与高谷氨酸生产相关的基因及其应用的制作方法

专利名称：与高谷氨酸生产相关的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程，更具体而言，本发明涉及包含与L-高谷氨酸(或叫做L-2-氨基己二酸或者L-α-氨基己二酸)生产相关的基因的DNA以及应用它来生产L-高谷氨酸(以下简称为高谷氨酸)的体系。
背景技术：
高谷氨酸广泛存在于生物界，如霍乱弧菌(Cholera vibrio)等细菌、以玉米属(Zea mays)为代表的植物、蛙胚等中。它是真菌类赖氨酸生物合成中的中间产物，是β-内酰胺类抗生素生物合成中的前体物质。此外，高谷氨酸作为以氨甲蝶呤(WO 92/09436)为代表的各种药物合成的中间产物也很有用处。
但是，由于用化学合成进行制备时有必要进行光学分割和多阶段反应，所以从消耗上讲这并不是有效的手段。另一方面，已知有应用土壤杆菌属(Agrobacterium)、克霉伯杆菌属(Klebsiella)、产碱杆菌属(Alcaligens)、短杆菌属(Breribacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物来制备L-赖氨酸的方法。(特开平6-181787号公报)。另外，本发明者们中的部分人提出应用黄杆菌属(Flavobacterium)的微生物由L-赖氨酸生产高谷氨酸的方法(WO96/31616)。但是，即便是有应用这些微生物的方法，仍殷切希望有更有效地制备高谷氨酸的方法。
因此本发明者们的目标是增强上述任何应用微生物的高谷氨酸生产体系，例如通过基因工程来达到增强目的。进行这样的操作时要依具体情况而论，例如研究头孢霉素C的生物合成途径时要确认头孢霉素生产菌带小棒链霉菌(Streptomyces Clavuligerus)中与从L-赖氨酸转换为α-氨基己二酸(或高谷氨酸)相关的赖氨酸-6-氨基转移酶和Δ-1-哌啶-6-羧酸脱氢酶的存在，或者对于前者要确认编码该酶的基因存在的位置(Fuente等，Biochem.J.(1997)327,59-64)。
已知用于L-赖氨酸生物鉴定的暗褐黄杆菌(由Flavobacteriumfuscum进行再鉴定的)IFO 3084中存在催化以下途径的2-酮或二酸6-氨基转移酶[或赖氨酸6-氨基转移酶(以下叫做LAT)](Soda等，Biochemistry 7(1968),4102-4109,同4110-4119)。 L-赖氨酸+2-酮戊→2-氨基己二+L-谷氨酸L-Δ’-哌啶高谷氨酸二酸酸-6-半醛 -6-羧酸上述生物测定中，用与o-氨基苯甲醛反应得到的生成物的吸光度来测定哌啶-6-己二酸(以下叫做P6C)。另外，L-赖氨酸其它的生物测定中利用L-赖氨酸6-脱氢酶活性(Misono等，J.Biochem.(Tokyo)105(1989),1002-1008)。
上述的IFO 3084株在上述L-赖氨酸的每一生物测定中常用，且已建立了使用方法。因此，除LAT之外该IFO 3084株具有编码P6C(或者在生物体内使量上达到平衡状态的2-氨基己二酸半醛)脱氢酶(以下简称为脱氢酶)活性蛋白的基因。所以本发明的目的就是提供与高谷氨酸的生产相关的基因，同时获得基因克隆用的候选菌株。
但是出乎意料的是本发明者们发现若使用最终选择地宿主-载体体系，通过鸟枪法克隆技术，至少可克隆出与高谷氨酸产生相关的的基因，更具体而言，可克隆出编码对P6C具有脱氢酶活性的蛋白质的基因。另外还发现与该基因具有一定同源性(或相同性)的变异体具有同样的功能。
另一方面，上述Soda等，Biochemistry、7(1968)、4110～4119中记载了从液态无色杆菌(Achromobactor liquidum)(=Flavobacterium lutescence)获得分子量为116,000 LAT结晶体的方法，在Yagi等，J.Biochem.87(1980),1395-1402中记载了从泥色黄杆菌而来的LAT由A、B1、B2和C4个非同一性的亚基构成。在这些文献的基础上，应用纯化的LAT蛋白质的氨基酸序列测定结果，克隆编码具有LAT活性的蛋白质的基因，初期的研究失败。但是，应用与先前的技术文献完全不同的方法从泥色黄杆菌中纯化出具有LAT活性的蛋白质，测定所得蛋白质的氨基酸序列，利用其测序结果来克隆目的基因时成功地克隆出编码LAT的基因(Lat)、本发明是以上述发现为基础的。
由此，本发明提供与高谷氨酸的生产相关的基因，它能从泥色黄杆菌(Flavobacterium lutescens)获得；或者本发明提供DNA，在严紧条件下它能与该基因杂交，并且它是从包含具有恢复缺乏高谷氨酸生产能力的突变体生产能力的突变体中分离纯化出的。
更具体而言，上述与高谷氨酸的生产相关的基因是编码具有LAT活性蛋白质及具有脱氢酶活性的蛋白质中至少1种蛋白质的一部分或全部的DNA，或其变异体。
本发明涉及具有上述DNA的自主复制性或整合复制性重组质粒，以及用该重组质粒转化的转化体、以及应用该转化体的高谷氨酸的生产方法。
图2是泥色黄杆菌突变株赖氨酸6-氨基转移酶(LAT)的活性图。Wild表示野生型，1st是第一突变侏，2nd是第二突变株，3rd是第三突变株的LAT活性。
图3是用薄层层析分析质粒pCF213对高谷氨酸生产缺损突变株的高谷氨酸生产能力互补性的结果。
