专利名称：新城疫病毒感染性克隆、疫苗及诊断分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及家禽的新城疫病毒感染。
新城疫病毒(NDV)是变化最多的致死性禽病原体之一。在几个不同地理区域几乎同时发生的表观为新疾病的新城疫以及该病在类型和严重性方面的极大差别导致命名上的混乱。
该病曾被命名为假家禽疫、假家禽瘟疫、禽瘟、禽瘟热和禽肺炎脑炎。该病的重要性主要是由于20世纪家禽业发展成依赖于国家间贸易的高效国际工业。
通常认为新城疫的首次爆发是1926在印度尼西亚的爪哇，以及英国的Newcastle-upon-Tyne(Kraneveld,1926；Doyle,1927)。新城疫的名称是由Doyle所取，以避免可能与其他疾病混淆的描述性名称。后来很清楚其他严重程度较低的疾病是由与NDV不可区分的病毒导致。在美国，一种相对温和的呼吸道疾病被命名为禽肺炎脑炎并已示出由NDV导致(Beach,1944)。在几年内世界上制备了导致鸡的极温和疾病或不致病的许多NDV分离株。
下述方法牵涉疾病的传播1)活鸟、野生鸟、狩猎鸟、赛鸽和商业家禽的运输；2)人和设备的迁移；3)家禽产品的运输；4)空气传播；5)污染的家禽饲料；6)污染的水；7)不完全灭活的或异源的疫苗。根据OIE，新城疫是由禽副粘病毒血清型1(APMV-1)病毒导致的家禽疾病，该病毒在1日龄鸡中的脑内致病性指数(ICPI)为0.7或更高。强毒株也可通过在F2蛋白的C末端存在多个碱性氨基酸以及在F1蛋白的N-末端的残基117存在F(苯丙氨酸)而证实。不能证实这个氨基酸序列将需要通过ICPI试验鉴定。术语“家禽”是指圈养用来育种、生产肉或蛋用来消费或用来供狩猎的家禽、火鸡、珍珠鸡、鸭、鹅、鹑、鸽、野鸡、鹌鹑和平胸类鸟。
根据Alexander(1988)，自从首次识别新城疫以来已发生了3次该病的流行。第一次为该病的初次爆发并似乎起于东南亚。独立的爆发，如1926年在英国的爆发是缓慢从亚洲至欧洲移动的主流之前的偶然引入。
第二次流行似乎在60年代晚期起于中东，并至1973年到达大多数国家。第二次流行的较快扩散可能由于相当的国际贸易导致的家禽业的大变革所致。
第三次流行主要影响驯养鸟类如家鸽和野鸽(Vindevogel andDuchatel,1988)。该病于70年代晚期起于中东，至1981年其已到达欧洲，然后快速传播至世界上所有地区，这很大程度上是由于比赛和观赏鸟之间的接触以及这种鸟的国际贸易所致。
目前，新城疫仍在亚洲、非洲、美洲和欧洲的许多国家广泛传播。仅有大洋洲国家似乎相对没有这种疾病(Spradbrow,1988)。
NDV属于Mononegavirales目，副粘病毒科，副粘病毒亚科，Rubulavirus属。除了通常称为禽副粘病毒1型的NDV，称为副粘病毒2-9型的8个其他血清型可在血凝集抑制试验和血清中和试验中基于它们的抗原相关性区分(Alexander,1993)。
除了血清学分组的一致性，不同血清型病毒之间有一些交叉相关性。
NDV的基因组是单链负极性RNA分子，与避免病毒蛋白的信使RNA互补。该RNA基因组大小约15200nt，编码下述基因产物(从基因组RNA的3’末端至5’末端列出)核衣壳蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，血凝素-神经酰胺酶(HN)和大聚合酶蛋白(L)(Chambers等，1986)。
RNA与NP,P和L蛋白复合形成核糖核衣壳颗粒(RNP)，其被内侧排列M蛋白的包膜环绕。包膜含有参与附着并穿透宿主细胞的F和HN蛋白。
NDV的复制与其他副粘病毒所用策略类似。起始步骤是病毒附着于宿主细胞受体，这由HN蛋白介导。病毒包膜与宿主细胞膜的融合依赖于HN和F蛋白的作用，并导致RNP释放进细胞质，在此发生病毒复制。
病毒RNA依赖性RNA聚合酶(其是RNP的一部分)产生起mRNA作用的互补转录物，并被细胞翻译机制利用而合成病毒蛋白。由于NP蛋白的积累，RNA聚合酶复合物从转录转为复制，导致合成全长基因组和反基因组RNA分子。
新形成的RNP在细胞膜上经积累在细胞质膜中的M蛋白和F及HN蛋白的作用而包被。经芽生机制从感染的细胞释放新形成的病毒颗粒。NDV复制的更详细信息参见Peeples(1988)。副粘病毒科的分子生物学的最新综述见Lamb and Kolakofsky(1996)。
除了商业家禽(即鸡、火鸡、野鸡、珍珠鸡、鸭、鹅、鸽)之外，各种俘获鸟、半驯化鸟和野生鸟包括迁移性水禽也易感于NDV，并可是初级感染来源(Kaleta and Baldauf,1988)。
NDV毒株的致病性随宿主而大大不同，最具抗性的物种似乎是水生鸟类，而最易感的是形成临时性或永久禽群的群居鸟。鸡是高度易感的，鸭和鹅可被感染但很少或不显示临床迹象，即使用对鸡致死的毒株也是如此。
新城疫很复杂，因为病毒的不同分离株和毒株可诱导差别非常大的疾病严重程度。Beard and Hanson(1984)将NDV毒株分成与在完全易感的小鸡中可见的疾病迹象相关的不同表型1)趋内脏强毒NDV，其产生急性致死性感染，其中在内脏中出血性损害占主导；向神经性强毒NDV，其产生高致死性，前趋症状为呼吸道和神经学症状，但无内脏损害；2)中等毒力NDV，其在某些鸟中产生低致死性，急性呼吸道疾病和神经症状；3)轻型NDV，其产生温和的或不明显的呼吸道感染或甚至无症状肠道NDV，其为似乎主要在肠道复制的无毒病毒。已报道与不同组相关的症状之间的某些重叠。
病毒经呼吸道和肠道或经眼进入体内。在气管中，病毒经纤毛作用或经细胞至细胞传播而扩散。最初在导入位点繁殖后，病毒在病毒血症过程中被携带至脾、肝、肾和肺。某些毒株的病毒非常快速地到达重要器官如肝和肾，从而鸟可在疾病症状明显前死亡。
大多数病毒在显著量的抗体出现之前就经血液到达中枢神经系统。推定在鹦鹉中发生的长期无症状携带者状态对家禽业构成了潜在的威胁。轻型和强毒病毒的长期携带者状态也可存在于鸡中(Heuschele and Easterday,1970)。
在NDV复制过程中，需要使前体糖蛋白Fo裂解成F1和F2才能使子代病毒变为感染性的(Rott and Klenk,1988)，这一翻译后裂解由宿主细胞蛋白酶介导。如果没发生裂解，则产生非感染性病毒颗粒，病毒复制不能进行。强毒病毒的Fo蛋白可被各种蛋白酶裂解，但是在弱毒病毒中的Fo蛋白的受其敏感性限制，这些病毒在体内仅能在某些宿主细胞类型中生长，并且通常不能体外生长。
轻型病毒仅在具有类似胰蛋白酶的酶的区域如呼吸道和肠道中复制，而强毒病毒能在一系列组织和器官中复制，产生致命的系统性感染。
Fo前体的氨基酸测序表明弱毒病毒具有连接F2和F1链的单个精氨酸(R)，而强毒病毒毒株具有额外的碱性氨基酸，在裂解位点形成两个配对如K/R-X-K/R-R-F。另外，强毒株的F2链通常以苯丙氨酸残基起始，而无毒毒株的F2链通常以亮氨酸开头。
对于几个NDV毒株，HN蛋白也作为需要裂解而具有生物学活性的前体产生(Garten等，1980；Millar等，1988)。
除了F和HN蛋白的可裂解性之外，其他病毒因子也可能对致病性有贡献。Madansky和Bratt(1978,1981a,1981b)已证明转录和翻译中的改变可调节病毒的生长和细胞至细胞传播和/或细胞致病性。
对NDV感染的最初免疫应答是细胞介导的并可早在用活疫苗株感染后2-3天即检测到，这推定解释了在接种的鸟中记录到的在可检测的抗体应答可见之前的抗攻击早期保护(Gough and Alexander,1973)。
在感染后约1周，循环抗体可保护宿主免受再感染，在早期中涉及IgM，随后是IgG。在约3周后滴度和保护达到峰值，并且如果没有加强免疫则逐渐降低，这意味着对于较老的鸟，再接种是必需的。
仅有通过呼吸途径给予的活疫苗在所有粘膜表面和血清中刺激抗体。失活的疫苗，甚至当经肌肉内途径施用时，即使血清抗体浓度很高，也不激发呼吸道中的局部抗性。
这一点强调了能提呈病毒抗原至上呼吸道以诱导局部和系统免疫性的活疫苗的重要性。小滴穿透进下呼吸道，主要产生体液免疫应答，而大滴在上呼吸道刺激局部免疫性。
因此，具有宽范围滴大小的气雾剂产生最佳整体局部和体液免疫性。
但是应注意到，尽管用目前的疫苗密集接种产生高水平抗体滴度，但是病毒仍可从粘膜表面回收。
在美国鉴定新城疫导致应用灭活疫苗(Hofstad,1953)。观察到某些地方性动物病病毒仅产生温和疾病，首先导致开发了中等毒力活疫苗株Roakin(Beaudette等，1949)，随后开发了更温和的HitchnerB1(Hitcner and Johnson,1948)和LaSota(Goldhaft,1980)，后二者是目前应用最广的活疫苗。
NDV活疫苗可分成两组，轻型和中等毒力的，中等毒力毒株由于其毒力较强仅适合作鸟的二次接种。免疫应答随活疫苗致病性的增加而增强，因此，为获得所需水平的保护而不发生严重反应，目前所用接种程序涉及依次使用毒力渐进的疫苗，或者先使用活疫苗，随后使用灭活疫苗。
活疫苗的主要优点是它们可经非昂贵的大量施用技术给予，常用的施用方法是经饮用水。但是，饮用水施用必需严格监控，因为病毒可经过量热和光灭活，并经水中杀病毒性杂质灭活。
通过喷雾和气雾剂大量施用活疫苗也是非常普及的，因为使用这种方法可在短时间内接种大量鸟。重要的是通过控制产生颗粒的条件达到正确颗粒大小。
目前使用的活疫苗具有几个缺点，根据环境条件和合并感染的存在，该疫苗仍可导致疾病迹象。因此，重要的是应用非常温和的病毒进行初次接种，由此通常需要多次接种。另外，母体衍生的抗体可阻止用轻型活疫苗进行的成功初次接种。
灭活疫苗通常从感染性尿囊液产生，感染性尿囊液用福尔马林或β丙内酯处理以灭活病毒，并与合适佐剂混合。灭活疫苗经肌肉内或皮下注射给予。生产和应用灭活疫苗很昂贵。
但是，灭活油乳液疫苗不象活疫苗一样受母体免疫性负面影响，它们可用于几日龄鸡。灭活疫苗的优点是在接种鸟中的副反应水平较低，保护抗体水平高，保护期长。上述疫苗与野生型NDV在血清学上均不可区分。
近年来，重组病毒疫苗的开发已引起家禽业的兴趣。这一概念是将感兴趣致病因子的关键免疫表位基因插入载体病毒的非必需基因中。因此用重组病毒接种导致抗载体病毒和感兴趣疾病因子的免疫。
已评价了作为家禽的潜在活病毒疫苗的几种类型病毒，最为关注的两种禽类病毒是禽痘病毒(FPV)和火鸡疱疹病毒(HVT)。禽痘病毒是DNA病毒，其具有大的基因组，并因此被认为具有充足空间来携带外来基因。
当减毒时，FPV不导致临床疾病并通常用作鸡的疫苗。HVT也是DNA病毒，并被分类为Marek氏病病毒(MDV)家族的血清型Ⅲ,HVT对于鸡是非病原性的，但仍交叉保护抗MDV，并通常用于免疫鸡以抗Marek氏病。
已表明抗新城疫的保护可用重组HVT或FPV疫苗诱导(Morgan等，1992,1993；Heckert等，1996；Boursnell等，1990；Taylor等，1990)。
但是，用表达NDV F蛋白或F和HN蛋白的重组病毒接种后，抗新城疫的保护的起始与用传统活或灭活NDV疫苗接种相比显著延迟，这可能是由于重组疫苗不提供除由重组疫苗表达的NDV蛋白上发现的抗原性相关NDV表位之外的足够宽免疫学范围的抗原性相关NDV表位，或者不能正确提呈至免疫系统。
另外，局部(粘膜、呼吸道或肠道)保护不能在用重组体接种的鸟中诱导。这是一个严重的缺点，因为用于抗呼吸道疾病的初次免疫的疫苗必须诱导局部免疫性以防止感染在野外条件饲养的鸡的强毒病毒的感染和传播。
能保护宿主的抗NDV抗体可以在病毒中和试验中测量，但是，由于中和应答看起来与血凝素抑制(HI)应答平行，所以后一试验通常用于评价保护应答，特别是在接种后。
抗F和HN蛋白的抗体可中和NDV，但是在体内和体外试验中抗F蛋白的抗体看起来比抗HN抗体诱导更强的中和(Meulemans等，1986)。
在鸟血清中存在抗NDV特异抗体几乎不给出对NDV感染株的信息，因此具有有限的诊断学价值。
在多数国家中轻型NDV毒株在鸟中的遍在以及至少不能与野生型NDV血清学区分的活疫苗的几乎全球使用，意味着仅仅证实感染不是采取控制措施的合适原因。由于野外疾病可能不是病毒真正毒力的可靠测量，需要进一步鉴定所发现的病毒。
目前，唯一的能够鉴定感染毒株的新城疫诊断方法是分离病毒，随后进行致病性测试。目前有三种体内测试用于这一目的1)在卵中的平均死亡时间(MDT)；2)在1日龄鸡中的大脑内致病性指数(ICPI)；3)在6周龄鸟中的静脉内致病性指数(IVPI)。
这些测试有许多缺点，如动物的可利用性，差再现性，以及相对长的测试时间，并且这些测试不能简单地经血清学鉴定用疫苗接种的家禽或被野生型毒株感染的家禽。
作为体内测试的替代方法，聚合酶链反应(PCR)已成功地用于区分强毒和无毒分离株(Stauber等，1995；Kant等，1997)，但是，同样血清学区分也是不可能的。
目前家禽饲养和其产品的贸易呈国际化，通常由跨国公司管理。新城疫的威胁已表明是对这种贸易的极大限制。
仅当所有国家均报道爆发新城疫时，其才能得到成功控制。但是，国际间协议不是很简单的，因为在不同国家中疾病监视程度差异巨大，某些国家不进行接种并且不希望任何形式的NDV被导入家禽，因为接种的家禽不能与被野生型NDV感染的家禽区分开。
其他一些国家仅允许使用特异的活疫苗并认为其他疫苗的毒力不能被接受。还有一些国家持续存在循环的高毒力病毒，但由于明显的疾病被接种所隐蔽而未认识到这一点。
在许多国家中存在对可能发生的新城疫爆发的控制的立法，国家控制措施是防止引入和传播。大多数国家有对家禽产品、蛋和活家禽贸易的限制，大多数国家已建立了进口特别是鹦鹉鸟的检疫程序。
