型包含5-6个N-糖基化位点。E2蛋白由363-370个氨基酸组成，并根据HCV基因型包含9-11个N-糖基化位点(关于其综述见Major和feinstone,1997；Maertens和Stuyver,1997)。E1蛋白含有各种可变域(Maertens和Stuyver,1997)，而E2蛋白含有3个高变域，其中主域位于所述蛋白的N末端(Maertens和Stuyver,1997)。后一种包膜蛋白已通过重组技术在大肠杆菌、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞产生。表达系统在高级真核生物、尤其是哺乳动物细胞培养物中的应用产生被患者样品中的抗体有效识别的包膜蛋白(Maertens等，1994)。
已经提出E1包膜蛋白需要E2包膜蛋白才能达到合适的折叠状态(Deleersnyder等，1997)。另外，已经提出E1和E2可形成构成病毒包膜基本单位的异二聚体(Yi等，1997)。在Liang等的WO 98/21338中，已将这些设想用于构建HCV颗粒，该颗粒由E1和E2以及核心蛋白和P7组成。换句话说，现有技术没有指出分别将E1或E2用于免疫接种和其它目的。但是Houghton(1997)报告，采用重组gpE1E2(4×25μg)反复接种免疫3只慢性HCV感染黑猩猩并没有诱发显著的免疫应答。本申请的发明人推论，在慢性丙型肝炎患者诱导抗包膜免疫应答应该切实可行，并有益于所述患者，因为似乎较高水平的这样的抗体与对干扰素治疗的良好反应有关，从而有助于所述患者清除所述病毒(Matertens等的PCT/EP 95/03031)。本发明的发明人进一步推论，因为在慢性HCV携带者中抗E1抗体水平是所有HCV抗体中最低的，所以升高这些抗体的水平可能是有益的，而且所述细胞应答可诱导控制甚或消除所述宿主的感染。对E1的高水平细胞免疫似乎也与对干扰素治疗的良好反应有关(Leroux-Roels等，1996)。
除了抗E1免疫与干扰素治疗有关的重要性外，其它种种迹象表明，HCV基因组的某些其它部分可能对诱导可允许控制感染的特异性免疫应答是重要的。在干扰素治疗反应患者中还更为常见地观察到对所述核心蛋白C末端区的T细胞反应性(Leroux-Roels等，1996)。在肝移植后消除了HCV的患者中证实了抗NS4B蛋白的潜在中和抗体(Villa等，1998)。也已对NS3中的几种T细胞表位作图，这几种表位似乎与急性期清除HCV有关(参见Leroux-Roels等的PCT/EP94/03555；Leroux-Roels等，1996；Rehermann等，1996和1997；Diepolder等，1995和1997)。此外，抗NS5A的抗体如E1抗体在α干扰素治疗之前为基线水平的长时性反应者(LTR)中具有较高水平，这是与无反应者比较而言。
目前HCV的治疗性疫苗接种还未取得成功。而且预防性疫苗接种仅显示对HCV同种病毒株的有效预防(Choo等，1994)。本发明涉及令人惊奇的发现，即给予HCV包膜抗原能够显著改善异种病毒株或分离株感染的个体的慢性活动性肝炎的病况，对于异种亚型1a或异种亚型1b感染都可以。实际上，给予6个剂量的50μg E1s(即E1的192-326氨基酸)的慢性感染的黑猩猩令人惊奇地显示强烈的体液免疫和细胞免疫应答，所述免疫应答在后一疫苗接种之前的整个慢性感染期间均未成功建立。而且在免疫接种后2-5个月内在肝脏检测不到病毒抗原并在免疫接种后至少5个月仍然不能检测到病毒抗原。尽管血清的HCV-RNA滴度并未下降，但是血清肝脏酶水平显示明显正常化趋势。最重要的是，两只受疫苗接种的黑猩猩的肝脏组织学均显著改善。本发明还涉及的令人惊奇的发现是，用于疫苗接种的E1蛋白表达为不需要疏水性锚的单一HCV蛋白，它可形成稳定的颗粒。还应该注意的是，为了避免诱导针对非相关表位的免疫应答，构建为从一个慢性携带者的单一血清样品获得的各个克隆的共有序列的用于免疫接种的E1蛋白。本申请另外涉及的发现是，通过采用基因型不同于所述宿主感染的基因型的抗原可增强诱导所述抗E1应答。而且，本申请涉及以下发现例如借助于N-(碘乙基)-三氟乙酰胺、乙烯亚胺或活性卤素如碘乙酰胺烷基化HCV包膜蛋白的半胱氨酸时，上述寡聚颗粒显示甚至更高的免疫原性。最后，本发明还涉及以下发现在上述的寡聚颗粒中HCV包膜蛋白的半胱氨酸突变为任何其它天然存在的氨基酸，优选突变为蛋氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸，这样的突变与原包膜蛋白相比也产生更高的免疫原性。
发明目的由文献可知，迫切需要开发可靠的HCV疫苗和有效的HCV治疗药物。所以，本发明的目的是提供能够甚至在(不仅限于此)慢性HCV携带者中诱导针对HCV包膜蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫的抗原制剂。所述相同抗原能用于所述免疫应答的诊断。
更具体地说，本发明的目的是提供以上定义的抗原制剂，它含有单一HCV包膜蛋白的稳定颗粒。应该清楚的是，这样的颗粒或制备这样的颗粒的方法是本领域未知的。而且，本领域没有证据指出，包括这样的稳定颗粒或所述纯化的单一HCV包膜蛋白的任何抗原制剂可成功用作针对HCV的(异种)预防性或治疗性疫苗。因此，本发明的目的是，除了提供编码HCV抗原的DNA疫苗外，还提供能够成功用作针对HCV的预防性剂或治疗剂的稳定颗粒的生产方法。更具体地说，本发明的目的是，提供基于去垢剂辅助颗粒形成的该稳定颗粒的生产方法(参见下文)。此外，本发明的目的是提供从不同HCV基因型获得抗原组成的颗粒的制备方法。
此外，本发明的目的是提供为各个克隆的共有序列的抗原，所述共有序列使得所述蛋白更正确地折叠。这是为了避免刺激针对非相关表位的免疫。
而且，本发明的目的在于提供特别用于治疗性疫苗接种的抗原制剂，其中所述抗原制剂基于感染慢性携带者的HCV的基因型。在该方面，本发明的目的是提供与慢性携带者的基因型或亚型不同或同种的基因型或亚型的包膜蛋白。
本发明的再一目的是提供采用可联用其它化合物的上述抗原或DNA疫苗治疗或治疗性疫苗接种慢性感染患者的方法。本发明的目的还在于提供针对HCV的预防性疫苗接种人类的方法。
本发明的另一目的是提供高免疫原性的寡聚颗粒，高免疫原性的原因是HCV包膜蛋白的至少一个半胱氨酸残基突变为天然氨基酸，优选突变为蛋氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸。或者可烷基化HCV包膜蛋白的至少一个半胱氨酸残基。特别是后一种蛋白可借助于乙烯亚胺、N-(碘乙基)三氟乙酰胺或活性卤素进行烷基化。在该方面，本发明的目的在于提供寡聚颗粒另外用作有效提供非HCV表位的载体的用途。
本发明的再一目的是提供用抗包膜抗体如抗E1抗体例如抗E1V2区抗体治疗急性或慢性感染患者的方法，该方法单独进行或联合其它治疗实施。
本发明的另一目的是提供与本发明包膜蛋白一起的T细胞刺激抗原如核心抗原、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B。
我们认为下文陈述的实施方案已达到本发明的所有目的。
图表简述表1提供得自单一慢性携带者的E1克隆的序列，用于产生疫苗的E1构建物为所有这些个体克隆的共有序列。V1-V5，可变区1-5；C4，恒定域4；HR，疏水区；HCV-B con，在克隆和HCV-J之间可变的位置的共有序列。
表2提供E1疫苗蛋白和在感染黑猩猩Phil和Ton中发现的E1蛋白的序列。Phil的1b亚型分离株与疫苗株的差异为5.92％。所述疫苗和Ton的1a亚型分离株的差异为20.74％。
表3提供治疗性疫苗接种在两只慢性感染黑猩猩(Ton和Phil)诱导的改变的简单概述。如图8和11所示进行分析。另外，根据肝脏活组织检查对组织学和炎症进行评价。
表4提供用于绘制B细胞表位的肽序列。注意HR与V4V5重叠。
表5显示NS3的重排，以便制备携带所有与病毒清除有关的主要表位的较短的蛋白。
表6显示E1s乙酰胺和E1s马来酰亚胺与慢性HCV携带者血清在LIA中的反应性的比较。将蛋白固定在LIA膜上。E1s乙酰胺原样喷射在LIA条上，而E1s马来酰亚胺(还含有生物素-马来酰亚胺)与链霉亲合素复合后进行喷射。将抗原结合到LIA膜上，基本上如Zrein等(1998)所述处理条带。用缀合碱性磷酸酶的人抗IgG对针对这些抗原的人抗体进行显色。NBT和BCIP用于所述条带的显色。染色记为0.5-4，如Zrein等(1998)所释。该分析的界限采用0.5，在表的下面给出了阳性样品数(#pos)和百分率(％pos)。
图1 根据Maertens等(PCT/EP95/03031)所述表达和纯化的E1s和E2s蛋白在PBS/3％Empigen-BB中的尺寸排阻层析分布的重叠。图2 E1s和E2s蛋白的尺寸排阻层析(SEC)分布的重叠。所述蛋白按照Maertens等(PCT/EP95/03031)表达和纯化，并使其在PBS/0.2％CHAPS中于相同SEC柱上再进行一次层析，获得估计表观分子量为250-300 kDa的特异性寡聚结构。采用3％甜菜碱可获得相似的缔合度。图3 E1s和E2s蛋白的尺寸排阻层析(SEC)分布的重叠，所述蛋白按照Maertens等(PCT/EP95/03031)表达和纯化，并使其在0.2％CHAPS或3％甜菜碱中进行第二次层析，获得图2所示的特异性寡聚结构，使其在0.05％CHAPS中于相同SEC柱上进行第三次层析，获得估计表观分子量为250-300 kDa(E2s)和＞600 kDa(E1s)的特异性同寡聚结构。采用0.1％或0.5％甜菜碱可获得相似缔合度。图4 E1s在PBS/0.05％CHAPS中的动态光散射分析，以颗粒数相对于所观测的直径(nm)的百分率表示。图5 E1s在PBS/0.1％甜菜碱(顶部)或0.5％甜菜碱(底部)中的动态光散射分析，以颗粒数相对于所观测的直径(nm)的百分率表示。图6 (A)E1s在PBS/0.05％CHAPS中的EM染色和(B)E1s在PBS/3％甜菜碱中的EM染色。图7 E1s在PBS/0.05％CHAPS中的颗粒大小分布。图8在1b感染黑猩猩(Phil)中6次连续的免疫接种和3次加强免疫接种(小箭头所示)诱导的抗E1抗体的变化，以及ALT、HCV RNA和抗E1抗体的变化。采用缀合过氧化物酶的抗人IgG特异性第二抗血清检测结合至固相E1的抗E1抗体。TMB用作显色底物。所述结果以终点效价表示。用临床分析仪测定ALT水平，并以U/l表示。采用HCV监测仪(Roche,Basel，瑞士)测定血清中的HCV RNA。采用特异性单克隆(ECACC收录号为98031215，如EP申请第98870060.5号所述)半定量检测在肝脏活组织检查中染色的E2抗原量，从而测定肝脏的病毒负荷量。图9 用E1免疫接种黑猩猩Phil诱导的抗体应答的表位作图。针对各种肽的抗体反应性以间接ELISA检测，其中生物素化肽(另参见表4)通过链霉亲合素吸附到微量滴定板上。采用缀合过氧化物酶的抗人IgG特异性第二抗血清检测特异性抗体。TMB用作显色底物。图10免疫接种黑猩猩Phil之前和之后的淋巴细胞增殖分析结果。解冻PBMC并用不同抗原以一式三份进行刺激。阴性对照为单独的培养基，5μg/ml浓度的刀豆球蛋白A用作阳性对照。在U形96孔微量滴定板中，将在150μl总体积中的细胞浓度为2-4×105细胞/孔的PBMC和所述对照或1μg/ml E1一起在补加有10％热失活FCS的RPMI 1640培养基中，于37℃、含有5％CO2的湿润氛围下培养90小时。在最后18小时以每孔0.5μCi(3H)胸苷对所述细胞施加脉冲。然后，将所述细胞收集在玻璃纤维滤膜上，并测定吸收标记。结果以刺激指数(SI)表示一式三份测定结果的抗原的平均cpm/单独培养基的平均cpm。图11在HCV 1a亚型感染的黑猩猩Ton中6次连续免疫接种和3次加强疫苗接种(小箭头所示)诱导的抗E1抗体的变化。显示血清ALT、HCV RNA变化和肝脏HCV抗原测定结果。通过间接ELISA测定抗E1抗体采用缀合过氧化物酶的抗人IgG特异性第二抗血清检测结合至固相包被的E1的特异性抗体。TMB用作显色底物。结果以终点效价表示。用临床分析仪测定ALT水平，并以U/l表示。采用HCV监测仪(Roche,Basel，瑞士)测定
