专利名称：N稳定性同位素标记l－谷氨酸的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵和生物提取方法领域，尤其涉及稳定性同位素标记化合物的生产工艺。
背景技术：
15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产可采用有机合成法、微生物发酵及蛋白分解分离制备法等。采用合成法比较简单，但需要光学拆分，使15N原料利用率比较低，成本上升。蛋白分解分离制备法常用于制备复合氨基酸，要分开所有氨基酸很困难。而采用直接发酵法生产，目标氨基酸大量富集，分离比较简单，但由于发酵配方中有机氮源很难标记，常常使L-谷氨酸-15N的丰度下降很多，达不到产品要求。目前，在15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产领域中还不见专利和文献报道。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种致在解决15N丰度下降的问题，并尽量提高15N利用率的15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产工艺。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产工艺，其特征在于，该工艺包括以下步骤(1)发酵菌株的选择用于L-谷氨酸生产的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium)之一；(2)保藏斜面制备将上述发酵菌株接种于斜面，29～37℃恒温培养8～20小时，得到保藏斜面，冷藏待用；(3)活化斜面制备将步骤(2)得到的保藏斜面接种于活化斜面，培养方法同步骤(2)；(4)种子培养将步骤(3)得到的活化斜面菌苔接种于已灭菌的装有种子培养基的摇瓶中，在29～37℃下摇床培养8～20小时；(5)发酵培养基的配制以全合成培养基为基本培养基，添加少量有机氮源；主要配方如下表所示说 明碳源 葡萄糖6～14g/dL或蔗糖12～25g/dL无机氮源 尿素0.2～1g/dL、氨水、液氨或氯化铵、硫酸铵、硝酸铵类铵盐按碳氮比100∶15～30有机氮源 玉米浆、酵母膏、酪蛋白水解液或菌体水解液0～1mL/dL，使用的有机氮源中氨基氮浓度5～20g/dLMgSO4.7H2O 0.02～0.08g/dLMnSO4.H2O2～20mg/LFeSO4.7H2O 2～20mg/LVH 100～600μg/LVB150～1000μg/L(6)发酵工艺将步骤(4)培养好的种子按体积比2～10％接种于已灭菌的装有步骤(5)所述发酵培养基的发酵摇瓶或发酵罐中开始发酵，摇床发酵控制条件为发酵初始温度30～33℃，初始pH6.8～7.2，摇床转速180～240r/min；在OD值净增0.2～0.6(发酵液稀释20倍时测定)将温度升高到37～39℃，同时提高转速到260～350r/min；在对数生长早期8～16小时加入0～0.3mL/dL左右的吐温60，发酵全过程控制pH在微碱性，添加15N标记尿素、氨水或液氨调节pH7.0～7.6，流加50％葡萄糖控制发酵液葡萄糖浓度2～5g/dL，发酵时间18～60小时；发酵罐控制条件为发酵初始温度30～33℃，初始pH6.8～7.2，通气量0.5～1.5VVM，罐压0.01～0.05Mpa，溶解氧0.5～90％饱和度，通过聚醚类或硅酮类消泡剂消泡；在OD值净增0.2～0.6(发酵液稀释40倍时测定)将温度升高到37～39℃，同时提高转速保证溶解氧在30～50％饱和度；在对数生长早期5～16小时加入0～0.3mL/dL的吐温60，发酵全过程控制pH在微碱性，添加15N标记尿素、氨水或液氨调节pH7.0～7.6，流加50％葡萄糖控制发酵液葡萄糖浓度2～5g/dL，发酵时间18～60小时；(7)分离提取将步骤(6)培养好的发酵液，通过发酵液预处理，即添加草酸除去金属离子，添加聚丙烯酰胺等絮凝剂、加热除去蛋白，离心除菌体得到的上清液采用等电点沉淀、离子交换法等分部提取得到15N稳定性同位素标记L-谷氨酸溶液，通过真空浓缩赶氨并采用活性炭脱色、乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。