HG表示高谷氨酸的移动位置，Lys表示L-赖氨酸的移动位置，St是高谷氨酸标准品的TLC分析结果，1st是pCF213、2nd pCF213及3rd pCF213分别表示有pCF213的第一、第二和第三突变株培养物的TLC分析结果，Wild pCF213及Wild pCF704是分别具有pCF213和pCF704的野生型株培养物的TLC分析结果，1st pCF704及2ndpCF704是分别具有pCF704的第一和第二突变株培养物的TLC分析结果，1st pCF111是具有pCH111的第一突变株培养物的TLC结果。
图4表示泥色黄杆菌IFO 3084(pCH213)(图中以pCF213表示)和泥色黄杆菌IFO 3084(pCF704)(图中以pCF704表示)随时间变化时高谷氨酸的生产能力。
图5是以pCF213插入区域的碱基序列为基础找到的ORF的存在位置。
图6表示在实施例2的3(6)中用MonoQ HR5/5柱处理时洗脱级分与相对应的LAT活性间的关系。
图7是在实施例2的3(7)中，用双层胶4/20及10/20对LAT活性级分进行非变性PAGE(A)和SDS-PAGE(B)时的照片。图中M是分子量标志物，C是在实施例2的3(5)中得到的过滤液，数字分别表示各级分编号。
图8表示各种质粒在高谷氨酸生产缺损性变株及野生型株中相对应的LAT活性。
图9是用各种质粒转化的泥色黄杆菌IFO 3084株随时间变化时其高谷氨酸的生产能力。
本发明中所讲的与高谷氨酸生产相关的基因是指关系从L-赖氨酸到P6C(LAT活性)或者经过与P6C有化学平衡关系的α-氨基己二酸-6-半醛到高谷氨酸(脱氢酶活性)2阶段转换关系中任一阶段的基因。首先介绍最初获得编码后面转换关系中有脱氢酶活性的蛋白质基因的具体情况，它是本发明者们应用以下列条件为基础确立的宿主-载体体系而得到的。
为了进行泥色黄杆菌的基因操作，必须确立泥色黄杆菌的适当宿主-载体体系，也必须解决以下3个问题。
(1)得到在泥色黄杆菌内能自主复制的复制子。
(2)得到在泥色黄杆菌内能表达、且发挥功能的耐药标志。
(3)确立泥色黄杆菌的DNA导入方法。
幸运地是上述问题(1)和(2)由最近Mo Bi Tec公司出售的pBBR122得到解决，它在广范围内的革兰氏阴性菌中自主复制，有卡那霉素、氯霉素耐性。上述问题(3)的解决首先以确立质粒pBBR 122的泥色黄杆菌导入方法为前提。可是用电穿孔法将DNA导入大肠埃希氏菌的方法进行检测的结果发现将泥色黄杆菌的集落生长在含卡那霉素20μg/ml的L板上，将之液态培养，用碱性SDS法抽提质粒后可确定pBBR 122稳定保持在泥色黄杆菌中。于是上述问题(3)也得到解决。该宿主-载体系统在以其它菌株作宿主时可以(a)转化效率非常高，(b)将适当大小的DNA片段插入pBBR 122(J.Bac.178(1996),1053-1060)，但已阐明泥色黄杆菌也具有上述(a)、(b)的性能，获得的基因不仅可以在泥色黄杆菌内扩增，而且可通过鸟枪法克隆技术获得编码对P6C具有脱氢酶活性的蛋白质的基因。取代所有的pBBR122的氯霉素耐药基因，导入pUC19的多克隆位点，制成pCF704，用它作为以后的载体。
然后建立所得基因或扩增基因的评价系统，即用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)诱发泥色黄杆菌IFO 3084的突变，用含有伊红Y的MEM培养板(pH7.0)进行筛选。
如此获得一点也不生产高谷氨酸的第一突变株和只稍微生产一点的第二、第三突变株。可以确认完全不生产高谷氨酸的第一突变株和野生型株具有相同的lat活性，只生产一点的第二、第三突变株只稍微有lat活性。也就是说第一突变株有可能是lat以外的与高谷氨酸的产生相关的基因受到一定损害，而第二和第三突变株可能是至少lat受到一定程度的损伤。
然后，用Sau Ⅲ AI部分消化野生型菌株的基因组DNA，将其6-8Kbp片段插入pCF704的BamHⅠ部位，制作DNA文库。将之分别导入上述第一、第二和第三突变株中，筛选恢复了高谷氨酸生产能力的菌株。此时，挑选在筛选突变株应用的含伊红Y的MEM平板(pH7.0)中变成黑色的克隆，应用TLC验证高谷氨酸的生产能力。作为这些突变株的代表，第二突变株(Flavobacterium lutescens 2nd mutant)于平成10年7月6日保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM P-16874；第1突变株(Flavobacterium lutescens1st mutant)于平成11年6月10日保藏于同一研究所，保藏号为FERM P-17419。按布达佩斯条约该FERM P-16874株和FERM P-17419株于平成11年7月26日移交到同一研究所的国际保藏部，保藏号分别为FERM BP-6798和FERM BP-6799。
结果获得有补充第一突变株高谷氨酸生产能力的质粒的菌株以及有部分补充第二突变株高谷氨酸生产能力的质粒的菌株。但是这些菌株，尤其是补充第二突变株的菌株的质粒容易缺失，所以为了获得稳定的质粒有必要进行再筛选。用限制性酶处理而得到的DNA片段分析的结果是所得补充第一突变株、部分补充第二突变株的命名为pCF111的质粒与命名为pCF213的质粒看上去是同一质粒。
