专利名称：按植物偏爱密码子设计人工合成胸腺素α1基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种植物基因序列，特别是一种按植物偏爱密码子设计人工合成胸腺素α1(Thymosin-α1，Tα1)基因序列，属于基因工程领域。
背景技术：
胸腺素α1(Thymosin-α1，Tα1)在临床被广泛应用于免疫缺陷、感染和自身免疫性疾病，如对肝炎(HBV、HCV)、爱滋病(HIV)、癌症(cancer)和糖尿病(diabetes)治疗取得了满意的效果(Ohta Y et al 1983，Kullavanuaya P et al 2001，AmarapurkarD and Das HS 2002。此前对给人类带来巨大恐慌的“SARS”的治疗，胸腺素曾被指定为临床主要用药。目前胸腺素α1的生产主要通过组织提取、化学合成法和基因工程法，由于组织来源有限和化学合成的成本高，使胸腺素α1在临床应用受限。利用基因工程法生产胸腺素α1具有很大的潜力，尤其是通过基因工程方法用植物作为生物反应器生产胸腺素α1在安全性和降低成本方面具有更大优势。
文献检索和查新发现，通过基因工程法生产胸腺素α1(Tα1)目前主要利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统。Xiu Z Y et al(Sheng Wu Gong Cheng XueBao，2002，18(5)541-545)和Korobko VG et al(Bioorg Khim，1992，18(5)646-659)均在大肠杆菌中成功地表达了人源的胸腺素α1。不过所表达产品需经过纯化加工才能在临床应用。纯化加工需要有必要培养基和设备支持，这就提高了胸腺素α 1生产成本；在加工过程中还存在二次污染和所用试剂对胸腺素α1生物活性的影响。同时，微生物表达系统在加工中难以除去重组蛋白中内毒素的污染而带来安全性隐患。
在现有技术文献检索和查新结果中，尚未发现公开报导过涉及本发明的在植物中表达的胸腺素α1编码序列的内容。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足，提供一种按植物偏爱密码子设计人工合成胸腺素α1基因序列。通过构建植物表达载体，在植物中表达胸腺素α1。产品对提高人体的免疫力，防止和治疗人类重大疾病如肝炎(HBV、HCV)、爱滋病(HIV)、癌症(cancer)和糖尿病(diabetes)方面具有重要应用价值。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明通过按植物偏爱密码子原则设计合成胸腺素α1基因，构建植物表达载体，在如番茄、生菜或烟草等高等植物中表达胸腺素α1。表达胸腺素α1的植物产品无需加工纯化就可以直接食用，表达胸腺素α1植物还易于规模化生产，使胸腺素α1的生产成本大幅度降低；同时植物病原菌对人类是安全的，因此表达胸腺素α1植物产品也是安全的。在本发明提供的一种人工设计并合成的含有新的胸腺素α1基因的克隆载体pUC18-Tα1，该载体包括根据植物偏爱密码子设计的胸腺素α1的核酸序列，所述的核酸序列与SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-104位DNA分子的核苷酸序列有至少75％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-104位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-104位的核苷酸序列。
在本发明提供的在植物中表达的胸腺素α1，它包括具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.6序列的多肽。
在本发明的几种表达载体，它包含上述的DNA分子。
在本发明用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是生菜、番茄和烟草。
在本发明在植物中产生和表达具有活性的胸腺素α1的方法，其步骤如下1、将人工合成的编码具有生物活性胸腺素α1多肽的核苷酸序列可操作性地连于表达调控序列，构建胸腺素α1蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.5中的核苷酸序列的第18-104位至少有75％的同源性；2、将步骤1中的表达载体转入宿主细胞，形成含胸腺素α1的重组细胞；3、在适合胸腺素α1表达的条件下，培养步骤2中的重组细胞；4、再生重组细胞，获得表达胸腺素α1的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。
较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.5中第18-104位的序列。