一些国家已采取根除政策，强制性屠宰被感染的鸟、其接触物和产品，其他国家甚至在不存在疾病爆发时也要求鸟的预防性接种，而一些国家采取围绕爆发区的环形接种政策以建立缓冲区。
很明显，需要可用于控制新城疫的更好的疫苗和更好的诊断方法。由于在大量应用活疫苗过程中个体鸟接受的剂量的很大不同以及在幼鸡中母体免疫性水平的差别，活疫苗的接种后反应是不可避免的，这是在强制接种的国家中农民的一个主要关注问题。
另外，许多疫苗是亚群的混合物，当克隆时，这些亚群互相在免疫原性和致病性方面可显著不同(Hanson,1988)。
但是目前所用活疫苗和灭活疫苗的最大的缺点是用目前所用的筛选技术如血凝素抑制或病毒中和试验不能区分接种的动物和感染的动物。
强毒野外病毒仍可能在接种禽类中传播，因为疾病症状被接种所隐蔽。由于经体内技术分离病毒和鉴定毒力在大规模上是不可行的，因此非常需要新的和有效的能与野外病毒血清学区分的减毒活疫苗。
这种疫苗称为NDV标记疫苗(及所伴随的诊断方法和试剂盒)应提供最完全免疫学范围的可能的抗原性相关NDV表位，并且应与野生型NDV有血清学区别，这种疫苗目前尚不存在。
本发明提供了一种通过基因修饰而修饰禽副粘病毒基因组的方法，提供了基因修饰的禽副粘病毒和禽副粘病毒标记疫苗。
现代分子生物学技术的发展使得可以对许多RNA病毒包括负链RNA病毒进行基因修饰，这一技术通常称为“反向遗传学”。首先提供病毒RNA的一个(全长)cDNA拷贝，随后在易感细胞中将此DNA转录产生感染性RNA，该感染性RNA可再次复制产生感染性病毒颗粒。
原则上，通过用标准分子生物学技术预先修饰cDNA，可以获得基因修饰的RNA病毒，但是这对于NDV或其他禽副粘病毒从未实现过，甚至还不能产生小基因组片段或禽副粘病毒基因组片段的质粒来研究禽副粘病毒的复制事件，由此了解如何构建感染性拷贝病毒。
令人惊奇地，虽然在本说明书中已完全确认禽副粘病毒基因组是目前测序的所有副粘病毒基因组中最小的，但是特别是NDV基因组的5’末端序列比预先认为的、并且通过与其他副粘病毒科的对比所预期的要长得多。本发明首次提供了禽副粘病毒基因组的全序列并提供了这种病毒的全长或小基因组长度cDNA。
本发明提供了禽副粘病毒cDNA，其至少包含相应于禽副粘病毒基因组5’末端的核酸序列，使得能产生禽副粘病毒的感染性拷贝，所述cDNA优选包含全长cDNA。但是，本发明也提供了cDNA，其至少包含相应于禽副粘病毒基因组的5’末端的核酸序列，由此能产生复制性禽副粘病毒小基因组。这种小基因组可有利地用于从修饰的核酸序列转录RNA和/或表达蛋白质。本发明提供了至少部分衍生于新城疫病毒的本发明的cDNA，例如，其中所述新城疫病毒是轻型病毒，优选衍生自疫苗株，如LaSota毒株ATCC VR-699。
本发明还提供了核酸中额外具有修饰如缺失、插入、突变、颠换等的本发明的cDNA。例如，提供了一种cDNA，其中所述修饰包括编码修饰的蛋白酶裂解位点的核酸，例如其中所述裂解位点是融合(F)蛋白的蛋白酶裂解位点。
在另一个实施方案中，本发明提供了cDNA，其中所述的修饰包括编码杂合病毒蛋白的核酸，所述杂合病毒蛋白如杂合血凝素-神经酰胺酶(HN)蛋白，如在本发明实验部分所述。本发明还提供cDNA，其中所述修饰包括编码病毒蛋白如基质(M)蛋白的核酸的缺失。
本发明还提供了额外具有编码异源抗原的核酸的cDNA，优选地其中所述抗原衍生自家禽病原体，如下所述。还提供了得自本发明的cDNA的RNA及其衍生的蛋白质。
近年来，已成功鉴定了一些不分节段负链RNA病毒，对其基因组的复制和表达的基础研究的结果是能完全通过用所述病毒的克隆cDNA转染细胞而产生感染性病毒(由Conzelmann综述，1996)。
目前，不分节段负链RNA病毒的感染性病毒已从例如狂犬病病毒(Schnell等，1994；Conzelmann,EP0702085A1)，水泡性口炎病毒(Lawson等，1995；Whelan等，1995)，仙台病毒(Garcin等，1995)，麻疹病毒(Radecke等，1995；Schneider等，1997；EP0780475A1)，人呼吸合胞病毒(Collins等，1995)，牛瘟病毒(Baronand Barrett,1997)和人副流感病毒3型(Hoffman and Banerjee,1997,Conzelmann；EP0702085A1)的克隆cDNA产生。
但是，所有上述感染性拷贝病毒均能在体内和体外在宿主，组织或各种来源的细胞中生长，使得在合适细胞系中的cDNA转染和复制及产生感染性病毒颗粒很容易。
这种可能性在NDV中不存在，当然在能提供疫苗的轻型NDV毒株中也不存在。这种NDV毒株的毒力与其在各种细胞中复制的能力相关，由强毒株可容易地在体外和体内复制而疫苗株仅能在体内复制这一事实反映出。
因此，很明显NDV具有catch 22情形，尽管从例如感染性cDNA产生感染性拷贝病毒的尝试可能产生感染性病毒，但是这种病毒通常不适合用作疫苗，因为如此产生的感染性病毒毒力太强不能用作疫苗；在cDNA转染细胞系后其可产生和复制这一事实表明其可容易地将Fo蛋白裂解成F1和F2，如上述所讨论的NDV毒力的特点。
使用疫苗株作为cDNA的亲代材料不能解决这一问题；疫苗株特别是轻型不含容易裂解的Fo蛋白，使得第一代病毒不能持续复制。用于感染的细胞不能用于支持具有不裂解Fo蛋白的疫苗型病毒的一或多轮复制。
本发明提供了这一问题的解决方案，提供了感染性拷贝cDNA，例如用于疫苗中。
本发明提供了产生感染性拷贝新城疫病毒的方法，包括用所述病毒的克隆的全长或基因组长度cDNA转染细胞，该细胞能表达病毒NP,P和L蛋白用于与病毒RNA复合，和进一步包括在培养基中培养所述细胞，该培养基中包含蛋白酶解活性，使得所述病毒的Fo蛋白被裂解。
在我们的系统中，表达NP质粒的共转染可省略。NP可从全长cDNA表达，因为NP基因是在反基因组RNA的5’末端之后的第一个基因。由于真核mRNA通常是单顺反的，因此远端基因预期不表达。但是，可以产生全长cDNA，其中NDV基因的相对位置被改变。如果这种cDNA的第一个基因是P或L基因，则不需从共转染质粒表达相应的基因产物。
作为使用全长cDNA的一种替代，可使用两或更多个亚基因组cDNA，其产生复制匹配亚基因组RNA，并且在一起表达禽副粘病毒蛋白质的全互补序列。即使RNA被分别包装，得到的类似病毒的颗粒可通过共感染和基因功能的互补用于后续复制中。
在一优选的实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述蛋白酶解活性衍生自一种酶如类似胰蛋白酶的酶，或衍生自包含所述蛋白酶解活性的组合物。在更优选的实施方案中，所述培养基包含含蛋白酶解活性的尿囊液。Fo蛋白的裂解是产生感染性病毒所需的。可以不额外添加外源蛋白酶解活性从轻型毒株产生感染性病毒，通过将转染细胞的上清接种进含胚卵的尿囊腔，存在于尿囊液中的蛋白酶解活性能裂解Fo蛋白产生融合匹配的F1-F2复合物。具有这种活化的F蛋白的病毒粒子能感染易感细胞，在表达所需蛋白酶解活性的细胞中的复制产生感染性子代。作为向转染细胞的上清提供所需的蛋白酶解活性的替代方法，例如可以使用相容NDV并已表达蛋白酶解活性的细胞。这种细胞系用于产生感染性轻型NDV，而不添加外源蛋白酶解活性。这种细胞系也可通过用产生所述活性的基因稳定转染细胞系而产生。另外，可以产生表达病毒包膜中野生型F蛋白的稳定转染的细胞系，由此提供能进入细胞的感染性颗粒(它们本身不具备编码野生型F蛋白的基因组信息)。感染性轻型病毒的获救也可通过用NDV辅助病毒感染转染的细胞进行。这种辅助病毒的必须条件是其可通过抗例如中和抗体而选择，这种中和抗体消除辅助病毒而不与轻型病毒反应。最后，可以构建表达一、二或全部三个必需NDV蛋白NP,P和L的稳定转染的细胞系，这种细胞系仅需要共表达三个必需蛋白的亚集合，或者不需共表达即可支持产生感染性拷贝病毒。
在一优选的实施方案中，本发明提供了一种方法，其中用于转染的所述细胞衍生自鸡原代或次代细胞或细胞系，例如CER或CEF细胞，其与大多数体外细胞一样缺乏裂解NDV例如毒株LaSota的Fo蛋白所需的合适蛋白酶。但是，衍生自例如其他鸟类的细胞也可使用。
本发明还提供了产生感染性拷贝新城疫病毒的方法，包括用例如图3所示的所述病毒的克隆的全长或基因组长度cDNA转染细胞，在包含能裂解所述病毒的Fo蛋白的蛋白酶解活性的培养基中培养细胞，以及通过培养所述细胞并用衍生自所述培养的细胞的材料接种含胚卵的尿囊腔。所述材料例如包含(收获或冻融的)细胞或细胞碎片，或从所述细胞培养物衍生的上清。
例如，本文描述了回收感染性病毒的方法，其中将转染的CEF单层的上清接种至含胚卵的尿囊腔，4天后收获尿囊液，在血凝素分析中分析并在卵中进一步传代。
另外，本发明提供了一种方法，进一步包括通过收获尿囊液并再接种含胚卵而传代所述感染性拷贝新城疫病毒。
在本发明一优选的实施方案中，提供了一种方法，其中所述病毒是轻型病毒，例如衍生自无毒野外NDV或NDV的疫苗株，如NDV的LaSota毒株。另外，提供了通过基因修饰而修饰禽副粘病毒基因组的方法，所述基因修饰使得导入一或多个突变、缺失和/或插入或其他修饰。例如，提供了减毒或修饰禽副粘病毒毒力的方法，其是通过修饰例如编码病毒蛋白V蛋白的cDNA，并将所述修饰的cDNA克隆进全长cDNA并从所述全长cDNA产生感染性拷贝病毒，由此产生具有改善性质的新NDV毒株或新减毒活疫苗。
除了通过修饰基因产物减毒之外，也可以通过修饰参与转录和/或复制的核苷酸序列而减毒禽副粘病毒。这种修饰导致表达类似野生型的F蛋白的减毒株，该蛋白在各种细胞中在体外和体内均可裂解，由此比经典疫苗株更具免疫原性。
在一优选的实施方案中，本发明提供了减毒或修饰禽副粘病毒如新城疫病毒的毒力的方法，包括提供修饰编码病毒蛋白的蛋白酶裂解位点的cDNA而修饰这种裂解位点，将所述cDNA克隆进例如新城疫病毒的基因组长度cDNA中并产生感染性拷贝新城疫病毒。所述裂解位点是例如新城疫病毒F或HN蛋白中的蛋白酶裂解位点。减毒通常限于毒力的降低，但是现在可以用相对减毒的NDV毒株并使这种毒株的子代的毒力增强，例如使其在特定细胞类型中复制的趋势增加。因此现在可以赋予NDV独特的毒力。
本发明提供了抗原性修饰禽副粘病毒如新城疫病毒的方法，包括修饰编码携带至少一个免疫显性表位的病毒蛋白的至少一部分的cDNA，将所述cDNA克隆进新城疫病毒的基因组长度cDNA中，并产生感染性拷贝新城疫病毒。
例如，本发明提供了(进一步)修饰NDV的方法，例如使用一种方法以产生已提供的NDV(疫苗)的感染性拷贝，提供了一种重组标记NDV疫苗的方法，含有最完全的可能的或所需的免疫学范围的抗原性相关NDV表位的标记疫苗，并且仍能与野生型NDV由血清学区分，因为一独特的血清学相关的表位或标记已由重组技术除去。本发明提供了修饰禽副粘病毒如NDV的抗原性组成的方法，由此使得产生能与禽副粘病毒野外毒株血清学区分的例如活NDV标记疫苗。
在一个实施方案中，本发明提供了感染性拷贝NDV，其中NDV的HN蛋白已通过将编码一部分所述HN蛋白的cDNA与编码衍生自禽副粘病毒如2型或4型的HN蛋白的一部分的cDNA重组而修饰。所述杂合HN蛋白作为由此获得的感染性拷贝NDV毒株的血清学标记，或者可用于改变禽副粘病毒对其他细胞和/或组织的嗜性。本发明提供的这些所谓的标记毒株使得能产生疫苗，这些疫苗是评价世界上商用禽类中NDV流行的无价工具。另外，大规模应用这种标记疫苗将使得通过密集筛选和消灭感染禽类的方法完全消灭NDV。
另外，提供了一种方法产生表达来自其他病原体的一或多种抗原的感染性拷贝NDV毒株，其可用于抗多种疾病的接种。这种感染性拷贝NDV病毒例如包括编码得自如下病毒的异源蛋白的异源cDNA，所述病毒为禽流感病毒(AI)(血凝素(H5和H7)和神经酰胺酶)，禽白血病病毒(ALV)(env蛋白(gp85))，鸡贫血病毒(CAV)(VP1+VP2),Marek氏病病毒(MDV)(糖蛋白B(gB),gH)，传染性喉气管炎病毒(ILT)(gB,gH,gD)，传染性囊病病毒(IBDV)(VP2和VP3)，火鸡鼻气管炎病毒(TRT)(融合(F)蛋白)，禽副粘病毒2、3、6(PMV)(F蛋白，血凝素神经酰胺酶(HN))，或其他，传染性支气管炎病毒(IBV)(膜粒蛋白，核蛋白)，呼肠孤病毒(sigma蛋白)，腺病毒，肺炎病毒，肠炎沙门氏菌，空肠弯曲杆菌，大肠杆菌，鸟博德特氏菌(旧称粪产碱菌)，副鸡嗜血菌，多杀巴斯德氏菌，鼻腔鸟杆菌，鸭瘟立默氏菌(旧称鸭瘟巴斯德氏菌)，枝原体(鸡败血枝原体，关节液枝原体，火鸡枝原体，衣阿华枝原体)或曲霉(黄曲霉，烟曲霉)。
本发明提供了能用作疫苗载体来表达来自其他家禽病原体的抗原的禽副粘病毒或其衍生的毒株。几种性质使得NDV成为一种理想的疫苗载体用于抗呼吸道或肠道疾病接种1)NDV可在含胚卵中容易地培养至非常高滴度，2)在含胚卵中NDV的大量培养相对廉价，3)NDV疫苗相对稳定并可通过大量应用方法方便地给药，例如通过引用水或喷洒或形成气雾剂，4)NDV感染的天然途径是经呼吸道和/或肠道，其也是许多其他家禽病原体感染的主要天然途径，5)即使存在循环母体抗体，NDV仍可诱导局部免疫性。
已表明NDV具有强抗瘤形成性和免疫刺激性(综述见Schirrmacher等，1998)(Schirrmacher,V.,Ahlert,T.,Steiner,H.-H.,Herold-Mender,C.,Gerhards,R.和Hagmuller,E.(1998)用病毒修饰的肿瘤细胞免疫，肿瘤学研讨会25:677-696)。虽然NDV似乎不能在正常人细胞中繁殖性复制，但注意到选择性NDV介导的对人癌细胞的杀伤。在局部NDV治疗后，在裸鼠中观察到人肿瘤异种移植物的病毒性溶解和完全消除，这导致NDV用于肿瘤治疗。但是，存在的问题是这种应用可能限于局部治疗。
