专利名称：一种重组内切几丁质酶基因序列及其重组载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重 组内切几丁质酶基因序列和含有该重组内切几丁质酶基因的重组载体。
背景技术：
几丁质又称甲壳素，化学名为(l,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-(3-D-葡萄糖，是由 N-乙酰氨基葡萄糖通过p-l，4-糖苷键连接而成的天然高分子氨基多糖类化合物， 广泛存在于低等植物菌类、藻类的细胞和甲壳动物虾、蟹、昆虫外壳以及高等 植物的细胞壁中。自然界中几丁质年生物合成量近一百亿吨，其中10%来自于 海洋，是地球上仅次于纤维素的第二大可再生资源，但遗憾的是这一资源未被 充分利用而作为废物自然流失，不仅造成了巨大的浪费，而且还导致了严重的 环境污染。大量的废弃几丁质资源由于没有行之有效的处理方法或因处理效果 不好长期存在于自然环境中，在一定条件下会发生化学的、物理的或生物的转 化，对周围环境造成一定的影响。污染成分不仅通过水、气、土壤、食物链等 途径污染环境，成为大气、水体和土壤环境污染的"源头"；同时又是各种病源微 生物的孽生地和繁殖场，形成病源型污染，严重危害人体健康。如何充分利用 这些几丁质资源，使之变废为宝，消除其对环境的污染，成为目前急需解决的 重要问题。
近年来人们逐渐发现几丁质的中间降解产物几丁寡糖具有区别于单糖的某 些独特的生理功能增强人体免疫机能；促进脾脏抗体的形成；抗肿瘤及抑制 肿瘤转移；降低胆固醇和血脂的含量；抗血栓、降血压、降血糖、抗凝血、抗菌和抑菌等生物活性并能选择性地活化和增殖人体肠道内的有益菌；消除体内 霉素，调节生理机能，延缓衰老；强化肝脏机能，阻碍病原菌生长繁殖和排除 体内重金属等，已被科学界列为人的生命第六要素，是目前发现的唯一的阳离 子动物性膳食纤维，在医药、保健、化工、食品、环境和农业等领域具有广泛 的应用前景，附加值高，因此几丁寡糖的生产己成为开发利用几丁质原料的一 条重要途径。
几丁质可通过酸法或酶法降解。酸法降解能耗大，降解程度难以控制，降解 产物主要为单糖，降解过程中产生的含硫酸或盐酸的废水直接排放或加碱中和 后排放到环境中，对环境造成严重的二次污染。酶法降解具有反应条件温和， 能耗低，无需昂贵设备和对环境友好等优点，因而具有良好的应用前景。几丁 质可通过几丁质降解酶系作用而降解。根据反应初级产物类型和水解切口位置 的不同，几丁质降解酶系可分为内切几丁质酶、外切几丁质酶和几丁二糖酶。 内切几丁质酶从几丁质链的内部切割P-1，4糖苷键，产生几丁寡糖；外切几丁质 酶从几丁质链的非还原性末端依次切割卩-l，4糖苷键，产生几丁单糖；几丁二糖 酶则专一性的将几丁二糖降解为几丁单糖，因此研制高效廉价的内切几丁质酶 是催化几丁质降解成几丁寡糖的关键所在。
巴斯德毕赤酵母表达系统现在已经发展成为一种高效的外源蛋白基因优秀 表达系统，具有高表达、高稳定、高分泌、易适应大规模工业化发酵和培养成 本低等优点。为了能够提高内切几丁质酶蛋白的表达量，本专利首先根据巴斯 德毕赤酵母基因组中各种氨基酸密码子的使用频率，设计合适的引物，采用PCR 技术合成了基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的内切几丁质酶基因序列，然后 构建了含有该目的基因序列的表达载体pSECH，最后将该表达载体转至表达量 高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的巴斯德毕赤酵母中，构建高分泌型内切几丁质酶巴斯德毕赤酵母工程菌，实现高效廉价内切几丁质酶的 产业化生产，具有广阔的应用前景，经济、生态环境效益将非常明显。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组
内切几丁质酶基因序列，其碱基序列如SEQIDNO.l所示。
本发明的又一个目的在于提供一种含有上述重组内切几丁质酶基因的重组 载体和由该重组载体转化的巴斯德毕赤酵母宿主。
本发明采用现代生物技术，利用PCR合成了基于巴斯德毕赤酵母密码子偏 爱性的重组内切几丁质酶基因，构建了微生物表达载体，再将该表达载体转至 表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的巴斯德毕赤酵母中， 构建高分泌型内切几丁质酶工程菌，可实现高效廉价内切几丁质酶的产业化生 产，具有广阔的应用前景，
图1表示重组内切几丁质酶基因的真核表达载体的构建。
具体实施例方式
实施例1.基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列的获 得
根据巴斯德毕赤酵母密码子的偏爱性和内切几丁质酶的基因序列，设计以下 引物
F,:5，-GAATTCGCTAGTGGTTACGCTAACGCTGTTTACTTTACTAACTGGGGTATTTACGGT-3，
F2:5，-ACTGGGGTATTTACGGTCGTAACTTTCAACCACAAAACCTTGTTGCTT CTGATATTACT-3，
F3:5，-TGTTGCTTCTGATATTACTCATGTTATTTACTCTTTTATGAACTTTCAAG CTGATGGTACT-3，
F4:5，-TTCAAGCTGATGGTACTGTTGTTTCTGGTGATGCTTACGCTGATTACC AAAAGCATTAC-3，
F5:5，-ATTACCAAAAGCATTACGATGATGATTCTTGGAACGATGTTGGTAACA ACGCTTACGGT-3'