另一方面，用pCF111和pCF213再分别转化第一、第二和第三突变株，用TLC检测其高谷氨酸的生产能力。结果是这两种质粒均补充第一突变株，而部分补充第二和第三突变株。
以该互补试验为基础，能充分恢复高谷氨酸生产能力缺损的突变株高谷氨酸生产能力的质粒中至少存在本发明中与高谷氨酸生产相关的基因，更具体而言，存在lat以外的任何基因。
因此，虽没有限定，但作为本发明中讲的“L-高谷氨酸生产相关基因中的一个，推选包含在质粒pCF213插入部分、编码有脱氢酶活性蛋白质的基因。例如，该基因存在于序列号2所示的序列中。
另一方面，与前者的转换相关的基因，即本发明的编码有LAT活性蛋白质的基因，如下克隆。
在一定的培养条件下培养泥色黄杆菌，将所得菌体破碎后，将破碎液离心，除去菌体破碎物，得到细胞抽提液，然后经过超速离心、硫酸铵沉淀、脱盐、离子交换色谱、亲和色谱、超滤、电泳等分离纯化目的蛋白质。
分析纯化的蛋白质N末端氨基酸序列，根据其结果设计DNA引物，对泥色黄杆菌(IFO 3084)株的基因组DNA进行PCR。以PCR扩增的DNA片段为模板再进行PCR，获得该DNA片段两外侧的周区域。如此获得编码本发明目的蛋白质的DNA。
因此可提供作为L-高谷氨酸生产相关基因之一的、编码有LAT活性蛋白质的DNA。也就是说作为本发明的另一基因包括，例如有构成序列号1所示碱基序列中编码区域的序列的基因。可以认为所对应的纯化蛋白质的N末端是序列号1中的Ser，其上游基因编码的到Met的氨基酸序列是经翻译后加工而去除的。
再者，包含本发明中所讲高谷氨酸生产相关基因的DNA包括包含编码有上述脱氢酶活性蛋白质的基因和编码有LAT活性蛋白质的基因各1个以上的DNA。
加之，本发明中所讲的基因有上述二基因的变异体，在一定的杂交条件下它们能分别与二基因进行杂交，例如在60℃ 2×SSC(标准柠檬酸盐溶液)中，优选60℃、0.5×SSC中，特别优选60℃、0.2×SSC中这样严紧条件下有杂交的碱基序列，且缺乏高谷氨酸的生产能力。也包含能恢复泥色黄杆菌突变体该生产能力的变异体。
更具体而言，编码具有脱氢酶活性蛋白质的基因的变异体与序列号2中2855～4387的碱基序列至少有70％的同一性。编码具有LAT活性蛋白质的基因的变异体与序列号1中545～2658的碱基序列(编码区)至少有50％、优选70％、更优选93％的同一性。
该变异体是上述两序列中5’末端或3’末端或其中的碱基发生了去除或添加，或者碱基的一部分被其它的碱基所替换。碱基中一部分被其它碱基所转换的变异体虽能编码同一蛋白质，但伴随遗传密码的缩合，也包含与上述二基因不同的碱基序列。
伴随遗传密码缩合之外的碱基置换，分别参照上述二基因编码的推算的氨基酸序列，以疏水性、亲水性、电荷、大小等为基准观测各氨基酸由来的侧链的类似性，它们与蛋白质整体有类似的性状。因此，变异体具有与上述二基因同等的功能，即它们能恢复高谷氨酸生产能力缺损的泥色黄杆菌突变株的这种生产能力，有相当高的准确率。
本发明的变异体可参考上述二基因的碱基序列或参照它们编码的推算的氨基酸序列，用核酸合成仪合成，或者通过诱导自身已知的点突变或部位特异性突变来制作。
本发明可提供持有上述基因或变异体的重组质粒。该质粒除含有上述基因或变异体以外，包含自主复制序列、启动子序列、终止序列、耐药基因等，能进行自主复制。并且质粒可是包含与预使用的宿主基因组的一定区域序列相同的、整合型质粒。例如含有编码具有脱氢酶活性蛋白质的基因的具有自主复制性的重组质粒是将多克隆位点插入到质粒pBBR122和pBBR122的特定位点，或者用多克隆位点置换该部位或区域，通过多克隆位点来插入上述基因和变异体。该质粒的具体例是本说明书中叫做质粒pCF111和pCF213的质粒。pCF213于平成10年3月11日保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERM9-16699，其后，如上所述按布达佩斯条约移交到国际保藏所，保藏号为FERM BP-6797，从Flavobacterium lutescens IFO3084(pCF213)，用其自身已知的质粒分离法可获得其质粒。含有编码具有LAT活性蛋白质的基因的DNA的重组质粒以及含有两基因的DNA的重组质粒制作与上述pCF213的制作相同。
本发明还提供用上述重组质粒转化作为宿主的黄杆菌属的细菌而得到的转化体。根据本发明的目的，属于黄杆菌属的宿主细菌可以是任何种的任何菌株，但优选泥色黄杆菌IFO 3084和泥色黄杆菌SP.7-1(FERM BP-5457)。
上述转化体的具体例是用pCF213转化泥色黄杆菌IFO 3084和泥色黄杆菌SP.7-1，泥色黄杆菌IFO 3084(pCF213)，上述FERMBP-6797，保藏于生命工学工业技术研究所的国际保藏单位。
本发明还提供用上述转化体生产高谷氨酸的方法。该方法中，将用培养基培养中增殖了的转化体与原始物质、L-赖氨酸或根据情况与P6C(或者2-氨基己二酸-6-半醛)接触，或者与增殖了的转化体或其处理菌体(例如有机溶剂处理物、菌体提取物、固化处理物)相接触，原始物质转换为高谷氨酸。
作为培养基中的碳源，只要是转化体可利用的、任何物均行，应用泥色黄杆菌作宿主时可应用，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、葡聚糖等糖类、甘油、山犁糖醇等糖醇类，苹果酸、柠檬酸等有机酸，这些碳源向培养基中的添加量通常希望在0.1～10％(重量百分比)(以下略作％)左右。