在本发明中，术语“胸腺素α1编码序列”是指编码具有生物活性胸腺素α1多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.5中第18-104位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.5序列的编码框的第18-104位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.5中第18-104位核苷酸序列同源性低至约75％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.6所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-104位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-104位的核苷酸序列的同源性至少75％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的胸腺素α1相同功能蛋白的SEQ ID NO.5中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“胸腺素α1”是指具有生物活性胸腺素α1的SEQ ID NO.6序列的多肽。该术语还包括具有与胸腺素α1在植物中表达相同功能的SEQ ID NO.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为15个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的在植物中偏爱的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个植物偏爱密码子所表达的氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括在植物中的表达的胸腺素α1的活性片段和活性衍生物。
本发明的胸腺素α1的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与胸腺素α1 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗胸腺素α1的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“胸腺素α1保守性变异多肽”是指与SEQ ID NO.6的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1胸腺素α1保守性变异多肽氨基酸替换表
发明还包括人工合成的在植物中表达的胸腺素α1或多肽的类似物。这些类似物与胸腺素α1的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、粘粒和λ噬菌体等。在植物中表达或生产本发明的胸腺素α1时，可以将胸腺素α1编码序列可操作性地连于表达调控序列，从而形成含胸腺素α1表达载体。
如本发明所用“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、生菜细胞、番茄细胞、油菜及其它植物细胞。
还可用Nothern印迹法技术分析胸腺素α1基因转录情况，即分析胸腺素α1的转录物RNA在细胞中的存在与否和数量。
胸腺素α1RNA的Northern印迹分析和特异抗体的胸腺素α1的Western印迹分析联合使用，可以证实在生物样本中胸腺素α1的表达。
此外，本发明的可用作探针的核酸分子，该分子通常具有胸腺素α1核苷酸编码序列的8-50个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码胸腺素α1的核酸分子。
本发明检测样品中是否存在核苷酸序列的胸腺素α1方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于胸腺素α1核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
本发明的胸腺素α1核苷酸编码序列通常可以用人工合成的方法获得。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
以下对本发明序列的内容进一步描述一、本发明的按植物偏爱密码子设计人工合成的胸腺素α1(与牛人工合成胸腺素α1核苷酸序列(GenBank Accession No.J02524.1)、鼠胸腺素α1(GenBankAccession No.NM 008972.1)和人的胸腺素α1(GenBank Accession No.AY169282.1)同源比较(GAP)，相同的核苷酸在两个序列之间用竖线符标出。
1.本发明按植物偏爱密码子设计人工合成的胸腺素α1与牛人工合成胸腺素α1核苷酸序列同源比较(GAP)如表190％identity in 87nt overlapQuery18 atgtctgatgctgctgttgatacctcttctgagatcaccaccaaggatcttaaggagaag 77||||||||||||||||||||||| ||||||||||| || || || |||||||||||||||Sbjct6 atgtctgatgctgctgttgatacttcttctgagattactactaaagatcttaaggagaag 65Query78 aaggaggttgttgaggaggctgagaac 104||||| ||||| || ||||||||||||Sbjct66 aaggaagttgtcgaagaggctgagaac 92Query按植物偏爱密码子设计人工合成的胸腺素α1核苷酸序列Sbjct牛人工合成胸腺素α1核苷酸序列表1按植物偏爱密码子设计人工合成的胸腺素α1与牛人工合成胸腺素α1核苷酸序列同源比较(GAP)。