F6:5，-GTAACAACGCTTACGGTTGTGTTAAGCAACTTTTTAAGTTGAAGAAG GCTAACCGTAAC國3'
FW-AGAAGGCTAACCGTAACTTGAAGGTTATGCTTTCTATTGGTGGTTGGA CTTGGTCTACT-3"
F8:5，-GTTGGACTTGGTCTACTAACTTTCCATCTGCTGCTAGTACTGATGCTA ACCGTAAGAAC陽3，
F9:5,-ATGCTAACCGTAAGAACTTTGCTAAGACTGCTATTACTTTTATGAAGG ATTGGGGTTTT-3,
F10:5，-TGAAGGATTGGGGTTTTGATGGTATTGATGTTGATTGGGAATACCCA GCTGATGATACT-3，
Fu:5，-ACCCAGCTGATGATACTCAAGCTACTAACATGGTTCTTCTTCTTAAGG AAATTCGTTCT-3，
F12:5，-TTAAGGAAATTCGTTCTCAACTTGATGCTTACGCTGCTCAATACGCTC CAGGTTACCAT画3'F13:5，-ACGCTCCAGGTTACCATTTTCTTCTTTCTATTGCTGCTCCAGCTGGTC CAGAACATTAC-3，
F14:5，-CAGCTGGTCCAGAACATTACTCTTTTCTTCATATGTCTGATCTTGGTC AAGTTCTTGAT-3，
R,:5，-AGCGGCCGCTTAGTTAAGACCACTACGAATGTTATCGTATTGAGAGTT
R2:5，-TTATCGTATTGAGAGTTTGGGTAACCAAGCAAGTTTTGAGTAGAATCA AGACTACCAAG-3，
R3:5，-GAATCAAGACTACCAAGAGCTCTATGACTAGTACCAATCAAAGAATC AGAACCAGTCTT國3，
R4:5，國GAATCAGAACCAGTCTTATCAGCAGAAGCTTCCCAAAACATACTACC ACCAAGACCAAG画3，
R5:5，-CTACCACCAAGACCAAGGTTCTTAAGGTAAGAAACCTTAGTGTTAAT CATAGCTGGAGT-3，
R6:5,誦TTAATCATAGCTGGAGTATCAAAAGAAATAAGTTCCTTACTACTTGGA TCGTAACTGTA-3,
R7:5，-CTTGGATCGTAACTGTAGTAAGCTTGAGCAGTAGAATCGTATTGAAC AGTAGCACCAGC-3，
Rg:5，曙TGAACAGTAGCACCAGCCTTTGGAAGAACCTTGTAATCCCAAATACC GTTTTCCCAACT-3，
R9:5，-ATACCGTTTTCCCAACTACCAGAACCAATACCACTGTAAGTTTGACCA ATACCACCAGT-3，
R10:5，-TGACCAATACCACCAGTACTTTCAAAAGAACGACCGTAAATTGGCATACCAAGAACAAT-3，
Rn:5，陽GGCATACCAAGAACAATCTTACTAGCTGGAACACCACCCTTAATGTA ATCCTTAATAGC-3，
R，2:5,-ATGTAATCCTTAATAGCTTGATCAGTGTTGTATGGAGAAGAGTTAGA GTTAGATGGGTT画3，
R13:5，-TTAGAGTTAGATGGGTTAGCAAACAAGTTAGCATCATGACCAGAGTA ACTACTCCAAGA-3'
R14:5，-GAGTAACTACTCCAAGAACCAGCGTAATCGTAAGCCATAAGGTTAAC GTAATCAAGAACTTGACCAA-3 ，
其中正向引物为F,-F",反向引物为RrR"。引物F,与F2， F2与Fs， F3与F4, F4与F" F5与F6， F6与F ， F"7与Fg， F^F9， F^F10， Fw与Fu， Fn与F^， F12 与Fu， Fu与F"以及引物R,与R2， R2与R3， R3与R4， R4与R5, Rs与R6， Re与R7， R7与Rs, Rg与R9， R9与Rh)， Rh)与Rh， Ru与Ru， R^与Ri3， 1113与1114之间分别存 在长度为17-20nt的相同序列片段。
将上述引物混合，各条引物的浓度为lOpM，然后进行PCR反应扩增编码 内切几丁质酶的基因序列。
PCR反应体系为(25pl): 10xPCR Buffer 2.5fil， MgCl2 1.5^1， dNTP 1^1， DNA 2pl， Taq酶0.25pl，引物混合物2nl，双蒸水14.75^1。
反应参数为94。C5min， (94。C45s， 55。C45s， 72°C lmin)共30个循环，最后 在72'C延伸10min，琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，回收产物送上海生工生物 工程有限公司测序，所得序列如SEQIDNO.l所示，经DNA序列比对分析，该 序列测序结果与预期序列结果一致。由SEQ ID NO.l编码的重组内切几丁质酶 的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。实施例2.重组巴斯德毕赤酵母表达载体的构建
