专利名称：修饰淀粉生物合成酶的基因表达从而在谷物中产生淀粉的制作方法
技术领域：
本发明属于植物分子生物学领域。更为具体地，本发明涉及改变淀粉生物合成的基因表达，从而在植物和种子中生产淀粉。
背景技术：
淀粉是两种多糖，直链淀粉与支链淀粉的混合物。直链淀粉是多达数千个由α-1,4糖苷键连接而成的α-D-吡喃型葡萄糖单位的未分支分子链。支链淀粉是由多达50,000个α-D-吡喃型葡萄糖残基通过α-1,4和α-1,6糖苷键连接而成的高度分支的分子。大约5％支链淀粉的糖苷键为α-1,6糖苷键，因而导致该聚合物的分支结构。
直链淀粉与支链淀粉形成颗粒结构而贮存于质体中。大多数植物产生的淀粉颗粒有15-30％的直链淀粉和70-85％的支链淀粉。直链淀粉与支链淀粉的比例以及支链淀粉的分支程度影响淀粉的物理及功能特性。功能特性，如凝胶化淀粉的粘度和稳定性决定了淀粉在食品及工业应用中的有用性及因此造成的价值。在需要特定功能特性的情况下，以多种作物如玉米、水稻、土豆或小麦中获得的淀粉也许达到功能性要求。如果淀粉达不到所需的功能特性，如在高温及酸性条件下稳定的粘度的要求，通常通过化学修饰这些淀粉来达到此功能特性。多种类型及程度的化学修饰用于淀粉工业中，并且化学修饰淀粉的标记与使用必需满足政府规定。
在含有淀粉的植物器官内，直链淀粉与支链淀粉的比例以及支链淀粉的分支程度受遗传控制。例如，隐性waxy(wx)突变纯合的玉米植株缺乏结合颗粒的淀粉合酶且产生几乎100％的支链淀粉。报导隐性直链淀粉延伸子(ae)突变及未经特征分析修饰基因纯合的玉米植株可产生大约80％到90％直链淀粉的淀粉颗粒(见美国专利No.5,300,145)。玉米的dull突变子缺乏与waxy品系所缺不同的淀粉合酶并且具有这样的淀粉，其特征在于与正常淀粉比较有更多的直链淀粉以及支链淀粉分子上具有更大比例较短的分支。
大多数谷物作物用作商品，并且这些作物在工业及动物饲料上的许多需求可通过广泛种植且大量生产常见的多个品种而得到满足。然而，目前存在一个逐渐增长的市场，其要求作物具有特定的终端-使用(end-use)特性，而标准组成的谷物往往得不到这些特性。最为常见的是，特质玉米(speciality corn)与“正常”玉米区别在于改变的胚乳特性，如与柔软(waxy)或高直链淀粉玉米中-样直链淀粉与支链淀粉比例的整体变化，如甜玉米中增加的糖分积累，以及如食物级玉米或爆花玉米中胚乳硬度的改变(Glover,D.V.与E.T.Mertz(1987))玉米谷物的营养质量；遗传及农艺学改进，R.A.Olson与K.J.Frey,编。美国农学会，Madison Wisconsin,183-336页；Rooney,L.W.和S.O.Serna-Saldivar(1987)完整玉米及干磨部分的食物用途，玉米化学与技术，S.A.Watson与P.E.Ramstead，编，美国谷物化学家学会有限公司，St.Paul,Minnesota,399-429页)。本发明给特质谷物购买者提供具有不同于柔软淀粉特性的淀粉来源并给农民提供种植较正常或柔软玉米具有更高附加值作物的机会。
纯化淀粉通过研磨过程而从植物中获得。玉米淀粉是通过湿磨方法(Wet milling process)从谷粒中提取的。湿磨是多步骤方法，包括浸泡和研磨谷粒并分离淀粉、蛋白、油和纤维部分，玉米湿磨方法综述列于S.R.Eckhoft(1992)的第四届玉米利用大会论文集，6月24-26日，St.Louis,MO.,由国家玉米种植者协会、CIBA-GEIGY种子处与美国农业部印刷，小麦也是纯化淀粉的重要来源。小麦淀粉的制备由J.W.Knight与R.M(1984)Olson在淀粉化学与技术，第2版，学术出版社，(Whisler等编)中综述过。
淀粉用于多种食品及工业应用中并且是人类饮食中碳水化合物的重要来源。通常，将淀粉与水混合并煮成增稠的凝胶。该方法称为凝胶化。淀粉三个重要的特性是凝胶化出现的温度、凝胶达到的粘度、及凝胶粘度随时间推移的稳定性。未修饰淀粉在加热与煮制过程中的物理特性限制其在许多应用中的有用性。结果，需要相当多的努力与代价来化学修饰淀粉从而克服淀粉的这些局限和扩展淀粉在工业应用中的有用性。
未修饰淀粉的一些局限性及修饰淀粉的特性列于修饰的淀粉特性与用途，O.B.Wurzburg，编，(1986)CRC出版公司，Boca Raton,FL中，未修饰淀粉在食品产品中具有很有限的使用因为谷粒容易膨胀与破裂，因此形成脆弱形体的不理想的凝胶。化学修饰用于稳定淀粉颗粒，因而使淀粉适于数千种食品及工业应用包括婴儿食品，粉状咖啡奶由分离器(powdered coffee creamer)、手术去尘粉、纸张及棉纱上浆及胶粘剂。常见的化学修饰包括交联，其中引入化学键用于稳定淀粉分子间的桥梁，和替代，其中将羟乙基、羟丙基或乙基导入淀粉分子中。
在美国，化学修饰淀粉的使用受食品与药品管理局(FDA)管制。“修饰的食物淀粉类”淀粉可用于食物中但必需满足特定的处理限制，且“修饰的工业淀粉类淀粉可于下列项目中使用，如与食品接触的容器并且同时必需满足特定的规定要求；联邦法典，第21目(Title)，第1章，第172部分，允许人类消耗食品中的食品添加剂，第172、892部分，淀粉修饰的食品，美国政府出版社，华盛顿特区1981；(a)第178部分，间接食品添加剂，178.3520部分，工业用修饰淀粉。这些规定通过限定可加入到修饰步骤中化学试剂的最大量而限制化学修饰的程度。由于该修饰方法而得到的淀粉中副产品水平也被规定。例如，羟丙基淀粉中丙烯氯代(丙二)醇残基受到特别关注(Tuschhoff,J.V.(1986)羟丙基化淀粉，修饰的淀粉特性与用途，O.B.Wurzburg编，CRC出版社，Boca Raton,FL,55-57页)。
除了用作纯化成分外，淀粉是完全面粉如小麦面粉的重要组分，这些淀粉用于面包、烤制食品及食用面糊的制备中。淀粉包括50％到70％麦粒的重量，并且其在小麦面粉特性中的重要性在本领域中是众所周知的。尽管小麦复杂的遗传学限制了可在完全面粉中得到的淀粉精细结构的变化，但是在小麦或其它面粉中产生新的淀粉结构可导致这些完全面粉在食品产品应用中改进的特性。淀粉结构也是完整消耗谷物如水稻的质量的重要组成部分。支链淀粉精细结构的差异与煮熟水稻的质地有关(Reddy等，(1993)碳水化合物，聚合物22:267-275)。
已知淀粉分支或聚合化程度的差异导致淀粉理化特性的变化。现已表明可通过改变支链分子支链的分布、直链淀粉对支链淀粉的相对比例或直链淀粉的聚合化程度而产生定制用于特定应用中的淀粉。有些作者(Shi与Seib(1992)碳水化合物研究227:131-145；Jane等，(1999)谷物化学，待发表)报导在其支链淀粉中含有增加比例的很短分子链(DP 6-9)的不同植物来源的淀粉中增稠的趋势下降。但是如何在玉米中达到此目的还未见报导。然而，完成淀粉组成的表型改变具有很多问题；尽管淀粉生物合成中的关键酶已被鉴定，但其确切作用尚不确定。因此，将特定的酶与淀粉结构的特定分子特征进行相关，进而与食品及工业产品中淀粉的功能进行相关是困难的。虽然理想淀粉所需的理想的功能特性可以设想出来，但是什么淀粉分子结构应当达到此目的理解很有限、同样对特定的淀粉生物合成酶如何特异性地影响这些参数也知之甚少。例如，单个酶在决定分支方式及分支长度中的作用尚不清楚，并且由于缺乏如何分支酶和淀粉合酶相互作用的知识而变得更为复杂。此外，虽然由waxy基因编码的谷粒-结合淀粉合酶的作用已得到很好理解；见Denyer等，(1996)植物杂志，10:1135-1143)，但是可溶性或谷粒结合的其它淀粉合酶的数目及确切功能还不十分清楚(Smith等，(1996)植物生理及分子生物学年鉴48:67-87)。
WO 94/09144讨论了在升高的温度下具有提高的合成淀粉能力的玉米植株的制备。此公开提出在升高温度下谷粒饱满(grain filling)的限制因素是某些淀粉生物合成酶，尤其是淀粉合酶(SS)与淀粉分支酶(SBE)的易变性。导入编码对于活性而言具有更高最佳温度或对加热具有更高耐性的酶的基因至植物中可得到增加量的贮存于谷粒中的淀粉。此外，声称由于导入了其表达可改变不同淀粉生物合成酶平衡的供体基因，此策略可用于产生具有改变精细结构的淀粉。推荐的供体基因包括这样的基因，它们编码相对于内源性酶显示改进的动力学或别构特性的酶或者是补偿由于热变性所致酶活性丧失的内源性基因的额外拷贝。作为改变淀粉结构的方法，WO 94/09144同时推荐了用有义及反义基因改变受体植株中不同淀粉合酶及分支酶的天然比例。此公开公开了温度对催化活性及某些淀粉生物合成酶稳定性的影响。然而，还没有发表的数据用于证实该提议的分子策略。的确，虽然此公开建议用改变的淀粉合酶的表达改变淀粉精细结构，即直链淀粉/支链淀粉的比例和支链淀粉分支的程度，其它或前或后的公开建议是淀粉分支酶，而不仅是淀粉合酶是必需的，或还有其它因素必需阐述。例如，Smith等(1995，植物生理学.107:673-677)建议两种不同的有关测定支链淀粉分支方式的观点首先，该方式代表分支酶与去分支酶活性间的平衡，并且其次，该方式可主要由分支酶特性进行解释。还没有提供任何淀粉合酶的作用。Guan和Preiss(1993，植物生理。102:1269-1271)提出多种形式分支酶与淀粉合酶之间相互作用的研究对于理解单个同工酶的特异性与功能以及支链淀粉生物合成机理的理解可能是至关重要的。因此，Guan和Preiss暗示同时改变这两种酶的必要性。近年来，Van den Koornhuyse等。(1996，生物学化学杂志271:16281-16287)提出低核苷酸糖浓度直接或间接负责贮存过程中观察到的淀粉组成或结构的主要差异。总之，从这些不同的观点，很明显有关确切地什么因素影响淀粉结构且因而如何改变之还未达成一致。此外，没有文献(workers)包括WO 94/09144列出这样的证据，即证明可溶性淀粉合酶限制了聚合的速率并且因此增加或降低其水平将实际上改变淀粉的精细结构。WO 94/09144进而没有教授如何区分编码对淀粉生物合成产生最少贡献同工酶与更活性形式的基因。降低相对不活动酶的表达方式(在酶水平，不一定在转录水平)不可能具有效应，总之，WO 94/09144提出了建议但没有对技术人员讲授足够的细节从而在实践中制备精细结构改变了的淀粉。
有数个有关通过改变土豆(Virgin等。(1994年6月)于第4届国际植物分子生物学大会，和Christensen等和Kossman等，(1994年7月)于植物多糖座谈会)和玉米(Broglie等，WO 97/22703)中SBE表达而改变淀粉结构的报导。这些工作中没有一个描述了改变淀粉合酶表达的可能性。虽然数位作者猜测改变非谷粒结合淀粉合酶Ⅰ(non-GBSSⅠ)合酶的表达将会改变淀粉结构或组成的可能性，但这还没有在谷物中得到清晰证明(Block等，WO 9745545A；Frohberg和Kossmamann,WO 9744472,Frohberg和Kossmann,WO9726362)。
虽然酶促步骤是已知的，但淀粉生物合成的分子细节还没有彻底明白。还不清楚是否不同的SS同工酶在整个淀粉生物合成中贡献相同或者是否每种同工酶在专一途径的各自步骤中的装配支链分子中具有不同的作用。在考虑到淀粉分支酶与在葡聚糖链延伸中发挥作用的多种淀粉合酶之间的可能相互作用时，依据每种酶的催化特性而对淀粉结构作准确的预测是可能的。