HCV RNA。采用特异性单克隆(ECACC收录号98031215，如EP申请第98870060.5号所述)在肝脏活组织检查中染色E2抗原。半定量评价如下表示黑色方框表示细胞的大部分非常清晰的阳性染色，灰色方框表示在细胞少数部位具有清晰的染色，白色方框表示显示没有可检测到的染色的活检组织。HCVRNA用小黑色方框表示。用核心蛋白和E1染色可证实E2染色(资料未提供)。图12用E1免疫接种Ton诱导抗体应答的表位作图。用间接ELISA检测抗体对各种肽的反应性，其中生物素化肽(另参见表4)通过链霉亲合素吸附到微量滴定板上。采用缀合过氧化物酶的抗人IgG特异性第二抗血清检测特异性抗体。TMB用作显色底物。图13分析在黑猩猩Ton中对1a亚型和1b亚型E1蛋白的E1抗体应答。为此产生表达与1b基因型相同的E1部分的1a基因型E1(衍生自HCV-H序列)的重组痘苗病毒(参见下文)。E1产生自感染痘苗病毒的RK13细胞的粗裂解物(按Maertens等(PCT/EP95/03031)所述制备)。用间接ELISA检测抗体反应性，其中E1通过高甘露糖结合的雪地花莲碱(Galanthus nivalis)凝集素(GNA)吸附到微量滴定板上。采用缀合过氧化物酶的抗人IgG特异性第二抗血清检测特异性抗体。TMB用作显色底物。结果表示为差示OD(吸附E1孔的OD减去没有吸附E1的孔的OD)。图14免疫接种黑猩猩Ton之前和之后的淋巴细胞增殖分析结果。解冻冷冻的PBMC，并用不同抗原一式三份进行刺激。阴性对照为单独的培养基，浓度为5μg/ml的刀豆球蛋白A用作阳性对照。在U形96孔微量滴定板中，将在150μl总体积中的细胞浓度为2-4×105细胞/孔的PBMC和所述对照或1μg/ml E1一起在补加有10％热失活FCS的RPMI 1640培养基中，于37℃、含有5％CO2的湿润氛围下培养90小时。在最后18小时以每孔0.5μCi(3H)胸苷对所述细胞施加脉冲。然后，将所述培养物收集在玻璃纤维滤膜上，并测定吸收标记。结果以刺激指数(SI)表示一式三份测定结果的抗原的平均cpm/单独培养基的平均cpm。图15用于表达其N末端高变区缺失的E2蛋白的构建物图。构建物pvHCV-92和pvHCV-99是用于构建缺失突变体pvHCV-100和pvHCV-101的中间体构建物。图16与图15所示构建物相应的序列(核苷酸A；翻译产物B)(参见上文)。图17用实施例9所述的不同E1制剂免疫接种时在小鼠获得的抗体效价。采用ELISA测定效价稀释小鼠血清20倍并进一步系列稀释(0.5log10)，对包被在微量滴定板上的E1s(乙酰胺或马来酰亚胺修饰)进行温育。洗涤后，用缀合过氧化物酶的抗小鼠IgG特异性第二抗血清检测结合抗体。TMB用作显色底物。结果表示为终点效价并显示标准差(n=6)。图18用不同E1s制剂免疫接种小鼠诱导的抗体应答的表位作图。用间接ELISA检测抗体对各种肽的反应性，其中生物素化肽(表4列出)通过链霉亲合素吸附到微量滴定板上。稀释小鼠血清20倍，并采用缀合过氧化物酶的抗小鼠IgG特异性第二抗血清检测特异性抗体。TMB用作显色底物。图19用不同E1s制剂免疫小鼠的免疫球蛋白同种型分布。特异性Ig类和亚类抗体吸附在微量滴定板上。从稀释500倍的免疫血清捕获小鼠Ig后，以1μg/ml温育E1s。形成的免疫复合物再与针对E1的多克隆兔抗血清温育。最后，用缀合过氧化物酶的山羊抗兔Ig第二抗血清检测兔抗体。TMB用作显色底物。结果对IgGl归一化(即对于每一动物，IgGl信号分别记为1，其它同种型的所有结果都表示为对该IgGl结果的相对值)。图20用E1s-乙酰胺在约1000天两次免疫接种黑猩猩Phil诱导的抗体效价。采用间接ELISA检测抗E1抗体用缀合过氧化物酶的抗人IgG特异性第二抗血清检测结合至固相E1的特异性抗体。
效价以单位/ml表示，这些单位是指基于人血清的固有标准。图21用E1s-乙酰胺在约900天两次免疫接种黑猩猩Ton诱导的抗体效价。采用间接ELISA检测抗E1抗体用缀合过氧化物酶的抗人IgG特异性第二抗血清检测结合至固相E1的特异性抗体。
效价以单位/ml表示，这些单位是指基于人血清的固有标准。图22最后的减少去垢剂的步骤(0.2-0.05％CHAPS)的SEC分布单独的E1颗粒(A)，单独的E2颗粒(B)或E1和E2的等摩尔混合物；混合颗粒(C)。该图还显示特异性检测只有E1(上部)、只有E2(中间)的ELISA以及检测只有混合颗粒(底部)的ELISA的OD值的重叠。图23最后的减少去垢剂的步骤(0.2-0.05％CHAPS)的SEC分布单独的E1 1b基因型颗粒(上部)，单独的E1 4基因型颗粒(中间)或E11b基因型和4基因型的等摩尔混合物；混合颗粒(底部)。该图还显示特异性检测只有混合颗粒(另参见图22)的ELISA的OD值的重叠。
发明详述本文描述的发明吸收了以前公开的著作和待审批的专利申请。作为实例，这样的著作包括科学论文、专利或待审批的专利申请。上文或下文引用的所有这些公开出版物和申请均通过引用结合到本文中。
本发明涉及HCV疫苗接种。采用HCV抗原疫苗接种首次能够成功实现对严重慢性活动性丙型肝炎黑猩猩的免疫治疗。所述疫苗不仅诱导高免疫应答，而且诱导从肝脏清除病毒抗原，以及显著改善肝脏病变和组织学活动性。本发明还涉及纯化的单一HCV包膜蛋白，尤其是寡聚颗粒。所述寡聚颗粒主要包括HCV包膜蛋白，其直径用动态光散射或尽可能以电子显微镜检测为1-100nm。在该方面，应该强调的是，只有E1和/或E2蛋白或其部分(参见下文)能够形成所述颗粒。所以，本发明的寡聚颗粒基本上不同于WO 98/21338中描述的HCV样颗粒，该颗粒必需由E1、E2、核心蛋白和P7组成。术语“基本上由HCV包膜蛋白组成的寡聚颗粒”本文定义为含有数个HCV E1和/或E2包膜蛋白的基本单位、具有特异性性质和形状的结构，认为其分别独立地由一个或两个E1和/或E2单体组成。应该清楚的是，本发明的颗粒定义为没有感染性HCV RNA基因组。本发明颗粒可以是空心的球形特性的高级颗粒，它由其中可加入脂质、去垢剂、HCV核心蛋白或辅助剂分子的包膜蛋白壳组成。后一种颗粒也可以用脂质体或载脂蛋白例如载脂蛋白B或低密度脂蛋白或用任何其它将所述颗粒导向特定器官或组织的手段进行包囊化。在此情况下，这样的空心球形颗粒通常称为“病毒样颗粒”或VLP。或者，所述高级颗粒可为固体球形结构，其中所述完整球体由HCV E1或E2包膜蛋白寡聚体组成，其中可以另外加入脂质、去垢剂、HCV核心蛋白或辅助剂分子，或其本身又可以以脂质体或载脂蛋白例如载脂蛋白B、低密度脂蛋白，或任何其它将所述颗粒导向特定器官或组织的手段例如脱唾液酸糖蛋白进行包囊化。所述颗粒也可以由较小的结构组成(与上述空心或固体球形结构相比而言)，所述结构通常为圆形(参见下文)而且通常不含有单层以上的HCV包膜蛋白。所述较小颗粒的典型实例是由较少数目(通常为4-16个)的HCV包膜蛋白组成的玫瑰花样结构。后者的具体实例包括本文例举的用E1s的0.2％CHAPS获得的较小颗粒，所述颗粒显然含有8-10个E1s单体。所述玫瑰花样结构通常以平面组构而且为圆形，例如轮形。此外，脂质、去垢剂、HCV核心蛋白或辅助剂分子可以另外加入，或所述较小颗粒可以以脂质体或载脂蛋白例如载脂蛋白B或低密度脂蛋白，或通过任何其它将所述颗粒导向特定器官或组织的手段进行包囊化。较小颗粒也可以形成由相似的较少的HCV E1或E2包膜蛋白组成的小球形结构，其中可以另外加入脂质、去垢剂、HCV核心蛋白或辅助剂分子，或其本身又可以用脂质体或载脂蛋白例如载脂蛋白B或低密度脂蛋白，或任何其它将所述颗粒导向特定器官或组织的手段进行包囊化。按本领域众所周知的动态光散射技术(参见以下实施例部分)测定以上定义的颗粒的大小(即直径)，通常为1-100nm，更优选为2-70nm，甚至更优选2-40nm、3-20nm、5-16nm、7-14nm或8-12nm。
本发明还涉及以上定义的寡聚颗粒，其中所述包膜蛋白选自HCVE1、HCV E1s、HCV E2蛋白、SEQ ID NO13或SEQ ID NO14，或其部分。在Maertens等的PCT/EP 95/03031中对HCV E1和HCV E2蛋白以及如何纯化后一类蛋白的详细描述进行了充分描述和特征鉴定。可以按Maertens等的PCT/EP 95/03031中关于HCV E1或HCV E1s的描述，相似地纯化HCV E1s、SEQ ID NO13或SEQ ID NO14或其部分。应该强调的是，后一文献的全部内容，包括所有定义，都通过引用结合到本申请中。HCV E1s蛋白是指E1的氨基酸192-326，而且代表没有其C末端疏水锚的E1蛋白。术语“或其部分”是指一旦它们为本发明颗粒的部分，就是具有免疫原性的本文所述蛋白的任何部分。
本发明还涉及本文所述寡聚颗粒，其中上述HCV包膜蛋白的至少一个半胱氨酸残基被烷基化，优选通过烷基化剂例如活性卤素、乙烯亚胺或N-(碘乙基)三氟乙酰胺烷基化。在该方面，应该理解的是，烷基化的半胱氨酸是指其硫原子上的氢被(CH2)nR取代的半胱氨酸，其中n为0、1、2、3或4,R为H、COOH、NH2、CONH2、苯基或它们的任何衍生物。可用本领域任何已知的方法例如活性卤素X(CH2)nR进行烷基化，其中X为卤素如I、Br、Cl或F。活性卤素的实例有甲基碘、碘乙酸、碘乙酰胺和2-溴乙胺。烷基化的其它方法包括应用乙烯亚胺或N-(碘乙基)三氟乙酰胺，它们均导致H被-CH2-CH2-NH2取代(Hermanson,1996)。本文使用的术语“烷化剂”是指能够进行本文所述烷基化作用的化合物。这样的烷基化最终产生能够模拟其它氨基酸的修饰半胱氨酸。用乙烯亚胺烷基化产生结构上类似的赖氨酸，其方式为导入新的胰蛋白酶切割位点(Hermanson 1996)。同样，应用甲基碘产生类似的氨基酸即蛋氨酸，而应用碘乙酸和碘乙酰胺分别产生类似的氨基酸谷氨酸和谷氨酰胺。相似的是，这些氨基酸优选用于半胱氨酸的直接突变。所以，本发明涉及本文所述的寡聚颗粒，其中本文所述的HCV包膜蛋白的至少一个半胱氨酸残基突变为天然氨基酸，优选突变为蛋氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸。术语“突变的”是指对编码这些氨基酸的核酸的定点诱变，即本领域众所周知的方法例如通过PCR的定点诱变或通过寡核苷酸介导诱变的定点诱变，如Sambrook等所述(1989)。