用i^o及I和ATod分别双酶切PCR扩增产物和原始表达质粒pPIC9K，琼脂 糖凝胶电泳回收目的条带，用T4DNA连接酶连接回收的目的条带，得到真核表 达载体pSECH，用CaCb法42-C热激90秒将其转化到大肠杆菌DH5a。利用 Kana抗性筛选单菌落。所选转化克隆酶切鉴定和DNA测序测定证明克隆正确 后送上海生物工程有限公司测序，具体操作流程见图l。 实施例3.重组巴斯德毕赤酵母的转化和筛选
将鉴定正确的重组表达载体pSECH质粒DNA经内切酶Xbal线性化处理， 电击转化毕赤酵母GS115。电击结束后，立即加入lml预冷的lmo1/1山梨醇， 3000rpm离心5min，菌体重悬于400pl预冷的lmo1/1山梨醇中，取200jil涂布 于MD平板(1.34%酵母氮碱，4xl(rV。生物素，2%葡萄糖，2%琼脂糖)上， 3(TC培养至菌落出现。随机挑取菌落点种到含不同浓度抗生素G418 (0， 0.25mg/ml， 0.50mg/ml， 0.75mg/ml,1.00mg/ml，1.50mg/ml， 1.75mg/ml， 2.00mg/ml， 3.00mg/ml， 4.00mg/ml)的YPD平板上，30。C培养2 5d， 每天 检查菌落生长情况。根据生长情况快速筛选出G418抗性较高的阳性克隆转化 子。测定酶活条件用1%胶态几丁质作为底物，pH二7缓冲液，37'C反应1小 时，加入3mL DNS，10(TC反应10min中止反应，迅速用冷水冷却，离心取上清 测定其OD540nm值。酶活定义pH=7缓冲液环境，37°C，每分钟催化胶态几 丁质生成lmg NAG(乙酰氨基葡萄糖)定义为一个酶活单位。根据该测定方法， 测得筛选的转化子产内切几丁质酶的酶活为837U/mL。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本 发明，而并非作为对本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述 实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。序列表
〈110〉浙江工商大学
〈120> —种重组内切几丁质酶基因序列及其重组载体
〈130>
〈160> 30
〈170〉 Patentln version 3.2
〈210〉 1
〈211〉 1185 〈212〉腿
〈213〉 木霉(Trichoderma)
〈400〉 1
gaattcgctagtggttacgctaacgctgtttactttactaactggggtatttacggtcgt60
aactttcaactgttgcttctgatattactcatgttatttactcttttatg120
aactttcaagctgatggtactgttgtttctggtgatgcttacgctgattaccaaaagcat180
tacgeitgatgattcttggaacgatgttggtaacaacgcttacggttgtgttaagcaactt240
tttaagttgaagaaggctaaccgtaacttgaaggttatgctttctattggtggttggact300
tggtctactaactttccatctgctgctagtactgatgctaaccgtaagaactttgctaag360
actgctattacttttatgaaggattggggttttgatggtattgatgttgattgggaatac420
ccagctgatgatactcaagctactaacatggttcttcttcttssggasattcgttctcaa柳cttgatgcttacgctgctcaatacgctccaggttaccattttcttctttc tattgctgct540
ccagctggtcC3g3aC3tt3ctcttttcttcatatgtctgatcttggtca agttcttgat600
tacgttaacctt3tggCtt3cgattacgctggttcttggsgtagttactc tggtcatgat660
gctaacttgtttgctaacccatctaactctaactcttctccatacaacac tgatcaagct720
attaaggattacattaagggtggtgttccagctagtaagattgttcttgg tatgccaatt780
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caatacgattctactgctcaagcttactacagttacgatccaagtagtaa ggaacttatt960
tcttttgatactccagctatg3tt3glC3Ct犯ggtttcttacctt肪gaa ccttggtctt1020
ggtggt3gt3tgttttgggaagcttctgctgataagactggttctgattc tttgattggt1080
actagtcatagagctcttggtagtcttgattctactcaaaacttgcttgg ttacccaaac1140
tctcaatacgataacattcgtagtggtcttaactaagcggccgca1185
<210〉 2 〈211〉 390 <212〉 PRT
〈213〉 木霉(Trichoderma) <400〉 2
Phe Ala Ser Gly Tyr Ala Asn Ala Val Tyr Phe Thr Asn Trp Gly lie
15 10 15
Tyr Gly Arg Asn Phe Gin Pro Gin Asn Leu Val Ala Ser Asp lie Thr
20 25 30