NDV感染诱导干扰素、趋化因子和其他潜在重要的基因产物，并将多效免疫刺激性质引入肿瘤细胞。这一概念已用于生产自体肿瘤细胞疫苗，其由已用NDV感染的新鲜采集的样本组成，这一类型的疫苗称为自体肿瘤疫苗-NDV或ATV-NDV(Schirrmacher等，1998)。NDV感染的细胞用γ-照射灭活，其组织细胞分裂但仍允许NDV在感染的细胞的细胞质中复制。用ATV-NDV接种患者后，通过NDV诱导的趋化因子募集T细胞，这些T细胞的一些可表达T细胞受体，该T细胞受体可与来自与细胞表面的主要组织相容性复合物Ⅰ类分子复合的肿瘤相关抗原的肽相互作用。这一相互作用导致诱导胞毒性T细胞应答，由此特异性杀伤自体肿瘤细胞。
本发明指出由NDV感染诱导的趋化因子和免疫刺激蛋白的全部组成成分和量是受调控的。本发明提供了一种产生重组NDV的方法，所述重组NDV已被修饰掺入和表达一种或多种异源基因。这种重组NDV可用于修饰感染细胞中免疫刺激蛋白的全部组成成分和量。在一个实施方案中，本发明提供了一种重组NDV，其掺入并表达编码人干扰素、趋化因子或其他免疫刺激蛋白的基因。所述重组NDV用于生产ATV-NDV，其比传统ATV-NDV更强。例如，细胞因子IFN-α,IFN-β,TNF-α,IL-1,IL-6；趋化因子RANTES,IP-10；其他基因如HSP,ACTH，内啡肽，iNOS,EPA/TIMP,NFkB。NDV的多效免疫刺激性质也可用作佐剂接种动物和人抗感染性疾病。在本发明的一个实施方案中，编码一或多种感染因子的一或多种相关抗原的外源基因被导入NDV基因组，感染的细胞对抗原和免疫刺激蛋白的同时表达可诱导抗所述感染因子的强免疫应答。在本发明的另一个实施方案中，NDV免疫刺激性质可进一步通过用同时表达抗原和特异免疫刺激蛋白的NDV重组体而增强。在一优选的实施方案中，本发明通过使用表达单独或与免疫刺激蛋白结合的人免疫缺陷病毒(HIV)的相关抗原的NDV重组体用于产生AIDS(获得性免疫缺陷综合征)疫苗。
NDV也可用作佐剂接种动物和人抗感染性疾病。在本发明的一个实施方案中，编码一或多种感染因子的一或多种相关抗原的异种或外源基因被导入NDV基因组，感染的细胞对抗原和免疫刺激蛋白的同时表达可诱导抗所述感染因子的强免疫应答。在本发明的另一个实施方案中，NDV免疫刺激性质可进一步通过用同时表达抗原和特异免疫刺激蛋白的NDV重组体而增强。在一优选的实施方案中，本发明通过使用表达单独或与免疫刺激蛋白结合的人免疫缺陷病毒(HIV)的相关抗原的NDV重组体用于产生AIDS(获得性免疫缺陷综合征)疫苗。
另外，本发明提供了产生条件致死NDV缺失突变体的方法，所述突变体可用作自我限制的不能传播的(载体)疫苗。产生了一种NDV缺失突变体，其不能表达参与NDV在内层细胞膜上芽生的基质(M)蛋白。本发明提供了例如一种表型互补的NDV毒株，其不能表达M蛋白，但仍能感染细胞并能通过细胞至细胞传播而扩散。但是突变病毒在非互补细胞中不能产生感染性子代，这表明表型互补的NDV缺失突变体可用作安全的自我限制的疫苗，其不会传播进环境中。这种不能传播的疫苗组合了活疫苗的最重要的优势，即效率，和灭活疫苗的最重要优势，即安全性。
本发明提供了新城疫病毒，或其衍生的毒株，例如通过在含胚卵或合适细胞中传代或进一步培养所衍生的，即衍生自通过本发明方法获得的感染性拷贝病毒。
例如，提供了这样的NDV，其以至少一种方式修饰而产生减毒的、毒力修饰的、抗原性修饰的、表达异源抗原或非传播的或其组合的感染性拷贝新城疫病毒。
本发明提供了NDV疫苗，其特征在于例如携带独特的毒力特征或独特的抗原性特征，其可以用于标记疫苗用途和/或表达来自其他病原体的异源抗原，其可以是可传播的和/或不能传播的形式。
这种疫苗可以是灭活的疫苗或活疫苗，优选地，这种疫苗是活疫苗，但是在活疫苗不适用或很少适用的情况，例如由于贸易限制或由疾病控制当局设定的其他条件下，有利的是本发明提供的灭活疫苗。
本发明也提供了诊断方法，和相应的测试试剂盒，以检测抗所述血清学相关免疫显性表位或标记的抗体，该试剂盒提供了在家禽中进行控制和/或消灭NDV和/或其他家禽疾病的方法的方法和手段。本发明提供了新的有效的疫苗，其可以与野外病毒和现有疫苗经血清学区分。这种称为NDV标记疫苗的新疫苗提供了最完全免疫学范围的抗原性相关NDV表位，并仍可通过应用所附诊断方法和试剂盒与野生型NDV血清学区分。
本发明提供了一种将未接种动物或用本发明的NDV疫苗接种的动物与被野生型NDV感染的动物或用未修饰的中等毒力或轻型NDV疫苗株接种的动物区分开的方法，包括从所述动物取至少一种样品(如血清、血、蛋或眼液体)，确定所述样品中是否存在抗由所述野生型或未修饰的NDV表达的但不被本发明的疫苗表达的免疫显性表位或标记的抗体。
本发明提供了一种方法，其中所述抗体抗NDV的HN或F蛋白，例如在本说明书实验部分所述的杂合蛋白。本发明提供了例如一种诊断方法，其中所述动物选自由家禽组成的一组，优选鸡。
本发明还提供了用于血清学区分动物的方法中的诊断试剂盒。在本发明的一个实施方案中，使用一种简便的快速的血凝集抑制(HI)试验以区分接种的动物和感染的动物。用标记疫苗接种的动物不诱导抗NDV的HN的抗体，因而不抑制NDV病毒粒对红细胞的血凝集作用，该疫苗中NDV的HN的完整球状头部被另一种血清型的HN的相应部分替换。
通过在HI试验中应用标记疫苗毒粒，检测到抗杂合HN蛋白的抗体，并可用作检测接种效果的措施。或者，检测抗NDV的F蛋白的抗体的ELISA用于检测接种效果。
除了HI试验，可使用ELISA确定抗NDV的HN的抗体的存在，在这种试验中使用的抗原例如是由重组DNA技术表达的NDV的HN或来自NDV的HN的保守肽。
也可使用封闭ELISA，在这种情况下使用抗NDV的HN的保守表位的一或多种单克隆抗体确定在来自接种的动物的样品中是否存在竞争抗体。如果标记疫苗仅含有嵌合HN蛋白或当NDV的HN的几个表位被替换时使用ELISA试验是有利的。
本发明进一步在本说明书的实验部分解释，但其不限制本发明。
实验部分材料和方法除非另有说明，均根据Sambrook等(1989)进行标准克隆程序。所有涉及由聚合酶链反应(PCR)产生的DNA片段的构建过程均由序列分析证实。在如下给出的引物序列中，下划线的核苷酸相应于NDV序列，并示出在NDV基因组中的位置。用于克隆的限制位点的核苷酸序列用黑体字示出。
细胞和病毒CER细胞(Smith等，1976)在含5％胎牛血清和2％抗生素混合物(含1000U/ml青霉素，1000μg/ml链霉素，20μg/ml两性霉素B,500μg/ml多粘霉素B和10mg/ml卡那霉素)的GMEM/EMEM(1∶1)中培养。QT35细胞(Moscovici等，1977；Cho,1982)在补加5％FCS和2％抗生素混合物的由GibcoBRL/Life Technologies供应的培养基(目录号041-91536；Fort Dodge的专利组合物)中培养。QM5细胞(Antin and Ordahl,1991)在补加10％磷酸tryptose液体，10％FCS和2％抗生素混合物的M199培养基中培养。
NDV毒株LaSota得自ATCC(ATCC VR-699)并在含胚卵中传代两次。在我们开始构建和克隆cDNA之前，病毒在原代鸡胚胎成纤维细胞(CEF)上经三轮噬斑纯化而纯化。为此，在含5％胎牛血清、2％抗生素混合物、5％尿囊液、30mM MgCl2、200μg/ml DEAE-葡聚糖(Sigma)和0.8％琼脂Nobel(Difco)的GMEM/EMEM(1∶1)中培养的CEF细胞上滴定病毒。将来自第三轮噬斑纯化的病毒(称为克隆E13-1)在含胚卵中培养，接种四天后收集尿囊液并在-70℃等份储存。表达T7 RNA聚合酶的重组禽痘病毒fpEFLT7pol(Britton等，1996；以下称为FPV-T7)由Michael Skinner惠赠，并在QT35细胞上培养。
病毒RNA的分离所有操作均在无RNase玻璃容器或塑料容器中进行，所有溶液均用无RNase水配制，所述的水用1％二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理并高压灭菌。在Beckman SW40转子中于4℃、21000rpm离心70分钟而从尿囊液沉淀病毒，沉淀重悬于均质缓冲液(50mM Tris-HClpH7.5,50mM NaCl,5mM EDTA,0.5％SDS)中并用蛋白酶K(200μg/ml)在37℃振荡处理90分钟。裂解物用等体积苯酚/氯仿(1∶1)pH5.4抽提两次，用等体积氯仿抽提一次，加入0.1体积3MNaOAc pH5.3和2.5体积100％乙醇从水相沉淀病毒RNA。离心收集沉淀，用70％乙醇洗涤，重悬于水中，并等份储存在-70℃。
反转录在12微升体积中将病毒RNA(1.5微克)与500纳克引物混合，并在70℃保温10分钟，加入4微升5×RT缓冲液(250mM Tris-HCl,pH8.3,375mM KCl,15mM MgCl2；GibcoBRL/Life Technologies)，在42℃保温混合物2分钟。通过加入200单位反转录酶(SuperscriptⅡ；GibcoBRL/Life Technologies)并随后在42℃保温60分钟而在终体积20微升中进行反转录。
聚合酶链反应(PCR)用于确定NDV基因组的3’和5’末端的所有PCR反应(参见下述)均用Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)进行。为克隆具体的NDV基因或大的亚基因组cDNA，根据供应商(宝灵格曼海姆)的指导，使用校正DNA聚合酶Pwo或Taq和Pwo混合物(Expand高可靠性试剂盒或Expand长模板试剂盒)。所有样品在开始指定次数PCR循环之前均在94℃保温2分钟。在指定次数PCR循环后，样品在延伸温度保温该PCR循环的延伸时间的至少3倍长时间。用高纯度PCR产品纯化试剂盒(宝灵格曼海姆)直接纯化PCR片段，或在琼脂糖凝胶电泳后用QiaexⅡ抽提试剂盒(Qiagen)基本上如供应商所述纯化PCR片段。
序列分析所有序列均用PRSM现成反应染料脱氧终止子循环测序试剂盒(Perkin Elmer)确定。反应混合物(5微升)在-GeneAmp2400热循环仪中进行25个线性扩增循环(94℃10秒，50℃5秒，60℃4分钟)，随后用乙醇纯化反应混合物，用70％乙醇洗一次，重悬于15微升TSR缓冲液(Perkin Elmer)中，在上样至Applied BiosystemsAB310自动测序仪之前在94℃加热2分钟。
用于测序NDV毒株LaSota完整基因组的引物的核苷酸序列衍生自公布的序列或在此测序计划中确定的序列。引物见表1所示。
NDV毒株LaSota基因组的3’和5’末端的克隆和测序NDV基因组的3’和5’末端的核苷酸序列用RACE程序(cDNA末端的快速扩增)确定。在一使用衍生自NDV的L基因的公布序列(Yusoff等，1987)的引物p360(5＇-GGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT-3＇；nt 14756-14779)的终体积20微升的反转录反应中应用NDVRNA。将单链cDNA(2.5微升RT混合物)加入8pmol锚定引物ALG3(5＇-CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC-3＇)中，并根据Tessier等(1986)所述，在含50mM Tris-HCl,pH8.0,10mM MgCl2,10μg/ml BSA,25％PEG,1mM HCC,20μM ATP和10单位T4 RNA连接酶(New England Biolabs)的20微升反应混合物中于室温连接过夜。用1微升连接反应作为PCR反应的模板，使用引物p375(5＇-CAATGAATTCAAAGGATATTACAGTAACT-3＇；nt 14964-14983)和ALG4(5＇-GAAGGATCCAGAATCGATAG-3＇)，后一引物互补于锚定引物ALG3。PCR条件(40个循环)如下94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，PCR产物纯化并克隆在T载体pBluescriptⅡ-TSK(Ichihara and Kurosawa,1993)中。或者，纯化的PCR产物用KlenowDNA聚合酶Ⅰ处理产生平末端并克隆在质粒pGEM4Z(Promega)的HincⅡ位点。测序13个独立的克隆(8个pBluescriptⅡ-TSK和5个pGEM4Z)以确定NDV毒株LaSota基因组的5’末端的核苷酸序列。3’末端的核苷酸序列由两个独立的方法确定，在方法Ⅰ中，用T4 RNA连接酶如Schutze等(1995)所述将引物ALG3连接至病毒RNA的3’末端，反应混合物(终体积10微升)含有2.5微克NDV RNA,100pmol ALG3,1微升10×T4 RNA连接酶缓冲液(500mM Tris-HCl,pH7.8,100mM MgCl2,100mM DTT,10mMATP),1微升DMSO,1微升10μM己胺-氯化钴，1微升RNasin(Promega)和10单位T4 RNA连接酶(New England Biolabs)。混合物室温保温过夜，5微升连接反应用作一反转录反应的模板，使用ALG4作为引物。1微升RT反应用作一PCR反应的模板，使用引物ALG4和p376(5＇-GAGCCTTAAGGAGCTGCTCGTACTGATC-3＇；nt 137-164)，后一引物衍生自NDV的3’末端的公布序列(Ishida等，1986),PCR条件如上述5＇RACE的条件。在方法Ⅱ中，病毒NDVRNA的3’和5’末端使用T4 RNA连接酶，在上述方法Ⅰ的相同条件下互相连接。5微升连接混合物用作一反转录反应的模板，使用引物p360。1微升RT反应用作一PCR反应的模板，使用引物p375和p376,PCR条件与5＇RACE条件相同。PCR产物用Klenow DNA聚合酶Ⅰ处理产生平末端并克隆在质粒pGEM4Z(Promega)的HincⅡ位点。10个独立的克隆(4个来自方法Ⅰ,6个来自方法Ⅱ)测序以确定NDV毒株LaSota基因组的3’末端的核苷酸序列。