作为培养基中的氮源可应用，例如氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等无机酸铵盐和苹果酸铵、柠檬酸铵等有机酸铵盐，肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物等天然氮源，这些氮源向培养基中的添加量通常希望是1-10％左右。
另外，作为无机盐类可应用，例如磷酸钙、磷酸钠等磷酸碱金属盐和氯化钙、氯化钠等碱金属盐酸盐，硫酸镁、硫酸铁等硫酸金属盐，这些无机盐向培养基中的添加量通常希望为0.001～1％左右。
这其中优选通常培养细菌用的液态培养基。碳源应用葡萄糖、甘露糖、淀粉等、氮源应用硫酸铵、蛋白胨、酵母提取物、大豆粉等。其它，无机盐通常应用磷酸钙、磷酸镁、食盐等。
微生物的培养是用上述培养基，在20-40℃、优选28-37℃，pH5～9、优选6～8，在通气的条件下实施。
培养过程中，上面增殖了的转化体与原始物质的接触可通过预先向培养基中加入原始物质，或在培养过程中适时添加原始物质进行。培养终止后，将形成集落的菌体或处理过的菌体与原始物质加入培养基或适当的缓冲液中，必要时加入适当的辅酶，在反应器中搅拌或振荡，让含有原始物质的液体在固定的菌体上流动，以实现上述的接触。
以培养过程中转化体与L-赖氨酸的接触为例，再如下进行具体说明。将转化体接种到培养基之后进行培养，例如在20～40℃培养12-120个小时，获得1ml中含106～1010个菌株的培养液，向该培养液中加入底场L-赖氨酸，通常其终浓度为0.5～30mg/ml，溶于水或助溶剂中，或者不溶解直接加入，通常在20～40℃反应门小时～7日，优选18小时-5日，应用阳离子交换树脂、阴离子交换树脂等各种离子交换色谱、HP20等吸附色谱、利用溶剂和温度的沉淀和结晶等常用的纯化手段获得高谷氨酸。
所添加的L-赖氨酸的性状和添加时期没有特殊限制，但从溶解性这一点来看优选盐酸盐，可以在培养开始时添加，也可在培养过程中的第1～5日添加。
本发明提供包括能将L-赖氨酸转换为高谷氨酸的与高谷氨酸生产相关的基因的DNA。该DNA在高谷氨酸的微生物学生产方法中有用。另外本发明提供高效生产高谷氨酸的转化体，以及应用该转化体的高谷氨酸的生产方法。
以下通过具体的例子对本发明进行详细说明。提供这些具体例的目的是容易理解本发明，而并非将本发明限制于此。实施例1编码具有脱氢酶活性蛋白质的基因的克隆等1．获得高谷氨酸的非生产株将泥色黄杆菌IFO 3084菌株种植到3mlL培养基(1.0％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.3％NaCl、0.1％葡萄糖、pH7.2)中，32℃振荡培养一晚。将之作为种菌，取100μl加到50ml L培养基中，32℃振荡培养4.5小时。然后5000×g离心10分钟，收集细菌，用0.2M磷酸缓冲液(pH-6.0)洗涤一次，悬浮到0.2M磷酸缓冲液(pH6.0)6ml中。向该菌体悬浮液中加入50μl 80mg/ml的NTG,32℃、振荡培养20分钟。从该培养液中收集的细菌用0.2M磷酸缓冲(pH6.0)洗一次，全部种植到50ml L培养基中，32℃振荡培养一晚。将该培养液每500μl分成一份，向其中加入60％甘油500μl，混合，-70℃冻存，将之作为突变株保存液。
将该突变株保存液用0.85％NaCl 106倍稀释，每100μl涂到8cmツヤ-レ的MEM琼脂培养基pH7.2上(多聚蛋白胨0.5％、酵母提取物0.2％、赖氨酸-HCl 1.0％、亚甲蓝0.006％、伊红Y0.04％、琼脂1.5％,pH7.2),32℃培养3天。挑选所生集落中呈白色的种植到筛选培养基(多聚蛋白胨1.0％、酵母提取物0.2％、赖氨酸-HCl 1.0％,pH7.2)1ml中，32℃振荡培养2天。将3μl该培养液滴到硅胶TLC板的各道中，使之干燥。用正丁醇∶醋酸∶水(3∶1∶1)构成的溶媒将板展开，用水合茚三酮发色，检测各道有无高谷氨酸。如此分离出一点也不生产高谷氨酸的第一突变株(FERM BP-6799)和仅稍微生产一点的第二突变株(FERM BP-6798)和第三突变株。用TLC分析所检测的由L-赖氨酸转换为高谷氨酸的能力(或者高谷氨酸的生产性)的结果如

图1所示。图1中高谷氨酸以HG表示(其它图中相同)。另外这些转换株中Lat活性的测定结果如图2所示。2．宿主-载体体系、转化体系的构建将泥色黄杆菌IFO 3084株种植到3mlL培养基上，32℃振荡培养一晚。将之作为菌种。取其100μl种植到50ml L培养基上，32℃、振荡培养4.5h。将培养液5000×g离心10分钟，收集菌体，用10％甘油溶液洗涤一次，悬浮到3ml 10％甘油溶液中。将该悬浮液每200μl分为一份，-70℃冻存，作为电转细胞保存液。冰上融解该保存液，加入Broad Host Range Vector pBBR122(Mo Bi Tec公司)200μg/mlTE溶液1μl。将之加入到0.2cm的(BIORAD)中，应用基因脉冲仪(Gene Pulser Ⅱ(BIORAD)在2.4kV、200Ω、25μF的条件下进行一次电冲。将细胞加入Falcon管中，加入预冷的L培养基1ml,32℃振荡培养2小时。