所述的步骤(1)中谷氨酸棒杆菌是指谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、AS1.805和它们的突变株之一，黄色短杆菌是指黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、TC2568温度敏感突变株、TSH5459温度敏感突变株和它们的突变株之一，乳糖发酵短杆菌是指乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869、AJ11360和它们的突变株之一，北京棒杆菌是指北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)AS1.299、7338、S9114、WTH-1和它们的突变株之一，钝齿棒杆菌是指钝齿棒杆菌(Corynebacterium)AS1.542、B9和它们的突变株之一。
所述的步骤(5)发酵培养基中，玉米浆、菌体水解液等有机氮源添加极少量0～1mL/dL，使用的有机氮源中氨基氮浓度5～20g/dL，以使其对15N丰度的影响降低到最低限度；通过直接添加大量生长因子生物素和VB1来促进生长，减少有机氮源的缺乏对菌体生长的影响。
所述的步骤(6)中溶解氧的控制通过调整搅拌转速、通气量、罐压实现。
所述的步骤(6)中细胞膜通透性、细胞转型的控制通过在OD值净增0.2～0.6时提高温度、添加吐温60等表面活性剂和提高溶氧来实现。
所述的步骤(6)中pH的控制通过流加15N标记尿素、氨水或液氨来实现。
所述的步骤(6)中通过流加50g/dL葡萄糖溶液控制发酵液中葡萄糖浓度2～5g/dL。
所述的步骤(7)中15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的提取工艺采用同位素分析专用质谱仪或光谱分析法分析15N丰度。
如果采用常规发酵方法，15N稳定性同位素标记L-谷氨酸产品虽然相对较高，但15N丰度下降很大，往往下降3％以上，很难达到高丰度产品要求。采用全合成培养基发酵虽然对15N丰度影响不大，但产酸量太低使得15N原料利用率不高。通过改变发酵配方和工艺，本发明获得的15N稳定性同位素标记L-谷氨酸产量比采用全合成培养基发酵产酸量相应提高10~50％以上，而15N稳定性同位素标记L-谷氨酸15N丰度下降可以减少到1％以下，有的甚至几乎不下降，大大提高了15N原料利用率，减少了生产成本。同时，在保证产品15N丰度条件下，简化发酵和提取工艺，由于原料得到充分利用大大节省了原料回收成本。本发明可利用低丰度和高丰度15N无机原料满足不同丰度产品要求。
本发明利用微生物直接发酵法生产，控制有机氮源添加量，直接添加生产因子，通过物理条件控制细胞膜通透性，并采用低糖流加工艺改善产酸率。这样可使15N原料得到有效利用，丰度下降不致于影响产品生产要求。本发明比传统L-谷氨酸提取工艺要精细，并采用同位素专用质谱仪或光谱法分析15N丰度，纯度分析采用常规方法。
具体实施例方式
实施例1使用菌种为以黄色短杆菌为出发菌诱变选育获得的温度敏感突变株TC2568，使用的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、摇瓶种子和发酵培养基。斜面保藏培养基和斜面活化培养基同常规发酵采用相同。使用的种子和发酵初始配方如下表所示。
种子配方发酵初始配方葡萄糖 3.0g/dL 6.0g/dL尿素(丰度5.31％)0.5g/dL 0.5G/dL玉米浆 0.2mL/dL 0.05mL/dL
MgSO4·7H2O 0.04g/dL 0.06g/dLMnSO4·H2O 10mg/L 200mg/LFeSO4·7H2O 10mg/L 200mg/LVH 100μg/L 200μg/LVB1 150μg/L 350μg/L流加用葡萄糖浓度为50g/dL，流加用尿素浓度为20g/dL，都分开高压灭菌，上述种子和发酵初始配方中尿素也分消。
将黄色短杆菌TC2568从斜面接种于上述种子培养基中(250mL三角瓶装量20mL)，30℃、220rpm于巡回式摇床上培养10小时左右。按5％接种量将上述种子液接种于发酵培养基中(500mL装量20mL，共接4瓶)，在33℃、220rpm条件下于巡回式摇床上发酵培养10小时左右，当PH下降到6.4左右时开始流加20g/dL尿素控制PH在微碱性。当OD值净增0.4左右时调节发酵温度为37℃、转速280rpm，直到发酵终了。发酵全过程通过流加50g/dL葡萄糖控制发酵液的残糖浓度在3g/dL左右，发酵培养42小时结束，发酵平均产酸64g/L。
