专利名称：大白菜冷相关蛋白编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种蛋白编码序列，特别是一种大白菜冷相关蛋白编码序列，属于基因工程领域。
背景技术：
低温式植物地域分布和产量的主要限制因素，冷害引起的粮食作物的大幅度减产是世界范围内普遍存在的问题。当植物受到低温胁迫后，植物体内的一些内源激素会发生显著的变化，从而进一步引发细胞骨架排列的改变，以便提高作物的抗低温的能力。当前，一些低温相关在提高作物抗低温胁迫方面起着重要作用，而且在试验中取得了良好的实验结果。
在对现有文献的分析中，虽然“Plant Mol Biol(植物分子生物学)，1993231211-21”对甘蓝型油菜冷相关基因功能已经做了初步证明，指出该基因在冷胁迫下能够增强表达，但没有把该基因进行转化，从而获得具有明显的抗冷效果的转基因植株的报道，至今尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种大白菜冷相关蛋白编码序列。使其冷相关II基因冷相关在冷相关中具有明显的作用，对提高植物的产量有所帮助。提高农作物的光合效率是有效解决这一问题的方法，具有很大的应用价值。
本发明是通过以下技术方案实现的在本发明所分离出的DNA分子，该分子包括编码具有大白菜冷相关蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第32-649位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第32-649位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第32-649位的核苷酸序列。
本发明分离出的大白菜冷相关蛋白质多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
本发明所提供的载体，它包含上述的DNA分子。一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
本发明用上述载体转化的宿主细胞，它是真核细胞。在实例中该宿主细胞是拟南芥。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“大白菜冷相关蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有大白菜冷相关蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第32-649位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第32-649位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第32-649位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第32-649位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第32-649位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的大白菜冷相关相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“大白菜冷相关蛋白或多肽”指具有大白菜冷相关蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然大白菜冷相关相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括大白菜冷相关蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的大白菜冷相关多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与大白菜冷相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用大白菜冷相关多肽的血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“大白菜冷相关保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1
表297％ identity in 972 nt overlapQuery1 cttttctctgacattcatctgaggagaagaaatgaagcacaacaatgtcatccccaatgg 60||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1 cttttctctgacattcatctgagttgaagaaatgaagcacaacaatgtcatccccaatgg 60Query61 tcatttcaagaagcactggcagaactatgtcaagacttggttcaaccagcctgccaggaa 120||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct61 tcatttcaagaagcactggcagaactatgtcaagacttggttcaaccagcctgccaggaa 120Query121 aaccaggagaagagttgcgagacaaaagaaggctgtgaagatcttcccccgtcccactgc 180||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct121 aaccaggagaagagttgcgagacaaaagaaggctgtgaagatcttcccccgtcccactgc 180Query181 tggacctcttcgccctgttgtgcatggtcagactctcaagtacaacatgaaggtccgaac 240||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct181 tggacctcttcgccctgttgtgcatggtcagactctcaagtacaacatgaaggtccgaac 240Query241 cggtaaaggtttcactcttgaagagctcaaggctgctggaatccccaagaagttggcacc 300||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||Sbjct241 cggtaaaggtttcactcttgaagagctcaagtctgctggaatccccaagaagttggcacc 300Query301 aaccattggtatctctgttgaccatcgccgcaagaacagatctctcgagggtcttcagtc 360||||||||||||| |||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||Sbjct301 aaccattggtatcgctgttgaccatcgccggaagaacagatctctcgagggtcttcagtc 360Query361 caatgtccagaggctcaaaacctacaaggctaagttggtcatcttcccgcgtcgtgccag 420||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct361 