除了GBSSⅠ在直链淀粉生物合成中的明显作用外，单个淀粉合酶的确切作用还不清楚。来自一些但不是所有种类的证据表明SS的单个同工酶在质量上对分支淀粉的生物合成贡献不同并且GBSSⅠ也可对支链淀粉及直链淀粉的生物合成起作用(Smith等，(1986)植物生理及分子生物学年鉴，48:67-87)。虽然众多的淀粉合酶已从不同的品种中克隆出，但Edwards等(1960，植物生理112:89-97)与Mu-Forster等(1996，植物生理111:821-829)证明除了waxy蛋白，GBSSⅠ以外，以前造成的结合谷粒与可溶性淀粉之间的差异可能不反映体内情况并且将不在这里使用。自从其最初从玉米中分离出来后(klsgen等，(1986)分子遗传遗传学203:237-244)，该基因已从许多品种中得到克隆。虽然许多其它SS已从多个品种中克隆出来，但是与GBSSⅠ相比，它们似乎在种间较少密切相关。土豆含有至少两种其它淀粉合酶，SSⅡ和SSⅢ(Marshall等，(1996)植物细胞8:1121-1135)。豌豆含有称为SSⅡ的合酶，其似乎以两种形式存在，一种来源于对另一种形式的加工(Edwards等，(1995)植物生理112:89-97)。Block等，(WO 9745545A)从小麦中分离出两个淀粉合酶cDNA克隆。三种形式的可溶性淀粉合酶从水稻中得到纯化。显示这些形式是来自通过分离相应的称为可溶性淀粉合酶Ⅰ(SSSⅠ)基因的主要形式(Baba等，(1993)植物生理103:565-573；Tanaka等，(1995)植物生理108:677-683)。与豌豆及土豆淀粉合酶Ⅱ序列显示出同源性的水稻表达序列标鉴(ESTs)已被鉴定出(AA 752475、AA 753266、AA 751702、AA 751557、AA 751512A,Nahm,B.H等)。一种与水稻SSⅠ相关的序列从玉米中得到分离(Harn等，(1995)植物生理108:S-50；Keeling等，WO 9720936)并命名为玉米SSⅠ。两个其它淀粉合酶cDNA克隆已由Keeling等分离(WO9720936)。编码这些淀粉合酶基因的表达已被研究并且其在玉米基因组中的表现度已有报导(Harn等(1998)植物分子生物学37:639-649)。Frogberg与Kossmann(WO 97/44472与WO 97/26362)也报导了这些玉米淀粉合酶基因序列中其中两个序列的分离。最近显示玉米中dull突变的座位编码另一种淀粉合酶(Gao等(1998)植物细胞10:399-412)。在一项对玉米胚乳中可溶性淀粉合酶活性进行特征分析的研究中，Gao等(1999，植物生理学120:205-215)报导DU1和SSSⅠ有可能解释发育胚乳中所有的可溶性淀粉合酶活性。单细胞生物也含有多种淀粉合酶(Fontaine等，(1993)生物学化学杂志268:16223-16230；Buleon等，(1997)植物生理学115:949-957)。尽管对于这些酶中的一部分酶作者已猜测其特定的作用，但是还没有阐明这些淀粉合酶同工酶的全部成员(full complement)如何一起工作从而延长支链淀粉分支或在一特定种类中整套生物合成酶如何相互作用和一起发挥作用从而产生在成熟种子或块茎中所观察到的淀粉结构。特别地，胚乳中低丰度淀粉合酶的作用还不清楚。
众所周知玉米中的waxy突变导致功能性GBSSⅠ酶的缺乏及改变的淀粉组成。类似地在小麦中，筛选出缺乏GBSS的低直链淀粉变种。通过在转基因土豆植株中表达GBSSⅠ反义基因已制备出土豆中显性形式的类似突变(Visser等，(1989)植物分子生物学17:691-699)。Shewmaker等(1994，植物生理学104:1159-1166)报导通过在块茎中表达大肠杆菌萄聚糖合酶而导致土豆改变的淀粉结构。同时在土豆中也报导了非GBSSⅠ淀粉合酶改变的表达。转基因土豆块茎中SSⅡ表达的下降用反义技术完成。降低的SSⅡ蛋白水平不与任何检测到的淀粉含量或组成变化相关并且淀粉颗粒形态学表现正常(Edwards等，(1995)植物杂志8:283-294)。最近，报导了在SSⅡ反义土豆植株中支链淀粉分支链分布的微小变化(dp 6-35)。当土豆块茎主要的可溶性淀粉合酶活性，SSⅢ受反义方法抑制时观察到不同的结果。在这些转基因植株中，淀粉含量与组成没有变化，然而，淀粉颗粒形态学受到显著影响(Marshall等，(1996)植物细胞8:1121-1135)。也观察到支链淀粉支链分布的变化，但这些变化与SSⅡ反义植株中见到的变化不同(Edwards等(1999)植物杂志17:251-261)。发现一种豌豆突变子，rug5缺乏与土豆SSⅡ高度同源的淀粉合酶同工酶。虽然两种淀粉合酶具有氨基酸序列同源性，但当此淀粉合酶同工酶在豌豆中受到抑制时产生不同的结果。明显的变化位于短(dp＜15)，中等(dp15-45)和很长(dp-1000)支链淀粉支链中。此外，这些结构改变与淀粉颗粒形态学中的粗略变化有关。因此，虽然来自土豆的转基因结果表明在一特定的器官内，淀粉合酶的不同同工酶在淀粉生物合成中执行不同的功能，获自豌豆rug5突变子的结果表明同源的同工酶在不同的淀粉贮存器官中不一定执行相同的功能。由于不同器官内代表性同工酶数目的差异以及由不同同工酶贡献的相对活性量的差异，使得总结特定同工酶的作用以及预测伴随表达改变的淀粉表型改变变得困难。虽然在土豆中已报导旨在改变淀粉合酶表达的转基因工作，但在玉米中还没有描述过类似的实验。
US 5824790指导了从玉米中分离3个non-waxy淀粉合酶cDNA克隆及其序列。其中提出了用这些序列产生这样的构建体，即被设计用于改变这些淀粉合酶在转基因植物中的表达。其进一步提出此改变的蛋白表达可导致淀粉精细结构的改变。尽管提供了三种淀粉合酶的核苷酸及蛋白序列，但还没有给出涉及带有源自这些序列DNA转基因植物概括与特征分析的数据；类似地也没有报导转基因植物中有关淀粉组成与结构的数据。在缺乏谷物胚乳中不同可溶性淀粉合酶同工酶具体作用以及这里论及的胚乳中SSⅡa和SSⅡb类酶活性存在的情况下，(Gao等(1999)植物生理学120:205-215)，很明显仅仅基因序列没有提供何种类型的淀粉结构变化(如果有的话)可通过改变特定可溶性淀粉合酶基因的表达而完成。且在缺乏此预测能力或淀粉实际产量的前提下，任何络定改变的用途都不清楚。实际上，就特定的功能特性如退化(retrogradation)趋势而言，很明显有些淀粉结构的改变实际上对用途是有害的。Qiange与Thompson(1998，碳水化合物研究314:221-235)测定了与正常柔软(waxy)淀粉相比三种玉米双突变子，duwx、aewx和su2wx的退化效应并且显示出在这三种支链淀粉类型中的两种中具有增稠性增加的趋势。因此，很显然单一改变不足以改进谷物淀粉的用途，并且有些改变可能是改进效应而另外的改变是中性或甚至是有害的。在缺乏有意义地预测可通过给定遗传修饰而产生的结构改变的能力的情况下，鉴定有用变化的唯一方式是实际制备修改的淀粉。
从谷物作物淀粉中产生具有改变精细结构的分子遗传学方法较传统的植物育种方法具有决定性的优势。淀粉精细结构的改变可通过反义抑制或共抑制而特异性抑制SS或SSE同工酶中一种或更多种形式的表达可产生淀粉精细结构的改变(WO 94/09144)。反义或共抑制构建体将用作基因活性的显性负调节子。尽管传统的突变可产生基因活性的负调节效应，但这些效应很有可能是隐性的。用转基因方法可得到的显性负调节可比一些谷物生产方法更为优越。此外，通过用特定的启动子将改变淀粉表型的表达限定于植物的生殖组织的能力可以赋予较传统突变更多优势因为这将在突变基因通常表达的所有基因中发挥作用。最后，来自染色体位置效应的各种水平的反义抑制或共抑制可能较来自谷物胚乳突变等位基因剂量效应的反义抑制或共抑制产生更广泛的淀粉表型。
对不同淀粉合酶在谷物作物中作用的不完全了解使得通过抑制淀粉合酶基因表达而控制淀粉精细结构的尝试变得困难。然而，通过共抑制及反义技术控制淀粉合酶基因的表达是可能的并且将有可能产生所需的类型。因此，本领域中的普通技术人员仅须从多个转基因植物中筛选淀粉精细结构中所需的改变。
发明概述本发明公开了用cDNA克隆构建嵌合基因与反义基因用于改变玉米谷粒或胚乳中以及其它作物的谷粒或胚乳中淀粉合酶的酶促活性。更为具体地，本发明涉及制备转化谷物作物的方法，其中的谷物作物谷粒淀粉精细结构与未转化谷物作物淀粉的精细结构相比有所改变(1)制备包括编码non-GBSSⅠ淀粉合酶结构基因或其片段核酸片段的嵌合基因，其中的结构基因或其片段上游一侧以有义或反义的方向可操作地连接到编码指导玉米胚乳组织中基因表达启动子的核酸片段上，并且下游一侧可操作地连接到编码用于转录终止的适当调节序列的核酸片段上；和(2)用所述的嵌合基因转化谷物作物，与源自不具有所述嵌合基因谷物作物的淀粉精细结构相比，其中所述的嵌合基因的表达导致源自所述转化谷物作物谷粒的淀粉精细结构的改变。本发明也涉及制备转化谷物作物的方法，其中的源自谷物作物谷粒的淀粉精细结构与源自不具有上述嵌合基因的谷物作物淀粉相比，在直链淀粉对支链淀粉的比例上具有变化，或者与不具有上述嵌合基因谷物作物的淀粉中直链淀粉聚合化程度相比，转化谷物作物淀粉中直链淀粉成分的聚合化程序具有变化。到目前为止，还没有报导证明通过改变转基因植物中non-GBSSⅠ淀粉合酶表达水平而产生淀粉分子结构的改变。本发明描述了可通过控制non-GBSSⅠ淀粉合酶在转基因植物中的表达而产生的淀粉结构的特定变化、直链淀粉对支链淀粉比例的改变、支链淀粉精细结构的改变、很短支链淀粉链(DP 6-9)增加的丰度、和直链淀粉聚合化程度的改变。
本发明也涉及用上述方法通过转化而制备的谷物作物变种、从用上述方法制备的谷物作物谷粒中分离淀粉和制备增稠食料的方法，该食料包括混合食料、水、和有效量从用该方法制备谷物作物变种谷粒中分离出的淀粉，以及必要时煮制得到的组合物从而制备增稠的食料。
本发明也涉及用上述方法通过转化而制备的谷物作物变种，从所述谷物作物变种的谷粒中制备的面粉以及通过混合水、食物成分、和有效量的来自用该方法制备谷物作物变种的谷粒中的面粉进行面包、烤制商品和食用面糊的制备以及必要时煮制得到的组合物从而生产面包、烤制商品或食用面糊产品。
附图简述及序列描述从下面的详述和伴随的附图及形成该申请一部分的序列描述，本发明可得到更为充分的理解。
图1列出质粒pSS43的限制性图谱。
图2列出质粒pSS64-C5的限制性图谱。
图3列出质粒pSS65-C11的限制性图谱。
图4列出质粒pSPB40的限制性图谱。
图5列出质粒pSPB47的限制性图谱。
图6列出了来自玉米植株R1谷粒改变的分离子(segregant)944-1与正常的分离子944-7去分支淀粉的分子量分布。
图7列出了来自品系S064.1.2.1单个谷粒改变的分离子XGB01717-2与正常分离子XGB01717-9去分支淀粉的分子量分布。
图8列出了对于来自改变的分离谷粒淀粉与来自非改变分离谷粒淀粉DP7与DP30之间链长相对摩尔百分比的分布。