将上述发酵液加热半小时后离心分离(3000rpm，10分)，所得到的上清液用盐酸调节PH至L-谷氨酸等电点，并放于冰箱等电结晶(过夜)。将过滤得到的晶体用水溶解后调PH2.0再上阳离子交换树脂(H+型)吸附，水洗后用1N氨水洗脱，将得到的L-谷氨酸-15N单斑洗脱液浓度，再结晶并过滤得到的晶体真空干燥得到L-谷氨酸-15N固体4.37克。并将等电结晶的母液调PH2.0后上阳离子交换树脂(H+型)吸附，水洗后用0.02N NH4Cl洗脱，将得到的L-谷氨酸-15N单斑洗脱液浓缩后再上柱，水洗将NH4Cl洗掉后再换0.5N氨水洗脱，洗脱液再重复按上述方法得到L-谷氨酸-15N固体1.22克。总共得到5.59克产品，经质谱分析得到产品丰度5.29％，丰度下降0.377％。
如果将种子培养基中玉米浆改为2.0mL/dL，发酵培养基中玉米浆改为1.0mL/dL，可以得到7.24克产品，但丰度只有4.74％，丰度下降10。73％。如果种子和发酵培养基中不加玉米浆，可以得到3.21克产品，丰度5.31％，丰度几乎不下降。综合考虑，本发明效果显著。
实施例2使用菌种为以黄色短杆菌为出发菌诱变选育获得的温度敏感突变株TSH5459。15N原料改为98.32％丰度尿素，使用的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、摇瓶种子和发酵培养基。斜面保藏培养基和斜面活化培养基同常规发酵采用相同。使用的种子和发酵初始配方如下表所示。
种子配方发酵初始配方葡萄糖 3.0g/dL 8.0g/dL尿素(丰度5.31％) 0.55g/dL 0.55g/dL玉米浆 0.6mL/dL 0.1mL/dLMgSO4·7H2O 0.04g/dL 0.06g/dLMnSO4·H2O2mg/L 20mg/LFeSO4·7H2O 2mg/L 20mg/LVH 100μg/L 300μg/LVB1 150μg/L 450μg/L流加用葡萄糖浓度为50g/dL，流加用尿素浓度为22g/dL，都分开高压灭菌，上述种子和发酵初始配方中尿素也分消。
将黄色短杆菌TSH5459从斜面接种于上述种子培养基中(250mL三角瓶装量20mL)，31℃、220rpm于巡回式摇床上培养12小时左右。按5％接种量将上述种子液接种于发酵培养基中(500mL装量20mL，共接6瓶)，在33℃、220rpm条件下于巡回式摇床上发酵培养10小时左右，当PH下降到6.4左右时开始流加22g/dL尿素，控制PH在微碱性。当OD值净增0.5左右时调节发酵温度为37℃、转速280rpm直至发酵终止。发酵全过程通过流加50g/dL葡萄糖控制发酵液的残糖浓度为2～3g/dL，发酵培养40～46小时。发酵平均产酸62g/L。
采用的分离提取方法同实施例1，最后共得到产品6.0克，经质谱分析得到产品丰度97.73％，产品纯度99.44％，丰度下降0.6％，完全满足产品生产要求。
权利要求
1.15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产工艺，其特征在于，该工艺包括以下步骤(1)发酵菌株的选择用于L-谷氨酸生产的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium)之一；(2)保藏斜面制备将上述发酵菌株接种于斜面，29～37℃恒温培养8～20小时，得到保藏斜面，冷藏待用；(3)活化斜面制备将步骤(2)得到的保藏斜面接种于活化斜面，培养方法同步骤(2)；(4)种子培养将步骤(3)得到的活化斜面菌苔接种于已灭菌的装有种子培养基的摇瓶中，在29～37℃下摇床培养8～20小时；(5)发酵培养基的配制以全合成培养基为基本培养基，添加少量有机氮源；主要配方如下表所示说 明碳源 葡萄糖6～14g/dL或蔗糖12～25g/dL无机氮源 尿素0.2～1g/dL、氨水、液氨或氯化铵、硫酸铵、硝酸铵类铵盐按碳氮比100∶15～30有机氮源 玉米浆、酵母膏、酪蛋白水解液或菌体水解液0～1mL/dL，使用的有机氮源中氨基氮浓度5～20g/dLMgSO4.7H2O 0.02～0.08g/dLMnSO4.H2O 2～20mg/LFeSO4.7H2O 2～20mg/LVH100～600μg/LVB1 