转录载体的构建用质粒pOK12(Vieira and Messing,1991)作为基本复制子构建低拷贝数转录载体。质粒pOK12用PvuⅡ消化，分离含有复制起点和卡那霉素抗性基因的DNA片段，这一片段与来自转录载体2.0(Dr.Andrew Ball惠赠；Pattnaik等，1992)的Eco47Ⅲ-AflⅡ片段(AflⅡ位点用Klenow DNA聚合酶Ⅰ平末端化)连接。从得到的质粒缺失-XbaⅠ-NheⅠ片段以消除尽可能多的单一限制位点，得到的质粒称为pOLTV5(
图1)。转录载体pOLTV5含有T7 DNA依赖性RNA聚合酶启动子，后接单一StuⅠ和SmaⅠ限制位点，来自丁型肝炎病毒(HDV)的自催化核酶以及来自噬菌体T7的转录终止信号。克隆在StuⅠ和SmaⅠ限制位点之间的DNA片段可用T7 RNA聚合酶体外或体内转录。转录后，得到的转录物的5’末端含有质粒编码的两个G残基。由于HDV核酶的自催化作用，转录物的3’末端相应于克隆的DNA片段的确切末端核苷酸(Pattnaik等，1992)。
小基因组质粒的构建为检查NDV复制和转录所需的要求，构建小基因组质粒，其含有NDV 3’和5’末端区，这两个末端区位于置换全部NDV基因的报道基因的侧翼(图2)。相应于NDV 3’和5’末端区的DNA片段用Pwo DNA聚合酶经PCR产生(30个循环，94℃15秒，50℃30秒，72℃30秒)，用含有3’和5’RACE片段的质粒作为模板(见上述)。
3’区用引物3UIT(5＇-ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3＇,nt 1-27)和SEAP3(5＇-ATCGATACTGGTCAGCATGCTGGCAGAAGGCTTTCTCG-3＇,nt 102-119)产生，5’区(nt 14973-15186)用引物SEAP5(5＇-GCATGCTGACCAGTATCGATATTACAGTAACTGTGACT-3＇,nt 14973-14990)和5NDV(5＇-ACCAAACAAAGATTTGGTGAATGACGA-3＇,nt 15158-15186)产生。这两个片段在一重叠PCR(重叠在上述引物序列中以斜体示出)中用引物3UIT和5NDV连接在一起。得到的DNA片段是由20个核苷酸隔开的NDV3’和5’末端的融合体，将该片段用T4多核苷酸激酶处理而磷酸化，并以两个方向克隆在用StuⅠ和SmaⅠ裂解并用小牛肠磷酸酶(宝灵格曼海姆)去磷酸化的转录质粒pOLTV5(图1)中。最后，通过用SphⅠ和ClaⅠ消化从质粒pSEAP-Basic(Clontech)中回收SEAP基因(编码分泌的碱性磷酸酶)并克隆在NDV3’和5’末端之间的SphⅠ和ClaⅠ位点之间。得到的质粒分别称为pOLTV535和pOLTV553。用T7 RNA聚合酶对质粒pOLTV535进行体外或体内转录产生反基因组RNA([+]-RNA)，而质粒pOLTV553的转录得到基因组RNA([-]-RNA)。
通过分别在位于pOLTV535和pOLTV553的SEAP基因和NDV5’末端之间的ClaⅠ位点插入自身互补寡核苷酸产生了质粒pOLTV535N0-N5和pOLTV553N0-N5(图2)。所用寡核苷酸为N0,5＇-CGCGAGCTCG-3＇；N1,5＇-CGCGAGSCTCG-3＇；N2,5＇-CGCGAGCGCTCG-3＇；N3,5＇-CGCGAGCWGCTCG-3＇；N4,5＇-CGCGAGCATGCTCG-3＇；N5,5＇-CGCGAGCASTGCTCG-3＇(W=A或T；S=C或G)。
质粒pOLTV535和pOLTV553中T7启动子的修饰为产生含NDV的真5’和3’末端的体外和体内转录物，修饰质粒pOLTV535和pOLTV553中T7启动子，从而转录在NDV的3’或5’末端的第一个核苷酸开始。
设计这样的引物，其含有1)BglⅠ限制位点，2)T7启动子序列(斜体示出)，其被修饰以使T7启动子末端的两个G残基被一个A残基置换，和3)NDV的3’(nt 1-21)或5’末端(nt 15164-15186)。用引物BGL3F2(5＇-GATATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTATAACCAAACAGAGAATCCGTGAG-3＇)和SEAP3(见上述)产生一DNA片段，其含有修饰的T7启动子和直至pOLTV535中SEAP基因的起点的完整NDV 3’末端。类似地，用引物BGL5F2(5＇-GATATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTATAACCAAACAAAGATTTGGTGAATG-3＇)和SEAP5产生含有修饰的T7启动子和直至pOLTV553中SEAP基因的终点的完整NDV 5’末端的DNA片段。得到的片段分别用BglⅠ和SphⅠ(3’末端)或BglⅠ和ClaⅠ(5’末端)消化，并用于置换pOLTV535中的BglⅠ-SphⅠ片段或pOLTV553中的BglⅠ-ClaⅠ片段，得到的质粒分别称为pOLTV735和pOLTV753。质粒pOLTV735N3和pOLTV753N3是通过将一自身互补寡核苷酸(5’-CGCGAGCWGCTCG-3＇；W=A或T)分别插入位于pOLTV735和pOLTV753中SEAP基因和NDV 5’末端之间的ClaⅠ位点中而获得。
SEAP报道基因质粒的构建通过将来自质粒pSEAP-Basic(Clontech)的含有SEAP基因的XhoⅠ-ClaⅠ片段(用Klenow DNA聚合酶Ⅰ将ClaⅠ位点平末端化)克隆在真核表达载体pCIneo(Promega)的XhoⅠ和SmaⅠ位点之间而构建质粒pCIneoSEAP,pCIneo除了噬菌体T7启动子外还含有人巨细胞病毒(hCMV)启动子。为了检查和定量仅由T7启动子产生的转录物对SEAP的表达，构建另一个缺失hCMV启动子的质粒，为此通过用HindⅢ部分消化pCIneo并用BglⅡ完全消化而从pCIneo中缺失hCMV启动子。分离缺失了hCMV启动子的DNA片段(根据Clontech的计数为nt 756-5469)，用T4 DNA聚合酶处理以产生平末端，用T4 DNA连接酶再环化，得到的质粒称为pCIneoD。最后，从pSEAP-Basic以MluⅠ-AccⅠ片段回收SEAP基因并克隆在pCIneoD的MluⅠ和ClaⅠ位点之间，得到的质粒称为pCIneoD SEAP。
转染细胞种于24孔培养皿，过夜培养至60-80％铺满，并用FPV-T7以m.o.i.为1在37℃感染1小时。用3微升LipofectAMINETM和OptiMem基本上根据供应商说明(GibcoBRL/Life Technologies)用0.5微克小基因组质粒DNA转染细胞。在37℃保温4小时(CER细胞)或16小时(QM5细胞)后，细胞用NDV(荷兰强毒分离株152608号；200微升每孔)以m.o.i.为5感染1小时或者不感染。吸出接种物并用1毫升完全培养基替换，进一步在37℃保温细胞。为了共转染，将细胞在6孔培养皿中培养并如上所述用FPV-T7感染。使用8微升LipofectAMINETM或9微升FuGeneTM6(宝灵格曼海姆)，细胞用0.25微克小基因组质粒DNA、0.4微克pCIneoNP、0.2微克pCIneoP和0.2微克pCIneoL(c)或pCIneo共转染。为产生感染性病毒，小基因组质粒用含有全长NDV cDNA的转录质粒替换。
SEAP活性的定量分泌进转染细胞的培养基中的SEAP量在一次性96孔板中测量，使用用于分泌的碱性磷酸酶的Phospha-LightTM化学发光报道分析试剂盒，基本上如供应商(Tropix)所述进行测量。化学发光是用液闪计数器(Wallac 1450 microbeta PLUS)定量。
跨越NDV毒株LaSota的整个基因组的cDNA的克隆和测序为克隆和测序NDV毒株LaSota的完整基因组，通过RT-PCR产生大的亚基因组cDNA克隆并克隆在pGEM-T中。第一链cDNA合成通过用引物3UIT如上所述进行，1微升RT反应用于一PCR反应中，使用Expand长模板PCR试剂盒(宝灵格曼海姆)，PCR由5个循环的94℃10秒、58℃30秒和68℃6分钟，10个循环的94℃10秒、58℃30秒和68℃6分钟组成，其中68℃延伸时间每个循环增加20秒。将PCR片段用pGEM-T克隆试剂盒基本上如供应商(Promega)所述克隆在pGEM-T中。连接混合物转化进大肠杆菌菌株SURE Ⅱ(Stratagene)。进行两个独立的RT-PCR反应(A和B)，每个反应产生类似系列的cDNA克隆。亚基因组cDNA克隆的核苷酸序列用NDV特异性引物(表1)和侧翼于插入片段的引物确定。将A和B系列克隆的核苷酸序列进行比较后，通过测序第三个独立系列的cDNA(C系列)的相关区而解决剩余的分歧区。NDV毒株LaSota的核苷酸序列如图3所示。
NDV全长基因组cDNA克隆的构建用pOLTV535作为起始质粒将全长NDV cDNA组装在转录质粒pOLTV5中。如图4所示，用通用限制性内切酶将DNA片段重叠连接在一起。在一系列克隆步骤中，构建含有由一ClaⅠ位点隔开的核苷酸1-3521和12355-15186的质粒(称为p535-DI)，该ClaⅠ位点是通过将在位置3521和12355的ClaⅠ相结合而形成的。在另一系列克隆步骤中，构建含有包括核苷酸3521-12355(ClaⅠ片段)的部分NDV基因组的质粒(称为pGEM-B)。为促进克隆，后一ClaⅠ片段附加有来自质粒pACYC184(Chang and Cohen,1978)的氯霉素抗性(Cm)基因，为此，用引物CAT-F(5＇-GCGTACGTCTAGACTGGTGTCCCTGTTGATACCGG-3＇)和CAT-R(5＇-GCTCTAGACGTACGACCCTGCCCTGAACCGACG-3＇)经PCR而从pACYC184中回收Cm基因，PCR用Pwo聚合酶进行，由30个循环的94℃30秒、60℃45秒和72℃60秒组成。得到的PCR片段用BsiWⅠ消化并克隆在pGEM-B的单一BsiWⅠ位点，产生pGEM-B(CAT)。来自pGEM-B(CAT)的ClaⅠ片段克隆在p535-DI的单ClaⅠ位点，产生pNDFL(CAT)。最后，通过用BsiWI消化从这一质粒除去Cm基因，再连接并转化大肠杆菌菌株DH5α。得到的质粒称为pNDFL+，含有克隆在转录质粒pOLTV5中的T7启动子和HDV核酶之间的完整NDV cDNA序列。
各个NDV基因的克隆和表达含有每个NDV LaSota基因的DNA片段通过RT-PCR产生并克隆在pCIneo中。克隆后，用侧翼于插入片段的引物和基因特异性引物测序所有片段。
NP基因用引物386(5＇-GAGCAATCGAAGTCGTACGGGTAGAAGGTG-3＇；nt 40-69)进行反转录，使用引物365(5＇-GTGTGAATTCCGAGTGCGAGCCCGAAG-3＇；nt 77-94)和892(5＇-TTGCATGCCTGCAGGTCAGTACCCCCAGTC-3＇；nt 1577-1593)经PWo DNA聚合酶进行PCR，使用下述PCR条件(30个循环)95℃30秒、65℃40秒和72℃45秒。得到的DNA片段用EcoRⅠ消化并克隆在pCIneo的EcoRⅠ和SmaⅠ位点之间。NP的表达在如Peeters等(1992)的免疫过氧化物酶单层分析(IPMA)中用单克隆抗体38(Russell等，1983)证实。
P基因用引物pRT1(5＇-CAAAGAATTCAGAAAAAAGTACGGGTAGAA-3＇；nt 1794-1814)进行反转录，使用引物pRT1和p2(5＇-GCAGTCTAGATTAGCCATTCACTGCAAGGCGC-3＇；nt 3053-3071)经Pwo DNA聚合酶进行PCR，使用下述PCR条件(30个循环)95℃30秒、65℃40秒和72℃60秒。得到的DNA片段用EcoRⅠ和XbaⅠ消化并克隆在pCIneo的EcoRⅠ和XbaⅠ位点之间。P的表达在IPMA中用单克隆抗体688(Russell等，1983)证实。
M基因用引物3UIT(5＇-ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3＇；nt 1-27)进行反转录，使用引物NDV5M(5＇-GGGTGCTAGCGGAGTGCCCCAATTGTGCCAA-3＇；nt 3268-3288)和NDV3M(5＇-TCTCCCCGGGGCAGCTTATTTCTTAAAAGGAT-3＇；nt4368-4389)和Expand高可靠性试剂盒进行PCR,PCR为10个循环的95℃15秒、55℃30秒和68℃2分钟，后接15个循环，其中68℃延伸时间每个循环增加20秒。得到的DNA片段用T4 DNA聚合酶处理产生平末端，用NheⅠ消化并克隆在pCIneo的NheⅠ和SmaⅠ位点之间。M蛋白的表达在IPMA中用单克隆抗体424(Russell等，1983)证实。