SEQ ID NO:1描述了BE62 PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2描述了BE61 PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3描述了SS7 PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4描述了SS8 PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5描述了SS1复合基因序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6描述了插入到pSS43中SS1 DNA序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7描述了MM50 PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8描述了BE56 PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9描述了MM62 PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10描述了MM60 PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11列出了插入到pSS64-C5中SSⅠ DNA序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12描述了插入到pSS65-c11中SS1 DNA序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13描述了SS9 PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14描述了SS10 PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15描述了pSPB37的SSb插入序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16描述了插入到pSPB40中的SSb DNA序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17描述了OSPB104 PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18描述了OSPB105 PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19描述了OSPB106 PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20描述了插入到pSPB47中SSb DNA序列的核苷酸序列。
序列描述含有单字母代码代表核苷酸序列特征且用三字母代码代表氨基酸，这与IUPAC-IUB中定义的标准(1985，核酸研究.13:3021-3030和1984，生物化学杂志219:345-373)(在此引用供参考)一致。
发明详述在本公开的上下文中将用到许多术语。如这里使用的，术语“淀粉”含有α-D-(1,4)葡聚糖并可含有不同比例α-D-(1,6)分支的多糖。如这里所使用的，术语“淀粉精细结构”指淀粉聚合物的分子结构、该聚合物中α-D-(1,6)键的存在、丰度与分布及分支与未分支α-D-(1,4)葡聚糖的存在、分布与长度。通过支链淀粉分支链分布、直链淀粉对支链淀粉的相对比例、直链淀粉的聚合程度来描述淀粉精细结构。这些结构分子中任何的改变导致改变的淀粉精细结构。这些参数中的一个、两个或所有三个可彼此独立地变化。术语“聚合化程度”指α-D-吡喃型葡萄糖单位在一个分子或分子指定部分如支链淀粉分支链中的数目。如这里所使用的，术语“分支链分布”指经异淀粉酶消化支链淀粉后通过大小排阻层析而分极分离释放的分支链后而检测到的α-1,4-连接二葡聚糖链的分布。
如这里所使用的“谷物作物”意为产生含有适用于食用或工业应用淀粉种子的植物，如玉米(corn)、水稻、高梁、小麦与大麦。如这里所使用的，“分离的核酸片段”是指视需要而定可以含有合成、非天然或改变核苷酸碱基的单链、或双链RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由一种或更多种cDNA片段、基因组DNA、或合成DNA所组成。
如这里所使用的，“基本上类似”指其中的一个或更多个核苷酸碱基的变化导致一个或更多个氨基酸的替代，但不影响由该DNA序列所编码蛋白功能特性的变化。“基本上类似”也指这样的核酸片段，该片段中一个或更多个核苷酸碱基的改变不影响该核酸片段介导通过反义或共抑制技术而改变基因表达的能力。“基本上类似”也指对本发明核酸片段进行下面的修饰，如缺失或插入一个或更多个核苷酸碱基，该修饰不影响得到的等价转录物通过反义或共抑制技术而介导基因表达改变能力的功能特性或得到蛋白分子的功能特性的改变。因此应当明白本发明包括不仅仅是具体的实例序列。例如，本领域中众所周知用代表少于整个基因编码区的核酸片段和用与待抑制基因不是100％同源的核酸片段可达到对基因表达的反义抑制及共抑制(美国专利No.5,107,065)。此外，在本领域中众所周知基因中这样的改变，即此改变导致在给定位点产生化学上相当的氨基酸，但是不影响该编码蛋白的功能特性。因此，氨基酸丙氨酸，一种疏水性氨基酸的密码子可由编码另一种较少疏水性的残基，如甘氨酸的密码子所替代。同样，丙氨酸的密码子可由编码更为疏水性残基，如缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸的密码子所代替。类似地，也可预期这些变化，即其导致一种带负电荷的残基为另一种带负电荷残基所替代，如天冬氨酸为谷氨酸所替代，或一种带正电的残基为另一种带正电荷的残基所替代，如赖氨酸为精氨酸所替代，从而产生功能上相当的产物。导致蛋白分子N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化预将不会改变蛋白的活性。每种提出的修饰位于本领域中常规的技术范围内，也就是测定编码产物生物活性的维持。此外，熟练的技术人员认识到由本发明所包括的基本上类似的序列也由它们在严格条件下(0.1×SSC,0.1％SDS,65℃)与这里例举的序列杂交的能力所限定。本发明优选的基本上类似的核酸片段为其DNA序列与这里报导的核酸片段的DNA序列有80％的一致性。更为优选的核酸片段与这里报导的核酸片段的DNA序列具有90％的一致性。最为优选是与这里报导的核酸片段的DNA序列具有95％一致性的核酸片段。这里使用的百分一致性可由Jotun-Hein算术(Hein,J.J.(1990)酶学方法.183:626-645)通过DNA STAR蛋白序列比较方法加以精确地测定。用于多重序列比较的Jotun-Hein方法缺省参数为GAP PENALTY=11,GAP LENGTH PENALTY=3；用于配对比数，KTUPLE6。
“密码子简并性”指允许核苷酸序列变异而不影响编码多肽氨基酸序列的遗传密码中的分散性。因此，本发明涉及编码SEQ ID NOs:5、11、12、15、16与20中列出的SS1或SSb蛋白的全部或部分氨基酸序列的任何核酸片段。技术人员应当注意到在使用核苷酸密码子定义给定氨基酸时由特定的宿主细胞所表现出的“密码子偏向”。因此，当合成一个用于在宿主细胞中更好表达的基因时，设计这样的基因从而使其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
“基因”指表达特定蛋白，包括编码序列之前(5′非编码序列)与之后(3′非编码序列)调节序列的核酸片段。“天然基因”指在自然界中发现的具有其自身调控序列的基因。“嵌合”基因指非天然基因的任何基因，包括的调节序列与编码序列没有在自然界中同时发现。因此一个嵌合基因可包括源自不同来源的调节序列与编码序列，或源自相同来源但以与自然界中发现的不同的方式排列的调节序列与编码序列。“内源基因”指生物基因组中自然位置中的天然基因。“外源”基因指通常未在该宿主生物中发现，但其通过基因转移导入到宿主生物中。外源基因可包括插入到非-天然生物中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化方法导入到基因组中的基因。
“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“起始密码子”与“终止密码子”指分别限定蛋白合成(mRNA翻译)起始与链终止的编码序列中三个相邻核苷酸的单位。“开放阅读框”指编码序列的翻译起始与终止密码子之间编码的氨基酸序列。“调节序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、序列内部或下游(3′非编码序列)并且影响相关的编码序列转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。
“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般地，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子序列由邻近的及更远处的上游元件所组成，后者常称为增强子。因此，“增强子”是这样的DNA序列，其可刺激启动子活性并且可以是启动子的内在元件或被插入而增强启动子水平或组织特异性的异质性元件。启动子可以是完全来自一个天然基因，或由自然界中发现的不同启动子中来源的不同元件所组成，或者甚至包括合成的DNA片段。本领域中的技术人员应当明白不同的启动子可指导基因在不同组织或细胞类型中表达，或指导基因在不同的发育时期、或应不同的环境条件而表达。导致基因在大多数细胞类型大多数时间表达的启动子通常称为“组成性”启动子。植物细胞中有用的各种新启动子常被发现；可在Okamuro与Goldberg,(1989)生物化学植物15:1-82中发现众多这样的实例。应当进一步认识到由于在大多数情况下调节序列的确切界线还未完全定义，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。
“翻译前导序列”指位于基因启动子与编码序列之间的DNA序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的完全加工过的mRNA中。翻译前导序列可影响初级转录本到mRNA的加工、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的实例描述于Turner,R.与Foster,G.D.(1995)分子生物技术3:225。
术语“3′非-编码序列”指位于编码序列下游的DNA序列并且包括能够影响mRNA加工或基因表达的多聚腺苷酸化识别序列和其它编码调控信号的序列。多聚腺苷酸化信号通常特征在于影响多聚腺苷酸片段至mRNA前体的3′末端，不同3′非编码序列的使用如Ingelbrecht等(1989)在植物细胞1:671-680中所述。