2.本发明按植物偏爱密码子设计人工合成的胸腺素α1与鼠胸腺素α1核苷酸序列同源比较(GAP)如表289％identity in 56 nt overlapQuery48 gagatcaccaccaaggatcttaaggagaagaaggaggttgttgaggaggctgagaa 103||||||||||||||||| | |||||||||||||| ||||| |||||||| |||||
Sbjct201 gagatcaccaccaaggacttgaaggagaagaaggaagttgtggaggaggcagagaa 256Query按植物偏爱密码子设计人工合成的胸腺素α1核苷酸序列Sbjct鼠胸腺素α1核苷酸序列图2按植物偏爱密码子设计人工合成的胸腺素α1与鼠胸腺素α1核苷酸序列同源比较(GAP)。
3.本发明按植物偏爱密码子设计人工合成的胸腺素α1与人胸腺素α1核苷酸序列同源比较(GAP)如表387％identity in 47 nt overlapQuery51 atcaccaccaaggatcttaaggagaagaaggaggttgttgaggaggc 97|||||||||||||| | |||||||||||||| ||||| || |||||Sbjct34 atcaccaccaaggacttaaaggagaagaaggaagttgtggaagaggc 80Query按植物偏爱密码子设计人工合成的胸腺素α1核苷酸序列Sbjct人胸腺素α1核苷酸序列图3按植物偏爱密码子设计人工合成的胸腺素α1与人胸腺素α1核苷酸序列同源比较(GAP)。
二、本发明的按植物偏爱密码子设计的胸腺素α1与人胸腺素α的氨基酸序列(GenPept Accession No.AY169282.1)和鼠胸腺素α的氨基酸序列(GenPeptAccession No.NM 021740.1)的同源比较(FASTA)，其中，相同的氨基酸在两个序列之间用用竖线符标出。
1.本发明按植物偏爱密码子设计的胸腺素α1与人胸腺素α的氨基酸序列同源比较(FASTA)如表4100％identity in 29 aa overlapQuery1 MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN 29|||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1 MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN 29Query按植物偏爱密码子设计的胸腺素α1氨基酸序列Sbjct人胸腺素α的氨基酸序列表4按植物偏爱密码子设计的胸腺素α1与人胸腺素α的氨基酸序列同源比较(FASTA)。
2.本发明的按植物偏爱密码子设计的胸腺素α1与鼠胸腺素α的氨基酸序列同源比较(FASTA)如表5100％identity in 29 aa overlapQuery1 MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN 29|||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1 MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN 29Query按植物偏爱密码子设计的胸腺素α1氨基酸序列Sbjct鼠胸腺素α的氨基酸序列表5按植物偏爱密码子设计的胸腺素α1与鼠胸腺素α的氨基酸序列同源比较(FASTA)。
本发明的按植物偏爱密码子设计人工合成的胸腺素α1的植物及其他生物的表达产品对提高人体的免疫力，预防和治疗人类重大疾病如肝炎(HBV、HCV)、爱滋病(HIV)、癌症(cancer)和糖尿病(diabetes)方面具有重要作用及应用价值。
具体实施例方式
下面结合实验室具体的试验数据和实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1胸腺素α1基因的合成及载体构建1.基因合成(gene synthesis)胸腺素α1基因由本实验室根据植物偏爱密码子设计并委托上海生工合成之后连入pUC18载体，即pUC18-Tα1；2.酶切(restriction enzyme cutting)对含有胸腺素α1基因pUC-18克隆载体(pUC18-Tα1)用KpnI和SacI双酶切，获得带有KpnI和SacI粘性末端的胸腺素α1基因DNA片段；然后将此片段连入已用KpnI和SacI切好的克隆载体pCAMBIA2300，构建pCA2300-Tα①；再用BamH I及Sac I双切pCA2300-Tα①获得带有Bam H I及Sac I粘性末端(与表达载体相同)的胸腺素α1基因的DNA片段；3.连接(ligation)将切下的基因连入已经用Bam H I及Sac I切好的质粒pBI121或用pBI121改造过的pCAMBIA2300植物表达载体大片段中，用蓝白筛选或PCR方法检测转化的大肠杆菌，从而获得阳性克隆。