50～1000μg/L(6)发酵工艺将步骤(4)培养好的种子按体积比2～10％接种于已灭菌的装有步骤(5)所述发酵培养基的发酵摇瓶或发酵罐中开始发酵，摇床发酵控制条件为发酵初始温度30～33℃，初始pH6.8～7.2，摇床转速180～240r/min；在OD值净增0.2～0.6(发酵液稀释20倍测定)时将温度升高到37～39℃，同时提高转速到260～350r/min；在对数生长早期8～16小时加入0～0.3mL/dL左右的吐温60，发酵全过程控制pH在微碱性，添加15N标记尿素、氨水或液氨调节pH7.0～7.6，流加50％葡萄糖控制发酵液葡萄糖浓度2～5g/dL，发酵时间18～60小时；发酵罐控制条件为发酵初始温度30～33℃，初始pH6.8～7.2，通气量0.5～1.5VVM，罐压0.01～0.05Mpa，溶解氧0.5～90％饱和度，通过聚醚类或硅酮类消泡剂消泡；在OD值净增0.2～0.6(发酵液稀释40倍测定)时将温度升高到37～39℃，同时提高转速保证溶解氧在30～50％饱和度；在对数生长早期5～16小时加入0～0.3mL/dL的吐温60，发酵全过程控制pH在微碱性，添加15N标记尿素、氨水或液氨调节pH7.0～7.6，流加50％葡萄糖控制发酵液葡萄糖浓度2～5g/dL，发酵时间18～60小时；(7)分离提取将步骤(6)培养好的发酵液，通过发酵液预处理，即添加草酸除去金属离子，添加聚丙烯酰胺等絮凝剂、加热除去蛋白，离心除菌体得到的上清液采用等电点沉淀、离子交换法等分部提取得到15N稳定性同位素标记L-谷氨酸溶液，通过真空浓缩赶氨并采用活性炭脱色、乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。
2.根据权利要求1所述的15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产工艺，其特征在于，所述的步骤(1)中谷氨酸棒杆菌是指谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、AS1.805和它们的突变株之一，黄色短杆菌是指黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067、TC2568温度敏感突变株、TSH5459温度敏感突变株和它们的突变株之一，乳糖发酵短杆菌是指乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869、AJ11360和它们的突变株之一，北京棒杆菌是指北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)AS1.299、7338、S9 114、WTH-1和它们的突变株之一，钝齿棒杆菌是指钝齿棒杆菌(Corynebacterium)AS1.542、B9和它们的突变株之一。
3.根据权利要求1所述的15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产工艺，其特征在于，所述的步骤(5)发酵培养基中，玉米浆、菌体水解液等有机氮源添加极少量0～1mL/dL，使用的有机氮源中氨基氮浓度5～20g/dL，以使其对15N丰度的影响降低到最低限度；通过直接添加大量生长因子生物素和VB1来促进生长，减少有机氮源的缺乏对菌体生长的影响。
4.根据权利要求1所述的15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产工艺，其特征在于，所述的步骤(6)中溶解氧的控制通过调整搅拌转速、通气量、罐压实现。
5.根据权利要求1所述的15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产工艺，其特征在于，所述的步骤(6)中细胞膜通透性、细胞转型的控制通过在OD值净增0.2～0.6时提高温度、添加吐温60等表面活性剂和提高溶氧来实现。
6.根据权利要求1所述的15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产工艺，其特征在于，所述的步骤(6)中pH的控制通过流加15N标记尿素、氨水或液氨来实现。
7.根据权利要求1所述的15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产工艺，其特征在于，所述的步骤(6)中通过流加50g/dL葡萄糖溶液控制发酵液中葡萄糖浓度2～5g/dL。
8.根据权利要求1所述的15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的生产工艺，其特征在于，所述的步骤(7)中15N稳定性同位素标记L-谷氨酸的提取工艺采用同位素分析专用质谱仪或光谱分析法分析15N丰度。
全文摘要
本发明涉及
文档编号C12P13/00GK1539984SQ20031010816
公开日2004年10月27日 申请日期2003年10月24日 优先权日2003年10月24日
发明者谭青乔, 吕志贤, 杜晓宁, 李良君, 梅丛笑, 侯静华, 宋明鸣 申请人:上海化工研究院