将该培养液涂到含有卡那霉素20μg/ml的L琼脂培养基(多聚蛋白胨1.0％、酵母提取物0.5％、NaCl 0.5％、葡萄糖0.1％、琼脂1.5％,pH7.2),32℃培养3天。得到2.4×105个转化体。3．质粒pCF704的构建合成末端附加EcoRⅠ位点和NcoⅠ位点的引物(ファルマツア社)，应用Taq聚合酶(Taq polymerase)(ファルレマツア社)和PCR热循环仪(Thermal Cycler)PERSONAL(TaKaRa)扩增pUC18的多克隆位点及其周围区域95bp。用限制性酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化该DNA片段，应用Ligation Kit Version 2(TaKaRa)连结到pBBR122的EcoRⅠ、NcoⅠ位点。用该反应液转化E.coli感受态细胞JM 109(TaKaRa)，应用QIAGEN Plasmid Midi Kit从转化体中制备质粒pCF 704。4．质粒pCF 213的构建按照GIAGEN Blood and Cell Culture DNA Kit提取纯化泥色黄杆菌IFO 3084株的基因组DNA。用限制性酶SauⅢAI部分分解该基因组DNA，从琼脂糖胶中切出其6～8Kbp的片段，应用0.4μm的超滤-C3单元(ミリポア)回收纯化DNA，溶解到TE溶液中，作为插入DNA溶液。另一方面，用限制性酶BamHⅠ消化pCF704，用碱性磷酸酶脱磷酸化。应用Ligation Kit Version 2(TaKaRa)将之与插入DNA溶液相连接，作为DNA文库。
将该DNA库加入到第二突变株的电动细胞保存液中，进行电脉冲。将该细胞加入到Falcon管中，加入预冷的L培养基1ml,32℃振荡培养2小时。将该培养液全部种植到含卡那霉素20μg/ml的50mlL培养基上，32℃、振荡培养2天。将培养液每500μl分份，每份加入500μl 60％的甘油溶液，混合，-70℃冻存，作为互补株保存液。
用0.85％NaCl将该互补株保存液稀释103倍，每100μl涂到8cmツヤ-レ的MEM琼脂培养板pH7.0(多聚蛋白胨0.5％、酵母提取物0.2％、赖氨酸-HCl 1.0％、亚甲蓝0.006％、伊红Y0.04％、琼脂1.5％,pH7.0)上，32℃培养3天。将所生长的菌株中呈现黑色的部分作为互补株混合菌体。将该互补株混合菌体种植到3ml的筛选培养基中，32℃振荡培养2天。将该培养液3μl滴到硅胶TLC板的各道中使之干燥。用正丁醇∶醋酸∶水(3∶1∶1)构成的溶媒系统将板展开，通过水合茚三酮发色来检测各道有无高谷氨酸。如此选择能恢复高谷氨酸生产能力的互补株混合菌体，再分离单菌落，选择恢复高谷氨酸生产能力的菌株，将之作为互补株，应用QIAGEN Plasmid MidiKit从这些互补株中制备的一个质粒叫做pCF213。将大约6.5Kbp的插入DNA插入到pCF213中。与从其它途径获得的质粒pCF111的各突变一起，检测上述pCF213的互补性，其结果如图3所示。5．pCF213对高谷氨酸生产能力的上调用pCF704转化野生型泥色黄杆菌IFO 3084株得到的转化体命为Wild pCF704株，用pCF213转化的菌株命为Wild pCF213株。将二者种植到含20μg/ml卡那霉素的筛选培养基中，32℃振荡培养一晚，作为菌种。取其100μl种到25ml生产培养基(多聚蛋白胨1.5％、酵母提取物0.5％、赖氨酸-HCl 2.0％、未调整pH)中，32℃分别振荡培养24小时、48小时、72小时。用HPLC测定各培养液上清中的高谷氨酸量。即用蒸馏水将培养液稀释到氨基酸总浓度达1000mg/L的程度，取50μl移到试管中减压干燥。向其中加入异氰酸苯酯、和三乙胺和乙醇及蒸馏水以1∶1∶7∶2混合的溶液50μl，搅拌溶解，室温放置10分钟后减压干燥。然后将之溶解到500μl HPLC移动相A溶液中，注入5μl。HPLC的条件如下所示。
柱TSK-GEL Super-ODS 4.6 ID×50mm移动相A溶液140mM醋酸钠0.05％、用冰醋酸将pH调整为6.2的Tris溶液1000乙腈40B溶液70％ 乙腈流速2.0ml/min洗脱条件流速一定的梯度0-7分B溶液2％～40％的线性梯度，7分以后B溶液100％检测UV254nm温度40℃该条件下高谷氨酸的保留时间为1.3min，赖氨酸为7.7min。
结果如图4所示，野生型pCF213株的高谷氨酸的生产能力是野生型pCF704株的1.5倍。6．pCF213插入区域基因碱基序列的测定应用ABIPRISM 377×L DNA Sequencer(Perkin Elmer)，通过引物游移法测定pCF213插入区域的碱基序列。其碱基序列如序列号2所示。
以测定的碱基序列为基础，参照Bibb等的方法(Gene,30,157(1984))确定其开放读码框(ORF)。其ORF显示于图5中。7．pCF213插入区域中NotⅠ部位约2.5Kbp的分析对pCF213插入区域中限制性酶NotⅠ部件约2.5Kbp(序列号2的碱基序列中2077-4578位)进行解析。从琼脂糖胶中切出约2.5kbp的该NotⅠ部位，用0.45的超滤C3单元(ミ リポア)回收纯化DNA，溶解到TE溶液中，用DNA Blunting Kit(TaKaRa)使之末端平滑化，作为嵌入DNA溶液。另外，用限制性酶HincⅡ消化pCF704，用碱性磷酸酶脱磷酸。用Ligation Kit Version 1(TaKaRa)将之与嵌入DNA溶液连结。用该反应液转化泥色黄杆菌IFO 3084株，用QIAGENPlasmid Midi Kit从转化体中制备质粒pCF235。