4.基因的PCR检测以下序列为引物，用合成的基因为模板进行PCR检测Tα1F15’-ggt acc atg tct aga atg tct gat-3’(SEQ ID NO.1)Tα1R15’-gag ctc tta act agt cat gtt ctc-3’(SEQ ID NO.2)PCR条件为94℃ 5分钟，随之以94℃ 40秒、56℃ 40秒和72℃ 1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸8分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为120bp。
将基因转入表达载体后用以下引物对所含基因进行PCR检测Tα1F25’-atg tct gat gct gct gtt gat-3’(SEQ ID NO.3)Tα1R25’-aag acc ggc aac agg att ca-3’(SEQ ID NO.4)PCR条件为94℃ 5分钟，随之以94℃ 40秒、60℃ 40秒和72℃ 1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸8分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为174bp。
实施例2胸腺素α1基因的序列信息与同源性分析本发明的按植物偏爱密码子设计合成的胸腺素α1(Tα1)基因全长为124bp(含保护碱基和酶切位点组成的接头)，详细序列见SEQ ID NO.5，其中开放读框位于18-104位核苷酸。据此所推导出的全长胸腺素α1的氨基酸序列共29个氨基酸残基，分子量Mw＝3197.47，等电点pI＝4.25。详细序列见SEQ ID NO.6。
将按植物偏爱密码子设计合成的胸腺素α1全长序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations +PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与牛人工合成胸腺素α1核苷酸序列(GenBank Accession No.J02524.1)、鼠胸腺素α(GenBank Accession No.NM 008972.1)和人的胸腺素α(GenBank Accession No.AY169282.1)核苷酸序列的同源性分别为90％、89％和87％(见表1-表3)；在氨基酸水平上，它与人胸腺素α的氨基酸序列(GenPeptAccession No.AY169282.1)和鼠胸腺素α的氨基酸序列(GenPept AccessionNo.NM 021740.1)的同源性为100％(见表4-表5)。由上可见，在植物中表达的胸腺素α1与人和鼠的胸腺素α1基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，可以认为它们在功能上也有很高相似性。
实施例3胸腺素Tα1在烟草和番茄细胞中进行真核细胞表达1.含目的基因(胸腺素Tα1基因)表达载体的构建通过基因工程(DNA重组)技术将含有胸腺素α1(Tα1)基因克隆载体pUC18和pCAMBIA2300的pUC18-Tα1和pCA2300-Tα①进行相应的酶切，通过琼脂糖胶回收获得带有相应的粘性末端的目的基因Tα1，然后将其克隆到植物双元表达载体(如pBI121或改造过的pCAMBIA2300)中，通过测序或酶切鉴定，使表达载体中的目的基因阅读框架正确的前提下好表达载体，再将其转入农杆菌(如EHA105)中，利用叶盘法转化模式植物烟草和番茄。
2.农杆菌介导的叶盘法转化生菜①用无菌牙签挑取LB选择平板上的阳性菌落，接种于含相应抗生素(Str+，Kan+和Rif+)的2ml液体LB培养基中，于28℃在240~260rpm摇床振荡培养24-36小时，使菌液的OD600＝0.5~0.8；②室温下4,000g离心10min；③弃上清，用等体积的1/2MS液体培养基重悬菌体，使菌液保持在OD600＝0.5~0.8；④取在1/2MS培养基上生长约10天的无菌生菜真叶切成小片；⑤将叶片放入制备好的菌液中，浸泡5~8min，并不时摇动，然后取出用无菌滤纸吸去残余菌液；⑥把菌液侵染后的生菜叶片置于MS1培养基(MS+6-BA 0.25mg/L+NAA 0.1mg/L)上，28℃暗罴条件下培养36~48小时；
⑦将叶片从MS1上转到MS2筛选培养基(MS+6-BA 0.25mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-10天可见抗性愈伤组织的形成；⑧在分化筛选培养基上生长20天后可见再生芽长出，待芽长至3~4cm后切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L+cb 250mg/L)上进行生根培养，7~10天左右生根；⑨待根系发达后将植株取出，用无菌水洗净附着于根部的固体培养基，移入珍珠岩中驯化，每周浇1％MS液体(无碳源)培养基1~2次，刚开始几天要保持一定的湿度，待苗的根系发达后转入田间或温室中培养。