F基因用引物3UIT(如上所述)进行反转录，使用引物NDV5F(5＇-ACGGGCTAGCGATTCTGGATCCCGGTTGG-3＇；nt 4508-4526)和NDV3F(5＇-ACTACCCGGGAAACCTTCGTTCCTCAT-3＇；nt 6212-31)和Expand高可靠性试剂盒在如上所述M基因的PCR条件下进行PCR。得到的DNA片段用T4 DNA聚合酶处理产生平末端，用NheⅠ消化并克隆在pCIneo的NheⅠ和SmaⅠ位点之间。F蛋白的表达在IPMA中用单克隆抗体8E12A8C3(ID-DLO，禽病毒学部)证实。
HN基因用引物3UIT进行反转录，使用引物NDV5HN(5＇-GTAGGCTAGCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3＇；nt 6335-6354)和NDV3HN(5＇-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3＇；nt8205-8227)和Expand高可靠性试剂盒在如上所述M基因的PCR条件下进行PCR。得到的DNA片段用T4 DNA聚合酶处理产生平末端，用XmaⅠ消化并克隆在pCIneo的平末端的(Klenow DNA聚合酶)NheⅠ和XmaⅠ位点之间。HN蛋白的表达在IPMA中用单克隆抗体86(Russell等，1983)证实。
L基因L基因从cDNA克隆pGEM-L7a(图4A)用SacⅡ和SalⅠ消化而回收。在用SalⅠ消化之前，用T4 DNA聚合酶处理使SacⅡ位点平末端化，得到的片段克隆在pCIneo的平末端化的(KlenowDNA聚合酶)NheⅠ位点和SalⅠ位点之间。T7启动子和L基因的ATG起始密码子之间的5’非翻译区含有2个不同框ATG密码子，其干扰L蛋白的正确表达。因此，构建一新质粒，其中第一个ATG缺失，第二个ATG通过如下PCR诱变改变为AAG。用质粒pGEM-L7a(图4)作为模板在一PCR中使用引物5LE(E)(5＇-CAATGGAATTCAAGGCAAAACAGCTCAAGGTAAATAATACGGG-3＇；nt 8332-8374)和3LE(B)(5＇-GTGAATCTAGAATGCCGGATCCGTACGAATGC-3＇；nt 8847-8870),PCR用Pwo DNA聚合酶进行，其由30个循环的94℃30秒、60℃45秒和72℃60秒组成。得到的DNA片段用EcoRⅠ和XbaⅠ消化，克隆在pCIneo的EcoRⅠ和XbaⅠ位点之间，产生质粒pCIneoL(N)。随后，将来自pGEM-L7a的含有L基因其余部分(nt 8852-15046)的BsiWⅠ-SalⅠ片段克隆进pCIneoL(N)的BsiWⅠ和SalⅠ位点之间，产生质粒pCIneoL(c)。由于没有抗L蛋白的抗体，L的表达不能用免疫化学检查。
在F基因作引入遗传标记为毫无疑问地显示感染性病毒可从克隆的全长cDNA产生，通过PCR诱变将一遗传标记引入F基因。为此，用两个重叠PCR片段克隆F基因，第一个PCR片段用引物NDV5F(见上述)和引物F5R(5＇-AAAGCGCCGCTGTCTCCTCCCTCCAGATGTAGTCAC-3＇；nt 4859-4894)产生，黑体残基是导入到引物中的变化以使F1和F2之间的蛋白酶解位点的氨基酸序列由NDV LaSota毒株的序列(GGRQGR|L)改变为强毒NDV毒株的保守裂解位点的序列(GRRQRR|F)。第二个PCR片段用引物F3F(5＇-GGAGGAGACAGCGGCGCTTTATAGGCGCCATTATTGG-3＇；nt 4875-4911)和Ⅳ09(5＇-CTCTGTCGACACAGACTACCAGAACTTTCAC-3＇；nt 6246-6266)产生，这一PCR用Pwo DNA聚合酶进行，由25个循环的94℃15秒、55℃30秒和72℃2分钟组成。用引物NDV5F和Ⅳ09和相同PCR条件将两个重叠PCR片段(重叠在引物序列中以斜体示出)在第二个PCR中连接在一起。得到的片段含有F基因的完整ORF并编码毒力保守裂解位点，用NheⅠ和SalⅠ消化该片段并克隆在pCIneo的NheⅠ和SalⅠ位点之间，得到pCIneoFwt。来自pCIneoFwt的StuⅠ-NotⅠ片段(nt 4646-4952)用于置换质粒p535-S中的相应片段，质粒p535-S通过将来自pGEM-B的ClaⅠ-ScaⅠ(nt 3521-10311)插入p535-DⅠ的ClaⅠ和ScaⅠ位点之间而构建(见图4C)。得到的质粒称为p535-S[Fwtc]。将含有来自pACYC184(见上述)的Cm抗性基因的PCR片段作为XbaⅠ片段克隆进质粒p535-S[Fwtc]的单XbaⅠ位点(NDV序列的第6172位)，得到质粒p535-S[Fwtc]Cm。随后，这一质粒的Cm标记的ApaⅠ-SpeⅠ片段(nt 2285-8094)用于置换全长cDNA克隆pNDFL+的相应片段。最后，通过用XbaⅠ消化并用T4 DNA连接酶再环化从这一质粒除去Cm基因。得到的质粒含有遗传标记的全长NDV cDNA，被称为pNDFL+[Fwt]。
产生表达各个NDV基因的稳定转化的细胞系质粒pCIneoNP,pCIneoP,pCIneoM,pCIneoF,pCIneoFwt和pCIneoHN用于产生分别表达这些蛋白质的稳定转化的细胞系。在转染前一天，将CER细胞种于6cm培养皿中，并保温过夜以达到60-80％铺满。用12微升LipofectAmine和OptiMem基本上如供应商所述(GibcoBRL/Life Technologies)用2微克质粒DNA转染细胞。48小时后胰酶化细胞并将在含500微克/毫升G418(宝灵格曼海姆)的培养基中的稀释液种于10cm培养皿中。每3天用含增加(100微克/毫升逐步增加)量的G418的新鲜培养基更换培养基，直至达到800微克/毫升G418。细胞保持在含800微克/毫升G418的培养基中，转染后3周，挑取各个集落并转移至96孔培养皿中。用如上所述瞬时表达研究的IPMA检查克隆的细胞系对各个NDV基因的表达。
组成型表达NP,P,M或F的细胞系可鉴别并分离，但是我们不能产生表达HN蛋白的细胞系，也许HN的组成型表达对细胞是有毒性的。
产生表达T7 RNA聚合酶的稳定转化的细胞系通过用EcoRⅠ和SalⅠ消化从质粒pRT7NT(Rene van Gennip,ID-DLO，哺乳动物病毒学部)回收编码T7 RNA聚合酶的基因。得到的片段含有位于杆状病毒p10启动子后面的T7 RNA聚合酶基因。将该DNA片段克隆在质粒pCIneo0的EcoRⅠ和SalⅠ位点之间，产生质粒pCIneo107。质粒pCIneo0不含T7启动子并通过用NheⅠ裂解、随后用ScaⅠ部分裂解、用Klenow DNA聚合酶填充粘末端并用T4DNA连接酶再环化而衍生自pCIneo。杆状病毒序列通过用EcoRⅠ和PacⅠ消化、T4 DNA聚合酶处理产生平末端并再环化而从pCIneo107除去。得到的质粒称为pCIneo007。T7 RNA聚合酶的表达通过用pCIneo007和pPRh01共转染细胞而证实，后一质粒含有克隆在T7启动子之后的含有内部核糖体进入位点的经典猪瘟病毒的E2蛋白质(Rene van Gennip，个人通讯)。E2的表达在一IPMA中用单克隆抗体V4(Wensvoort等，1986)测定。如上所述产生并分离表达T7 RNA聚合酶的稳定转化的CER细胞系，不同之处是使用10cm培养皿，且细胞用5微克pCIneo007 DNA和25微升LipofectAmine转染。为检查表达T7 RNA聚合酶的个体细胞系，用质粒pPRh01转染这些细胞系并在一IPMA中用单克隆抗体V4检查E2的表达(其依赖于T7 RNA聚合酶)。鉴定了表达T7 RNA聚合酶的几个细胞系，其中一个细胞系，称为CER-C9，用于以下实验。
HN基因和杂合HN基因的克隆和表达如上所述用引物3UIT合成NDV和禽副粘病毒血清型2和4(APMV2和APMV4)的单链cDNA，所有后续的PCR反应均为25个循环的94℃15秒、55℃30秒和72℃2分钟。
APMV2的HN基因的完整编码区用引物Ⅳ03(5＇-GGGGGAATTCCCCATTCAATGAAGGGTCTAC-3＇)和Ⅳ05(5＇-GATCCCCGGGTCTTAAACCAGGCTTCGCAATG-3＇)经PCR回收，所述引物衍生自APMV2的HN基因序列(GenBank登录号D14030)。APMV4的HN基因的完整编码区用引物Ⅳ06(5＇-GGGGGAATTCTGGTAGGGTGGGGAAGGTAGC-3＇)和Ⅳ08(5＇-ATTGCCCGGGGGGTAACTAATCAGGATCTCAG-3＇)经PCR回收，所述引物衍生自APMV4的HN基因序列(GenBank登录号D14031)。得到的PCR片段用EcoRⅠ和XmaⅠ消化(直接消化或在亚克隆在pGEM-T中之后消化)并克隆在pCIneo的EcoRⅠ和XmaⅠ位点之间，得到的质粒分别称为pCIneoHN2和pCIneoHN4。
NDV毒株LaSota的HN基因和APMV2和APMV4的HN基因之间的杂合体用如下重叠PCR构建。NDV毒株LaSota的HN基因的N-末端部分(氨基酸1-141)用引物Ⅳ01B(5＇-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3＇；nt 6325-6354)和Ⅳ10(5＇-AATGAGTTCTTTGCCTATCCCCCC3＇；nt 6811-6834)。APMV2的HN基因的C-末端部分(氨基酸142-580)用引物Ⅳ11B(5＇-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTCAAGGAGATGCATCTGCAGGC-3＇)和Ⅳ05经Pwo DNA聚合酶扩增。在一重叠PCR中(重叠以斜体示出)用引物Ⅳ01B和Ⅳ05以及Expand高可靠性酶混合物将得到的片段连接在一起。得到的PCR片段用EcoRⅠ和XmaⅠ消化(直接消化或在亚克隆在pGEM-T中之后消化)并克隆在pCIneo的EcoRⅠ和XmaⅠ位点之间。得到的质粒含有杂合HN基因，由NDV的氨基酸1-141和APMV2的氨基酸142-580组成，该质粒称为pCIneoHN1/2141。
APMV4的HN基因的C-末端部分(氨基酸143-569)用引物Ⅳ14B(5＇-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3＇)和Ⅳ08扩增。在一重叠PCR中用引物Ⅳ01B和Ⅳ08将这一片段与NDV的HN基因的N-末端部分(见上述)连接在一起。得到的PCR片段用EcoRⅠ和XmaⅠ消化(直接消化或在亚克隆在pGEM-T中之后消化)并克隆在pCIneo的EcoRⅠ和XmaⅠ位点之间。得到的质粒含有杂合HN基因，由NDV的氨基酸1-141和APMV4的氨基酸143-569组成，该质粒称为pCIneoHN1/4141。
与上述构建过程类似，构建杂合HN基因，其由NDV的氨基酸1-143和APMV2的氨基酸144-580组成，或由NDV的氨基酸1-143和APMV4的氨基酸145-569组成。对于这些构建过程，用下述引物对获得PCR片段NDV氨基酸1-143，引物Ⅳ01B和Ⅳ13(5＇-ATCTACAATGAGTTCTTTGCCTATC-3＇；nt 6816-6840)；APMV2氨基酸144-580，引物Ⅳ14B(5＇-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3＇)和Ⅳ05；APMV4氨基酸145-569，引物Ⅳ15B(5＇-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATCAAACAGCTGACTACACAGCAG-3＇)和Ⅳ08。得到的PCR片段用EcoRⅠ和XmaⅠ消化(直接消化或在亚克隆在pGEM-T中之后消化)并克隆在pCIneo的EcoRⅠ和XmaⅠ位点之间。得到的质粒分别称为pCIneoHN1/2143和pCIneoHN1/4143。为检查HN蛋白的表达，CER细胞或QM5细胞用FPV-T7以m.o.i.为1感染1小时，用质粒pCIneoHN,pCIneoHN2,pCIneoHN4,pCIneoHN1/2141,pCIneoHN1/2143,pCIneoHN1/4141和pCIneoHN1/4143转染，在转染后24小时，细胞单层上覆盖在PBS中的1％鸡红血细胞悬液，置于室温45分钟。随后，用PBS小心洗细胞单层，显微镜检查红血细胞与转染细胞的粘附。为检查HN和F蛋白共表达后的细胞融合的诱导，CER细胞或QM5细胞用pCIneoFwt与下述质粒之一共转染，所述质粒为pCIneo-HN1,pCIneoHN2,pCIneoHN4,pCIneoHN1/2141,pCIneoHN1/4141,pCIneoHN1/2143或pCIneoH-N1/4143。保温2-3天后，用PBS洗细胞单层，用Giemsa溶液(在水中1∶30稀释)染色15分钟，显微镜检查。