本文使用的术语“纯化的”是指其中目的组分例如HCV包膜蛋白或寡聚颗粒占组合物总组分的至少35％的组合物。所述目的组分优选占所述组合物总组分部分的至少约40％，更优选至少约50％，甚至更优选至少约60％，甚至更优选至少约70％，甚至更优选至少约80％，甚至更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％，最优选至少约98％。所述组合物可以在不影响本文所用的百分纯度的测定的情况下含有其它化合物例如碳水化合物、盐、脂质、溶剂等。“分离的”HCV寡聚颗粒意指至少为35％纯度的HCV寡聚颗粒组合物。在该方面，应该清楚的是，本文使用的术语“纯化的单一HCV包膜蛋白”是指基本纯形式的分离的HCV包膜蛋白。本文使用的术语“基本纯化的寡聚颗粒”和“单一HCV包膜蛋白”是指HCV寡聚颗粒或单一HCV包膜蛋白，使得它们能够用于体外的诊断方法和治疗学。这些HCV寡聚颗粒基本上不含细胞蛋白、载体来源的蛋白或其它HCV病毒组分。通常将这些颗粒或蛋白纯化至均一(至少80％纯度，优选为85％，更优选90％，更优选95％，更优选97％，更优选98％，更优选99％，甚至更优选至少99.5％，最优选采用常规方法例如SDS-PAGE和银染色法检测不到污染蛋白)。
本发明还涉及以上定义的寡聚颗粒，其中所述包膜蛋白为HCVE1、HCV E1s、HCV E2、SEQ ID NO13和/或SEQID NO14或其部分的任何可能的混合物，例如本发明颗粒基本可以包含HCV E1蛋白和HCV E2蛋白、HCV E1蛋白和HCV E1s蛋白、HCV E1s蛋白和HCV E2蛋白以及HCV E1蛋白、HCV E1s蛋白和HCV E2蛋白。而且，本发明还涉及以上定义的寡聚颗粒，其中所述蛋白衍生自不同HCV病毒株、亚型或基因型，例如所述蛋白衍生自基因型1b和基因型4，或为得自一种HCV病毒株或基因型以及至少一种其它HCV病毒株或基因型的HCV包膜蛋白组成的混合物。在Maertens等的PCT/EP 95/04155中对不同HCV病毒株或基因型进行了明确定义以及特征鉴定。再一次强调，该文献的全部内容包括所有定义通过引用结合到本申请中。因此，本发明涉及包含衍生自本领域已知的任何HCV病毒株或基因型的包膜蛋白的寡聚颗粒，或涉及包含衍生自本领域已知的任何HCV病毒株或基因型的蛋白的混合物的颗粒。在该方面，本发明还涉及衍生自以下例举和实施例部分中(参见下文)的各个克隆的共有序列。
本发明还涉及可用一种方法获得的本文所述的寡聚颗粒，以及涉及生产所述寡聚颗粒的所述方法。所述方法的特征在于以下步骤(Ⅰ)纯化HCV包膜蛋白，可能包括应用任选的第一种去垢剂。实质上，步骤(Ⅰ)的纯化方法已在Maertens等的PCT EP 93/03031中进行了详细的描述。重要的是，按照本发明，PCT EP 95/03031中所述的纯化方法中例如用NEM-生物素的封闭步骤和本申请所述的最好用碘乙酰胺的烷基化步骤一起进行。而且步骤(Ⅰ)的纯化方法可能包括应用二硫键裂解剂以及可能包括应用烷化剂。最后，步骤(Ⅰ)的方法获得纯化的HCV包膜蛋白溶液。
(Ⅱ)用去垢剂或盐置换所述纯化的HCV包膜蛋白的溶液，导致形成寡聚颗粒。
(Ⅲ)回收或纯化所述寡聚颗粒，可能包括进一步降低步骤(Ⅱ)的去垢剂或盐的浓度，这进一步有助于形成和稳定在所述置换后形成的寡聚颗粒。
本发明更优选涉及本文所定义的寡聚颗粒以及生产所述颗粒的方法，其中所述任选的第一种去垢剂是Empigen-BB。本发明更优选涉及本文所定义的寡聚颗粒以及生产所述颗粒的方法，其中所述步骤(Ⅱ)的去垢剂是CHAPS、辛基葡萄糖苷(octylglucaside)或吐温，或任何其它去垢剂，吐温更优选为吐温-20或吐温-80。本发明更优选涉及本文所定义的寡聚颗粒以及生产所述颗粒的方法，其中所述盐为甜菜碱。本发明甚至更优选涉及上述定义的寡聚颗粒以及生产所述颗粒的方法，其中所述Empigen-BB的使用浓度为1％-10％以及其中所述CHAPS或吐温的使用浓度为0.01％-10％，或所述甜菜碱的使用浓度为0.01％-10％。本发明甚至更优选涉及以上定义的寡聚颗粒以及生产所述颗粒的方法，其中所述Empigen-BB的使用浓度为3％以及其中所述CHAPS或甜菜碱的使用浓度分别为0.2％或0.3％，此后变换缓冲液而所述CHAPS或甜菜碱的使用浓度分别为0.05％或0.1-0.5％。需要理解的是，上述方法中所用的所有百分率均为重量/体积。应该清楚的是，上述方法(同样参见PCT/EP 95/03031和本申请的实施例部分)是如何生产本发明所述颗粒的实例。在该方面，本发明还涉及任何其它可用于生产本发明所述寡聚颗粒的本领域已知的方法，例如省略PCT/EP95/03031和所述实例部分(见下文)所述的还原剂以及使用替代的宿主细胞，所述细胞在内质网中具有最佳的氧化还原态，用于还原半胱氨酸桥。另外，应该清楚的是，可使用所有烷基甜菜碱，例如具有Cn尾的甜菜碱，其中N=1-20中的一个正整数，以及甜菜碱衍生物，例如磺基甜菜碱。
因为首次采用纯化的HCV抗原免疫接种成功免疫治疗严重慢性活动性丙型肝炎的黑猩猩，所以本发明还涉及纯化的单一HCV包膜蛋白尤其是E1或E1s。而且，本发明涉及包含所述单一HCV包膜蛋白的组合物以及其作为HCV疫苗的用途或其用于生产HCV疫苗的用途。
为了避免诱导针对不相关表位的免疫应答，优选构建作为各个亚型、病毒株或克隆的共有序列的用于疫苗接种的HCV包膜蛋白。因此，本发明还涉及HCV抗原(肽、蛋白或多核苷酸形式)用于免疫接种或诊断的用途。此外，本发明还涉及本文所定义的寡聚颗粒及其用途，其中所述HCV包膜蛋白由共有序列编码，该共有序列基于分离株的准种变异性(分离株共有序列)或基于一个亚型(亚型共有序列)、型或种(型或种共有序列)或全部HCV属(属共有序列)中的不同分离株的共有序列。因此，该共有HCV包膜蛋白的氨基酸序列是衍生自分离株-、亚型-、株-或属共有序列的共有序列。术语“共有”的含义特别涉及到Maertens和Stuyver(1997)和其中所引用的文献。
本发明的寡聚颗粒具有特别有效的表位(参见下文)。所以，所述寡聚颗粒是使本发明表位可诱导非常有效的免疫应答的手段。在本申请中，应该理解的是，本文所定义的HCV包膜蛋白不需要只含有HCV表位。形成所述寡聚颗粒的HCV包膜蛋白可仅含有衍生自HCV的表位，也可以含有衍生自其它外源性致病因子例如HBV或HIV的表位。换句话说，具有HCV包膜蛋白支架的所述寡聚颗粒除了可提供HCV表位外，还能够用作提供非HCV表位的载体。所以，本发明还涉及本文所定义的但是可能不具有HCV表位、可能含有非HCV表位的寡聚颗粒以及其应用和生产。本文所用的术语“外源性致病因子”是指无论存活与否都能够诱发免疫应答、不是所述宿主内源性的、不是HCV的任何致病因子。具体地说，该术语是指病原体、变应原和半抗原。病原体包括朊病毒、病毒、原核生物和真核生物。更具体地说，病毒特别包括HBV、HIV或单纯疱疹病毒但不包括HCV。变应原包括当在所述变应原接触宿主时能够在宿主独立地激发免疫应答的物质或分子。半抗原激发免疫应答的能力类似于变应原，但是与变应原相比，半抗原需要载体分子。
本发明还涉及包含以上所定义的寡聚颗粒的组合物。更具体地说，本发明涉及疫苗组合物。术语“疫苗组合物”是指能够诱导针对HCV的保护(无论是部分还是完全保护)的免疫原性组合物。所以，它包含HCV肽、蛋白或多核苷酸。抗HCV的保护特指对人的保护，但是也指对人类以外的灵长类、trimera小鼠(Zauberman等，1999)或其它哺乳动物的保护。
本发明颗粒可以以原样、生物素化形式(如WO 93/18054中所解释)和/或与中和抗生物素蛋白(Neutralite Avidin)(Molecular Probes Inc.,Eugene,OR,USA)复合的形式使用。还值得注意的是，“疫苗组合物”除了包含活性物质外，还含有合适的赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂，所述添加剂本身不会诱导产生对接受所述组合物的个体有害的抗体，也不会诱导保护。合适的载体通常显著减缓大分子的代谢，所述大分子例如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活的病毒颗粒。这样的载体是本领域技术人员众所周知的。优选的增强所述组合物有效性的佐剂包括但不限于氢氧化铝、WO93/19780中所述的铝与3-O-脱酰化单磷酰脂质A的组合、WO93/24148所述的磷酸铝、在美国专利第4,606,918号中所述的N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺、N-乙酰基-去甲胞壁酰基(normuramyl)-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸2-(1’2’二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)乙胺和含有单磷酰脂质A的RIBI(ImmunoChem Research Inc.,Hamilton,MT,USA)、脱毒内毒素、海藻糖-6,6-二霉菌酸酯以及在2％角鲨烯/吐温80乳剂中的细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。MPL、TDM或CWS三种组分中任何一种也可以单独使用或2×2联合使用。此外，可以使用诸如Stimulon(Cambridge Bioscience,Worcester,MA,USA)或SAF-1(Syntex)的佐剂，以及可以使用以下佐剂QS21和3-去-O-乙酰单磷酰脂质A(WO 94/00153)的组合，或MF-59(Chiron)，或聚[二(羧苯氧基离子(carboxylatophenoxy))磷腈]基佐剂(VirusResarch Institute)，或嵌段共聚物基佐剂如Optivax(Vaxcel,Cythx)，或菊粉基佐剂如Algammulin和GammaInulin(Anutech)，不完全氟氏佐剂(IFA)或Gerbu制剂(Gerbu Biotechnik)。应该理解的是，完全氟氏佐剂(CFA)也可用于非人类用途以及研究目的。“疫苗组合物”还可含有赋形剂和稀释剂，它们本身是无毒和非治疗性的，例如水、盐水、甘油、乙醇、湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质、防腐剂等。疫苗组合物通常制备为可注射的液体溶液或悬浮液。也可以制备为在注射前适于用液体载体溶解或悬浮的固体形式。所述制剂也可以以脂质体乳化或包囊化以增强佐剂作用。所述多肽也可以加入免疫刺激复合物和皂苷类如Quil A(ISCOMS)中。疫苗组合物包含免疫有效量的本发明多肽和任何其它上述组分。“免疫有效量”是指以单剂量或系列分剂量给予个体的有效预防量或治疗量。该剂量随以下因素而不同所治疗个体的健康和生理状况、所治疗个体的分类群(例如人类、人类以外的灵长类、灵长类等)、个体免疫系统建立有效免疫应答的能力、所需要保护的程度、疫苗配方、治疗医生的评价、感染的HCV病毒株和其它相关因素。预期所述剂量是可通过常规试验确定的较宽剂量范围。通常该剂量范围为0.01-1000μg/剂，更特别为0.1-100μg/剂。所述疫苗组合物常规为胃肠外给予，通常为注射例如皮下或肌内给予。适合其它给药方法的其它制剂包括口服制剂和栓剂。给药治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。所述疫苗可以联合其它免疫调节剂给予。所以，本发明涉及使用本文定义的寡聚颗粒预防性诱导针对HCV的免疫。值得注意的是，疫苗也可以用于治疗以上所述个体，在此情况下的疫苗称为“治疗疫苗”。