caatgtccagaggctcaaaacctacaaggctaagttggtcatcttcccgcgtcgtgccag 420Query421 gaaggtcaaggctggtgattctactgctgaagagttggccaatgccactcaagtccaagg 480||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct421 gaaggtcaaggctggtgattctactgcagaagagttggccaatgccactcaagtccaagg 480Query481 ggactacatgcctattgtccgtgagaagcatgctacagagcttgtgaagctgacaactga 540||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct481 ggactacatgcctattgtccgtgagaagcatgctacagagcttgtgaagctgacaactga 540Query541 gatgaaatcagtcaaggcttttgacaagatccgtctggagcgcacaaacaagagacatgc 600||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct541 gatgaaatcagtcaaggcttttgacaaaatccgtctggagcgcacaaacaagagacatgc 600Query601 cggtgctagagccaagagagctgctgatgctgagaaagaagagaagaagtgagagacgca 660|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||Sbjct601 cggtgctagagccaagagagctgctgatgctgagaaagaagagaagaagtgagagaagca 660Query661 ctttatctcttgtcaacgtttgaatcagtcnnnnnnngtgtatcagactctgtttttgtt 720|||||||||||||||||||||||||||||| | ||||||||||||| |||||||Sbjct661 ctttatctcttgtcaacgtttgaatcagtctttttttgagtatcagactctgcttttgtt 720Query721 tcttcagatttttatccttcaaagattttgctgctacttggttatctggatttatggaaa 780|| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct721 tcctcagatttttatccttcaaagattttgctgctacttggttatctggatttatggaaa 780Query781 agatcgttttac 792||||| ||||||Sbjct781 agatcattttac 792Query大白菜冷相关蛋白冷相关的核酸序列Sbjct甘蓝型油菜冷相关蛋白基因(CO24A)核酸序列(Z22618)表2为本发明的大白菜冷相关蛋白(冷相关)与甘蓝型油菜冷相关蛋白的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。
表399％ identity in 206aa overlap，100％ similarity in 206aa overlapQuery1 MKHNNVIPNGHFKKHWQNYVKTWFNQPARKTRRRVARQKKAVKIFPRPTAGPLRPVVHGQ 60MKHNNVIPNGHFKKHWQNYVKTWFNQPARKTRRRVARQKKAVKIFPRPTAGPLRPVVHGQSbjct1 MKHNNVIPNGHFKKHWQNYVKTWFNQPARKTRRRVARQKKAVKIFPRPTAGPLRPVVHGQ 60Query61 TLKYNMKVRTGKGFTLEELKAAGIPKKLAPTIGISVDHRRKNRSLEGLQSNVQRLKTYKA 120TLKYNMKVRTGKGFTLEELK+AGIPKKLAPTIGI+VDHRRKNRSLEGLQSNVQRLKTYKASbjct61 TLKYNMKVRTGKGFTLEELKSAGIPKKLAPTIGIAVDHRRKNRSLEGLQSNVQRLKTYKA 120Query121 KLVIFPRRARKVKAGDSTAEELANATQVQGDYMPIVREKHATELVKLTTEMKSVKAFDKI 180KLVIFPRRARKVKAGDSTAEELANATQVQGDYMPIVREKHATELVKLTTEMKSVKAFDKISbjct121 KLVIFPRRARKVKAGDSTAEELANATQVQGDYMPIVREKHATELVKLTTEMKSVKAFDKI 180
Query181 RLERTNKRHAGARAKRAADAEKEEKK 206RLERTNKRHAGARAKRAADAEKEEKKSbjct181 RLERTNKRHAGARAKRAADAEKEEKK 2068Query大白菜冷相关蛋白冷相关的氨基酸序列Sbjct甘蓝型油菜冷相关蛋白基因(CO24A)氨基酸序列(S42555)表3为本发明的大白菜冷相关蛋白(冷相关)与冷相关的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
发明还包括大白菜冷相关蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然冷相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的大白菜冷相关多肽时，可以将大白菜冷相关编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成大白菜冷相关蛋白表达载体。
如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
还可用Northern印迹法技术分析大白菜冷相关基因产物的表达，即分析大白菜冷相关的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有大白菜冷相关核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码大白菜冷相关的核酸分子。
本发明涉及检测样品中是否存在大白菜冷相关核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于大白菜冷相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的大白菜冷相关核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选大白菜冷相关源基因或同源蛋白。
为了得到与大白菜冷相关基因相关的大白菜cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选大白菜cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对大白菜冷相关的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自大白菜的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与大白菜冷相关的基因家族的核苷酸序列。