3.转化番茄①将番茄种子用75％乙醇和20％的次氯酸钠灭菌后播于1/2MS培养基上，待6~8天子叶展开后，将子叶或下胚轴剪成小片(小段)用于转化；②农杆菌过夜培养，待菌摇至OD600＝0.8~1.0，室温下6,000g离心5~8min；③弃上清，菌体用1/2MS液体培养基重悬，然后加入准备好的子叶浸泡8~10分钟；④取出侵染好的叶片，用无菌吸水纸吸去多余菌液；然后将子叶放在共培养的MS1培养基(MS+ZT 1.0mg/L+I AA 1.0mg/L)上，共培养36小时；⑤共培养后将叶片转移到含Kan的分化培养基(MS+ZT 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L+Kan 50mg/L+cb 250mg/L)上，在25-28℃光照下培养，3~4周可见形成抗性愈伤组织或再生芽；⑥待芽长大后约3-4厘米的时将幼芽移植在生根培养基中(1/2MS)上进行生根培养，7~10天左右生根；⑦根系发达后，将植株取出，用无菌水洗去附着在根系上的固体培养基，在珍珠岩中驯化并用1％的MS补充营养和水分，一周后移入土中。
4.农杆菌介导的烟草叶盘转化①取用表达载体转化过的农杆菌500μL接种于100mL LB+Rif(40mg/L)+Str(25mg/L)+Kan(75mg/L)液体培养基中，28℃过夜摇菌，使其OD600≈0.8-1.0，8000rpm下离心收集菌体并用等体积的MS重悬备用；②用灭菌剪刀将健壮烟草苗的幼嫩叶片剪成0.6×0.6cm2见方叶盘(去主脉)，为防止叶盘脱水置其于MS1(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L)培养基上；③取约120~150片叶盘在放入用MS重悬农杆菌中，在60-80rpm摇床上室温摇动10min，使农杆菌被叶盘充分吸附；④吸附完成后用灭菌吸水纸吸去多余菌液；⑤将吸干的叶盘小心置于加盖一层滤纸的共培养的MS1培养基上(叶盘间不要叠加在一起)，用parafilm封好培养皿，于暗黑处25℃共培养48-60h；⑥将共培养后的叶盘直接转入分化的MS2培养基，使有伤口的叶盘边缘尽可能与培养基接触，每2周转接1次，其间培养条件为25℃，光周期14h/10h(light/dark)；⑦待叶盘边缘的再生芽长到3-4cm时(约30d)，切下置于生根培养基1/2MS中生根；⑧待生根后用水冲去根部粘附的培养基，然后栽入盛有预先用自来水清洗过的珍珠岩的营养钵中驯化7-10d后移入带有营养土的花盆中，细心养护，用于以后的研究。
5.用western blot检测胸腺素Tα1在转基因生菜、烟草和番茄植株中的表达①蛋白提取(在冰上进行)a.取50mg叶片，加入100ul 1×PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于1.5ml离心管中研磨；b.13000rpm 4℃离心10分钟；c.取上清，备用。
②蛋白定量参考Bradford法(Bradford，1976)，取2ul蛋白样品加1ml；Bradford试剂混匀后，分光光度计测OD595。
③SDS-PAGE分离蛋白SDS-PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；a.加样前样品中加入少量的含50mmol/L DTT加样缓冲液(2×加样缓冲液甘油2.4g，1M Tris-HCl pH6.8 1ml；溴酚兰0.01％，H20定容至20ml)，煮沸10分钟；b.室温100V电压下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶底部。
④蛋白质向硝酸纤维膜上转移a.转移之前，用转移缓冲液(39mmol甘氨酸，48mmol Tris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；b.室温下用半干式电转仪转移1h，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸；⑤硝酸纤维膜蛋白检测a.将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37℃缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液取5g脱脂奶粉溶于100ml 1×PBS(含0.5g叠氮钠))；b.再将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37℃洗涤两次，每次15分钟；c.加入第一抗体(抗胸腺素Tα1的抗体)，37℃温育30分钟；同步骤b，洗涤三次；d.加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37℃温育30分钟；同步骤b，洗涤两次；e.加入底物显色观察蛋白条带。
本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度24bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1ggt acc atg tct aga atg tct gat(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度24bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2gag ctc tta act agt cat gtt ctc