本发明还涉及以上定义的组合物，它还包含HCV核心蛋白、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和/或NS5B蛋白，或其部分。E1、E2和/或E1E2颗粒可以例如联合T细胞刺激抗原，例如核心蛋白、P7、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和/或NS5B。本发明特别涉及以上定义的组合物，其中所述NS3蛋白或其部分具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的氨基酸序列(详见实施例部分)。这些NS3蛋白的纯化优选包括可逆性修饰半胱氨酸残基，甚至更优选磺化半胱氨酸。在Maertens等的PCT/EP 99/02547中已描述了用于NS3蛋白的获得这样的可逆性修饰包括磺化的方法。要强调的是，该文献的全部内容包括所有定义通过引用结合到本申请中。
由上可知，本发明还涉及以上定义的寡聚颗粒或以上定义的组合物用于生产HCV疫苗组合物的用途。本发明特别涉及应用本文定义的寡聚颗粒诱导抗慢性HCV携带者的HCV的免疫的用途。本发明更特别涉及在任何其它治疗之前、同时或之后应用本文定义的寡聚颗粒诱导抗慢性HCV携带者的HCV的免疫的用途，所述其它治疗例如众所周知的干扰素治疗，可联合或不联合给予少量治疗HCV的药物，例如病毒唑。这样的组合物也可以在肝移植之前或之后、或推测感染(例如针刺伤)后使用。另外，本发明涉及含有本发明寡聚颗粒或本发明单一HCV包膜蛋白的试剂盒，用以检测生物样品中的HCV抗体。本文使用的术语“生物样品”是指从个体分离的组织或体液样品，包括但不限于例如血清、血浆、淋巴液、皮肤外部，呼吸道、肠道和泌尿生殖道、卵母细胞、眼泪、唾液、乳、血细胞、肿瘤、器官、胃分泌液、粘液、脊髓液、外分泌物如大便、尿液、精子等。因为本发明寡聚颗粒和单一HCV包膜蛋白具有高度免疫原性，既可刺激体液免疫应答，又可刺激细胞免疫应答，所以本发明还涉及用于检测HCV相关性T细胞应答、包含本发明寡聚颗粒或纯化的单一HCV包膜蛋白的试剂盒。例如可按实施例部分所述或Leroux-Roels等在PCT/EP94/03555中所述检测HCV T细胞应答。需要强调的是，该文献的全部内容包括所有定义通过引用结合到本申请中。
应该清楚的是，本发明还涉及应用特异性HCV免疫球蛋白治疗和预防HCV感染。本发明首次证实足量水平的HCV抗体尤其是HCV包膜抗体诱导缓解丙型肝炎疾病。还首次证实足量水平的抗体能够结合循环病毒，以及抗体-复合的病毒的存在与HCV抗原从肝脏消失和肝脏病变缓解相一致。HCV包膜抗体可通过疫苗接种诱导或可以在从HCV感染血库或得自已接种HCV疫苗者的血液中纯化出该抗体后通过注射被动转移。所以本发明还涉及针对上述寡聚颗粒或上述组合物或单一HCV包膜蛋白产生的特异性抗体。本发明特别涉及包含检测HCV抗原的所述抗体的试剂盒。本文使用的术语“特异性抗体”是指针对本发明公开的寡聚颗粒特异性的表位产生的抗体。换句话说，特异性抗体是针对产生自寡聚颗粒形成的表位或仅存在于寡聚颗粒上的表位产生的抗体。而且，已知有产生HCV肽的各种方法。这些方法可产生能够提供表位的HCV肽。可以想象用这些各异的方法获得的HCV肽能够提供相似的表位。相似表位是产生自不同生产或纯化方法但是可被一种抗体和所述相同抗体识别的表位。然而，本发明寡聚颗粒提供非常有效的表位。因此，在所述寡聚颗粒上的表位是高免疫原性的。所以，本发明还涉及寡聚颗粒上的表位，与不是按照本发明生产的HCV-肽-即不是通过去垢剂辅助颗粒形成产生的HCV-肽相比，所述表位的免疫原性至少高10倍，优选至少高20倍，优选至少高50倍，优选至少高100倍，优选至少高500倍，最优选高1000倍。本领域技术人员应该认识到，例如能够检测所述免疫原性，并因此可通过给予相似量的用以上两种方法中的每一种方法生产的肽免疫哺乳动物，对免疫原性进行比较。而且，所述术语“特异性抗体”也是指针对纯化的单一HCV包膜蛋白产生的抗体。本文使用的术语“抗体”是指多克隆或单克隆抗体。术语“单克隆抗体”是指具有均一抗体群的抗体组合物。术语“抗体”不受限于所述抗体的物种或来源，也不受限于其制备方法。此外，术语“抗体”也指人源化抗体，其中免疫球蛋白构架区的至少一部分得自人免疫球蛋白序列和单链抗体，例如如美国专利第4,946,778号所述，也指保持原抗体的抗原结合功能和特异性的抗体片段如Fab、F(ab)2、Fv和其它片段。
而且，本发明的另一特征是应用上述寡聚颗粒或上述组合物检测抗HCV包膜蛋白的抗体。本文使用的术语“用以检测”是指适合用于检测的本领域已知的任何分析。该术语特别指WO 96/13590所述的任何免疫分析。
在本发明中术语“肽”、“多肽”和“蛋白”交替使用。“多肽”是指氨基酸聚合物(氨基酸序列)，而不是指具体长度的所述分子。因此，寡肽包含在多肽定义中。应该理解的是，肽模拟物本身包括在术语“多肽”、“肽”和“蛋白”中。
本发明还涉及应用本文所述寡聚颗粒诱导抗HCV的免疫，其特征为所述寡聚颗粒用作一系列的时间和化合物的一部分。关于这点，应该理解的是，术语“一系列的时间和化合物”是指以一定时间间隔给予个体用于刺激免疫应答的化合物。后一化合物可包含任何以下组分寡聚颗粒、HCV DNA疫苗组合物、HCV多肽。
在该方面，系列给予包括以下任何一种给予方法(Ⅰ)以一定时间间隔给予HCV抗原例如寡聚颗粒，或(Ⅱ)HCV抗原例如寡聚颗粒联合HCV DNA疫苗组合物给予，其中所述寡聚颗粒与所述HCV DNA疫苗组合物可以同时给予，或以不同时间间隔包括以变化的时间间隔给予，或(Ⅲ)(Ⅰ)或(Ⅱ)可结合其它HCV肽以一定时间间隔给予。
在该方面，应该清楚的是，HCV DNA疫苗组合物包括编码HCV包膜肽的核酸，所述包膜肽包括E1-、E2-、E1/E2-肽、E1s肽、SEQID NO13、SEQ ID NO14、NS3肽、其它HCV肽、或所述肽的部分。而且，需要理解的是，所述HCV肽包括HCV包膜肽，包括E1-、E2-、E1/E2-肽、E1s肽、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、NS3肽、其它HCV肽、或所述肽的部分。术语“其它HCV肽”是指任何HCV肽或其片段，前提是所述HCV肽不是E1、E2、E1s、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14或NS3。在上述方案的第Ⅱ项中，所述HCV DNA疫苗组合物优选包含编码HCV包膜肽的核酸。在上述方案的第Ⅱ项中，所述HCV DNA疫苗组合物甚至更优选包括编码HCV包膜肽的核酸，它可结合HCV-NS3 DNA疫苗组合物。在该方面，应该清楚的是，HCV DNA疫苗组合物包含含可操作性连接至转录调节元件、编码上述HCV肽的多核苷酸序列的质粒载体。本文使用的术语“质粒载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。优选的载体为能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的质粒。一般来说，质粒载体是其载体形式不与染色体结合的环形双链DNA环，但是不限于此。本文使用的“多核苷酸序列”是指诸如脱氧核糖核酸(DNA)以及适当时的核糖核酸(RNA)的多核苷酸。也应该理解的是该术语包括为同等物的根据核苷酸类似物制得的RNA或DNA类似物以及单链(有义或反义)和双链多核苷酸。本文使用的术语“转录调节元件”是指含有必需的调节元件的核苷酸序列，这样当导入活的脊椎动物细胞时，它能够指导细胞器生产所述多核苷酸编码的翻译产物。术语“可操作性连接的”是指其中装配所述组分以便实现其常规功能的一种并列。因此，可操作性连接至核苷酸序列的转录调节元件能够实现所述核苷酸序列的表达。本领域技术人员可认识到，可以成功使用不同的转录启动子、终止子、携带载体或特异性基因序列。
最后，本发明涉及检测HCV抗体的免疫分析，该免疫分析包括(1)提供本文定义的寡聚颗粒或纯化的单一HCV包膜蛋白，或其功能等同物，(2)将生物样品与所述寡聚颗粒或所述HCV包膜蛋白在允许形成抗体-抗原复合物的条件下进行温育，(3)确定是否形成包含所述寡聚颗粒或所述HCV包膜蛋白的所述抗体-抗原复合物。
现在将参照阐明特别有利的实施方案的以下实施例说明本发明。但是，值得注意的是，这些实施方案仅仅是说明性的，而不能解释为以任何方式限制本发明。
实施例实施例1HCV E1蛋白的表达、纯化和去垢剂辅助的同型寡聚反应按照Maertens等(PCT/EP 94/03031)所述方案采用重组痘苗病毒pvHCV-11A从RK13细胞表达以及纯化HCV E1s蛋白(氨基酸192-326)。另外，将表观分子量相当于E1同型二聚体(约60kDa，图1)的纯化的E1蛋白的3％Empigen-BB合并，然后再将合并的流分加样于尺寸排阻层析柱(按照PCT/EP 95/03031)，在存在0.2％CHAPS或3％甜菜碱的情况下进行层析。令人惊奇的是，尽管E1S蛋白缺乏其膜锚区，但是用两种去垢剂能够获得表观分子量为260-280kDa的均一群体的特异性相关的E1同型寡聚体(图2)。这样的同型寡聚结构可含有约数目为9的E1s单体。应该清楚的是，该单体数目是初步的估计，因为所述寡聚体的形状可以明显影响其以尺寸排阻层析测定的表观分子量。当将0.2％CHAPS转换为0.05％CHAPS并重复相同步骤，所述表观分子量进一步漂移超过了所述柱的分离度(柱出现空隙，＞600kDa，图3)，说明形成了颗粒。3％甜菜碱转换为0.1％甜菜碱产生一群相似性质的E1s寡聚体(资料未提供)。根据能够实现相似的去垢剂辅助的寡聚反应可选用其它去垢剂。导致颗粒形成的寡聚反应不是CHAPS或甜菜碱独有的，因为用吐温-20或吐温-80或辛基葡萄糖苷可获得相似的结果。而且进一步去除可能产生甚至更大的颗粒的去垢剂也是可能的。所以可能不再需要存在去垢剂以获得颗粒。用例如SCC而不用任何去垢剂可以获得所述颗粒。值得注意的是，E1单体约31kDa，而E2单体约70kDa。但是这些值可随所述蛋白的糖基化状态而不同。实施例2用动态光散射分析E1s的高级寡聚结构为了证实产生颗粒的意外结果，对按照实施例1制备的在0.05％CHAPS和0.1％甜菜碱中的E1s制剂或通过稀释在0.5％甜菜碱中的制剂制备的在0.1％甜菜碱中的制剂进行动态光散射(DLS)分析。
动态光散射技术检测布朗运动并将其与颗粒大小联系起来。颗粒越大，则布朗运动越慢。布朗运动的速率定义为称为扩散系数的特性(通常用符号D表示)。根据扩散系数采用以下的Stokes-Einstein方程计算颗粒大小d(H)=kT/3πηD，其中d(H)为流体直径，k为Boltzmann常数，T为绝对温度，η为粘度。值得注意的是，测定的直径是指颗粒如何在一种流体中扩散的值。因此，它称为流体直径。扩散系数得自自相关函数(光的强度波动随时间而变化)。所述仪器应用计算机控制的相关器自动计算自相关函数的强度。