杂合HN基因克隆在全长基因组NDV cDNA中用寡核苷酸-HN12a(5＇-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGACTTA-3＇)和HN12b(5＇-CTAGTAAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3＇)将一称为HN12的合成接头插入pGEM-T(Promega)的NotⅠ和SpeⅠ位点之间。用寡核苷酸HN14a(5＇-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGA-3＇)和HN14b(5＇-CTAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3＇)将一称为HN14的合成接头插入pGEM-T的NotⅠ和SpeⅠ位点之间。得到的质粒分别称为pGEM-HN12和pGEM-HN14，这两个质粒用NotⅠ和XbaⅠ消化并用于克隆来自质粒p535-S[Fwtc]Cm的NotⅠ-SpeⅠ片段(nt 3390-7488)。得到的质粒分别称为pGEM-HN1/2NS和pGEM-HN1/4NS，这两个质粒的HN基因分别被来自质粒pCIneoHN1/2143和pCIneoHN1/4143(见“HN基因和杂合HN基因的克隆和表达”一段)的杂合HN基因置换。为此，用NheⅠ和SmaⅠ消化pCIneoHN1/2143和pCIneoHN1/4143，得到的片段(含有杂合HN1/2143和杂合HN1/4143基因)克隆在质粒pGEM-HN1/2NS和pGEM-HN1/4NS的NheⅠ和HpaⅠ位点，分别得到pGEM+HN12和pGEM+HN14。后两个质粒用于将杂合HN基因导入NDV的全长基因组cDNA克隆。为此，用NotⅠ和SpeⅠ消化质粒pGEM+HN12和pGEM+HN14，用含有HN12或HN14基因的片段置换pNDFL+中的相应片段，分别得到pNDFL+HN1/2143Cm和pNDFL+HN1/4143Cm。通过用XbaⅠ消化随后用T4 DNA连接酶再环化从这些质粒中除去Cm基因。为符合“六核苷酸规则”(rule of six)，用自身互补的寡核苷酸将一合成接头插入这些质粒的单SpeⅠ位点中，接头H2(5＇-CTAGCGAGCGCTCG-3＇)插入质粒pNDFL+HN1/2143中，接头H3(5＇-CTAGCGAGCWGCTCG-3＇)插入质粒pNDFL+HN1/4143中，分别得到质粒pNDFL+HN1/2143(H2)和pNDFL+HN1/4143(H3)。
消除NDVLaSota的HN蛋白中的一特异性表位由单克隆抗体4D6(Long等，1986；Meulemans等，1986)识别的NDV LaSota的HN蛋白中的一特异性表位即氨基酸346-354(PDEQDYQIR)通过用APMV-2的HN蛋白的相应序列(NRTDIQQTI)或APMV-4的HN蛋白的相应序列(PDPLQDQIL)置换这一序列而被消除。为此，质粒pCIneoHN(见“各个NDV基因的克隆和表达”一段)用作模板产生重叠PCR片段。对于APMV一2序列，用引物Ⅳ01(5＇-GTAGACGCGTAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3＇)和引物3HN2(5＇-GATAGTTTGCTGTATATCAGTCCGATTGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3＇)产生第一个PCR片段，用引物5HN2(5＇-AATCGGACTGATATACAGCAAACTATCATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3＇)和NDV3-HN(5＇-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3＇)产生第二个PCR片段。合并得到的片段并用作第三个PCR的模板，所用引物为引物Ⅳ01B(5＇-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3＇)和引物NDV3-HN。对于APMV-4序列，用引物Ⅳ01和引物3HN4(5＇-TAAGATCTGATCTTGCAGCGGGTCAGGGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3＇)产生第一个PCR片段，用引物5HN4(5＇-CCTGACCGCTGCAAGATCAGATCTTAATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3＇)和NDV3-HN产生第二个PCR片段。合并得到的片段并用作第三个PCR的模板，所用引物为Ⅳ01B和NDV3-HN。引物3HN2/5HN2和3HN4/5HN4部分互补并分别含有编码HN2序列(NRTDIQQTI)和HN4序列(PDPLQDQIL)的遗传密码。PCR反应用Expand长模板PCR试剂盒(宝灵格曼海姆)进行，PCR条件为30个循环的94℃10秒、58℃30秒和68℃2分钟，然后1个循环的68℃4分钟。用EcoNⅠ和Bsu36Ⅰ消化PCR片段，并克隆在pCIneoHN的EcoNⅠ和Bsu36Ⅰ位点之间。得到的质粒分别称为pCIneoHN1(HN2e)和pCIneoHN1(HN4e)。瞬时表达研究表明修饰的HN蛋白被正确表达并转运到细胞表面，正如用鸡红血细胞进行的血细胞吸附研究判断的。另外，针对NDV的HN的一线性表位并由氨基酸346-354组成(或至少包括氨基酸346-354)的单克隆抗体6D4不与修饰的HN蛋白反应。
用NarⅠ和SpeⅠ消化质粒pCIneoHN1(HN2e)和pCIneoHN1(HN4e)，含有修饰的HN基因的片段分别克隆在pGEM-HN1/2NS和pGEM-HN1/4NS的NarⅠ和SpeⅠ位点之间。得到的质粒称为pGEM-HN1(HN2e)和pGEM-HN1(HN4e)，用NotⅠ和SpeⅠ消化，用于置换pNDFL+中的NotⅠ-SpeⅠ片段。得到的质粒分别称为pNDFL-HN(HN2e)Cm和pNDFL-HN(HN4e)Cm。通过用XbaⅠ消化并再连接去除Cm基因。得到的质粒分别称为pNDFL-HN(HN2e)和pNDFL-HN(HN4e)。结果NDV毒株LaSota基因组的3＇和5＇末端的核苷酸序列NDV基因组的潜在的3＇末端序列已公开(Ishida等，1986)，但公开的是另一种NDV毒株(D26)而不是本发明所用毒株(LaSota)。Yusoff等(1987)公开了NDV毒株Beaudette C.的L基因和L基因之后相对较大的非编码区的序列。但是如本文所示，这一序列不包括病毒基因组的全部5’末端，因而不能产生感染性拷贝NDV。负链RNA病毒基因组的3’和5’末端在复制和转录中起重要作用(Lamb andKolakofsky,1996)，因此，为了产生能用于通过反向遗传学(Conzelmann,1996)产生感染性病毒的全长NDV cDNA，必需包括病毒基因组的正确3’和5’末端。因此，我们用3’和5’RACE程序(cDNA末端的快速扩增)确定了NDV毒株LaSota的基因组RNA的3’和5’末端的精确核苷酸序列。在将一单链锚定引物(ALG3)与通过基因组RNA的5’末端的反转录产生的单链cDNA连接后经PCR回收5’末端。用与锚定引物互补的引物(ALG4)和NDV特异性引物，产生含有5’末端的PCR产物。
为了克隆NDV的3’末端，用T4 RNA连接酶将单链锚定引物ALG3与病毒RNA的3’末端连接，并用引物ALG4和NDV特异性引物经PCR扩增(方法Ⅰ)。或者，用T4 RNA连接酶将NDV RNA的3’和5’末端相互连接，得到的多联RNA用于RT-PCR，使用侧翼于连接点的NDV特异性引物(方法Ⅱ)。将3’和5’RACE产物克隆在T载体pBluescriptⅡ-TSK(Ichihara and Kurosawa,1993)或pGEM4Z中，分离并测序几个独立的克隆，结果见表2。为了直接对比3’和5’末端，以DNA的形式显示序列并且基因组链的3’末端以反基因组链的5’末端表示。在基因组RNA水平，3’末端序列为3＇-UGGUUUGUCUCUUAG，而5’末端序列为UUUAGAAACAAACCA-5＇。3’末端序列几乎与公布的NDV毒株D26的3’末端序列(Ishida等，1986)相似，但是5’末端序列显示NDV毒株LaSota含有与公布的NDV毒株Beaudette C的L基因的序列(Yusoff等，1987)相比额外的64个核苷酸。(图6)辅助病毒对NDV小基因组的复制为确定NDV的3’和5’末端是否在复制和转录中起作用，构建小基因组，其由NDV的3’末端(nt 1-119)、编码分泌的碱性磷酸酶(SEAP)的报道基因以及NDV的5’末端(nt 14973-15186)组成(图2)。这些小基因组以双向克隆在转录载体pOLTV5中，分别产生质粒pOLTV535和pOLTV553(构建细节见材料和方法)。质粒pOLTV5(图1)含有T7 RNA聚合酶启动子，后接单StuⅠ和SmaⅠ限制位点，来自丁型肝炎病毒(HDV)的自催化核酶以及来自噬菌体T7的转录终止信号(Pattnaik等，1992)。用T7 RNA聚合酶进行质粒pOLTV535的体内或体外转录产生反基因组RNA(或称[+]-RNA)，而质粒pOLTV553的转录产生基因组RNA(或称[-]-RNA)(图5)。
为检查由质粒pOLTV535和pOLTV553产生的小基因组RNA是否可用NDV作为辅助病毒而复制和表达，我们使用CER细胞，其组成型表达T7 RNA聚合酶(CER-C9细胞，见材料和方法)，或用表达T7 RNA聚合酶的禽痘病毒重组体fpEFLT7pol(Britton等，1995；以下称为FPV-T7)感染后表达T7 RNA聚合酶。用小基因组质粒pOLTV535或pOLTV553转染CER-C9细胞和FPV-T7感染的CER细胞，在37℃培养3小时后，细胞用NDV感染1小时或不感染。转染后约24小时，从培养基取样并分析SEAP活性。结果显示在FPV-T7感染的细胞中SEAP表达非常高。这不令人惊奇，因为T7 RNA聚合酶转录产生反基因组[+]-RNA，其被禽痘病毒酶加帽，并被宿主细胞有效地翻译。在用pOLTV553转染的细胞中，T7RNA聚合酶转录产生基因组[-]-RNA，其必须被辅助病毒转化成[+]-RNA以翻译成SEAP蛋白(参见图5)。在两种情况下，与未感染的细胞相比NDV感染的细胞中未观察到SEAP表达的增加。相反，NDV感染的细胞中SEAP表达始终比未感染的细胞中SEAP表达低约2倍(结果未示出)。对于pOLTV535转染的细胞，这可通过由T7 RNA聚合酶产生的转录物的非常高的SEAP表达水平来解释。但是在pOLTV553转染的细胞中，该细胞中的SEAP有效表达依赖于由病毒聚合酶复合物将基因组[-]-RNA转变成反基因组[+]-RNA或mRNA，我们原来预期在NDV感染后SEAP表达应增加。
关于小基因组不能被NDV表达和复制的原因，我们认为有两种，首先，小基因组RNA的大小不符合所谓的“六核苷酸规则”(Calain and Roux,1993；Kolakofsky等，1998)，根据这一规则，副粘病毒基因组仅当它们的长度是6个核苷酸的倍数时才能有效复制。其次，在小基因组RNA的5’末端存在的两个额外G残基可能干扰由病毒聚合酶复合物进行的正确复制和/或转录。为确定基因组的复制是否依赖于六核苷酸规则，我们将一系列大小依次增加1个核苷酸的短自身互补寡核苷酸插入质粒pOLTV535和pOLTV553的单ClaⅠ位点(图2)，得到的质粒(pOLTV535N0-N5和pOLTV553N0-N5)的大小差异为1-6个核苷酸，因此它们中的一个应产生符合六核苷酸规则的小基因组RNA。用这些质粒转染如上所述的CER细胞或FPV-T7感染的CER-C9细胞，结果显示仅质粒pOLTV535N3和pOLTV553N3在NDV感染后产生增强的SEAP活性，由T7 RNA聚合酶从这些质粒产生的小基因组RNA的长度计算为6n+2。由于在小基因组RNA的5’末端存在两个额外G残基，这些结果提示仅仅位于小基因组RNA的真3’和5’末端之间的RNA序列的大小相关于六核苷酸规则。这一点通过构建如下小基因组质粒而证实，该质粒中T7 RNA聚合酶的转录起点被改变从而掺入RNA的第一个核苷酸为NDV的3’或5’末端的第一个核苷酸(见材料和方法)。这些质粒的转染示出仅有由质粒pOLTV735N3和pOLTV753N3产生的小基因组RNA被辅助病毒复制(结果未示出)。这些发现再一次指示NDV的复制严格依赖于六核苷酸规则，另外，这些发现还指示小基因组RNA的5’末端存在两个额外G残基不干扰正确复制。用来自其他副粘病毒的小基因组质粒(或DI质粒)获得类似的结果(Pattnaik等，1992；Harty and Palese,1995)。
辅助病毒对NDV小基因组的包装为确定小基因组RNA能否被NDV辅助病毒包装，将转染的细胞的培养基转移至新鲜的细胞单层，吸附1小时后，用PBS洗单层3次，并在完全培养基中进一步保温。保温24小时后，测定培养基中的SEAP活性。结果显示仅在用来自小基因组质粒pOLTV553N3转染的细胞的培养基处理的细胞中存在SEAP活性(表4)。这一发现指示小基因组RNA可被包装进NDV包膜中，并且这些颗粒能感染细胞。另外，这些结果显示包装依赖于辅助，指示仅有与病毒NP、P和L蛋白复合的RNA分子被包装成病毒样颗粒。
由表达NP、P和L蛋白的质粒对NDV小基因组的复制为确定小基因组RNA是否也能被编码必需的NP、P和L蛋白的质粒复制，我们在用FPV-T7感染的细胞中进行了共转染实验。细胞用由小基因组质粒和质粒pCIneoNP,pCIneoP或pCIneoL(c)组成的质粒组合转染细胞，作为阴性对照，编码必需的L蛋白的pCIneoL(c)被载体质粒pCIneo替换。结果(表5)示出编码NP,P和L的质粒确实能复制小基因组RNA，结果还显示与由辅助病毒对小基因组的复制类似，由NP、P和L蛋白进行的复制也依赖于六核苷酸规则。