(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度21bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.3atg tct gat gct gct gtt gat(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.4aag acc ggc aac agg att ca(5)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度124bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.5GGGGTACCAT GTCTAGAATG TCTGATGCTG CTGTTGATAC CTCTTCTGAG 50ATCACCACCA AGGATCTTAA GGAGAAGAAG GAGGTTGTTG AGGAGGCTGA 100
GAACATGACT AGTTAAGAGC TCGG 124(6)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度37氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO.61 MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN29
<110>上海交通大学<120>按植物偏爱密码子设计人工合成胸腺素α1基因序列<140>
<141>
<160>2<170>Patent In version 3.1<210>1<211>124<212>DNA<213>人工序列<400>1GGGGTACCAT GTCTAGAATG TCTGATGCTG CTGTTGATAC CTCTTCTGAG 50ATCACCACCA AGGATCTTAA GGAGAAGAAG GAGGTTGTTG AGGAGGCTGA 100GAACATGACT AGTTAAGAGC TCGG 124<210>2<211>29<212>PRT<213>人工序列<400>21 MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN29
权利要求
1.一种按植物偏爱密码子设计人工合成胸腺素α1基因序列，其特征在于，包括根据植物偏爱密码子设计的编码具有生物活性胸腺素α1多肽的核苷酸序列，而且核苷酸序列与SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-104位的核苷酸序列有至少75％的同源性；或者核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-104位的核苷酸序列杂交。
2.根据权利要求1所述的按植物偏爱密码子设计人工合成胸腺素α1基因序列，其特征是，所述的序列编码具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的多肽。
3.根据权利要求1所述的按植物偏爱密码子设计人工合成胸腺素α1基因序列，其特征是，该序列具有SEQ ID NO.5中从核苷酸第18-104位的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的按植物偏爱密码子设计人工合成胸腺素α1基因序列，其特征是，它包括编码具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.根据权利要求4所述的按植物偏爱密码子设计人工合成胸腺素α1基因序列，其特征是，该序列在植物中表达的多肽是具有SEQ ID NO.6序列的多肽。
6.根据权利要求4所述的按植物偏爱密码子设计人工合成胸腺素α1基因序列，其特征是，它包含DNA分子中18-104个连续核苷酸。
7.根据权利要求6所述的按植物偏爱密码子设计人工合成胸腺素α1基因序列，其特征是，所述的DNA分子，其所构建的载体包含该DNA分子。
8.根据权利要求4所述的按植物偏爱密码子设计人工合成胸腺素α1基因序列，其特征是，所述的DNA分子，其所构建的载体转化的宿主细胞是真核细胞。
全文摘要
一种按植物偏爱密码子合成胸腺素α1基因序列，属于基因工程领域。本发明包括根据植物偏爱密码子设计的编码具有生物活性胸腺素α1多肽的核苷酸序列，而且核苷酸序列与SEQ ID NO.5中从核苷酸第18－104位的核苷酸序列有至少75％的同源性；或者核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.5中从核苷酸第18－104位的核苷酸序列杂交。本发明的产品对提高人体的免疫力，对预防和治疗人类重大疾病如肝炎、艾滋病、癌症和糖尿病方面具有重要作用及应用价值。
文档编号C12N15/12GK1528893SQ20031010797
公开日2004年9月15日 申请日期2003年10月16日 优先权日2003年10月16日
发明者赵凌侠, 唐克轩, 李柱刚, 钱虹妹, 唐东芹, 邱承祥 申请人:上海交通大学