“RNA转录本”指来自RNA聚合酶-催化的对DNA序列转录的产物。当RNA转录本为该DNA序列的完全互补拷贝时，其称为初级转录本或其可以是源自对初级转录本进行转录后加工的RNA序列并被称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”指没有内含子且可由细胞翻译成蛋白的RNA。“cDNA”指来自mRNA并与之互补的双链DNA。“有义”DNA指包括mRNA并且可由细胞翻译成蛋白的RNA转录本。“反义RNA”指与目标初级转录本的全部或部分互补并且阻止靶基因表达的RNA转录本(美国专利No.5,107,065)。反义RNA的互补性可以是与特定基因转录本的任何部分互补，即与5′非编码序列，3′非编码序列、内含子或编码序列的互补。“功能性RNA”指不被翻译但对细胞过程具有影响的反义RNA、核糖酶RNA或其它RNA。
术语“可操作连接”指在单一的核酸片段上核酸序列的结合从而其中一个片段的功能受到另一个核酸片段的影响。例如，当其能够影响编码序列的表达(即，编码序列处于启动子的转录控制之下)时，则该启动子可操作地与编码序列相连。编码序列可操作地以有义或反义方向与调节序列相连。
这里使用的术语“表达”指转录和来自本发明核酸片段有义(mRNA)或反义RNA的稳定积累。表达也可指mRNA翻译成多肽。“反义抑制”指能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录本的产生“过度表达”指一种基因产物在转基因生物中的产量超过正常或未转化生物中的产量水平。“共抑制”指这样的植物中的现象，即通过该现象外源或内源基因通过导入足够同源的转基因而被沉默。基因失活的机理还未充分理解但可通过阻断转录或抑制mRNA积累而发生。例如，美国专利No.5,231,020描述了能够抑制一致或基本上类似外源或内源基因的有义RNA转录本的制备。
“改变的水平”指转基因生物中基因产物的产量在量或比例上与正常或未转化生物不同。
“转化”指将核酸片段导入宿主生物基因组中，从而导致遗传上稳定的遗传。含有转化核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物。植物转化方法的实例包括农杆菌介导的转化(De Blaere等，(1987)酶学方法143:277)和粒子-加速或“基因枪”转化技术(Klein等，(1987)自然(London)327:70-73；美国专利号4,945,050)。
这里使用的标准重组DNA与分子克隆技术在本领域中是众所周知的并且更为详细地描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F与Maniatis,T.的分子克隆实验指南；冷泉港实验室出版社冷泉港，1989(下文称为“Maniatis”)。
术语“糊化(pasting)”指淀粉颗粒或淀粉颗粒悬液不可逆的物理变化，其特征在于颗粒的膨胀与水化、悬液粘度的迅速增加以及悬液中溶胶的形成。此变化也称为煮制或凝胶化作用。简称“SNU”指搅拌数单位，大约等于10厘泊，其为粘度的测定。为了转换成SI单位(帕斯卡秒(pascal seconds)，将厘泊乘以1000，即1 PaSec=1000cp。因此，1 SNU=0.01 PaSec。术语“溶胶”指流体碰撞系统。术语“粘度”为流体内部摩擦力的指标，可认为是流体的粘度(consistency)或稠度(thickness)。
本发明涉及具有转基因谷粒植株的构建，其中编码涉及淀粉合成、特别是淀粉聚合物形式(淀粉合酶)的基因的表达被调节从而改变支链淀粉中分支链的分布、直链淀粉对支链淀粉的相对比例、或淀粉直链淀粉组分的聚合化程度。这种淀粉精细结构的变化导致从转基因谷物作物中分离的淀粉的物理特性的改变。淀粉精细结构的这种变化将产生具有在食品及工业应用中有利的特性的新型淀粉。
这些基因中优选的是编码单子叶植物淀粉合酶而不是GBSSⅠ的基因，其克隆如上文所述。当所需基因的核苷酸序列已知或另一种生物的同源基因序列已知时，这些基因可通过本领域技术人员常用的用于基因分离的技术加以分离。所需基因的序列信息可用于制备寡核苷酸探针从而用于从适当的基因文库中鉴定和分离完整的淀粉合酶基因。此文库可以是基因组文库，其中的编码序列可包含于单个DNA片段中或可包含于数个不同的DNA片段中。此外，编码淀粉合酶的两个或更多的外显子可为一个或更多个内含子所分隔。作为选择，该文库可以是cDNA文库，其中作为一个连续序列而分离出包括完整编码区的cDNA克隆的可能性更大。或者，用相应于所需基因一个或更多个部分的探针通过DNA-DNA杂交可鉴定出适当的克隆。作为选择，可制备寡核苷酸引物并用作PCR引物从而从基因组DNA，或从上述的基因组或cDNA文库中扩增并随后分离整个或部分的淀粉合酶编码区。
多个不同的分析可用于测定淀粉合酶活性。用评估放射性标记的ADP-葡萄糖(14C-葡萄糖)向醇不溶性聚合物中掺入的多种方法可测定其活性(Pollock与Priess(1980)Arch.Biochem.Biphys.204,578-588；Keeling等(1994)澳大利亚植物生理学杂志21:807-827；Fontaine等，1993，生物学化学杂志268:16223-16230)。Keeling等的方法是典型的方法。切取正在发育玉米谷粒的胚乳组织、冷冻干燥并于液氮中研磨。通过将100mg研磨的组织悬浮于2ml缓冲液(50mM Hepes,pH 7.5,5mM MgCl2,1mM DTT)并用机械匀浆器匀浆而制备提取物。以30,000xg离心匀浆物并分析上清中可溶性淀粉合酶活性。简言之，用25ml兔肝糖原(2mg)和100mL缓冲液(200mM Bicine,9mM EDTA,50mM KCl和20mM还原型谷胱甘肽，pH 8.3)在1.5mL管中分析可溶性淀粉合酶活性。加入50mL可溶性提取物并预温育2分钟。分析通过加入25mML 8.0mM的ADP-葡萄糖(14C,444dpm nmol-1)而开始并且在加入100mL 0.25MNaOH之前使其反应10分钟。通过加入1.0mL甲醇、于冰上冷却5分钟并且离心而沉淀葡聚糖。将葡聚糖重溶于0.1M的NaOH中并用甲醇再次沉淀。在加入闪烁鸡尾酒和在闪烁计数器中测定放射性之前通过加热而使沉淀物凝胶化。
为了改变玉米中淀粉的精细结构，构建这样的嵌合基因，其中编码淀粉合酶基因的表达在下列情况中处于适于该基因表达的调控元件的控制之下，包括1)在所需的植物组织中，2)在提供最大所需效应的发育时期，和3)在这样的基因表达水平，即该水平导致淀粉合酶功能的改变从而表达影响淀粉精细结构中可检测到的及显著的改变。外源基因在植物中的表达已很好地确立(Klein等(1987)自然(London)327:70-73，和De Blaere等(1987)酶学方法143:277-291)。有义或反义合酶基因在玉米中适当水平的表达需要用不同的嵌合基因并利用不同的调节元件。此外，通过共抑制或反义抑制而对内源淀粉合酶基因表达的有效调节可能需要构建包括淀粉合酶有义或反义序列不同区域的嵌合基因。共抑制和反义技术的众所周知的可变性表明甚至用不同的遗传构建体，为了鉴定出具有所需表型的那些植株，可能不得不筛选多株植物。
只要所选用的启动子具有足够的转录活性从而通过在所需宿主组织中表达可翻译的mRNA，适于共抑制的mRNA或反义RNA而完成本发明，则用于驱动转基因植物中基因表达的启动子可来自多种来源。例如，用于在多种植物器官中表达的启动子包括那些指导花椰菜花叶病毒19S与35S转录本的那些启动子(Odell等(1985)自然313:810-812；Hull等(1987)病毒学86:482-493)、指导核酮糖1,5-二磷酸羧化酶的小亚单位的那些启动子(Morelli等(1985)自然315:200-204；Broglie等(1984)科学224:838-843；Hererra-Estrella等(1984)自然310:115-120；Coruzzi等(1984)EMBO J.3:1671-1679；Faciotti等(1985)生物/技术3:241)以及指导叶绿素a/b结合蛋白的那些启动子(Lamppa等(1986)自然316:750-752)。
依据本申请，筛选在植物一种或更多种器官中特异性表达的启动子可能是必要的。实例包括核酮糖1,5-二磷酸羧化酶小亚单位的光诱导启动子，如果该表达在光合作用器官中是必要的，或启动子在种子中具有特异性活力的话。
优选的启动子为那些允许在种子中特异性表达的启动子。这可能特别有效，因为种子是长期淀粉积累的主要场所。此外，种子特异性表达可排除任何含酶调节可能对非种子器官具有的替在有害效应。种子特异性的启动子实例包括但不限于种子贮存蛋白的启动子。种子贮存蛋白的表达在植物中受严格调控，表达以高度器官特异性及时期特异性的方式几乎完全局限于种子中(Higgins等，(1984)植物生理学年鉴35:19l-221；Goldberg等(1989)细胞56:149-160；Thompson等(1989)BioEssays 10:108-113)。此外，不同的种子贮存蛋白可在种子发育的不同时期表达。目前有许多有关种子贮存蛋白的基因在转基因植物中种子特异性表达的实例。这些实例包括单子叶植物的基因如大麦β-醇溶蛋白基因(Marris等(1988)植物分子生物学10:359-366)和小麦麦谷蛋白基因(Colot等(1987)EMBO J.6:3559-3564)。此外，可操作地连接到嵌合基因构建体异质编码序列上的种子种子-特异性基因的启动子同时维持它们在转基因植物中的时空表达(Goldberg等(1989)细胞56:149-160)。这样的实例包括连接云扁豆蛋白或芥菜(Arabidopsis)2S清蛋白启动子与巴西栗(Brazil nut)2S清蛋白编码序列并且在烟草、芥菜、或Brassica napus中表达这种组合(Altenbach等(1989)植物分子生物学13:513-522；Altenbach等(1992)植物分子生物学18:235-245；De Clercq等(1990)植物生理学94:970-979)，用菜豆凝集素与菜豆(bean)b-云扁豆蛋白启动子表达萤光素酶(Riggs等(1989)植物科学63:47-57)和小麦麦谷蛋白启动子表达氯霉素乙酰转移酶(Colot等(1987)EMBO J.6:3559-3564)。