NDV毒株LaSota的完整基因组核苷酸序列通过RT-PCR构建跨越完整NDV基因组的亚基因组cDNA片段(图4)。为使PCR错误率最低，使用校正酶混合物(Expand LongTemplate；宝灵格曼海姆)和有限的PCR循环次数(15个循环)。互补于NDV RNA的3’末端的引物3UIT用于反转录，基因特异性引物用于PCR。为鉴定可能的PCR错误，进行3个独立的RT反应，并用于产生3个独立系列的亚基因组cDNA，将大小约为4-7kb的cDNA克隆在pGEM-T中。用从公布的NDV序列推导的引物或从在这一测序计划中推导的NDV序列衍生的引物(表1)确定两个序系列的cDNA的核苷酸序列，剩余的歧义通过测序第三个系列的cDNA克隆的相关区域而解决。NDV毒株LaSota的基因组由15186个核苷酸组成(图3)，其是目前完整序列已确定的所有副粘病毒基因组中最小的(Kolakofsky等，1998)。
在转录质粒pOLTV5中构建全长NDV cDNA克隆为构建NDV毒株LaSota的全长cDNA克隆，根据图4所示策略，在共享的限制位点连接跨越完整NDV基因组的重叠cDNA克隆。在衍生自转录质粒pOLTV5的小基因组质粒pOLTV535(见上述)中组装完整NDV cDNA。如图4B所示，完整NDV cDNA的组装的最后一步是将来自pGEM-B的约8.8kb ClaⅠ(nt 3521-12355)片段克隆进含有侧翼于ClaⅠ位点任一侧的NDV序列(即分别为nt 1-3521和12355-15186)的p535-DI中。这一步被证明是非常困难的，因为我们产生正确克隆的尝试多次失败。因此，将pGEM-B的ClaⅠ片段用来自质粒pACYC184的氯霉素抗性(Cm)基因标记。分离携带Cm基因的ClaⅠ片段并克隆在p535-DI的ClaⅠ位点中，用抗氯霉素和卡那霉素抗性选择转化子。由于转化子生长较差，将抗生素选择降至15微克/毫升Cm和10微克/毫升Km，培养温度由37℃降至32℃。最后，用BsiWⅠ消化随后用T4 DNA连接酶再环化而从这一质粒去除Cm基因。转化大肠杆菌后，通过筛选卡那霉素抗性而氯霉素敏感性而经表型鉴定携带所需质粒的细胞。得到的质粒称为pNDFL+，其由克隆在转录质粒pOLTV5的SmaⅠ和StuⅠ位点之间的全长NDV cDNA组成。
从全长cDNA产生感染性NDV为产生完全来自克隆的cDNA的感染性NDV，在一共转染实验中，如以上针对小基因组质粒所述一样将质粒pNDFL+和质粒pCIneoNP,pCIneoP或pCIneoL(c)一起应用。用小基因组质粒pOLTV553N3并测量SEAP表达监测CER和CEF细胞的转染。作为阴性对照，用pCIneo代替pCIneoL(c)。共转染后，细胞在含5％尿囊液的培养基中培养3-6天，加入尿囊液是必需的，因为CER或CEF细胞缺少裂解NDV毒株LaSota的F蛋白所需的合适蛋白酶。F蛋白的裂解对于细胞至细胞传播和感染性病毒的产生是绝对必需的。培养3天后，我们用抗F蛋白的单克隆抗体进行了固定的单层细胞的免疫学染色。结果显示被抗体染色的细胞仅存在于用pNDFL(+),pCIneoNP,pCIneoP和pCIneoL(c)共转染的细胞单层中，这些结果表明在这些细胞中发生了基因组复制和表达。当在共转染实验中用pCIneo代替pCIneoL(c)时没有观察到染色的细胞。为回收感染性病毒，将转染的CEF单层的上清注射进含胚卵的尿囊腔中，4天后收集尿囊液，在血细胞凝集分析中分析，并在卵中进一步传代。结果表明仅用pNDFL+和pCIneoNP,pCIneoP和pCIneoL(c)的组合转染的细胞的上清在血细胞凝集分析中呈阳性反应。显示阳性血细胞凝集反应的尿囊液随后在一血凝抑制分析中用单克隆抗体787,8C11,5Al,7D4和4D6(Long等，1986)进行分析，这些单克隆抗体可用于区分NDV各毒株。这一分析的结果表明从接种的卵中回收的NDV毒株显示与原始LaSota毒株相同的反应性。从接种的卵中回收的病毒被称为NDFL，以将其与原始LaSota毒株区分。
从全长cDNA产生基因修饰的NDV为毫无疑问地显示共转染系统可用于从考虑的全长NDV cDNA回收感染性病毒，将一遗传标记导入质粒pNDFL(+)。为此，通过PCR诱变(详见材料和方法)将Fo蛋白中的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列从LaSota毒株的序列(GGRQGR|L)改变为强毒NDV毒株的共有序列(GRRQRR|F)。得到的质粒pNDFL+[Fwt]使用上述共转染系统产生病毒。从已用共转染的CEF细胞的培养基接种的含胚卵的尿囊液中回收称为NDFL[Fwt]的感染性病毒。在HI试验中，特异于LaSota毒株的所有单克隆抗体包括7D4均显示与新产生的病毒的反应性相同于与原始LaSota毒株的反应性。通过RT-PCR确定编码F蛋白的蛋白酶裂解位点的区域的核苷酸序列，结果显示该核苷酸序列含有精确的在用于修饰原始LaSota序列的诱变引物中导入的核苷酸变化。这一发现表明病毒衍生自质粒pNDFL+[Fwt]且证实(基因修饰的)NDV可完全从克隆的全长NDV cDNA产生。
NDV的Fo蛋白的蛋白酶裂解位点是毒力的关键决定簇通常认为Fo蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列是不同NDV毒株的毒力的关键决定簇，产生这样的基因修饰的LaSota毒株，其中蛋白酶裂解位点的氨基酸序列从轻型(无毒)NDV毒株的序列变为强毒NDV毒株的序列，提供了测试这一观点的独特机会。因此，我们测定了新产生的病毒NDFL[Fwt]的脑内致病性指数(ICPI)，并将其与NDFL毒株和原始LaSota毒株(克隆E13-1)的ICPI进行比较。结果显示毒株NDFL[Fwt]的ICPI是1.3，其比毒株NDFL(ICPI=0.0)和克隆E13-1(ICPI=0.3)的值高得多，这些结果表明如所预期的，NDV的毒力很大程度上由Fo蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列决定。
血清学标记的导入NDV的包膜糖蛋白F和HN是该病毒最重要的免疫原性蛋白。在感染后，F和HN蛋白均激发强中和抗体应答。诱导这种中和抗体应答是用无毒NDV毒株(如广泛使用的LaSota毒株)成功接种的基础。但是抗NDV疫苗株的抗体应答不能与抗强毒NDV野外毒株的抗体应答相区别，因此，强毒野外病毒的感染不能用血清学方法追踪。这一情形是不希望的，因为野外病毒感染被接种所掩盖，由野外毒株导致的临床迹象可被忽视或者甚至被归因于疫苗。由于成功区分接种和感染对于消灭NDV是很重要的，所以我们立志开发基因修饰的NDV毒株，这种毒株可用于接种并可与NDV野外毒株进行血清学区分(所谓的标记疫苗)。为了开发NDV标记疫苗，对病毒进行基因修饰，从而(主要)抗原之一的一或几个免疫显性表位被缺失或修饰。缺失一个重要蛋白的一个或几个部分可导致该蛋白生物学功能的丧失，因此，我们所选择的修饰NDV的一个免疫显性包膜蛋白的方式是保持该蛋白的生物学功能，而抗该修饰的蛋白的全部抗体组分不同于抗原始蛋白的全部抗体组分。考虑到如下所述的原因，我们选择本发明的一个实施方案是修饰NDV的HN蛋白。NDV的感染通过毒粒包膜与宿主细胞的质膜的融合而起始，这一过程需要F蛋白和HN蛋白。已示出F和HN蛋白物理相互作用，这一相互作用是膜融合所需的(Deng等，1995)。另外，已表明这一相互作用是类型特异性的，即F和HN蛋白必须衍生自同一病毒才能显示融合活性。NDV的HN蛋白的相互作用结构域已被定位于该蛋白的所谓的柄或茎区，其包含HN蛋白的胞外域的前92个氨基酸残基(Deng等，1995)。由NDV的氨基酸1-141和人副流感病毒3型(hPIV3)的氨基酸141-572组成的杂合HN蛋白已显示当与NDV F蛋白共表达时保留融合活性。这些发现提示携带由NDV的茎区和后接的不同禽副粘病毒血清型的HN蛋白的球状头部组成的杂合HN蛋白的基因修饰的NDV毒株可以是活的。另外，这种毒株可激发与NDV所激发的不同的抗HN抗体应答。由于抗F蛋白的中和抗体应答就足以产生抗攻击病毒感染的有效保护，因此这种基因修饰的NDV毒株满足标记疫苗的两个必需条件，即抗病保护及血清学区分性。
构建这样的杂合HN基因，其由NDV的氨基酸1-141和禽副粘病毒血清型2(APMV2)的氨基酸142-580的融合体组成(称为HN1/2141)，或由NDV的氨基酸1-143和APMV2的氨基酸144-580的融合体组成(称为HN1/2143)。类似地，构建这样的杂合HN基因，其由NDV的氨基酸1-141和APMV4的氨基酸143-569的融合体组成(称为HN1/4141)，或由NDV的氨基酸1-143和APMV4的氨基酸145-569的融合体组成(称为HN1/4143)。这些杂合基因克隆在真核表达载体pCIneo中，并与携带NDV F蛋白的质粒用于共转染实验。为此，修饰F蛋白从而F2和F1之间的蛋白酶解位点的氨基酸序列从LaSota序列变为强毒NDV毒株的共有序列(Fwt，见材料和方法)。在CER细胞和QM5细胞中的共转染实验表明HN1/2141和HN1/2143及HN1/4141和HN1/4143当与Fwt蛋白共表达时均诱导细胞融合。这些结果表明，杂合HN蛋白和F蛋白的复合物是生物学活性的。用杂合HN蛋白HN1/2143和HN1/4143代替全长cDNA克隆pNDFL+中的原始HN基因，产生pNDFL-HN1/2143和pNDFL-HN1/4143，这两个质粒随后用于经上述共转染系统产生感染性病毒。可从已用转染的单层细胞的上清接种的含胚卵的尿囊液中分离活重组病毒(称为NDFL-HN1/2143和NDFL-HN1/4143)。
在两种重组体的每种中均存在杂合HN基因通过RT-PCR证实。血凝抑制试验显示抗NDV的单克隆抗体和多价抗血清不能抑制重组病毒NDFL-HN1/2143和NDFL-HN1/4143对鸡红血细胞的凝集。这些结果表明毒株NDFL-HN1/2143和NDFL-HN1/4143可用作能与传统NDV疫苗血清学区分的疫苗。
从重组NDV表达异源蛋白为检查外源基因能否被插入NDV基因组，我们构建了携带SEAP报道基因的重组病毒，SEAP基因衍生自质粒pOLTV535并被修饰以包括典型的NDV转录终止和起始盒。将含有后接转录终止和起始盒的SEAP基因的DNA片段插入质粒pNDFL+[Fwt]的XmnⅠ位点(nt109)，通过共转染系统产生感染性病毒，称为NDFL-AP，经RT-PCR证实SEAP基因的存在。用毒株NDFL-AP感染的细胞表达非常高水平的SEAP蛋白。用SEAP蛋白的比活性，我们计算出SEAP蛋白占在用NDFL-AP感染的细胞中表达的蛋白的x％。这些结果显示异源基因可从重组NDV以非常高的水平表达。
在反式互补细胞系中产生NDV缺失突变体为了废除NDV的M蛋白的表达，通过用BsaAⅠ(nt 3087)消化pNDFL+[Fwt]，随后用HindⅢ(nt 4252)部分消化而缺失M基因的一大部分。用Klenow DNA聚合酶填充HindⅢ末端后，用T4 DNA连接酶重新环化该片段，并用于转化大肠杆菌。得到的质粒称为pNDFL+[Fwt]dM，用该质粒经共转染系统在表达NDV M蛋白的反式互补CER-M细胞中产生病毒。转染的单层的上清在CER-M细胞上传代3次，分析病毒的存在。第三次传代的培养物上清在血细胞凝集(HA)和血凝抑制(HI)试验中呈阳性结果说明获得了病毒，该病毒被称为NDFL-dM。当用NDFL-dM感染CEF细胞的单层时，病毒仍能经细胞至细胞传播而扩散，如在IPMA中用抗F蛋白的单克隆抗体所示。如所预期的，M蛋白的表达不能在IPMA中用抗M蛋白的单克隆抗体而证实。当用上清感染CEF细胞或CER-M细胞时，通过IPMA我们不能显示在这些单层中存在复制病毒。这一发现表明在非互补CEF细胞中不能产生感染性病毒，这一发现由在HA或HI试验中观察到用来自感染的CEF细胞的上清接种含胚卵不产生子代病毒而证实。
对更好的NDV疫苗特别是NDV标记疫苗的需求促使我们开发反向基因系统，其可对NDV进行基因修饰。在本说明书中我们描述了完全从克隆的全长cDNA产生感染性NDV的方法，我们证明NDV的毒力可通过仅仅修饰决定F蛋白的蛋白酶裂解位点的特异性的3个核苷酸而大大改变。在这种情况下，蛋白酶裂解位点从LaSota毒株的裂解位点改变为强毒NDV毒株的共有裂解位点。通过产生这种基因修饰的NDV毒株，我们进行了正式的证实，即F蛋白的可裂解性是NDV毒力的关键决定簇(但不是唯一的决定簇)。通过使用相同的反向遗传学途径，可依照需要将裂解位点修饰成任何氨基酸序列，这可导致产生一系列展示各种毒力水平的NDV毒株。
体内如上所述，已表明除了F和HN蛋白的可裂解性之外，其他的病毒因子也可与致病性相关。转录和翻译的改变可调控病毒的生长和细胞至细胞的传播和/或致细胞病变作用。NDV的感染性cDNA的可得性使得可系统修饰参与转录和复制的序列，这可导致设计具有最佳免疫原性并完全无毒的新NDV疫苗。
安全性是活疫苗的最重要的性质之一，但是对于许多活疫苗包括NDV，免疫原性通常与毒力反相关。因此，进一步减毒活疫苗而不丧失免疫原性是最希望的变化之一，对此可使用基因修饰。在这一方面，值得提到的是已表明消除仙台病毒V蛋白的表达导致对小鼠的体内致病性的显著降低(Kato等，1997)。与仙台病毒类似，NDV也通过RNA编辑的机制产生V蛋白(Steward等，1993)，因此可预期消除NDV的V蛋白的表达也可产生体内减毒表型。