His Val lie Tyr Ser Phe Met Asn Phe Gin Ala Asp Gly Thr Val Val 35 40 45Ser Gly Asp Ala Tyr Ala Asp Tyr Gin Lys His Tyr Asp Asp Asp Ser
50
55
60
Trp Asn Asp Val Gly Asn Asn Ala Tyr Gly Cys Val Lys Gin Leu Phe
65
70
75
80
Lys Leu Lys Lys Ala Asn Arg Asn Leu Lys Val Met Leu Ser lie Gly
85
90
95
Gly Trp Thr Trp Ser Thr Asn Phe Pro Ser Ala Ala Ser Thr Asp Ala
100
105
110
Asn Arg Lys Asn Phe Ala Lys Thr Ala lie Thr Phe Met Lys Asp Trp
115
120
125
Gly Phe Asp Gly lie Asp Val Asp Trp Glu Tyr Pro Ala Asp Asp Thr
130
135
140
Gin Ala Thr Asn Met Val Leu Leu Leu Lys Glu lie Arg Ser Gin Leu
145
150
155
160
Asp Ala Tyr Ala Ala Gin Tyr Ala Pro Gly Tyr His Phe Leu Leu Ser
165
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lie Ala Ala Pro Ala Gly Pro Glu His Tyr Ser Phe Leu His Met Ser
180
185
190
Asp Leu Gly Gin Val Leu Asp Tyr Val Asn Leu Met Ala Tyr Asp Tyr
195
200
205
Ala Gly Ser Trp Ser Ser Tyr Ser Gly His Asp Ala Asn Leu Phe Ala
210
215
220
Asn Pro Ser Asn Ser Asn Ser Ser Pro Tyr Asn Thr Asp Gin Ala lie<formula>formula see original document page 13</formula>〈211〉 57 <212> DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 3
gaattcgcta gtggttacgc taacgctgtt tactttacta actggggtat ttacggt 57
<210> 4
〈211> 59 <212〉腿 <213>人工序列
<400〉 4
actggggtat ttacggtcgt aactttcaac cacaaaacct tgttgcttct gatattact 59
<210> 5
<211> 61
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<400〉 5
tgttgcttct gatattactc atgttattta ctcttttatg aactttcaag ctgatggtac 60 t 61〈210> 6
<211〉 59
〈212〉 ■ 〈213>人工序列
〈400〉 6
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〈210〉 7
〈211> 59
〈212〉 DNA 〈213>人工序列
〈400〉 7
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<210> 8
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〈212〉 腿 <213>人工序列
〈400〉 8
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15<210> 9
<211> 59 〈212>腿 〈213>人工序列
〈400〉 9
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<210> 10
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〈212〉 ■ 〈213>人工序列
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gttggacttg gtctactaac tttccatctg ctgctagtac tgatgctaac cgtaagaac 59
〈210〉 11
<211〉 59 <212>腿 <213>人工序列
〈400〉 11
atgctaaccg taagaacttt gctaagactg ctattacttt tatgaaggat tggggtttt 59<formula>formula see original document page 17</formula>〈210〉 15
<211> 59
〈212〉 ■ 〈213>人工序列
〈400〉 15
acgctccagg ttaccatttt cttctttcta ttgctgctcc agctggtcca gaacattac 59
〈210〉 16
<211> 59
〈212〉 腿 〈213>人工序列
<400> 16