在表达本发明核酸片段中有特别用途的将是来自数个经深入特征分析过玉米种子贮存蛋白基因的启动子，如来自10kD麦醇溶蛋白基因的胚乳特异性启动子(Kirihara等(1988)基因71:359-370)、来自15kD麦醇溶蛋白基因的胚乳特异性启动子(Hoffman等(1987)EMBO J.6:3213-3221；Schernthaner等(1988)EMBO J.7:1249-1253；Williamson等(1988)植物生理学88:1002-1007)、来自27kD麦醇溶蛋白基因的胚乳特异性启动子(Prat等(1987)基因52:51-49；Gallardo等(1988)植物科学54:211-281)以及来自19kD麦醇溶蛋白基因的胚乳特异性启动子(Marks等(1985)生物学化学杂志260:16451-16459)。这些启动子在玉米中的相对转录活性已有报导(Kodrzyck等(1989)植物细胞1:105-114)，从而提供了挑选用于玉米嵌合基因构建体启动子的基础。此外，驱动编码涉及淀粉生物合成酶基因表达的启动子可用于本发明实践中。这些启动子包括但不限于下列基因的5′调控序列，包括蔗糖合酶(Yang,N.S.和Russell.D.(1990)美国自然科学院院报87:4144-4148)柔软(waxy)或颗粒结合的淀粉合酶Ⅰ(Unger等(1991)植物生理学96:124)基因、sh2(Bhave等(1990)植物细胞2:581-588)和bt2(Bae等(1990)Maydica 35:317-322)基因，后者产物构成ADP-萄萄糖焦磷酸化酶。技术人员将会认识到那些较早期的实例现可通过用现代基因组科学技术分离的全部的淀粉生物合成及其它种子特异性基因而得到补充，从而提供了可用于完成本发明目的的种子特异性启动子几乎无限制的来源。当必要时，cDNA克隆可用于分离含有目的调控序列的基因组克隆。可通过用增强子序列，包括那些在内含子序列中发现的增强子序列增加这些启动子中任何一个的表达(见实施例，Callis等(1987)基因发育1:1183-1200；Maas等(1991)植物分子生物学16:199-207,Luehrsen,K.R.和Walbot,V.(1991)分子遗传遗传学225:81-93；Oard等(1989)植物细胞繁殖8:156-160)。
能够提供多聚腺苷酸化信号和其它可能是适当表达所需的调节序列的任何3′非-编码区可用于完成本发明。这将包括来自任何存贮蛋白的3′末端，如10kD、15kD、27kD和α麦醇溶蛋白基因的3′末端、云扁豆蛋白基因的3′末端、大豆β-conglycinin基因的3′末端、病毒基因的3′末端如35S或19S花椰菜花叶病毒转录本的3′末端、冠瘿氨基酸(opine)合成基因的3′末端、编码核酮糖1,5-二磷酸羧化酶或叶绿素a/b结合蛋白基因的3′末端，或来自任何基因的3′末端序列从而使使用的序列在其核酸序列内部提供必须的调节信息因而导致其可操作连接的启动子/编码区组合的适当表达。本领域中有许多实例讲授不同3′非-编码区域的有用性(例如，见Ingelbrecht等(1989)植物细胞1:671-680)。本领域技术人员也可得到将DNA序列导入(即转化)高等植物真核细胞中的许多方法(见EPO公开0 295 959 A2和0 138 341 A1)。这些方法包括用涂布核酸构建体的金属颗粒的高速弹道轰击(见Klein等(1987)自然(London)327:70-73，并且见美国专利No.4,945,050)以及那些基于农杆菌Ti和Ri质粒，特别是这些载体中的双型(binary type)质粒的转化载体方法。Ti-衍生的载体转化多种高等植物，包括双子叶植物，如大豆、棉花和油菜(rape)(Pacciotti等(1985)生物/技术3:241；Byrne等(1987)植物细胞、组织与器官培养8:3；Sukhapinda等(1987)植物分子生物学8:209-216；Lorz等(1985)分子遗传遗传学199:178-182；Potrykus等(1985)分子遗传遗传学199:183-188)；Qu,R.等(1996)Dev.Bio-Plant 32:233-240；Vasil,V.等(1993)生物/技术11:1553-1558)以及更晚出现的单子叶植物如水稻和玉米(Hiei,Y等(1994)植物杂志6:271-282)。
本领域技术人员也可得到其它转化方法，如外源DNA构建体的直接摄入(EPO公开0 295 959 A2)、和电穿孔技术(Fromm等(1986)自然(London)319:791-793)。一旦得到转化，本领域技术人员可将这些细胞再生成成熟植株。还有数种最近描述的将核酸片段导入下列商业上可得到重要作物中的方法，包括如油菜(rapeseed)(De Block等(1989)植物生理学91:694-701)、向日葵(Everett等(1987)生物/技术5:1201-1204)、大豆(McCabe等(1988)生物/技术6:923-926；Hinchee等(1988)生物技术6:915-922；Chee等(1989)植物生理学91:1212-1218；Christou等(1989)美国自然科学院院报86:7500-7504；EPO公开0 301 749 A2)、水稻(Qu R等(1996)Dev.Bio-Plant 32:233-240；Hie Y.等(1994)植物杂志6:271-282)、小麦(Vasel V.等(1993)生物/技术11:1553-1558)和玉米(Gordon-Kamm等(1990)植物细胞2:603-618；Fromm等(1990)生物/技术8:833-839)。
本领域中的技术人员还会熟悉其它制备转基因玉米植物的方法包括导入DNA至原生质体中并从所述的原生质体中再生植物(Omirulleh等(1993)植物分子生物学21:415-423)电穿孔完整的组织(D′Halluin等(1992)植物细胞4:1495-1505；Laursen等(1994)植物分子生物学24:51-61)、硅碳化物(Silica carbide)介导的玉米细胞的纤维转化(Kaeppler等(1992)应用遗传学理论84:560-566；Frame等(1994)植物杂志6:941-948)。除了上述粒子轰击玉米愈伤组织细胞的方法，本领域的技术人员还应熟悉粒子轰击玉米盾片或悬浮培养物从而产生高产的(fertile)转基因植物(Koziel等(1993)生物/技术11:194-200；Walters等(1992)植物分子生物学18:189-200)。
本领域技术人员将会明白为了降低特定基因的表达，应特别关注反义或共抑制技术的使用。美国专利Nos.5,190,931、5,107,065和5,283,323公开了这些技术的易行性。一旦通过上述方法获得了转基因植株，筛选那些最为有效地显示所需表型的单个转基因植株将是必要的。本领域技术人员众所周知带有相同构建体的单个转基因植株在表达水平上可能不同；该现象常称为“位置效应”。例如，当讨论的构建体被设计成表达更高水平目的基因时，此单个植株在产生的蛋白量方面及酶活性方面将会有差异，这又反过来影响表型。因此，使用这些技术时它们在单个转基因植株中的效率不可预测，但是如果得到大量的转基因种群，将会获得具有抑制基因表达的单个植株。在这两种情况的任一情况中为了节省时间，本领域的技术人员将会制备含有待抑制基因一个或更多个不同部分的多个遗传构建体，因为本领域中还没有讲述过预测哪一个片段将会对特定基因更为有效的方法。此外，甚至是最为有效的构建体可能只会在分离转基因品系的一部分中得到有效的抑制表型。例如，WO 93/11245与WO 94/11516公开了当试图抑制油菜(canola)中脂肪酸去饱和酶基因的表达时，在测试品系中获得了不到1％的实际抑制。虽然在其它品种该百分比会有一定升高，但还没有一种案例该百分比达到100％。虽然这将不会看作是对本发明的限制，但相反，实际上这也是本领域技术人员所能理解和预期的。因此，技术人员将开发用于筛选大量转化子的方法。这些筛选的特性将一般根据实际依据另以挑选，且不是本发明的固有部分。例如，在本案例中，人们可通过下列方法筛选，包括用层析寻找淀粉表型的变化从而测定直链淀粉对支链淀粉的相对比例，支链淀粉分支链分布，聚合化程度；快速粘度分析(Rapid Visco Analysis)，用于测定食品水解胶体，特别是淀粉功能性(如本实施例中一样)的标准工业技术或其它方法。人们同样可使用对待抑制基因所编码蛋白特异性的抗体，或者人们可建立特异性测定酶活性的方法。优选的方法将是允许大量样品可被迅速处理的方法，因为预计大多数样品将是阴性的。
被鉴定具有改变的谷粒淀粉精细结构的植物提供特有的遗传物质，其较传统的谷物作物品系及已知的淀粉突变子提供更多优势。在谷物作物育种中使用具有SS同工酶抑制表达的本发明品系提供了可简化和加速育种过程的显性性状。虽然已知的淀粉突变子可以使用但它们常是隐性的并且出现更多的复杂情况。此外对于谷物作物如小麦，已知突变子的数目有限。此外，使用反义及共抑制来抑制SS同工酶导致由于染色体位置效应所致的不同水平的抑制。得到的SS活性的不同水平将导致用传统突变子不可能达到的广泛表型，其中的传统突变子仅可导致谷物作物胚乳中突变等位基因有限的剂量系列。其它独特的及可能有价值的淀粉精细结构将来自新发展的具有改变SS活性的玉米品系彼此间杂交或/和与已知突变子如wx或ae之间的杂交。
实施例本发明在下列的实施例中得到进一步阐明。应当明白这些实施例的给出仅是为了说明的目的并且本发明并不限于在实施例中所述的用途。除非另有说明，否则温度值表示摄氏度且百分值表示温度对体积的比值。本发明可用产生这样的转基因植物，即该植物改变的淀粉可用于其特性在其中有用的任何目的，如但不限于食品、纸张、塑料、粘附剂或绘画中。通过上面的讨论及下面的实施例，本领域技术人员可在不偏离本发明精神与范围的情况下确信并制备出本发明的各种变化与修饰从而使其适应于不同用途及情况。所有这样的修饰也有意包括在权利要求范围内。
实施例1表达玉米淀粉合酶Ⅰ反义构建体转基因玉米的制备玉米淀粉合酶Ⅰ克隆的分离用水稻可溶性淀粉合酶的cDNA序列(Baba T.等(1993)植物生理学103:565-573)制备用于检测玉米中同源淀粉合酶序列的DNA探针。于Beckman Oligo 1000TM寡核苷酸合成仪合成寡核苷酸BE62(SEQ ID NO:1)和BE61(SEQ ID NO:2)。这些引物分别包括发表水稻序列的核苷酸(nt)1600-1619与1826-1808。5′-AAGCTTGAATTCCACAGAATCAGGGTACAGG-3′〔SEQ ID NO:1〕5′-GAAGGACTGGCACTAGACTGG-3′ 〔SEQ ID NO:2〕用此引物对及在Gene AmpPCR试剂盒(Perkin Elmer)中定义的标准PCR条件从水稻基因组DNA中扩增429 bp的DNA片段。扩增进行30个循环，每循环由94°1分钟、55°2分钟及72°3分钟所组成，然后在最后一轮循环后在72°再延伸最后的7分钟。核苷酸序列分析显示扩增的片段(SSⅠ)含有预期的cDNA序列以及发表序列nt 1678后的124 bp内含子及nt 1788后的81 bp内含子。通过缺口翻译标记该DNA片段并用于检测发育中玉米谷粒总RNA的Northem印迹。在早达授粉后10天(DAP)检测到-2.6 kb的玉米转录子并于22 DAP达到其峰值水平，水稻SS1片段被设计成含有2个序列同源区域，该同源性存在于植物与细菌淀粉或糖原合酶之间(Baba T.等(1993)植物生理学，103:565-573)。用包括该cDNA nt 1083-1103(SS7；SEQID NO:3)与nt 1440-1459(SS8；SEQ ID NO:4)的引物对通过PCR扩增水稻DNA而获得缺乏这些氨基酸保守区域的第二个可溶性淀粉合酶片段(SS2)。5′-GGATCCGAATTCTCCTTTCTCAGCAAACGG-3′〔SEQ ID NO:3〕5′-AAGCTTGAATTCCTGGGATTGCCACCTGAATTG-3′〔SEQ ID NO:4〕获得了明显含有一个或数个内含子的900 bp的DNA片段。当用作玉米总RNA印迹中的杂交探针时，该片段检测到一个类似大小的转录本(2.7 kb)，该转录本的表达分布与用SSⅠ探针观察到的分布相当。然后用SS2片段筛选19 DAP玉米胚乳cDNA文库中与水稻可溶性淀粉合酶序列同源的序列。