为了测定大小分布，校正上述自相关函数，获得线性曲线，所述仪器配有分析大小分布的计算机程序。但是，所述技术具有类似于称为多角激光散射(MALLS)技术的限制性假设，据认为这两种方法都不能获得绝对值。DLS的大小分布结果应当解释为半定量多分散性指标，而不是真正代表分布。
将含有E1s颗粒(80-400μg E1s/ml PBS-0.05％CHAPS，0.1％或0.5％甜菜碱)的样品吸入配有10mW HeNe激光的LSP 3.53 DLS仪器(PolymerLabs)的检测室中。图4(E1s的0.05％CHAPS)和图5(E1s的0.1％或0.5％甜菜碱)显示分析读数。
这些分析确实证实了所获得E1s结构为球形、单分散颗粒的意外结果。在PBS/0.1％甜菜碱中的E1s颗粒平均大小分布为21.3±4nm，在PBS/0.5％甜菜碱中颗粒大小分布为27.9±5nm，而E1s在PBS/0.05％CHAPS中获得的直径为12.5nm。实施例3采用电子显微镜分析大小和形状采用1％乙酸双氧铀的标准阴性染色在碳稳定的透明塑胶(formvar)栅格(formvar grid)上显色10μl E1s(226μg/ml的PBS/0.05％CHAPS；和143μg/ml的PBS/3％甜菜碱)。样品上样30秒，然后用dH2O冲洗之后染色5秒，并进行照相(图6)。
统计学分析获得以下结果在CHAPS中的E1s颗粒的平均直径为8.7±0.27nm(4.3-29.0范围；95％CI 5.4)，在甜菜碱中的E1s颗粒较不均一，平均直径为9.7±0.55nm(4.3-40.5范围；95％CI 11.0)。令人惊奇的是，最初SEC分析显示其分子量为250-300 kDa的3％甜菜碱制剂颗粒甚至较最初显示分子量为＞600 kDa的0.05％CHAPS制剂颗粒更大。所以我们推测用3％甜菜碱获得的中间体同型寡聚型E1s可以随时间形成更高级颗粒。该出人意外的结果指出了获得更高级颗粒的其它可能性。颗粒大小分布(图7)显示CHAPS制剂是单分散，尽管观测到较大颗粒的拖尾现象(高至0.05％CHAPS的29nm)。因为在DLS分析中对较大颗粒估测过高，所以这些较大的颗粒虽然数目较少，但其存在可以解释由DLS分析获得的较大直径(实施例2)。直径的差异也可以用这样的事实解释DLS检测运动的颗粒，而电子显微镜检测静态颗粒。应该清楚的是，以下实施例所示的这些制剂的免疫原性源自完整的所述制剂，并可能产生自平均、较小或较大颗粒，或它们的混合物。实施例4免疫接种慢性感染HCV 1b亚型的黑猩猩用E1(氨基酸192-326)接种已用HCV 1b亚型病毒株感染13年以上(免疫接种前5015天)的黑猩猩(Phil)，所述E1得自不同1b基因型病毒株，在氨基酸水平上的同一性为95.1％(另参见表2)，并按实施例1-3所述制备。黑猩猩总共接受6次肌内免疫接种，每次按照生产商的方案(Ribi Inc.Hamilton,MT)注射50μg在与RIBI R-730(MPLA+TDM+CWS)混合的PBS/0.05％CHAPS中的E1。6次免疫接种以3次注射的两个系列给予，每次注射间隔3周，两个系列之间的迟滞期为6周。在免疫接种前150天开始、免疫接种期间直到免疫接种后1年(但是参见下文)，连续检测该黑猩猩的各种显示HCV诱导的疾病活动的参数。这些参数包括血液化学ALT、AST、γGT，血清病毒负荷，肝脏病毒负荷和肝脏组织学。另外，在体液水平和细胞水平监测对免疫接种的免疫应答。在此期间，还要监测动物的免疫接种的任何副作用，例如行为变化、临床症状、体重、体温和局部反应(红、肿、硬结)。未检测到这样的副作用。
只要抗E1的抗体水平达到最大，ALT(尤其是γGT，资料未提供)水平明显下降(图8)。只要所述抗体的水平开始下降，ALT就非常迅速地反弹，但是只要抗E1仍然可检测到，γGT就保持在较低水平。
在其中抗E1可检测到期间，肝脏的E2抗原下降至几乎检测不到的水平，而在这些抗体消失后不久所述E2抗原反弹。在核心抗原和E2抗原在肝脏中检测不到的同时，肝脏炎症也明显减轻(另参见表3)。这是疫苗诱导肝脏损伤减轻的主要证据，这可能是因为将病毒抗原从其主要靶器官肝脏清除了、至少是部分清除了。
用Amplicor HCV监测器(Roche,Basel，瑞士)监测的血清病毒血症水平在整个研究期间大致无变化。
体液应答的更详细的分析显示，最大终点效价达到14.5×103(在第6次免疫接种后)，此效价在免疫接种后1年降至检测不到的水平(图8)。图9显示，可由肽模拟、B细胞识别的主要表位位于E2的N末端区(肽V1V2和V2V3，详见表4所用的肽)。因为对重组E1的反应性更高更持久，所以也可以根据该图推论，识别这些肽的抗体仅仅代表抗E1的总抗体群的部分。其余部分针对肽不能模拟的表位，即不连续表位。这样的表位仅存在于完整的E1分子上甚或仅存在于颗粒样结构上。这样的针对E1的免疫应答是独特的，至少与在人慢性HCV携带者(Maertens等的WO 96/13590)和黑猩猩(van Doom等，1996)中通常观测到的相比，它在其天然感染过程中升高抗E1抗体。在这些患者中，抗E1也部分针对不连续表位，但是大部分是针对C4表位(±50％患者血清)，小部分是针对V1V2(2-70％范围，取决于所述基因型)，对V2V3的反应性仅仅例外地记录到(Maertens等，1997)。
T细胞反应性分析表明，所述疫苗也以特定方式刺激免疫系统的该部分，因为这些T细胞的刺激指数从1升高至2.5，而且在后续期间保持略微升高(图10)。就是此T细胞反应性仅见于干扰素治疗的长时性反应者(参见Leroux-Roels等的PCT/EP 94/03555；Leroux-Roels等，1996)。实施例5用不同亚型免疫接种慢性HCV携带者用1b基因型的E1接种已用1a基因型HCV感染10年以上(免疫接种前3809天)的黑猩猩(Ton)，所述E1在氨基酸水平上的同一性仅为79.3％(另参见表2)，并按前述实施例所述制备。该黑猩猩总共接受6次肌内免疫接种，每次按照生产商的方案(Ribi Inc.Hamilton,MT)注射50μg在与RIBIR-730混合的PBS/0.05％CHAPS中的E1。6次免疫接种以3次注射的两个系列给予，每次注射间隔3周，两个系列之间的迟滞期为4周。在免疫接种前250天开始、免疫接种期间直到免疫接种后9个月(但是参见下文)，连续检测该黑猩猩的各种显示HCV诱导的疾病活动的参数。这些参数包括血液化学ALT、AST、γGT，血清病毒负荷，肝脏病毒负荷和肝脏组织学。另外，在体液水平和细胞水平监测对免疫接种的免疫应答。在此期间，还要监测动物的免疫接种的任何副作用，例如行为变化、临床症状、体重、体温和局部反应(红、肿、硬结)。未检测到这样的副作用。
只要抗E1的抗体水平达到最大，ALT(尤其是γGT，资料未提供)水平明显下降(图11)。只要所述抗体的水平开始下降，ALT和γGT就反弹，但是在整个后续期间ALT和γGT保持较低水平。与免疫接种前(85±11 U/l)相比，免疫接种后ALT水平(62+6 U/l)甚至显著下降。因为在血清中较少组织损伤标记恢复，所以这些发现首次表明，免疫接种诱导肝脏疾病的改善。
在其中抗E1仍然高于1.0×103效价期间检测不到E2抗原水平，但是在较低E1抗体水平时又可检测到E2抗原水平。HCV抗原消失的同时，肝脏炎症也从中度慢性活动性肝炎显著减轻为最轻型的慢性迁延性肝炎(表3)。这是疫苗诱导肝脏损伤减轻的另一个主要证据，可能是因为将所述病毒从其主要靶器官肝脏清除了、至少是部分清除了。
用Amplicor HCV监测器(Roche,Basel，瑞士)监测的血清病毒血症水平在整个研究期间保持在大致相似的水平。体液应答的更详细的分析显示，达到的最大终点效价是30×103(在第6次免疫接种后)，此效价在免疫接种后9个月降至0.5×103(图11)。图12显示，可由肽模拟和B细胞识别的主要表位位于N末端区(肽V1V2和V2V3，详见表4所用的肽)。因为对重组E1的反应性更高更持久，所以也可以根据该图推论，识别这些肽的抗体仅仅代表抗E1的总抗体群的部分。其余部分最可能是针对肽不能模拟的表位，即不连续表位。这样的表位仅存在于完整的E1分子上甚或仅存在于颗粒样结构上。针对E1的这样的免疫应答是独特的，至少与在可检测到抗E1的人慢性HCV携带者中通常观测到的相比。在这些患者中，抗E1也部分是不连续的，但是大部分是针对C4表位(±50％患者血清)，小部分是针对V1V2(2-70％范围，取决于所述基因型)，对V2V3的反应性仅仅例外地记录到(Maertens等，1997)。因为此黑猩猩感染1a分离株，所以也评价了针对E1-1a抗原的交叉反应性的抗体应答。由图13可见，确实产生了这样的交叉反应抗体，尽管它们仅占总抗体群的部分。肝脏病毒抗原的重新出现与血清可监测抗1a E1抗体的消失之间的相关性是显著的。
T细胞反应性分析表明，所述疫苗也以特定方式刺激免疫系统的该部分，因为这些T细胞的刺激指数从0.5升高至5，而且在后续期间保持高水平(图14)。实施例6用E1再次加强免疫HCV慢性携带者因为如在实施例4和5中所观测到的E1抗体效价不稳定且随时间而降低，甚至在1b感染的黑猩猩中降至检测不到的水平，所以需要研究该抗体应答是否能够通过额外的加强接种增强。两只黑猩猩均再次以间隔3周的3次连续肌内免疫接种(50μgE1，与RIBI佐剂混合)免疫。根据图8和11可判断，抗E1应答的确能够被加强，肝脏的病毒抗原再次降低到检测限制水平以下。尽管在Ton中，血清病毒负荷仍然恒定不变(图11)。在后续期间首次检测到病毒血症水平＜105基因组相当量/ml。
值得注意的发现是，如第一系列免疫接种的已有情况，1b HCV病毒株感染的黑猩猩(Phil)应答的抗E1效价比1a HCV病毒株感染的黑猩猩的应答效价低(第一轮的最大效价Phil为14.5×103，Ton为30×103；在额外的加强免疫后，Phil仅为1.2×103，Ton为48×103)。尽管两只黑猩猩的有益效应似乎相似，但是根据此试验可以得出结论用得自另一亚型或基因型的E1蛋白免疫接种慢性携带者可能特别有益于达到较高的效价，可能避免了宿主存在的而且是由感染亚型或基因型诱导的预先存在的特异性免疫抑制。另一方面，在类似环境(1b疫苗+1b感染)中观测到低效价可能表明大量抗体与病毒结合。所以所述诱导的抗体可能具有中和能力。实施例7a构建结合已知与控制感染有关的主要表位的NS3蛋白除了E1中的所述表位之外，其它表位也可能与急性期清除HCV或干扰素治疗有关。几种这样的表位定位于NS3中(Leroux-Roeld等，1996；Rehermann等，1996和1997；Diepolder等，1995和1997)。两种主要的表位是Rehermann和助手作图的CTL表位(氨基酸1073-1081)和Diepolder和助手作图的T细胞(CD4)表位(氨基酸1248-1261)。遗憾的是，这些表位分散在整个NS3蛋白上。为了获得至少这些可用的表位，需要较大的蛋白(氨基酸1073-1454)。产生这样的大蛋白通常产量低，并在疫苗接种时产生仅小部分是针对重要表位的应答。所以，生产较小的蛋白应该更好解决此问题。为了这样做，需要将一些表位重新置于这样的较小蛋白上。利用现有的认识，即另一个CTL表位(氨基酸1169-1177)与HCV清除无关(Rehermann等，1996,1997)，设计NS3分子，它从氨基酸1166开始至氨基酸1468结束(表5)。该构建物已经包括了Weiner和助手以及Diepolder和助手描述的表位。通过将1167-1180区突变为1071-1084区序列，使不相关的CTL表位变为Rehermann和助手发现的与病毒清除有关的表位。另外修饰该构建物以在位置1166含有蛋氨酸，从而使得可以启动翻译。在大肠杆菌中将切除该蛋氨酸，因为其后接有丙氨酸。这样，引入在天然NS3中不存在的新表位的限制降至最小。另一方面，如果该蛋白的表达繁复，可将CTL表位连接至氨基酸1468的C末端，详见表5。