将用pCF235转化的第一突变株接种到3ml筛选培养基中，32℃振荡培养2天。将培养液3μl滴到硅胶TLC板的各道中，使之干燥。用正丁醇∶醋酸∶水(3∶1∶1)构成的溶媒系统展开，通过水合茚三酮发色来检测各道中有无高谷氨酸。其结果是用pCF235转化的第一突变株能恢复高谷氨酸的生产能力。
嵌入pCF235的约2.5Kbp的DNA序列中存在编码510个氨基酸的ORF，它从序列号2的碱基序列中第2855位的ATG开始到4387位的TAA结束。将该氨基酸序列在BLAST中进行同源性检索，结果发现它与多种醛脱氢酶有高同源性，且与最近在database中登录的Streptomyces dlavuligerus的哌啶-6-羧酸脱氢酶的氨基酸序列(J.Bac.,Vol.180,No.17,4753-4756(1998))整个区域有高的同源性。考虑到用pCF235转化的第一突变株能恢复高谷氨酸的生产能力，以及野生型pCF213株高谷氨酸生产能力的上调，可以看到该ORF编码的蛋白质具有哌啶-6-羧酸脱氢酶活性。实施例2编码具有LAT活性蛋白质的基因的克隆等1．LAT活性测定将赖氨酸-HCl 73mg,2-酮戊二酸59m溶解到含0.5mM磷酸吡哆醛的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3)1ml中，作为反应溶液。向酶溶液260μl中加入28.75μl反应溶液，32℃放置1小时。加入151.8μl溶于乙醇的5％三氯醋酸终止反应，离心，向60μl上清中加入含4mMO-氨基苯甲醛的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3)90μl,37℃放置1小时。在A465处测定，将相对来说A465高的部分作为LAT活性级分。2．菌株的培养将泥色黄杆菌IFO 3084在32℃振荡培养一晚，将之作为菌种。将其50ml接种到30l缸中的10 L flaro-M9培养基(Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl 0.2％、多聚蛋白胨1.0％、酵母提取物0.5％、赖氨酸-HCl 0.5％、硅KM75 0.005％、MgSO40.025％、CaCl20.0015％,pH7.2)中，通气搅拌培养17小时。将所得培养液5L离心(1000×g,10分钟)，收集菌体，在0.01M磷酸缓冲液(pH7.2)中洗2次。将之悬浮到同种缓冲液中，用超声波破碎菌体。通过离心(1000×g,10分钟)去除菌体破碎物，获得细胞提取液。将之进行高速离心(16,000×g,90分钟)。其上清部分按以下所述进行纯化。3．酶的纯化如下所示进行纯化，若无特殊说明均在4℃进行。(1)硫酸铵分级将实施例1中的上清部分600ml通过硫酸铵沉淀进行纯化。将用30％-80％硫酸铵沉淀的部分进行离心(1000×g,30分)，收集沉淀，溶解到0.01M磷酸缓冲液(pH7.2)中，用同种缓冲液进行透析。(2)脱盐将透析的酶溶液10ml上到4根PD10柱(Amasham Pharmacra)上，用含0.5mM磷酸吡哆醛的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.4)洗脱，脱盐。(3)QAE-TOYOPEAL550C柱层析将脱盐了的酶溶液加到预先用含0.5mM磷酸吡哆醛的0.1MTris-HCl缓冲液(pH7.4)平衡过的QAE-TOYOPEAL550C(TOSOH)柱(φ5.5×6.0cm)上。用同种缓冲液洗涤后，用同种缓冲液配制的2L氯化钠线性梯度(0～1.0M洗脱)，收集LAT活性部分。(4)Phenyl-TOYOPERL 650S柱层析向LAT活性部分中加入1M硫酸铵，将之加到预先用含0.5mM磷酸吡哆醛和1M硫酸铵的0.01M磷酸缓冲液(pH7.2)平衡过的Phenyl-TOYOPERL 650S(TOSOH)柱(φ5.5×3.0cm)上。用应用同种缓冲液的1200ml硫酸铵梯度(0.8-0M)洗脱，收集LAT活性部分。(5)超滤用ADVANTEC UP-20超滤150ml的LAT活性部分，缩到15ml。将该浓缩液2.5ml加到PD10柱(Amasham Pharmacia)柱上，用0.1MTris-HCl缓冲液(pH7.4)洗脱，脱盐。(6)AKTA MonoQ HR5/5柱层析将脱盐了的酶溶液3.5ml加到预先用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.4)平衡过的AKTAexplorer 10S系统的MonoQ HR5/5柱(Amasham Pharmacia)上。用同种缓冲液洗涤后，用40ml应用同种缓冲液的氯化钠线性梯度(0～0.4M)洗脱，收集LAT活性部分。再用PD10柱将LAT活性部分5ml脱盐，再次加到AKTAexplorer 10S系统的MonoQ HR5/5柱上，收集LAT活性部分。