用从19DAP的胚乳组织中收获的polyA+RNA通过Clontech构建玉米cDNA文库。cDNAs被克隆成载体λ-ZAPⅡ(Stratagene)中的EcoRⅠ-XhoⅠ插入子。将大约12,000个未扩增文库的噬菌斑形成单位铺板于NZY琼脂平板上并复制转移一份至硝酸纤维素膜上(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.，和Maniatis,T.(1989)分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，下文称“Maniatis”)，在6 X SSPE、5 X Denhardt氏、0.5％SDS、100mg/ml变性鲑精DNA(Maniatis)中于51°将固定的DNA与缺口翻译标记的SS2(2×105dpm/ml)杂交16小时。于室温在2×SSC、0.1％SDS中洗膜2次，每次30分钟并且再于50°在1×SSC,0.1％SDS中洗15分钟一次(Maniatis)。从该初始筛选中鉴定出共38个可能的阳性噬菌斑。纯化其中的24个克隆并通过限制酶消化与部分核苷酸序列分析而对其进一步特征分析。称为pSS23和pSS31的两个克隆含有最长的cDNA插入子并选择用于更为详尽的特征分析。发现质粒pSS31含有这样的2.2kb cDNA，其由144 bp的5′非翻译DNA、1923 bp的开放阅读框和168 bp的3′非翻译DNA所组成。质粒pSS31因此编码玉米淀粉合酶多肽的完整拷贝。此推导的氨基酸序列与水稻可溶性淀粉合酶的氨基酸序列比较显示其整个长度中有80％的一致性。pSS23含有一个1954 bp的插入子，其实1715个核苷酸序列与pSS31的nt 521到2235一致。然而，pSS23的cDNA插入子在pSS31的3′末端延伸239 bp。因此pSS23含有缺乏氨基酸末端126个氨基酸的淀粉合酶多肽的不完全拷贝。通过比较pSS23与pSS31的序列得到SSⅠ cDNA的共有序列并示于SEQ ID NO:5中。pSS23与pSS31均用于制备改变此淀粉合酶在玉米植株中表达的DNA构建体。编码玉米SSⅠ反义转录本表达载体的构建用淀粉合酶克隆pSS23制备用于抑制玉米SSⅠ表达的反义构建体。pSS23首先用限制酶PvuⅠ消化并通过与T4DNA聚合酶反应而使5′凹端变平。向10mg PvuⅠ消化的pSS23(于40mL 10mM Tris-HCl,pH 7.5,100mM NaCl,10mM MgCl2,1mM DTT中)加入20单位的T4DNA聚合酶及终浓度为0.1mM的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，反应混合物于12°温育15分钟，75°温育10分钟并通过用酚∶氯仿∶异丙醇(25∶24∶1)提取后乙醇沉淀来纯化DNA。修复质粒DNA然后在上述缓冲液中与限制酶XhoⅠ温育。消化后，加入dNTPs至50μM的终浓度并通过与大肠杆菌聚合酶Ⅰ的Klenow片段(10单位)及dNTPs于室温下反应15分钟而补平XhoⅠ末端。于75°温育10分钟而失活酶并通过于40mM Tris-乙酸，pH 8.5,1mM EDTA中0.7％的低熔点琼脂糖凝胶上电泳分离末端补平的DNA。从该凝胶中切下1.55 kb的条带(插入子)并与4.9kb的质粒pML 103(ATCC 97366)片段合并。质粒pML 103含有pGem9Zf(+)载体(Promega)中玉米27kD醇溶蛋白基因的1.05 kb SalⅠ-Nco-Ⅰ启动子片段及玉米10kD醇溶蛋白基因的0.96 kb SmaⅠ-SalⅠ3′片段。质粒pML 103用NcoⅠ与SmaⅠ消化，消化的DNA用Klenow及dNTPs处理从而补平该酶留下的突出端，并按所述电泳与分离所需的4.9 kb的载体片段。基本上按所述(Maniatis)将合并的插入子与载体片段于68°解链并连接过夜。用连接的DNA转化大肠杆菌XL1-Blue细胞(Epicurean Coli XL-1 BlueTM；Stratagene)。通过用限制酶HindⅢ消化而筛选细菌转化子中插入DNA的存在与方向。pSS42含有相对于27kD玉米醇溶蛋白的启动子片段及10kD玉米醇溶蛋白3′末端为反义方向的pSS23中1.5kb的片段(SEQ IDNO:6)。为了制备用于植物转化的构建体，通过用BamHⅠ消化而释放pSS42的嵌合基因并将3.6kb片段克隆入载体pKS17的BamHⅠ位点中。质粒pKS17含有潮霉素B磷酸转移酶(HPT)基因，因而对抗生素潮霉素具有抗性。为了制备植物转化的构建体，将pSS42嵌合基因克隆入载体pKS17中。载体pSP72(Promega)的衍生物，pKS17含有赋予对抗生素潮霉素抗性的潮霉素B磷酸转移酶(HPT)基因。通过添加T7-启动子-HPT-T7终止子基因至删除β-内酰胺酶基因的修饰质粒pSP72中而装配pKS17。通过用BamHⅠ消化而释放pSS42的嵌合基因。得到的在pKS17中含有27kD玉米醇溶蛋白启动子反义SSⅠ-10kD玉米醇溶蛋白3′末端的质粒称为pSS43(图1)。用SSⅠ反义构建体转化玉米从正在发育中的核质(caryopses)中切下未成熟玉米胚胎，其中的种质来自“Hi-Ⅱ”玉米种质(germplasm)的自花传粉，Hi-Ⅱ玉米选自玉米A188×B73近交的F2代(Armstrong等(1991)，玉米遗传学协作简报65:92-93)。Hi-Ⅱ种质已广泛用于转化因为其特征在于“Ⅱ型”愈伤组织的高频形成。该愈伤组织来自体外切除的未成熟合子胚胎的盾片。Ⅱ型愈伤组织尤其易于转化因为其脆弱、快速增殖及高度胚胎发生性。授粉后10到12天，当其达到1.0到1.5mm长时分离胚胎。将胚胎以胚轴一侧向下放置并且与补充1mg/L 2,4-D的琼脂糖软化MS培养基(Murashige,T.和Skoog,F.,(1962)生理学植物15:473)接触。将胚胎于27°置于黑暗中。由未分化细胞体所组成并具有从抑制结构中生长出的体细胞前胚状体(proembryoids)及胚状体的脆弱胚原性愈伤组织从这些未成熟胚胎的盾片增殖。将从这些初级外植体分离的胚原性愈伤组织培养于补充1mg/L 2,4-D的琼脂糖软化N6培养基(Chu等(1975),Sci.Sin.Peking 18:659-668)上并于每2到3周在该培养基上传代培养。
为了提供转化实验中可选择的标记，使用质粒pML 108的-个片段。该质粒含有编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的bar基因(Thompson等，(1987)EMBO J.6:2519-2523)。酶PAT赋予对除草剂型谷氨酰胺合成酶抑制剂如膦丝菌素的抗性。pML 108中的bar基因位于花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell等(1985)自然313:810-812)的控制之下，并且含有根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒T-DNA章鱼氨酸合酶基因的3′区域。含有嵌合35S-bar-OCS基因的2116 bp HindⅢ片段从pML 108中得到分离并与特征(trait)DNA在植物转化实验中联合使用。
粒子轰击方法(Klein等(1987)自然327:70-73)用于将基因转移到愈伤组织培养细胞中。用下面的技术用DNA涂布金颗粒(1μm直径)。将质粒DNA(1μg pML 108片段和12μg pSS43)加入到50μl金颗粒的悬液中(每ml 60mg)。向颗粒中加入氯化钙(50μl 2.5M溶液)和无亚精胺的碱(20μl 1.0M溶液)。在加入这些溶液过程中及加入最后一种溶液后5分钟旋转混合悬液。再过5分钟，简单离心溶液管(15,000rpm 5秒)并去除上清液。将颗粒重悬于140μl绝对的乙醇中，再次离心并去除上清液。再以进行乙醇冲洗并将颗粒重悬于55μl终体积的乙醇中。将涂布DNA的金颗粒等份(6μl)置于KaptonTM飞盘(flying disc)(Bio-Rad Labs)的中央。用110psi氦压，0.5cm间距及1.0cm飞行距离通过BiolisticTMPDS-1000/He(Bio-Rad仪器，Hercules,CA)将颗粒加速进入玉米组织中。
为了轰击，将胚原性组织置于补充1mg/L 2,4-D琼脂糖软化N6培养基上的滤纸上。将组织排列成一薄层(thin lawn)并覆盖大约5cm直径的圆形区域。将含有组织的培养皿置于距阻断屏大约8cm的PDS-1000/He控制室中。然后将控制室抽成28英寸Hg的真空。用休克管中He压达到110psi时爆破的爆破膜以氦休克波来加速巨大载体(macrocarrier)。
轰击后4天将组织转移至补充了1mg/L 2,4-D加上双丙氨酰膦(2-10mg每升)但没有酪蛋白或脯氨酸的N6培养基(选择培养基)中。组织继续在此培养基中缓慢生长。一周后，将组织再次转移至含有2,4-D和双丙氨酰膦的新鲜N6选择培养基中。于该选择培养基中6-8周后，在一些含有补充双丙氨酰膦培养基的平板上鉴定出大约1cm直径活性生长愈伤组织的区域。当于该选择培养基上传代培养时这些愈伤组织继续生长。取样在选择培养基上继续旺盛生长的愈伤组织从而通过冷冻大约200-500mg新鲜重量愈伤体积而用于PCR分析。
通过在由50mM Tris-HCl、pH 8.0,7M尿素，0.35M NaCl,20mM EDTA,1％n-月桂基肌氨酸所组成的缓冲液中悬浮冷冻、研磨的组织并于37°温育15分钟而从该收集到的样品中提取DNA。此后，样品用酚-氯仿-异丙醇(25∶24∶1)混合物提取并用异丙醇沉淀浓缩。将DNA重悬于10mM Tris-HCl,pH 8.0,0.1mM EDTA(100μl)中并用引物MM50(SEQ ID NO:7)和BE56(SEQ ID NO:8)而用作PCR模板。5′-AAGCTTGAATTCGGCACATCGGGCCTTATGG-3′〔SEQ ID NO:7〕5′-GTCTAGTGCCAGTCCTTC-3′ 〔SEQ ID NO:8〕将DNA(2μl)与20μM每种MM50和BE56引物合并于Gene AmpPCR试剂盒(Perkin Elmer)中提供的标准混合物中。扩增进行30个循环，每循环由95°1分钟、55°2分钟和72°3分钟所组成。记录跨越SSⅠ片段3′部分与10kD玉米醇溶蛋白3′末端的546 bp靶条带存在的样品。性状基因阳性愈伤组织样品进一步用于转化方案。
通过首先将组织块转移至无双丙氨酰膦或2,4-D并置于黑暗中的MS培养基中而从该转基因愈伤组织中再生植株。两周后将组织转移至光下的再生培养基(Fromm等(1990)生物/技术8:833-839)中。用pSS43构建体从单次转化实验中再生总共35株玉米植株。