按Maertens等所述(PCT/EP 99/02547；克隆19b；HCV氨基酸1188-1468用作原料)，分离并表达HCV NS-3片段编码序列。将由Rehermann描述的并不存在于19b NS-3片段中的CTL表位与该片段融合。构建N末端和C末端融合物，因为所述融合物对表达水平、对蛋白水解破坏的敏感性和功能性的作用可能受所述表位的位置的影响。
采用pIGRI2NS-3质粒作PCR模板，将分别与Rehermann CTL表位的N末端和C末端融合的NS3 19b编码序列(分别称为NS-319bTn和NS-3 19bTc)首先亚克隆入pGEM-T(Promega)克隆载体中，产生载体pGEM-TNS-319bTn和pGEM-TNS-319bTc，其中所述质粒为在λ嗜菌体的左侧启动子控制下表达NS-3 19b片段的大肠杆菌表达质粒。DNA序列分析证实PCR扩增的序列。
在T细胞表位序列融合至NS-3的N末端区的情况下，采用带有CTL表位的长有义引物和与NS-3 19b终止密码子3’序列同源的短反义引物进行PCR。引物序列如下所示。引物9038(有义)5′-GCCATGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGGTCGTGCGGCTGTTTGCACCCGTGGGGTTGCGAAGGCGGTGG-3′(SEQ ID NO 5)引物1901(反义)5′-TTTTATCAGACCGCTTCTGCG-3′(SEQ ID NO 6)在C末端融合的NS-3的情况下，用与NS-3 19b起始密码子5’序列同源的短有义引物和在框内终止密码子之前带有CTL表位的长反义引物进行PCR。引物序列如下。引物1052(有义)5′-AGCAAACCACCAAGTGGA-3′(SFQ ID NO7)引物9039(反义)5′-CTCTAGACTATTAACCGTGGTAAACGGTCCAGCAAACACCGTTGATGCAGGTCGCCAGGCTGAAGTCGACTGTCTGG-3′ (SFQ ID NO 8)以克隆入pGEM-T载体的编码序列为原料，将NS-3 19bT序列插入pIGRI2大肠杆菌表达载体中。对于N末端融合的NS-3 19bT，分离作为379 bpNcoⅠ/SnaBⅠ片段的NS-3 19bT编码序列，并将其与载体pIGRI2NS-3的SnaBⅠ/AllwNⅠ和AlwNⅠ/NcoⅠ片段连接。产生载体pIGRI2NS-3Tn。对于C末端融合的NS-3 19bT，分离作为585 bpSnaBⅠ/SpeⅠ片段的NS-3 19bT编码序列，并将其插入SnaBⅠ/SepⅠ断开的载体pIGRI2NS-3，产生载体pIGRI2NS-3Tc。
之后pIGRI2NS-3Tn和pIGRI2NS-3Tc载体均转化至大肠杆菌表达菌株MC1061(pAcI)中，在温度诱导λPL启动子后，采用多克隆兔抗NS-3血清以SDS-PAGE和蛋白质印迹分析表达水平。NS-3 19bTn蛋白的氨基酸序列MATCINGVCWTVYHGRAAVCTRGVAKAVDFVPVESMETTMRSPVFTDNSSPPAVPQTFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGVDPNIRTGVRTTTTGAPITYSTYGKFLADGGCSGGAYDIIICDECHSIDSTSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSSTGEIPFYGKAIPIEVIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKLSGFGINAVAYYRGLDVSVIPTSGDVVVVATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFS(SEQ ID NO1)NS-3 19bTc蛋白的氨基酸序列MGVAKAVDFVPVESMETTMRSPVFTDNSSPPAVPQTFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGVDPNIRTGVRTITTGAPITYSTYGKFLADGGCSGGAYDIIICDECHSIDSTSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSSTGEIPFYGKAIPIEVIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKLSGFGINAVAYYRGLDVSVIPTSGDVVVVATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLATCINGVCWTVYHG(SEQID NO 2)NS-3 19bTn编码区的核苷酸序列ATGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGGTCGTGCGGCTGTTTGCACCCGTGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTACCCGTAGAGTCTATGGAAACCACCATGCGGTCCCCGGTCTTTACGGATAACTCATCTCCTCCGGCCGTACCGCAGACATTCCAAGTGGCCCATCTACACGCCCCCACTGGTAGTGGCAAGAGCACTAAGGTGCCGGCTGCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGGTACTTGTCCTGAACCCATCCGTTGCCGCCACCTTAGGATTCGGGGCGTATATGTCTAAAGCACATGGTGTCGACCCTAACATTAGAACTGGGGTAAGGACCATCACCACGGGCGCCCCCATTACGTACTCCACCTACGGCAAGTTTCTTGCCGACGGTGGTTGCTCTGGGGGCGCTTACGACATCATAATATGTGATGAGTGCCACTCGATTGACTCAACCTCCATCTTGGGCATCGGCACCGTCCTGGATCAGGCGGAGACGGCTGGAGCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACTGCTACACCTCCGGGGTCGGTCACCGTGCCACATCCCAACATCGAGGAGGTGGCTCTGTCCAGCACTGGAGAGATCCCCTTTTATGGCAAAGCCATCCCCATCGAGGTCATCAAAGGGGGGAGGCACCTCATTTTCTGCCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCCGCAAAGCTATCGGGCTTCGGAATCAACGCTGTAGCGTATTACCGAGGCCTTGATGTGTCCGTCATACCGACTAGCGGAGACGTCGTTGTTGTGGCAACAGACGCTCTAATGACGGGCTTTACCGGCGACTTTGACTCAGTGATCGACTGTAACACATGCGTCACCCAGACAGTCGACTTCAGCTAA(SEQ IDNO 3)NS-3 19bTc编码区的核苷酸序列ATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTACCCGTAGAGTCTATGGAAACCACCATGCGGTCCCCGGTCTTTACGGATAACTCATCTCCTCCGGCCGTACCGCAGACATTCCAAGTGGCCCATCTACACGCCCCCACTGGTAGTGGCAAGAGCACTAAGGTGCCGGCTGCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGGTACTTGTCCTGAACCCATCCGTTGCCGCCACCTTAGGATTTCGGGGCGTATATGTCTAAAGCACATGGTGTCGACCCTAACATTAGAACTGGGGTAAGGACCATCACCACGGGCGCCCCCATTACGTACTCCACCTACGGCAAGTTTCTTGCCGACGGTGGTTGCTCTGGGGGCGCTTACGACATCATAATATGTGATGAGTGCCACTCGATTGACTCAACCTCCATCTTGGGCATCGGCACCGTCCTGGATCAGGCGGAGACGGCTGGAGCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACTGCTACACCTCCGGGGTCGGTCACCGTGCCACATCCCAACATCGAGGAGGTGGCTCTGTCCAGCACTGGAGAGATCCCCTTTTATGGCAAAGCCATCCCCATCGAGGTCATCAAAGGGGGGAGGCACCTCATTTTCTGCCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCCGCAAAGCTATCGGGCTTCGGAATCAACGCTGTAGCGTATTACCGAGGCCTTGATGTGTCCGTCATACCGACTAGCGGAGACGTCGTTGTTGTGGCAACAGACGCTCTAATGACGGGCTTACCGGCGACTTTGACTCAGTGATCGACTGTAACACATGCGTCACCCAGACAGTCGACTTCAGCCTGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGGTTAA(SEQ ID NO 4)实施例7b纯化NS-3 19bTn和NS-3 19bTc蛋白得自锥形瓶培养的大肠杆菌细胞用细胞破碎器(CSL,B型)以1.4kbar在50mM TRIS，pH8中破碎。离心(15000g,30min,4℃)使该裂解物澄清。弃上清液，因为用于N末端和C末端构建物的NS3均回收在沉淀物中。结果所获得的该沉淀物对于N末端构建物而言是高度稳定的，在溶解之前可以彻底洗涤(第一次洗涤用2％十二烷基肌氨酸钠、0.5M氯化胍和10mM DTT，第二次和第三次洗涤用1％TritonX-100、0.5M氯化胍和10mM EDTA)。