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〈210〉 17
<211> 48
<212〉 腿 〈213〉人工序列
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〈212> DNA <213>人工序列
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<210> 19
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<212〉 DNA 〈213〉人工序列
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<210> 20
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<212> 腿 〈213〉人工序列
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gaatcagaac cagtcttatc agcagaagct tcccaaaaca tactaccacc aagaccaag 59〈210〉 21
〈211> 59
〈212〉 DNA <213〉人工序列
〈400> 21
ctaccaccaa gaccaaggtt cttaaggtaa gaaaccttag tgttaatcat agctggagt 59
<210> 22
<211> 59 <212>纖 〈213>人工序列
<400> 22
ttaatcatag ctggagtatc aaaagaaata agttccttac tacttggatc gtaactgta 59
<210> 23
〈211> 59
〈212〉 ■ <213>人工序列
<400> 23
cttggatcgt aactgtagta agcttgagca gtagaatcgt attgaacagt agcaccagc 59〈210〉 24
<211〉 59 〈212〉腿 〈213〉人工序列
〈400〉 24
tgaacagtag caccagcctt tggaagaacc ttgtaatccc aaataccgtt ttcccaact 59
〈210〉 25
〈211> 59
<212〉 DNA <213>人工序列
<400〉 25
ataccgtttt cccaactacc agaaccaata ccactgtaag tttgaccaat accaccagt 59
〈210〉 26
<211> 59 <212〉腿 〈213>人工序列
〈400〉 26
tgaccaatac caccagtact ttcaaaagaa cgaccgtaaa ttggcatacc aagaacaat 59〈210〉 27
〈211〉 59
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
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ggcataccaa gaacaatctt actagctgga acaccaccct taatgtaatc cttaatagc 59
<210> 28
<211> 59
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400> 28
atgtaatcct taatagcttg atcagtgttg tatggagaag agttagagtt agatgggtt 59
<210> 29
<211> 59 〈212〉腿 〈213〉人工序列
〈400〉 29
ttagagttag atgggttagc aaacaagtta gcatcatgac cagagtaact actccaaga 59<210> 30
〈211〉 67
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
<■> 30
gagtaactac tccaagaacc agcgtaatcg taagccat33 ggttaacgta atcaag肪ct 60 tgaccaa 6权利要求
1.一种重组内切几丁质酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2. —种含有权利要求1中所述重组内切几丁质酶基因的重组载体，其特征在于， 在质粒pSECH中包含有SEQIDNO.l核苷酸序列。
3. 一种由权利要求2所述重组载体转化的巴斯德毕赤酵母宿主。
全文摘要
本发明提供了一种基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列和含有该重组基因的重组载体。本发明采用现代生物技术，利用PCR合成了基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列，将该基因序列克隆至载体pPIC9K中，得到真核表达载体pSECH。通过电击法转化巴斯德毕赤酵母GS115，根据生长情况快速筛选抗性较高的阳性克隆转化子，可实现高效廉价内切几丁质酶的产业化生产，具有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/56GK101307319SQ200810061979
公开日2008年11月19日 申请日期2008年6月6日 优先权日2008年6月6日
发明者平 于, 励建荣, 唐云平 申请人:浙江工商大学