实施例2表达玉米淀粉合酶Ⅰ有义构建体转基因玉米的制备质粒pSS64-C5与pSS65-C11编码SSI基因的有义转录本。对于两种构建体，通过PCR在SSⅠ cDNA的起始甲硫氨酸处导入NcoⅠ位点。在被设计成利于在模板DNA的富含GC区域扩增的修饰PCR混合物(Advantage-GCTM；Clontech)中合并寡核苷酸MM62(SEQ IDNO:9)与MM60(SEQ ID NO:10)和模板DNA pSS31。5′-GAGTCACACGCGATGGC-3′ 〔SEQ ID NO:9〕5′-CTCTCCGCCATGGCGACGCCCTCGGCC-3′〔SEQ ID NO:10〕扩增用35轮循环后于72°延伸最后10分钟完成，每个循环由95°1分钟、53°1分钟及72°1分钟所组成。扩增的片段覆盖SSⅠ cDNA的核苷酸136-1003。该DNA随后用限制酶KpnⅠ与NcoⅠ消化，于1％琼脂糖凝胶上电泳分离(Maniatis)并从凝胶中切下537 bp的NcoⅠ-KpnⅠ片段并用GelaseTM(Epicentre Technologies)处理加以纯化。质粒pET-SSSⅠ(PpuMⅠ)含有包括SSⅠ cDNA核苷酸418-2235的片段，其以有义的方向插入到pET24d(Novagen)的平末端NcoⅠ位点中并与T7启动子的阅读框一致。当插入SSⅠ片段时SSⅠ序列5′端的NcoⅠ位点重新产生。将PET-SSSⅠ(PpuMⅠ)与KpnⅠ温育后与NcoⅠ温育并于1％琼脂糖凝胶中分离消化产物。按上述切下7.1 kb条带、纯化并与537 bp的NcoⅠ-Kpn SSⅠ片段相连接。除了168 bp的3′非翻译DNA外还含有SSⅠ全长编码区的得到的质粒称为pET-SSSI@MAT。该质粒用于构建pSS64-C5和pSS65-C11。为了制备pSS64-C5，基本上按上述用Bg1Ⅱ消化pET-SSSI@MAT并用K1enow与dNTPs的反应补平5′突出端。该DNA用NcoⅠ消化并将释放的1.485 kb片段克隆入pSPB38的4.53 kb的NcoⅠ-SmaⅠ片段中。此pSPB38片段含有上述载体DKS17中27kD玉米醇溶蛋白基因的1.05 kb的SalⅠ-NcoⅠ启动子片段和10kD玉米醇溶蛋白基因3′末端0.96 kb的SmaⅠ-PvuⅠ片段。得到的质粒，称为pSS64-C5(图5)，因此含有27kD玉米醇溶蛋白启动子，后接SSⅠ编码区的氨基酸1-494(SEQ ID NO:11)和10kD玉米醇溶蛋白3′末端。为了制备pSS65-C11，质粒pET-SSSⅠ@MAT用BsrGⅠ消化并用Klenow与dNTPs的反应补平5′突出末端。DNA用NcoⅠ消化从而释放2.0 kb的片段，然后将连接到上述4.53 kb的pSPB38片段上。得到的质粒，pSS65-C11(图3)由下列部分所组成，即SSⅠ完整编码区，其后为84 bp的SSⅠ 3′非翻译DNA(SEQ ID NO:12)，后者周围为27kD玉米醇溶蛋白启动子和0.96 kb的10kD玉米醇溶蛋白3′末端片段。通过实施例1中概述的方法将这些DNA构建体，pSS64-C5与pSS65-C11导入玉米中。通过PCR分析鉴定性状阳性愈伤组织品系(实施例1)并进一步用于再生转基因植株。
实施例3含有pSS43反义构建体转化玉米植株淀粉的分析从pSS43反义构建体转化玉米植物中获得的单一种子(singleseeds)中提取淀粉。将种子浸于含有1.0％乳酸和0.3％偏亚硫酸氢钠，pH 3.82的溶液中并于52°保持22-24h。滤去种子的水份，冲洗并分别于8-9mL 100mM NaCl溶液中匀浆。向每管中加入5mL甲苯，将溶液管剧烈振动两次，每次6分钟，随后使其静置30分钟。将2mL100mM的NaCl喷洒入该溶液中，使其静置30分钟，并且蛋白/甲苯层被蒸发掉。重复甲苯冲洗步骤。加入12mL水并于喷涂摇床(paintshaker)中振荡45秒。将此溶液在台式离心机中离心10分钟并去除水分。重复水洗步骤后用12mL丙酮最后洗一次。振荡与离心步骤后，滤掉丙酮并使其蒸发1小时。为了去除任何残留的丙酮，将淀粉提取物于40°炉子中温育过夜。
按如下酶促去分支提取的淀粉。向具有1.1mL水的旋转盖试管中加入7mg每种淀粉样品。将试管加热至120°30分钟且然后置于45°水浴中。通过稀释50μl异淀粉酶(5×106单位/mL,Sigma)每mL乙酸钠缓冲液(50mM,pH 4.5)而制备去分支溶液。向每种淀粉样品中加入40μL去分支溶液并于45°温育3h。通过加热至110°5分钟而终止反应。将去分支的淀粉样品冷冻干燥并重溶于DMSO中用于凝胶渗透层析(GPC)分析，注射入10μL去分支的淀粉并于100°系列流经3个窄孔柱(Polymer Labs,Mini-Mix C)且以0.35mL/分钟的流速用DMSO洗脱。取样间隔为30分钟。使用折射指数检测器(Waters)，该仪器使用计算机运行的Waters Millenium层析管理系统，带有GPC选项(2.15.1版，Waters公司)从而分别用于检测、数据收集和分析。使用出芽短梗孢糖(pullulan)标准(标准1380kD、100kD、23.7kD、5.8kD、666和180mw，标准2853kD、186kD、48kD、和12.2kD)的滞留时间建立线性校正并用Millenium软件的计算分子量分布。
如本领域中技术人员所知道的，此反义现象一般在每个单独转基因品系中没有观察到。因此，检测来自多个品系的单个谷粒且如所预期的，一些但不是所有品系具有表现出相对于对照改变的淀粉表型的谷粒。同样对本领域技术人员已知的是通过粒子轰击而制备的转基因玉米植物一般对于导入的转基因是杂合的并且此转基因将以可预测的孟德尔方式分离。在R0(初级转化子)植株的自交穗(ear)中，负责淀粉产生的组织，即三倍体胚乳对于0,1,2与3拷贝导入的转基因分别分离为1∶1∶1∶1。为了具有观察到任何一种这样转基因剂量的合理可能性，提取S048.6.1.10(命名为XBG00944-1到XBG00944-10)10个单个谷粒的淀粉，并按上述去分支并分离每只谷粒的淀粉。图6显示获自S048.6.1.10品系2种代表性谷粒去分支淀粉的分子量分布。XGB00944-7描述了相应于正常分离物的分布图而XGB00944-1描述了相应于改变分离物的分布图。
品系S048.6.1.10产生两种具有非常不同类型分子量分布的淀粉。种子944-3、944-4、944-5和944-7去分支淀粉的分子量分布为观察到的正常凹型(dent)玉米淀粉的典型分子量分布。种子944-1、944-2、944-6、944-8、944-9和944-10去分支淀粉的分子量分布显示去分支淀粉分子量分布的改变。图6描述了这些类型种子中每种中的其中一个的分子量分布，944-7示为正常淀粉的实例且944-1示为改变淀粉的实例。如在图6中所能见到的1高分子量物质(log MW 74)的量有所增加且低分子量物质的分布降低。用卡方(x2)统计将分离穗中改变种子与正常种子发生率的比例与各种可能的预期遗传模式作比较。观察到的60％改变40％正常种子的频率与下面的两个假说相匹配，包括简单显性假说(或者1个或者更高剂量的转基因足以产生改变的淀粉结构)(x2=1.2)或需要2个或更高剂量的转基因来改变淀粉结构的假说(半显性，x2=0.4)。
实施例4XBG00944种子中淀粉结构改变的定量分析为了定量比较改变的转基因淀粉，将XBG00944-1淀粉用作淀粉结构中最大改变的代表(见实施例6)并用于与凹型玉米淀粉的比较，后者淀粉为来自dull突变子的淀粉及来自waxy突变子的淀粉。按上述酶促去分支来自这四个品系(凹型、du、wx、944-1)的淀粉并用略微修改的层析方法加以分离从而提供该支链淀粉部分中支链分布更好的分辨率。注射10μL去分支的淀粉并于90°系列流经3个窄孔柱(Polymer Labs,Mini-Mix C,D,E，具有Mini-mix(保护柱)并以0.35mL/分钟的流速用DMSO洗脱。取样间隔为35分钟。使用反射指数检测器(Waters)，使用具有计算机运行的Waters Millenium层析管理系统，具有GPC选项(2.15.1版，Waters公司)从而分别用于检测和数据收集及分析。出芽短梗孢糖标准(标准1380kD、100kD、23.7kD、5.8kD、666和180mw；标准2853kD,186kD,48kD和12.2kD)的滞留时间用于建立第三级校正并用Millenium软件计算分子量分布。对比较的四种淀粉的每种进行三次重复分析。
为了测定直链淀粉(Am)与支链淀粉(Ap)的含量，比较适当层析峰下的面积。waxy突变子(缺乏直链淀粉)用于确立用于比较的适当分子量范围。表1显示四个品系每种中直链淀粉与支链淀粉的含量。
表1与du、凹型和wx淀粉相比SSSI反义淀粉中直链淀粉与支链淀粉含量(平均值(n=3)与标准误)％Am 标准误％Ap 标准误944-135.40％0.15％64.60％0.15％du 31.99％0.05％68.01％0.05％dent 25.65％0.14％74.35％0.14％wx 0.00％ 0.00％100.00％ 0.00％
与正常凹型淀粉及dull突变子的淀粉相比，直链淀粉含量显著增加(P＜0.01)。与这两个品系相比，支链淀粉含量类似地显著降低(P＜0.01)。淀粉合酶Ⅰ表达的抑制因此导致这些植物中淀粉精细结构的改变，特别是直链淀粉对支链淀粉比例的显著改变。
MilleniumGPC软件用于产生分析淀粉中直链淀粉与支链淀粉组分的独立分子量分布以及测定平均分子量Mn(分子量平均数)、Mw(加权平均分子量)、Mz和Mz+1(聚合物沉积(sedimentation)分子量)、峰值分子量(MP)和直链淀粉与支链淀粉组分的多分散性(Mw/Mn)。
表2显示对来自944-1、凹型和dull淀粉直链淀粉分子量分布的定性分析。
表2来自944-1、du和凹型淀粉直链淀粉组分的平均分子量(道尔顿)MnMPMw(平均分子量)(峰值分子量)(加权平均分子量)944-191414±110 278047±0.00 357427±278du 82728±693 183963±13228 283207±2727dent 90511±1106172334±8444 304715±3480MzMz+1PD(沉积分子量)(沉积分子量)(多分散性Mw/Mn)944-1 1123204±12306 2258755±484323.9100±0.0074du894430±213411908812±916463.4236±0.0349dent 968529±367152095380±176856 3.3667±0.0037通过比较表2中Mw栏的值可以看出，与dull及凹型淀粉相比，944-1中淀粉中的最大直链淀粉分子分子量显著增加(P＜0.01)。这也在MP、Mz及Mz+1中的显著增加中得到类似的反映。944-1直链淀粉相对于凹型及dull淀粉明显增加的多分散性(P＜0.01)表明直链淀粉分子量的增加不是以更短直链淀粉分子为代价而得到而是通过扩展直链淀粉组分的分布实现的。这与表1中报道的增加的直链淀粉相对含量相一致，并且944-1增加的直链淀粉含量可归就于末在凹型或dull淀粉中出现的高分子量直链淀粉的存在。因此，该净效应是因为改变淀粉合酶Ⅰ表达导致这些植株种子中淀粉精细结构的改变，此改变通过造成直链淀粉对支链淀粉比例的显著改变，以及改变淀粉中直链淀粉组分的分子量分布而得到因为其它直链淀粉分子量更大。
表3显示944-1、凹型、和dull淀粉中直链淀粉分子量分布的定量分析。