C末端构建物的情况就不是如此。对N末端构建物进行进一步纯化。洗涤的沉淀最终溶解于6M氯化胍/50mM Na2HPO4,pH7.2中，并如Maertens等(PCT/EP 99/02547)所述将其磺酸化。首先将所述磺酸化沉淀物在Sephadex G25柱上对6M尿素/50mM三乙醇胺，pH7.5进行脱盐，最后在相同的缓冲组合物中以两次连续的阴离子交换层析进行纯化。第一次阴离子交换在Hyper DQ(50μm)柱(BioSpraInc.Marlborough,Ma.USA)上进行，并在0.11-0.19 MNaCl中回收NS3。稀释后，将这些流分上第二个HyperDQ(20μm)柱(BioSpra Inc.Marlborough,Ma.USA)，并在含有0.125 MNaCl的流分中回收NS3。将这些流分对6M尿素的PBS,pH7.5脱盐。根据继之以银染色的SDS-PAGE估测最终纯度＞90％。用EDMAN降解的N末端测序表明该NS3具有完整的N末端，其中所述目的表位存在于正确序列中。还证实了用于起始翻译的蛋氨酸按预定切除。实施例8构建没有高变区I的E2蛋白已注意到对E2的HVRⅠ区的免疫显性同源应答。该应答在疫苗方法中几乎没有应用，因为疫苗方法是异源性建立(疫苗株总是与现场株不同)。所以诱导产生针对更保守但是免疫原性更小的E2区的抗体的E2蛋白必需缺失该区。通过仔细分析E2前导序列和E2高变区，从而设计用于表达没有HVRⅠ的E2蛋白的最理想的构建物。该构建物允许从位置氨基酸409而不是氨基酸384开始表达E2肽。使用E1的C末端20个氨基酸作为前导序列。但是，因为关于该HVR的描述不明确，所以制备了第二种类型的构建物(从氨基酸412开始)，它在右侧位置被切割的可能性也非常高。中间体构建物pvHCV-99(另参见图15和16)在所述表达盒中E2-715的编码序列应该在E1前导信号肽之后，从Met364开始。所以，在含有具有长型E1信号肽(从Met347开始)的E2-715 HCV1b亚型的编码序列的质粒pvHCV-92(图15)中，用EcoRⅠ和NcoⅠ进行双消化，然后用T4 DNA聚合酶进行5’突出端的填平反应，从而制备缺失。连接所获得平端(再环化6621 bp片段)，产生编码与短E1前导信号肽(从Met364开始)相同的蛋白(E2-715)的质粒pvHCV-99。pvHCV-99以ICCG 3635保藏于在病毒株目录(strainlist)中。应该清楚的是，可以使用不同长度的HCV或异源信号序列。
质粒pvHCV-100和-101应该在E2序列中含有缺失，即缺失高变区Ⅰ(HVR-Ⅰ)。在质粒pvHCV-100中，缺失氨基酸384(His)-408(Ala)，而在质粒pvHCV-101中缺失氨基酸384(His)-411(Ile)。构建pvHCV-100设计以下两种寡核苷酸用于构建pvHCV-100HCV-pr4095′-CTT TGC CGG CGT CGA CGG GCA GAA AAT CCA GCT CGT AA-3′(SEQ ID NO 9)BCV-pr4085′-TTA CGA GCT GGA TTT TCT GCC CGT CGA CGC CGG CAA AG-3′(SBQ ID NO 10)用Gpt-pr和HCV-pr 408PCR扩增(95℃变性5分钟，30个周期的扩增包括55℃退火，72℃聚合反应1分钟和95℃各变性1分钟，72℃延长10分钟)pvHCV-99模板获得221 bp片段，而用HCV-pr 409和Tkr-pr扩增获得1006 bp片段。两种PCR片段相互重叠19个核苷酸。用Gpt-pr和Tkr-pr引物通过PCR装配并扩增这两种片段。产生的1200 bp片段用EcoRⅠ和HinDⅢ消化，并连接入EcoRⅠ/HinDⅢ消化的pgsATA18[ICCG 1998]载体(5558 bp)中。通过限制酶切分析和序列分析对该构建物pvHCV-100进行分析，并将其在病毒株目录中以ICCG 3636保藏。构建pvHCV-101设计以下两种寡核苷酸用于构建pvHCV-101HCV-pr4115′-CTT TGC CGG CGT CGA CGG GCA GCT CGT AAA CAC CAA CG-3′(SEQ ID NO 11)HCV-pr4105′-CGT TGG TGT TTA CGA GCT GCC CGT CGA CGC CGG CAA AG-3′(SEQ ID NO 12)
用Gpt-pr和HCV-pr 410PCR扩增pvHCV-99模板获得221 bp片段，而用HCV-pr 411和Tkr-pr扩增获得997 bp片段。两种PCR片段相互重叠19个核苷酸。用Gpt-pr和Tkr-pr通过PCR装配并扩增这两种片段。产生的1200 bp片段用EcoRⅠ和HinDⅢ消化，并连接入EcoRⅠ/HinDⅢ消化的pgsATA18[ICCG 1998]载体(5558 bp)中。通过限制酶切分析和序列分析对该构建物pvHCV-101进行分析，并将其在病毒株目录中以ICCG 3637保藏。
用序列分析检查所有质粒，并将其保藏于Innogenetics病毒株目录。对于每种质粒，在无菌条件下制备两种基本DNA制剂(PLASmix)，并将其合并。测定其DNA浓度，并用限制酶切分析进行QA。按Maertens等(PCT/EP 95/03031)所述采用纯化的DNA产生重组痘苗病毒。但是在WHO认证的Vero细胞中产生重组病毒vvHCV-100和vvHCV-101。经过两轮的噬菌斑纯化后，按Maertens等(PCT/EP95/03031)所述通过蛋白质印迹分析分析表达产物。采用特异性抗E2单克隆抗体(IGH 212，可从在Innogenetics N.V.,Zwijnaarde，比利时的本发明人处获得)显示蛋白，其中vvHCV-100的单克隆抗体的估测分子量为69和37 kDa，vvHCV-101的单克隆抗体的估测分子量为68和35 kDa。这些分子量表明存在糖基化和非糖基化两种E2蛋白，这一点通过在进行蛋白质印迹分析之前用PNGaseF处理该样品得到证实。所述处理使得分别检测到vvHCV-100和vvHCV-101仅有37 kDa和35 kDa各一种蛋白。得自pvHCV-100的成熟E2的氨基酸序列QKIQLVNTNGSWHINRTALNCNDSLQTGFFAALFYKHKFNSSGCPERLASCRSIDKFAQGWGPLTYTEPNSSDQRPYCWHYAPRPCGIVPASQVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRFGVPTYNWGANDSDVLILNNTRPPRGNWFGCTWMNGTGFTKTCGGPPCNIGGAGNNTLTCPTDCFRKHPEATYARCGSGPWLTPRCMVHTPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRFEAACNWTRGERCDLRDRDRSELSPLLLSTTEWQILPCSFTTLPALSTGLIHLHQNIVDVQYLYGVGSAVVSLVIK(SEQ ID NO 13)得自pvHCV-101的成熟E2的氢基酸序列实施例9免疫原性进一步改进的E1颗粒如实施例1所述，按照Maertens等的PCT/EP 95/03031所述方案纯化E1s蛋白。该方案包括用马来酰亚胺衍生物(N-乙基马来酰亚胺和生物素-马来酰亚胺，均得自Sigma)共价修饰半胱氨酸(游离半胱氨酸和参与分子内桥的半胱氨酸，后者需要在用DTT还原这些半胱氨酸桥后进行修饰)。作为马来酰亚胺封闭的替代方法，也可以评估活性卤素。这些化合物即活性卤素通过烷基化封闭游离半胱氨酸。作为实例可以评估活性卤素(碘乙酰胺，Merck)。相同的方案用于纯化E1，如Maertens等(PCT/EP 95/03031)所述，但是用碘乙酰胺代替马来酰亚胺化合物。用该方法获得的E1s蛋白在整个纯化步骤过程中具有类似于所述马来酰亚胺封闭蛋白的性质。在最后按实施例1所述降低去垢剂浓度至0.05％CHAPS或转换为0.5％甜菜碱时，按DLS测定，获得相似的颗粒。但是当用该乙酰胺-修饰的E1s免疫小鼠时见到了令人惊奇的效果。
在总的3个系列的6只小鼠中，采取注射3次E1s免疫每只小鼠，每次间隔3周，每次注射包括5μgE1s(100μg/ml PBS)，并将其与等体积RIBI佐剂(R-700)混合。第一个系列接受用0.05％CHAPS配制的E1-马来酰亚胺，第二个系列接受也是用0.05％CHAPS配制的E1-马来酰亚胺，而第三个系列接受用0.12％甜菜碱配制的E1-乙酰胺。最后，在第三次免疫后10天从所有小鼠取血。分别测定每只动物针对E1-马来酰亚胺和E1-乙酰胺的终点效价(定义为仍然产生高于本底值2倍的OD值的血清的稀释度)。图17显示这些终点效价，以均值和标准差表示。接受E1-马来酰亚胺的小鼠仅建立能够识别含有马来酰亚胺的表位的抗体应答(对E1-乙酰胺根本没有反应性)，显然，接受E1-乙酰胺的小鼠建立针对真正的E1表位的抗体应答，因为所述抗体对E1-乙酰胺和E1-马来酰亚胺均有反应性。在其它试验中清楚地证实了这一点，其中采用既不是用乙酰胺也不是用马来酰亚胺修饰的表位测定E1特定区的抗体。结果示于图18，证实用E1-乙酰胺(CHAPS和甜菜碱配制的)免疫的小鼠的确建立了能够识别肽V1V2、V2V3、V3V4、V5C4、C4V6的抗体应答。因为V6不是E1s的组成部分，所以我们可以得出结论针对C4、V3(V3V4是阳性，而V4V5是阴性)和V1V2产生抗体。用E1s-马来酰亚胺免疫的小鼠仅建立针对V1V2和V2V3肽的非常低的应答。这再次强调了这样的事实检测到的相当高效价的这些抗马来酰亚胺-E1s的小鼠抗体主要针对马来酰亚胺依赖性表位。另外，我们能够证实E1s-乙酰胺诱导的应答部分属于Th1型，因为大量的诱导抗体属于IgG2(a+b)亚型。甚至甜菜碱制剂的IgG2量高于CHAPS制剂(图19)。根据这些结果可得出结论其中至少一个半胱氨酸(但是可能多于一个半胱氨酸)烷基化的HCV包膜蛋白是免疫原性非常强的蛋白。