各级分相对应的LAT活性关系如图6所示。(7)电泳将LAT活性部分加到双层胶4/20及10/20第一化学药品公司，进行Natire-PAGE及SDS-PAGE，结果如图7所示。在Natire-PAGE中，分子量100000附近可看到LAT活性部分的带；SDS-PAGE中，分子量55000附近可看到LAT活性部分的带。用Phast Transfer(Amasham Pharmacia)将SDS-PAGE中分子量55000附近的带转到PVDF膜上。4．N末端氨基酸序列分析应用HP G1005A Protein Sequencing System(HEWLETTPACKARD)对点到膜上的带进行N末端氨基酸序列分析，应用Edman分析法进行。结果表明N末端的氨基酸序列为SLLAPLAPLRAHAGTRLTQG。以此为基础设计DNA引物NmaRout CCYTGIGTIARICKIGTICCIGCRTGIGCICGNmaRin CCIGCRTGIGCICGIARIGGIGCIARIGGIGC应用LA PCR in vitro cloning kit(TaKaRa)对泥色黄杆菌IFO3084株的基因组DNA进行PCR。PCR反应条件是94℃30秒→55℃2分→72℃1分，进行30个循环。结果得到400bp的包含上述末端及其上游区域的PCR扩增片段。以该序列为模板再应用PCR扩增出其周围的区域。即分别用限制性酶PstⅠ和SalⅠ消化泥色黄杆菌IFO 3084株的基因组DNA，用Ligation Kit Version 2(TaKaRa)各自进行连接反应，反应产物作为模板DNA。设计针对该模板DNA的DNA引物NIFout ttgatttgag cagattcgca ctgccattt(序列号3)NIRout aaggttttcg acaaagtgac catttccca(序列号4)应用LA Taq(TaKaRa)进行PCR。PCR反应条件是98℃ 20秒→68℃6分，30个循环。结果从PstⅠ模板得到约2Kbp的PCR扩增片段，从SalⅠ模板得到大约8Kbp的PCR扩增片段。应用ABIPRISM 377XL DNASequencer(PerKin Elmer)，通过引物游走法测定这些PCR扩增片段的碱基序列。其碱基序列如序列号1所示。5．质粒pCF301、pCF335的构建设计DNA引物ctggtaccgc tcgatccggc tctgcaccgt(序列号5)ctggagctca ggcaggtgcg ggccacgtgt(序列号6)使序列表1中545位碱基和2658位碱基间的PstⅠ位点分别改变成KpnⅠ、SacⅠ位点，应用这些引物进行PCR反应，扩增Lat基因区域。用KpnⅠ、SacⅠ消化该约2.1Kbp的扩增片段，作为嵌入DNA溶液。另外，用限制性酶KpnⅠ、SacⅠ消化pCF704，应用Ligation Kitversion 2(TaKaRa)将之与嵌入DNA溶液连接，作为质粒pCF301。再用KpnⅠ、SacⅠ消化pCF301，从琼脂糖胶中切出大约2.1Kbp的片段，将之与用KpnⅠ、SacⅠ消化的pCF235的片段进行连接，得到质粒pCF335。6．质粒pCF301对lat活性的互补用pCF704转化第二突变株得到的转化株为2nd pCF704株，用pCF301转化第二突变株得到的转化体为2nd pCF301株。将这二种菌株32℃振荡培养一晚，作为菌种。取其30μl接种到离心管中的3ml生产培养基(多聚蛋白胨1.5％、酵母提取物0.5％、赖氨酸-HCl 2.0％,pH未调)中，通气搅拌培养17小时。将所得培养液1ml离心(1000×g,10分钟)，收集菌体，用10ml含0.5mM磷酸吡哆醛的0.2M磷酸缓冲液(pH7.3)洗涤。悬浮到同种缓冲液中，用超声波破碎菌体。通过离心(1000×g,10分)去除菌体破碎物，得到细胞提取液。测定该提取液的lat活性。结果如图8所示。pCF301弥补第二突变株的lat突变。7．pCF335对高谷氨酸生产能力的上调用pCF704转化野生型泥色黄杆菌IFO 3084株，得到的转化体为野生型pCF704株，用质粒pCF301、pCF335转化形成的转化体为野生型pCF301株、pCF335株。将这些菌株接种到3ml含卡那霉素20μg/ml的筛选培养基中，32℃振荡培养一晚。将之作为菌种。取其100μl接种到25ml生产培养基中(多聚蛋白胨1.5％、酵母提取物0.5％、赖氨酸-HCl 2.0％,pH未调整)，32℃分别振荡培养24小时、48小时、72小时。用HPLC测定培养液上清中高谷氨酸的含量。即用蒸馏水将培养液稀释到氨基酸总浓度为1000mg/L的程度，取50μl到试管中，减压干燥。向其中加入50μl异氰酸苯酯与三乙胺、乙醇、蒸馏水以1∶1∶7∶2混合的溶液，搅拌溶解，室温放置10分钟，然后减压干燥。将之溶解到500μl HPLC移动相的A溶液中，注入5μl。HPLC的条件如实施例1的5中所述。
结果如图9所示，野生型pCF335株高谷氨酸的生产能力大约是野生型pCF704株的2倍。