除了改变NDV的毒力外，我们示出可如此修饰NDV的抗原组成，从而可产生与NDV野外毒株血清学区分的毒株。这些所谓的标记疫苗是评价全世界商业禽类中NDV流行的无价工具。另外，大规模应用这种标记疫苗并通过加强筛选和除去感染的禽类最终可完全消除NDV。在本说明书中我们示出外源基因可在感染的细胞中以非常高的水平表达，这表明NDV可被用作疫苗载体来表达来自其它(家禽)病原体的抗原。有若干性质使得NDV成为抗呼吸道或肠道疾病的接种的理想疫苗载体1)NDV可在含胚卵中容易地培养至非常高的滴度；2)在含胚卵中大量培养NDV相对廉价；3)NDV疫苗相对稳定并可通过大量应用方法如添加至饮用水或喷洒或气雾剂形成而简便地给药；4)NDV感染的天然途径是呼吸道和/或肠道，这也是许多其他家禽病原体感染的主要天然途径；5)尽管存在循环的母体抗体，NDV仍能诱导局部免疫性。
最后，我们示出活NDV缺失突变体可用反式互补细胞系产生。产生了一种不能表达参与NDV在内层细胞膜芽生的基质(M)蛋白的NDV缺失突变体。我们示出了一种表型互补的NDV毒株，其不能表达M蛋白，但仍能感染细胞并能通过细胞至细胞传播而扩散。但是突变病毒在非互补细胞中不能产生感染性子代，这一发现表明表型互补的NDV缺失突变体可用作安全的自我限制的疫苗，其不会传播进环境中。这种不能传播的疫苗组合了活疫苗的最重要的优势，即效率，和灭活疫苗的最重要优势，即安全性。
附图简述图1转录载体pOLTV5是Pattnaik等(1992)所述的转录载体的衍生物，构建过程详见说明书。该质粒含有T7 DNA依赖性RNA聚合酶启动子(黑体显示)，后接单StuⅠ和SmaⅠ限制位点和来自丁型肝炎病毒(HDV)的自催化核酶。DNA片段可克隆在StuⅠ和SmaⅠ位点之间并可用T7 RNA聚合酶体外或体内转录。得到的转录物的5’末端含有不是插入片段编码的2个额外G残基。由于核酶的作用，转录物的3’末端精确地相应于插入片段的最后一个核苷酸。
图2小基因组质粒pOLTV535(图2A)和pOLTV553(图2B)的结构。所述小基因组质粒基于转录质粒pOLTV5(见图1)并含有侧翼于编码分泌性碱性磷酸酶(SEAP)的基因的NDV毒株LaSota的3’区(nt 1-119)和5’区(nt 14970-15186)。T7 RNA聚合酶对pOLTV535的转录产生基因组RNA(或称[-]-RNA)。示出了作为病毒转录起始和终止信号的起始(S)和终止(E)盒。SEAP基因的起始密码子下划线。还示出了产生每个长度为1个核苷酸之差的小基因组质粒(pOLTV535N0-N5和pOLTV553N0-N5)的插入ClaⅠ位点的插入片段(N0-N5)的序列。
图3NDV毒株LaSota的基因组的核苷酸序列和NDV基因的推导的氨基酸序列。所示序列对应于反基因组链并以ssDNA形式由5’至3’方向示出。本图中所示序列是由完全测序两个独立系列的跨越完整NDV基因组的重叠的亚基因组cDNA而确定的共有序列。剩余的歧义(可能由PCR错误所致)由测序第三个独立系列的克隆的相关区解决。由重叠的亚基因组cDNA克隆组装的全长cDNA克隆pNDFL+的序列与共有NDV序列在如下位置不同(括号中为共有序列)nt 1755,G(A)；nt 3766,A(G)；nt 5109,G(A)；nt 6999,T(C)；nt7056,G(A)；nt 9337,G(A)；nt 9486,A(T)；nt 10195,T(C)；nt 13075,A(G)。这些差异导致3个氨基酸的改变(括号中为共有序列)F蛋白，R189(Q)；HN蛋白，S200(P),L蛋白，N369(Ⅰ)。
图4(A)用于从亚基因组重叠cDNA克隆组装全长NDV cDNA的整体策略。cDNA组装在已含有NDV毒株LaSota的3’和5’末端的质粒pOLTV535(见图2)中。得到的质粒称为pNDFL+，用于产生感染性NDV。
(B)从亚基因组重叠cDNA克隆组装全长NDV cDNA的详细克隆程序。Cm代表氯霉素抗性基因，其被临时导入作为表型标记(详见说明书)。
(C)产生基因修饰的全长NDV cDNA的详细克隆程序。修饰由导入F基因的3个核苷酸变化组成，其导致F蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列的修饰(详见说明书)。
图5(A)pOLTV535系列用T7 RNA聚合酶转录产生反基因组RNA(或称[+]-RNA)，其可直接由细胞翻译成SEAP蛋白。用辅助病毒感染细胞后(或与编码NP、P和L蛋白的质粒共转染后)，病毒聚合酶复合物用反基因组RNA合成基因组RNA(或称[-]-RNA)，病毒聚合酶复合物随后用基因组RNA合成mRNA(用特异性转录起始[S]和终止[E]盒)和反基因组RNA。
(B)pOLTV553系列用T7 RNA聚合酶转录产生基因组RNA(或称[-]-RNA)，其不能翻译成SEAP蛋白。用辅助病毒感染细胞后(或与编码NP、P和L蛋白的质粒共转染后)，病毒聚合酶复合物用基因组RNA合成mRNA(用特异性转录起始[S]和终止[E]盒)和反基因组RNA。
图6给出NDV LaSota和其他副粘病毒的5’末端核酸系列的对比，NDV与Rubulavirus属的4个成员，副粘病毒属3个成员以及麻疹病毒属3个成员进行序列对比。序列以从L基因终止盒至5’(3＇-5＇cDNA)示出。
NDV，新城疫病毒；hPIV2，人副流感病毒2；MuV，腮腺炎病毒；SV5和SV41，猴病毒5和41；SeV，仙台病毒；bPIV3和hPIV3，牛和人副流感病毒；CDV，犬瘟热病毒；MeV，麻疹病毒；RPV，牛瘟病毒。完整基因组的核苷酸(nt)序列如下获得(登录号)NDV(AF077761)；hPIV2(X57559)；MuV(AB000388)；SV5(AF052755)；SV41(X64275)；bPIV3(D84095)；hPIV3(Z11575)；CDV(L13194)；MeV(X16565)；RPV(Z30697)。
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表1
表1(续)
表1(续)
表1(续)
表2 NDV毒株Lasota基因组的3’和5’末端序列A 3’末端序列(以反基因组DNA链的5’末端显示)方法Ⅰ．克隆 序列04ACCAAACAGAGAATC05ACCAAACAGAGAATC13ACCAAACAGAGAATC21ACCAAACAGAGAATC方法Ⅱ．克隆 序列26ACCAAACAGAGAATC28ACCAAACAGAGAATC30ACCAAACAGAGAATC31GCCAAACAGAGAATC32ACCAAACAGAGAATC33ACCAAACAGAGAATC共有 ACCAAACAGAGAATCB 5’末端序列(以DNA显示)pBluescriptⅡ-TSK克隆 克隆 序列r3101-13ACCAAACAAAGATTTr3101-14ACCAAACAAAGATTTr3101-15ACCAAACAAAGATTTr2601-17ACCAAACAAAGATTTr2601-18ACCAAACAAAGATTT
表2(续)r2601-19 ACCAAACAAAGATTTr2601-20 AACAAGGTGAAGATAr2601-21 ACCAAACAAAGATTTpGEM4z克隆克隆 序列r3101-16 ACCAAACAAAGATTTr3101-17 ACCAAACAAAGATTTr3101-18 ACCAAACAAAGATTTr3101-19 ACCAAACAAAGATTTr3101-22 ACCAAACAAAGATTT共有 ACCAAACAAAGATTT
表3 NDV辅助病毒的小基因组复制A．用pOLTV535和pOLTV553系列质粒转染CER-C9细胞后的SEAP活性(cps)质粒 +NDV -NDV 比率pOLTV535N0 3.5×1047.1×1040.49pOLTV535N1 5.9 12.1 0.49pOLTV535N2 2.4 6.2 0.39poLTV535N3 7.6 5.2 1.46pOLTV535N4 1.8 4.1 0.44pOLTV535N5 1.5 3.0 0.50pOLTV553N0 5.5×1039.6×1030.57pOLTV553N1 9.6 27.6 0.35pOLV553N2 2.4 3.5 0.68pOLTV553N3 15.1 9.5 1.59pOLV553N4 3.4 7.9 0.43poLTV553N5 2.9 4.8 0.60B．用pOLTV553系列质粒转染FPV-T7感染的CER细胞后的SEAP活性(cps)质粒 +NDV -NDV 比率pOLTV553N0 7.2×1048.3×1040.86pOLTV553N1 8.4 12.0 0.70pOLTV553N2 8.9 12.6 0.71pOLTV553N3 27.4 8.6 3.19pOLTV553N4 9.7 10.4 0.93pOLTV553N5 8.5 8.1 1.05
表4CER细胞用已转染有pOLTV553系列质粒并已用NDV超感染的FPV-T7感染的CER细胞(见表3)的上清处理后SEAP活性(cps)的转移质粒pOLTV553N02.4×103pOLTV553N16.2pOLTV553N22.0pOLTV553N320.6pOLTV553N42.0pOLTV553N52.1
表5pOLTV553系列质粒与质粒pClneoNP,pClneoP和pClneoL(c)(或作为阴性对照的pClneo)共转染CER细胞后的SEAP活性(cps)质粒 NP,P&LNP,P&pCIneo 比率pOLTV553N03.1×1042.7×10311.7pOLTV553N14.1 5.2 7.9pOLTV553N23.1 3.1 10.0pOLTV553N335.9 3.6 100.8pOLTV553N41.9 4.6 4.1pOLTV553N51.0 4.1 2.权利要求
1.禽副粘病毒cDNA，其至少包含相应于禽副粘病毒基因组的5’末端的核酸序列，使得能够产生禽副粘病毒的感染性拷贝。
2.权利要求1的cDNA，包含全长cDNA。
3.一种cDNA，其至少包含相应于禽副粘病毒基因组的5’末端的核酸序列，使得能够产生复制型禽副粘病毒小基因组。
4.权利要求1、2或3的cDNA，其至少部分衍生于新城疫病毒。
5.权利要求4的cDNA，其中所述的新城疫病毒是轻型病毒，优选衍生自疫苗株。
6.权利要求5的cDNA，其中所述疫苗株是LaSota毒株ATCC VR-699。
7.权利要求1-6任一项的cDNA，其核酸中额外引入一种修饰。
8.权利要求7的cDNA，其中所述修饰包含编码修饰的蛋白酶裂解位点的核酸。
9.权利要求8的cDNA，其中所述裂解位点是融合(F)蛋白的蛋白酶裂解位点。
10.权利要求7的cDNA，其中所述修饰包含编码杂合病毒蛋白的核酸。
11.权利要求10的cDNA，其中所述蛋白是血凝素-神经酰胺酶(HN)蛋白。
12.权利要求7的cDNA，其中所述修饰包含编码病毒蛋白的核酸中的缺失。
13.权利要求12的cDNA，其中所述病毒蛋白是基质(M)蛋白。
14.权利要求1-13任一项的cDNA，其额外包含编码异源抗原的核酸。
15.权利要求14的cDNA，其中所述抗原衍生自家禽病原体。
16.权利要求14或15的cDNA，其额外包含编码免疫刺激蛋白或其部分的核酸。
17.由权利要求1-16任一项的cDNA获得的RNA。
18.产生感染性拷贝禽副粘病毒的方法，包括用权利要求1-16任一项的cDNA转染至少一个细胞。
19.权利要求18的方法，其中所述细胞至少能表达病毒核衣壳(NP)、磷蛋白(P)或大聚合酶(L)蛋白。
20.权利要求18或19的方法，进一步包括使得所述病毒的融合蛋白裂解。
21.权利要求18-20任一项的方法，进一步包括将所述细胞在包含蛋白酶解活性的培养基中培养。
22.权利要求21的方法，其中所述培养基包含尿囊液，所述尿囊液包含所述蛋白酶解活性。
23.权利要求18-22任一项的方法，其中所述细胞衍生自鸡细胞。
24.由权利要求18-23任一项的方法获得的感染性拷贝禽副粘病毒。
25.一种包含权利要求24的病毒的疫苗。
26.权利要求25的活疫苗。
27.权利要求25或26的疫苗，其中所述感染性拷贝禽副粘病毒至少部分衍生于新城疫病毒(NDV)。
28.一种将未接种的动物或用权利要求27的NDV疫苗接种的动物与被野生型NDV感染的或用未修饰的中等毒力或轻型NDV毒株接种的动物区分开的方法，包括从所述动物取至少一种样品，并确定所述样品中是否存在抗由所述野生型或未修饰的NDV表达的但不被所述疫苗表达的免疫显性表位或标记的抗体。
29.权利要求28的方法，其中所述抗体抗NDV的HN或F蛋白。
30.权利要求28或29的方法，其中所述动物选自由家禽组成的一组，优选为鸡。
31.权利要求28-30任一项的方法中使用的诊断试剂盒。
全文摘要
本发明涉及完全从克隆的全长cDNA产生感染性新城疫病毒(NDV)的方法,以及用所述方法产生的和衍生自所述方法的疫苗和诊断分析的应用。所述方法提供了用基因修饰来修饰NDV基因组的可能性并使得能导入突变、缺失和/或插入。所述方法可用于修饰NDV的毒力,由此产生具有改进性质的新减毒活疫苗。所述方法还可用于修饰NDV的抗原组成,由此使得能产生可与NDV野外毒株血清学区分的活NDV标记疫苗。
文档编号C12Q1/70GK1314942SQ99809714
公开日2001年9月26日 申请日期1999年6月17日 优先权日1998年6月19日
发明者伯纳德斯·彼得鲁斯·许贝特斯·佩特斯, 奥拉夫·斯文·德莱乌, 古阿斯·科克, 阿尔努·莱昂纳德·约瑟夫·吉尔肯斯 申请人:Id-莱利斯塔德动物育种及动物保健研究所公司