所以用甜菜碱配制的乙酰胺修饰的E1也用来再加强免疫黑猩猩Phil和Ton。以间隔3周的两次连续的肌内免疫接种(50μg与RIBI佐剂混合的E1，见实施例4和5)再次免疫两只黑猩猩。根据图20和21可判定，的确能够再次加强抗E1应答，注射2次后达到的应答水平高于先前的免疫接种获得的水平。相对于标准品进行滴定，标准品为3种人高效价抗E1血清(得自慢性HCV携带者)的混合物。这些血清的抗E1效价定义为1单位/ml。在黑猩猩Phil(图20)中，在2次免疫接种后仅诱导2倍于人携带者的效价。在黑猩猩Ton(图21)中诱导的效价增高高达140倍。这再次强调了这些E1-颗粒的高免疫原性。实施例10烷基化E1具有高品质的诊断用途进一步评价作为检测人慢性HCV携带者血清样品中的抗E1抗体的抗原的实施例9所述的E1s-乙酰胺。例如将这些抗原结合至LIA-膜，而且基本上按Zrein等(1998)所述处理条带。首先评价72个血液供者的血清样品，以确定能够用于所述分析的E1抗原的最适浓度，以便排除“假”阳性。证实E1s-马来酰亚胺的最适浓度为8μg/ml，而E1s-乙酰胺的浓度高至50μg/ml也不会产生假阳性结果(没有样品显示相对染色高于0.5)。E1s-马来酰亚胺和E1s-乙酰胺最适浓度分别采用8μg/ml和50μg/ml，对24份HCV慢性携带者血清筛选抗E1s抗体。如表6所示，E1s-乙酰胺明显导致更多的样品评价为阳性(67％，而E1s-马来酰亚胺为38％)。没有发现只有E1s-马来酰亚胺评价阳性的样品。对于E1s-马来酰亚胺和E1s-乙酰胺评价均阳性的样品，后者的反应性更高。根据本实施例可以得出结论烷基化HCV包膜蛋白与马来酰亚胺修饰的包膜蛋白相比，是检测人抗体的更好抗原。实施例11产生含有E1和E2的混合颗粒按Maertens等的PCT/EP 95/030301所述产生并纯化E1s和E2s(vvHCV-44)，实际上不同的是以采用碘乙酰胺的烷基化代替马来酰亚胺修饰。将单独的或等摩尔混合物的E1s和E2s的3％empigen进样于用PBS/0.2％CHAPS平衡的Superdex-200 PC 3.2/30柱上。设计该柱以用于Pharmacia LKB(瑞典)的SMARTMHPLC仪器。利用3种不同的夹心ELISA筛选各个流分。对于这些ELISA，以2μg/ml包被E1-(IGH 207)和E2-(IGH 223)特异性单克隆。温育稀释2500倍的凝胶过滤流分。将两种缀合生物素的其它E1(IGH 200)和E2(IGH 212)单克隆用于检测结合抗原。链霉亲合素-HRP/TMB体系用于使结合的生物素变为可在450nm检测的黄色。
在同种组合(抗E1包被/抗E1检测或抗E2包被/抗E2检测)和异种组合(抗E1包被/抗E2检测)中使用上述ELISA体系。后者在理论上只检测其中E1和E2均加入的颗粒。合并活性流分，在10 kDa滤器上浓缩，再在PBS/0.05％CHAPS平衡的Superdex-200上层析。采用不同的ELISA组合测试所有这些流分的反应性。根据图22可以判定，与单独的E1相比，E1中加入E2不会导致保留时间的明显改变，表明确实仍然存在颗粒。这些颗粒含有E1和E2两者，因为只有在这种组合中异种ELISA评价为阳性。实施例12产生含有两种不同基因型的E1的混合颗粒按Maertens等的PCT/EP 95/030301所述产生并纯化1b基因型和4基因型的E1s(vvHCV-72)，实际上不同的是对1b基因型以采用碘乙酰胺的烷基化代替马来酰亚胺修饰。将单独的或等摩尔混合物的E1s-1b和E1s-4的3％empigen进样于用PBS/0.2％CHAPS平衡的Superdex-200 PC 3.2/30柱上。该柱设计成和Pharmacia LKB(瑞典)的SMARTTMHPLC仪器共用。合并含有主要蛋白的流分，在10 kDa滤器上浓缩，再在PBS/0.05％CHAPS平衡的Superdex-200上层析。采用仅检测含有两种基因型的E1的颗粒的ELISA组合测试所有这些流分的反应性。对于此ELISA，以2μg/ml包被链霉亲和素。温育稀释2500倍的凝胶过滤流分。只识别1和10基因型的E1的E1单克隆抗体(IGH200)用于检测所述结合抗原。山羊抗小鼠-HRP/TMB体系用于使所述分析物变为可在450nm检测的黄色。根据图23判定，E1-1b中加入E1-4不会导致所述蛋白保留时间的明显改变，表明确实仍然存在颗粒。这些颗粒含有两种E1蛋白，即1b基因型和4基因型的E1s，因为只有在这种组合中ELISA评价为阳性。
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1．主要包括HCV包膜蛋白而且其直径为1-100nm的寡聚颗粒。
2．按照权利要求1的寡聚颗粒，其直径为2-40nm。
3．按照权利要求1或2中任一项的寡聚颗粒，其中所述HCV包膜蛋白的氨基酸序列为产生自分离株-、亚型-、病毒株-或种属-共有序列的共有序列。
4．按照权利要求1-3中任一项的寡聚颗粒，它们可能含有非-HCV-表位。
5．按照权利要求1-4中任一项的寡聚颗粒，其中所述包膜蛋白的至少一个半胱氨酸残基被烷基化。
6．按照权利要求5的寡聚颗粒，其中所述半胱氨酸残基借助于活性卤素、乙烯亚胺或N-(碘乙基)三氟乙酰胺进行烷基化。
7．按照权利要求1-4中任一项的寡聚颗粒，其中所述包膜蛋白的至少一个半胱氨酸残基突变为天然氨基酸，所述天然氨基酸优选选自蛋氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸。
8．按照权利要求1-7中的任一项的寡聚颗粒，其中所述包膜蛋白为HCV E1蛋白或其部分。
9．按照权利要求1-7中的任一项的寡聚颗粒，其中所述包膜蛋白为HCV E1s蛋白或其部分。
10．按照权利要求1-7中任一项的寡聚颗粒，其中所述包膜蛋白为HCVE2病毒或其部分。
11．按照权利要求1-7中任一项的寡聚颗粒，其中所述包膜蛋白为SEQ ID No13和/或SEQ ID No14或它们的部分。
12．按照权利要求1-11中任一项的寡聚颗粒，其中所述包膜蛋白由分离的核苷酸共有序列、亚型核苷酸共有序列、种核苷酸共有序列或属核苷酸共有序列或它们的部分编码。
13．按照权利要求1-7中任一项的寡聚颗粒，其中所述包膜蛋白为HCV E1、HCV E1s、HCV E2蛋白和/或SEQ ID No13和/或SEQID No14或它们的部分的混合物。
14．按照权利要求1-13中任一项的寡聚颗粒，其中所述包膜蛋白或其部分得自不同的HCV病毒株或基因型。
15．按照权利要求1-14中任一项的寡聚颗粒，其中所述包膜蛋白或其部分为得自一种病毒株或基因型HCV和至少一种其它病毒株或基因型HCV的HCV包膜蛋白组成的混合物。
16．按照权利要求1-15中任一项的寡聚颗粒，可用具有以下步骤特征的方法制得Ⅰ-纯化HCV包膜蛋白溶液，-可能包括使用一种任选的第一种去垢剂，-可能包括使用二硫键裂解剂，-可能包括使用烷化剂，Ⅱ-用去垢剂或盐置换所述纯化HCV包膜蛋白的所述溶液，产生寡聚颗粒，Ⅲ-纯化所述置换后生成的寡聚颗粒，-可能包括进一步降低步骤Ⅱ的去垢剂或盐的浓度。
17．按照权利要求16的寡聚颗粒，其中所述任选的第一种去垢剂为Empigen-BB，其中所述步骤Ⅱ的去垢剂为CHAPS、辛基葡萄糖苷(octylglucaside)、吐温或任何其它去垢剂，其中所述盐为甜菜碱。
18．按照权利要求16或17中任一项的寡聚颗粒，其中所述Empigen-BB的使用浓度为1％-10％，其中所述CHAPS或吐温的使用浓度为0.01％-10％，或所述甜菜碱的使用浓度为0.01％-10％。
19．生产权利要求1-14中任一项的寡聚颗粒的权利要求16-18中任一项的方法。
20．生产权利要求1-14中任一项的寡聚颗粒的方法，其特征在于以下步骤Ⅰ-纯化HCV包膜蛋白溶液，-可能包括使用一种任选的第一种去垢剂，-可能包括使用二硫键裂解剂，-可能包括使用烷化剂，Ⅱ-用去垢剂或盐置换所述纯化HCV包膜蛋白的所述溶液，产生寡聚颗粒，Ⅲ-纯化所述置换后生成的寡聚颗粒，-可能包括进一步降低步骤Ⅱ的去垢剂或盐的浓度。
21．按照权利要求20生产寡聚颗粒的方法，其中所述任选的第一种去垢剂为Empigen-BB，其中所述步骤Ⅱ的去垢剂为CHAPS、辛基葡萄糖苷、吐温或任何其它去垢剂，其中所述盐为甜菜碱。
22．按照权利要求20或21任一项生产寡聚颗粒的方法，其中所述Empigen-BB的使用浓度为1％-10％，其中所述CHAPS或吐温的使用浓度为0.01％-10％，或所述甜菜碱的使用浓度为0.01％-10％。
23．包含权利要求1-22中任一项的寡聚颗粒的组合物。
24．权利要求23的组合物，它还包含HCV核心蛋白、P7、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和/或NS5B蛋白或其部分。
25．权利要求24的组合物，其中所述NS3蛋白或其部分具有SEQID No1或SEQ ID No2所示的氨基酸序列。
26．权利要求1-25中任一项的寡聚颗粒的用途，该用途为用于生产HCV疫苗组合物。
27．权利要求1-25中任一项的寡聚颗粒的用途，该用途为用于在慢性HCV携带者诱导抗HCV的免疫。
28．权利要求27的寡聚颗粒的用途，该用途用于在任何其它治疗之前、同时或之后在慢性HCV携带者诱导抗HCV的免疫。
29．权利要求27的寡聚颗粒的用途，该用途用于在肝移植之前或之后、或在推定感染后在HCV感染个体诱导抗HCV免疫。
30．权利要求1-28中任一项的寡聚颗粒的用途，该用途用于预防性诱导抗HCV的免疫。
31．权利要求1-28中任一项的寡聚颗粒的用于诱导抗HCV免疫的用途，其特征为所述寡聚颗粒或所述组合物用作一系列时间与化合物的一部分。
32．用作HCV疫苗的权利要求1-25中任一项的寡聚颗粒或组合物。
33．用于在慢性HCV携带者中诱导抗HCV免疫的权利要求1-25中任一项的寡聚颗粒或组合物。
34．用于在任何其它治疗之前、同时或之后在慢性HCV携带者中诱导抗HCV免疫的权利要求33的寡聚颗粒或组合物。
35．用于在肝移植之前或之后、或在推定的感染之后在HCV感染个体中诱导抗HCV免疫的权利要求1-25中任一项的寡聚颗粒或组合物。
36．用于预防性诱导抗HCV免疫的权利要求1-25中任一项的寡聚颗粒或组合物。
37．用于诱导抗HCV免疫的权利要求1-25中任一项的寡聚颗粒或组合物，其特征在于所述寡聚颗粒是一系列时间与化合物的一部分。
38．纯化的单一HCV包膜蛋白。
39．权利要求38的纯化的单一HCV包膜蛋白，其中所述包膜蛋白是E1或E1s。
40．含有权利要求38或39中任一项的纯化的单一HCV包膜蛋白的组合物。
41．用作HCV疫苗的权利要求40的组合物。
42．用作HCV疫苗的权利要求40的组合物的用途。
43．用于生产HCV疫苗的权利要求40的组合物的用途。
44．针对权利要求1-25中任一项的寡聚颗粒或针对权利要求38-40中任一项的纯化的单一HCV包膜蛋白产生的特异性抗体。
45．用于治疗或预防HCV感染的权利要求44的特异性抗体的用途。
46．用于检测HCV抗原的试剂盒，它包括权利要求44的特异性抗体。
47．用于检测生物样品中存在的HCV抗体的试剂盒，它在合适的容器中含有权利要求1-25中任一项的寡聚颗粒或权利要求38-40中任一项的纯化的单一HCV包膜蛋白。
48．检测HCV相关性T细胞应答的试剂盒，它包括权利要求1-25中任一项的寡聚颗粒或权利要求38-40中任一项的纯化的单一HCV包膜蛋白。
49．检测HCV抗体的免疫检测法，所述免疫检测法包括(1)提供权利要求1-25中任一项的寡聚颗粒或权利要求38-40中任一项的纯化的单一HCV包膜蛋白，或它们的部分，(2)将生物样品与所述寡聚颗粒或所述HCV包膜蛋白在允许形成抗体-抗原复合物的条件下进行温育，(3)检测是否形成包含所述寡聚颗粒或所述HCV包膜蛋白的所述抗体-抗原复合物。
全文摘要
本发明基于这样的发现:HCV包膜蛋白在慢性HCV感染的黑猩猩诱导有益的免疫应答。优选采用以去垢剂辅助的方式生产的颗粒型HCV包膜蛋白进行疫苗接种。当将这样的包膜蛋白给予慢性HCV携带者时,所述包膜蛋白具有高度免疫原性,并既刺激细胞免疫应答,又刺激体液免疫应答。
文档编号C12N7/01GK1313864SQ99809890
公开日2001年9月19日 申请日期1999年6月23日 优先权日1998年6月24日
发明者E·德普拉, G·梅尔滕斯, A·波斯曼, F·范韦宁戴勒 申请人:基因创新有限公司