序列表<110>Mercian Corporation<120>与高谷氨酸的生产相关的基因及其应用<130>K-38Mercian<150>JP10/232382<151>1998-08-05<150>JP11/182362<151>1999-06-28<160>6<210>1<211>2663<212>DNA<213>泥色黄杆菌<220><221>CDS<222>(801)---(2276)<400>1cccgggtgtc attgaatacc agcaggtcgc caggttgcag cagctggtcc agatcgcgca60cctggcgatc ctccagcgca gccggtgccg gcggcaccag cagcaggcgg ctggccgaac 120gctccggcag cggcgcctgg gcaatcagtt cgggaggcag gtggtaggca aaatcggact 180tcttcaacgc cggcagctcg atacaacggg ggcgtcagtt tacgcccctg taccgcctgt 240gccctcaccg ctcgaacttg gtgcccagga tcaccgccgt ggtggtgcgc tcgaccccat 300cagtggcgcc gatggcatcg gtcagctcgt ccatcgccgc cacgccatcg acggcggcca 360tcgccaccag gtcatgcgcg ccactgaccg aatgcaggct gcgcaccgca gcaatggcct 420gcagcgcccg cacgaccgcc ggcattttct tcggcatcac ggtgatggag atatgcgcgc 480ggacctgctg gcgctccatc gcctggccaa ggcgcacggt gtagccggcg attattccgc 540tgtgctgcag ccgctcgatc cggctctgca ccgtggtccg cgacaccccg agccggcgcg 600ccagcgccgc ggtcgaggcg cgcgcatcct cacgcaacag gtcaagcaac tgtgcatccg 660cctgggaaat ggtcactttg tcgaaaacct 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权利要求
1．一种分离、纯化的DNA，它包括从泥色黄杆菌细菌可获得的L-高谷氨酸生产相关基因，或者其变异体，其中，该突变体在严紧条件下与该基因进行杂交，且具有恢复L-高谷氨酸生产能力缺损的泥色黄杆菌突变株的这种生产能力的功能。
2．权利要求1的DNA，其中L-高谷氨酸生产相关基因是编码选自具有L-赖氨酸2-酮戊二酸6-氨基转移酶活性蛋白质及具有哌啶-6-羧酸脱氢酶活性蛋白质中至少1种蛋白质的一部分或全部的DNA。
3．权利要求2的DNA，其中编码具有L-赖氨酸2-酮戊二酸6-氨基转移酶活性蛋白质的DNA包含序列号1中801～2276的连续碱基序列。
4．权利要求3的DNA，它含有序列号1的碱基序列或者序列号1中545～2658位的连续碱基序列。
5．权利要求2的DNA，其中编码具有哌啶-6-羧酸脱氢酶活性蛋白质的DNA包含序列号2中2855～4387的连续碱基序列。
6．权利要求5的DNA，它含有序列号2中的碱基序列或序列号2中2077～4578的连续碱基序列。
7．重组质粒，它载有权利要求1中的DNA，具有自主复制性或整合复制性。
8．权利要求7中的重组质粒，其中DNA具有序列号1中545～2658的连续碱基序列和/或序列号2中2077～4578的连续碱基序列。
9．权利要求7的重组质粒，它能从泥色黄杆菌IFO 3084(pCF213)(FERM BP-6797)获得。
10．转化体，它是用权利要求7中的重组质粒转化属于黄杆菌属的宿主菌而得到的。
11．L-高谷氨酸的生产方法，其特征在于，用载有分离、纯化DNA的自主复制性或整合复制性重组质粒进行转化，在培养基中培养所得转化体，培养过程中或培养后，使增殖的转化体与L-赖氨酸或L-哌啶-6-羧酸接触，转换成L-高谷氨酸，然后回收如此产生的高谷氨酸，其中的DNA包含从泥色黄杆菌细菌可获得的L-高谷氨酸生产相关基因，或其变异体，其中该变异体在严紧条件下与该基因进行杂交，且具有恢复泥色黄杆菌突变株生产能力的功能。
12．权利要求11的L-高谷氨酸的生产方法，其中L-高谷氨酸相关基因是编码选自具有L-赖氨酸2-酮戊二酸6-氨基转移酶活性蛋白质及具有哌啶-6-羧酸脱氢酶活性蛋白质中至少一种蛋白质的一部分或全部的DNA。
13．权利要求12的L-高谷氨酸的生产方法，其中编码具有L-赖氨酸2-酮戊二酸6-氨基转移酶活性蛋白质的DNA包含序列号1中801～2276的连续碱基序列。
14．权利要求12的L-高谷氨酸的生产方法，其中编码具有哌啶-6-羧酸脱氢酶活性蛋白质的DNA包含序列号2中2855～4387的连续碱基序列。
15．权利要求11的L-高谷氨酸的生产方法，其中转化体是用从泥色黄杆菌IFO 3084(pCF213)(FERM BP-6797)可获得的重组质粒转化黄杆菌属的宿主菌而获得的。
全文摘要
一种参与L－高谷氨酸生产的分离的基因,以及应用该基因的L－高谷氨酸生产体系。该基因来自泥色黄杆菌的基因组。
文档编号C12N9/02GK1311821SQ9980934
公开日2001年9月5日 申请日期1999年8月4日 优先权日1998年8月5日
发明者藤井匡, 成田隆夫, 仲田邦穗, 上松仁, 恒川博, 一色邦夫, 吉冈武男 申请人:美露香株式会社