本发明的大白菜冷相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的大白菜冷相关蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与大白菜冷相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。
本发明在冷相关中具有明显的作用，对提高植物的产量有所帮助。我国的农作物在很多地区存在者产量低、不稳产的因素，提高农作物的光合效率是解决这一问题的有效方法，本发明的冷相关基因冷相关正具备这项功能，包括植物的抗旱、水淹以及抗盐等逆境的改良。因此，具有很大的应用价值。
具体实施例方式
下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1大白菜冷相关基因的克隆1.组织分离(isolation)大白菜(品种为“日喀则一号”)，将大白菜置于28℃发芽24小时，然后播种于温室中，待大白菜叶片为4-5片时，准备抽取DNA或RNA。
2.RNA的分离(RNA isolation)取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)根据拟南芥冷相关基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1)RT-PCRPCR[BP001(SEQ ID NO.1)+BP002(SEQ ID NO.2)]得到2002BP(782bp)，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)冷相关基因的同源性很高，故初步认为它是一个冷相关基因。
(2)3’-RACEPCR[AP+BP003(5’-CAAGGCTTTTGACAAGATC-3’)]得到2002BP3’(356bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis thaliana)冷相关基因的同源性很高，故初步认为它是一个与冷相关基因。
(3).5’-RACE第一轮PCR[AAP+BP004(5’-CATGTCTCTTGTTTGTGCG--3’)]第二轮PCR[(AUAP+BPR005(5’-GGACAATAGGCATGTAGTCC-3’))得到2001BP 5’(约500bp)(过程同(1))将测序结果的重叠区拼接，发现过程(1)得到的片段既是该基因的完整编码区。
BLAST的结果证明从大白菜中新得到的基因确为一个与植物冷相关的基因。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的大白菜冷相关蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.3)。
实施例2
大白菜冷相关基因的序列信息与同源性分析本发明新的大白菜冷相关全长cDNA的长度为827bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于32-649位核苷酸(618个核苷酸)。根据全长cDNA推导出大白菜冷相关的氨基酸序列，共206个氨基酸残基，分子量为66.84kDa，等电点(pI)为5.11。详细序列见SEQ ID NO.3。
将大白菜冷相关的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与大白菜型油菜冷相关基因(Z22618)在核苷酸水平上具有99％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它与拟南芥冷相关蛋白(S42555)也有99％的相同性(附表3)。由此可见，大白菜冷相关基因冷相关与甘蓝型油菜冷相关蛋白无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为冷相关在提高植物的抗冷性上也具有相似的作用。
实施例3大白菜冷相关蛋白或多肽在拟南芥中进行真核细胞表达及转基因植株的冷相关性鉴定含目的基因(大白菜冷相关基因)的表达载体的构建，根据大白菜冷相关的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将大白菜冷相关基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA2300)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物拟南芥。
1.发苗种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70％的乙醇消毒1分钟，然后用0.1％升汞消毒10-12分钟。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干，放入MS培养基。光照培养5天，待苗长到4-5厘米便可以剪苗。
2.剪苗剪取0.5-1厘米的下胚轴小片段放入预培养基，培养2天。
预培养基MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)3.转化共培养将预培养2天的下胚轴放入事先培养好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分钟。接着取出放入预培养基暗培养2天。
4.筛选培养共培养结束后，将外植体放入筛选培养基。2周继代一次。2-4周有愈伤组织形成和芽的分化。待绿芽长到2厘米后，切下生根。
筛选培养基MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)生根培养基MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)5.转化植株培养；待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
含大白菜冷相关基因的转基因拟南芥植株的冷相关鉴定鉴于编码冷相关基因在同源性搜索上已初步被证明是冷相关基因，在进一步对含大白菜冷相关的转基因拟南芥植株进行冷相关性鉴定。我们利用RT-PCR和Northern blot对转基因植株进行了检测，两种方法均证明目的基因已经整合到拟南芥的基因组中。我们以正常的拟南芥和以转冷相关基因的拟南芥植株进行4℃处理48小时。结果证明转冷相关基因植株在抗冷相关上均强于未转基因的植株，它的生长状况好于未转基因的植株短。这证明cpCO24A基因有冷抗性，大白菜冷相关基因将可用于利用转基因技术改良植物抗冷相关的研究和产业化生产中。
大白菜冷相关基因冷相关在大白菜中的拷贝数分析采用常规方法从大白菜叶片中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分别用SnaBI，KpnI和HindIII酶切DNA[13μg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我们将BoFLC基因编码区标记为探针，然后进行杂交(于60℃杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。结果(Southern blot)发现在杂交膜上出现2-3杂交条带，说明冷相关基因在大白菜中属于低拷贝基因。
大白菜冷相关基因冷相关在大白菜中的表达谱分析1.RNA的提取将大白菜“日喀则一号”，播在温室(温度设置为25-26℃，光照时间为16小时)。待叶片长到2-3片叶时抽取大白菜叶的RNA。以正常生长的植株作为对照，以4℃处理的植株为材料(条件同上)，利用TRIzol试剂盒(GIBCOBRL，USA)提取并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD260；RNA含量计算1 OD260＝40μg/ml。
3总RNA琼脂糖凝胶电泳分离1)取6ml 25*(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2ul 10*上样缓冲液，混匀。7)在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。
4.RNA尼龙膜上转移1)转移之前，将尼龙膜用10*SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2*SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃烘烤2小时。
5.膜上杂交信号的检出1)将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA]，65℃下预杂交2小时。2)将用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入1)的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。4)用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIGlabeled试剂盒说明书)。Northern杂交表明；正常生长的大白菜的植株冷相关转录水平比上述冷相关处理的材料的表达水平明显偏低，这说明冷相关转录水平与冷相关显著相关。
本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征
(A)长度21bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1ATGAAGCACAACAATGTCATC(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2CTTCTTCTCTTCTTTCTCAG(3)SEQ ID NO.3的信息
<110>上海交通大学<120>大白菜冷相关蛋白编码序列<140>
<141>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>827<212>DNA<213>大白菜(Brassica Campestris ssp.Pekinensis)CTTTTCTCTG ACATTCATCT GAGGAGAAGA AATGAAGCAC AACAATGTCA TCCCCAATGG 60TCATTTCAAG AAGCACTGGC AGAACTATGT CAAGACTTGG TTCAACCAGC CTGCCAGGAA 120AACCAGGAGA AGAGTTGCGA GACAAAAGAA GGCTGTGAAG ATCTTCCCCC GTCCCACTGC 180TGGACCTCTT CGCCCTGTTG TGCATGGTCA GACACTCAAG TACAACATGA AGGTCCGAAC 240CGGTAAAGGT TTCACTCTTG AAGAGCTCAA GGCTGCTGGA ATCCCCAAGA AGTTGGCACC 300AACCATTGGT ATCTCTGTTG ACCATCGCCG CAAGAACAGA TCTCTCGAGG GTCTTCAGTC 360CAATGTCCAG AGGCTCAAAA CCTACAAGGC TAAGTTGGTC ATCTTCCCGC GTCGTGCCAG 420GAAGGTCAAG GCTGGTGATT CTACTGCTGA AGAGTTGGCC AATGCCACTC AAGTCCAAGG 480GGACTACATG CCTATTGTCC GTGAGAAGCA TGCTACAGAG CTTGTGAAGC TGACAACTGA 540GATGAAATCA GTCAAGGCTT TTGACAAGAT CCGTCTGGAG CGCACAAACA AGAGACATGC 600CGGTGCTAGA GCCAAGAGAG CTGCTGATGC TGAGAAAGAA GAGAAGAAGT GAGAGACGCA 660CTTTATCTCT TGTCAACGTT TGAATCAGTC TTTTTTTGTG TATCAGACTC TGTTTTTGTT 720TCTTCAGATT TTTATCCTTC AAAGATTTTG CTGCTACTTG GTTATCTGGA TTTATGGAAA 780AGATCGTTTT ACACCCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 827<210>2<211>206<212>PRT<213>大白菜(Brassica Campestris ssp.Pekinensis)<400>2MKHNNVIPNG HFKKHWQNYV KTWFNQPARK TRRRVARQKK AVKIFPRPTA GPLRPVVHGQ 60
TLKYNMKVRT GKGFTLEELK AAGIPKKLAP TIGISVDHRR KNRSLEGLQS NVQRLKTYKA 120KLVIFPRRAR KVKAGDSTAE ELANATQVQG DYMPIVREKH ATELVKLTTE MKSVKAFDKI 180RLERTNKRHA GARAKRAADA EKEEKK 20权利要求
1.一种大白菜冷相关蛋白编码序列，其特征在于，包括编码具有大白菜冷相关蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第32-649位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第32-649位的核苷酸序列杂交。
2.根据权利要求1所述的大白菜冷相关蛋白编码序列，其特征是，所述的序列编码具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的大白菜冷相关蛋白编码序列，其特征是，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第32-649位的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的大白菜冷相关蛋白编码序列，其特征是，包含DNA分子中8-100个连续核苷酸。
5.根据权利要求4所述的大白菜冷相关蛋白编码序列，其特征是，DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。
全文摘要
一种大白菜冷相关蛋白编码序列，属于基因工程领域。包括编码具有大白菜冷相关蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第32－649位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40－55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第32－649位的核苷酸序列杂交。本发明在植物抗冷中具有明显的作用，本发明具有很大的应用价值。
文档编号C12N15/79GK1528900SQ20031010797
公开日2004年9月15日 申请日期2003年10月16日 优先权日2003年10月16日
发明者李柱刚, 唐克轩, 赵凌侠, 孙小芬, 邱承祥 申请人:上海交通大学