表3944-1与对照淀粉中支链淀粉组分的平均分子量(道尔顿)MnMPMw(平均分子量)(峰值分子量)(加权平均分子量)944-12727±4.52409±8.3 3534±5.8du 2713±6.72320±8.0 3557±11.2dent 2717±2.32352±14.13739±0.9wx 2873±13.0 2460±8.7 4144±8.6MzMz+1PD(沉积分子量)(沉积分子量)(多分散性，Mw/Mn)944-1 4803±13.9 6406±26.9 1.296±0.0019du 4878±20.2 6529±35.4 1.311±0.0009dent5311±7.1 7133±18.3 1.376±0.0012wx 6196±20.3 8716±65.8 1.442±0.0043如Mz与Mz+1栏中所示，与凹型淀粉相比，944-1支链淀粉的Mw显著降低(P＜0.01)，表明支链淀粉链长度分布向更短的链长迁移。与dull一样，与凹型支链淀粉相比，944-1支链淀粉的多分散性也显著减少(P＜0.01)，再次证明图6中的观察结果，即944-1淀粉中支链淀粉的部分较凹型支链淀粉在链长上更均匀。
因此，与凹型淀粉相比，定量分析证实了944-1淀粉中直链淀粉组分含量及分子量的增加。通过扩展直链淀粉链的分子量分布而得到直链淀粉分子量观察到的增加。观察到的944-1淀粉中支链淀粉含量的下降伴随分支链链分布的改变从而增加短链。
总之，定量分析证实改变玉米种子中淀粉合酶Ⅰ的表达导致这些种子淀粉精细结构的多重变化，包括直链淀粉含量的显著增加、淀粉中直链淀粉组分分子量的增加。以及在还原的支链淀粉组分中更多的短链分布。观察到的直链淀粉分子量的增加通过扩展直链淀粉链的分子量分布而实现。
实施例53′反义构建体纯合品系淀粉的功能分析正如对本领域的技术人员所熟知的，纯合品系可来自通过种植分离种群足够的谷粒而得到的杂合植株如品系S048.6.1.10的分离子代、自花传粉从这些种子中获得的植株并且筛选产生的单个子代种子从而鉴定出将此改变的淀粉性状固化的穗(ear)。一旦鉴定出这样的纯合穗，可从该鉴定出的品系及产生正常凹型玉米淀粉的对照品系干燥成熟谷粒中提取较大的淀粉样品。对于每个品系，可称量15g谷粒并置于三角瓶中且于52°浸于50mL的浸渍液(实施例3)中18h。然后过滤谷粒且用水冲洗。用20mm Polytron probe(kinematica GmbH；kriens-Luzern，瑞士)于50mL冷的50mM NaCl中匀浆这些谷粒。用72微米的网筛过滤此匀浆物。过滤物用50mM NaCl将体积增至总共400mL并加入等体积甲苯。然后用磁力棒以足够的速度搅拌该混合物1h从而彻底乳化这两相物质。在加盖的烧杯中将乳化分离进行过夜。蒸发去除上层甲苯相。重悬留在烧杯底部的淀粉浆泥(slurry)并倒入250mL的离心瓶中以25,000 PCF离心15分钟。去上清并按上述通过振摇与离心而以水和丙酮依次清洗淀粉。丙酮清洗和离心后，倒去丙酮并让淀粉于室温在通风橱中干燥过夜。可用具有高灵敏度选项的快速粘度分析仪(Newport Scientific；Sydney，澳大利亚)及Thermocline软件进行粘度(pasting)曲线分析。对于每个品系，称量1.50g淀粉至样品杯中并加入25mL含有1％NaCl的磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液(pH 6.50)中。用下列温度进行粘度曲线分析空转温度50°，于50°维持0.5分钟、线性加热至95°2.5分钟、经4分钟线性冷却至50°、于50°维持4分钟。
实施例6表达玉米淀粉合酶SSb反义及有义构建体的转基因玉米的制备根据与淀粉合酶具有同源性的玉米表达序列标鉴(EST)(T14684)的核苷酸序列，设计寡核苷酸SS9(SEQ ID NO:13)和SS10(SEQ IDNO:14)并用于以在GeneAmpPCR试剂盒(Perkin Elmer)中定义的标准条件通过PCR扩增351bp的DNA片段。5′-AAGCTTGAATTCGCAGTATGCTCGCTCTGTGC-3′〔SEQ ID NO:13〕5′-GGATCCGAATTCGGTTCCACTCGCTCATGTCG-3′〔SEQ ID NO:14〕得到的DNA用Rad Primer DNA标记系统(BRL Life Technologies)标记且然后用于在λ-ZAPⅡ中筛选19DAP玉米胚乳cDNA文库。大约500,000个噬菌斑形成单位被铺板至NZY琼脂板上并转移拷贝到硝酸纤维素膜(Maniatis)上。基本上按Maniatis所述，将固定的DNA与标记的片段杂交并去除滤膜上过剩的探针。总共鉴定出10个阳性噬菌斑，并纯化且将DNA插入子进行进一步特征分析。DNA序列分析显示这10个克隆中的9个彼此相关并在用于起始检测它们的50 bp探针序列区有84％的同源性。余下的克隆与其余的不同且与T14684显示出95％的同源性。在这9个克隆中有一个，即pSPB37含有一2006 bp的插入子(SEQ ID NO:15)并用于制备导入到玉米中的反义构建体。首先用pSPB37中相同的区域代替另一个分离的SSb克隆，pSPB28中的431 bp NcoⅠ片段而较正pSPB37中DNA插入子中存在的额外T而得到pSPB39。用BamHⅠ及BsrGⅠ消化pSPB39而得到1.78kb的SSb片段。用标准的方法(Maniatis)通过与DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段反应而补平该SSb片段及pSPB38载体的4.53 kb的NcoⅠ-SmaⅠ片段。通过用BamHⅠ及XhoⅠ的限制酶消化筛选SSb插入子存在并具有正确方向的细菌转化子。此分析导致pSPB40的鉴定，该质粒含有相对于27kD玉米醇溶蛋白启动子为反义方向的1.8 kb SSb片段(SEQ ID NO:16)及10kD玉米醇溶蛋白3′末端。基本上按实施例1中所述，每次轰击用1.33μg pSPB40和0.34μg pML108的标记基因片段将纯化的pPSB40(图4)DNA导入玉米愈伤组织细胞中。通过PCR分析测定愈伤组织样品中性状基因DNA的存在并将性状基因阳性样品用于进一步的转化方案中。
同时制备全长的有义SSb构建体并通过粒子轰击方法导入玉米愈伤组织中，用pSPB39作为起始材料首先获得SSb cDNA的完整拷贝。从发育胚乳中提取总RNA的Northern印迹分析表明SSb转录本大约为3.0 kb。通过对供应商提供方法作一定修改，用5′RACE系统试剂盒(Life Technologies)通过cDNA末端快速扩增(RACE)法获取SSbcDNA的其余5′序列。第一链cDNA的合成用基因特异性引物OSPB104(SEQ ID NO:17)于50°进行。5′-CCATCTCCGTAGCACACACC-3′〔SEQ ID NO:17〕用Advantage GC PCR试剂盒(lontech)以RACE试剂盒中提供的AAP引物及基因特异性引物OSPB105(SEQ ID NO:18)进行dI-dG-尾部cDNA的扩增。5′-GTGCCAAGGAACCTCAACAG-3′〔SEQ ID NO:18〕用AAP引物及OSPB106(SEQ ID NO:19)以类似的方式再次扩增。
5′-GAGGGGCATCAATGAACACA-3′〔SEQ ID NO:19〕通过连接获自XbaⅠ与KpnⅠ消化的1485 bp 5′RACE产物而得到的1346 bp片段与XbaⅠ消化及KpnⅠ部分消化pSPB39而得到的1604 bp3′SSb区域而制备SSb cDNA的全长等价物，pSPB45。通过PCR在pSPB45编码区的起始密码子处导入NcoⅠ位点而得到pSB46。用BsrGⅠ消化pSPB46并用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段的末端补平反应(Maniatis)而使5′突出端补平。用NcoⅠ消化后，分离2248 bp的SSb片段(SEQ ID NO:20)并克隆入pSPB38的4.53 kb NcoⅠ-SmaⅠ片段中而得到pSPB47(图5)。质粒pSPB47含有有义方向的完整SSbcDNA，其两侧为27kD玉米醇溶蛋白启动子及10kD玉米醇溶蛋白的3′末端所包围。基本上按实施例1中所述，每次轰击用1.43μg pSPB47和0.33μg pML 108的标记基因片段将纯化的pSPB47 DNA导入玉米愈伤组织培养细胞中。通过PCR分析测定愈伤组织样品中性状基因DNA的存在并将阳性样品进一步用于转化方案中。
实施例7含有SSB反义构建体转化玉米植株淀粉的分析从按前述用SSb反义构建体转化的玉米植株获取的单个种子中提取淀粉。提取的淀粉按前述酶促去分支并通过凝胶渗透加以分析。注射10μL去分支淀粉并于90°系列流经3个窄孔柱(Polymer Labs,Mini-Mix C,D,E，其中Mini-Mix C为保护柱)并以0.35mL/分钟的流速用DMSO加以洗脱。取样间隔为35分钟。用反射指数检测器(Waters)分别用于检测和数据收集及分析，其中的检测器带有计算机运行的Waters Millenium层析管理系统，具有GPC选项(2.15.1版，Waters公司)。出芽短梗孢糖标准(标准1380K、100K、23.7K、5.8K、666和180mw，标准2853K、186K、48K和12.2K)的滞留时间用于建立第三级校正并用Millenium软件计算分子量分布。
如本领域技术人员所熟知的，在每个单个转基因品系中一般没有观察到反义现象。因此，检测来自多个品系的单个谷粒并且如所预期，部分但不是所有的品系具有改变淀粉表型的谷粒。同样如本领域中技术人员所熟知的，通过粒子轰击而制备的转基因玉米植株一般对于导入的转基因是杂合的，并且将以可预计的孟德尔方式分离转基因。在R0植株的自交穗上，为负责淀粉产生组织的三倍体胚乳对于0、1、2和3拷贝导入的转基因将分别分离为1∶1∶1∶1。为了对于观察的任何一个转基因剂量具有合理的几率，提取10个S064.1.2.1品系(命名为XBG01717-1到XBG01717-10)单个谷粒的淀粉并按上述去分支和分离淀粉。S064.1.2.1产生分离出具有不同类型分子量分布淀粉的种子。部分种子淀粉(XBG01717-1、2、3、4、5、6和8)产生较正常凹型玉米支链淀粉更为异质性的支链淀粉(位于log MW 3与logMW 4.2之间的区域)，而正常凹型玉米显示出典型的双型性分布(XBG01717-7、9和10)。图7显示获自两种代表性谷粒，即正常的分离子XBG01717-9和改变的分离子XBG01717-2的分支淀粉的分子量分布。与正常的分离子一样典型，图7显示XBG01717-9在log MW 3.5处具有一单一显著峰且在log MW 3.9处具有一单一显著的肩。图7同时显示了异常分离子(XBG01717-2)在log MW 3.5的主峰处具有一个分隔(split)并且在log MW 3.9处具有一较少显著的肩。显示出该改变的支链淀粉结构的分离子同时显示出层析的直链淀粉部分(log MW＞4.2)丰度的增加虽然此增加在有些分离子中较其它分离子中更大。比较分离穗上含有改变及正常支链淀粉种子出现的比例与用卡方(x2)统计的各种可能的预期遗传模式。观察到的70％改变30％正常种子的频率与下面的两假说相匹配，即简单显性假说(1个或更多剂量的转基因足以产生改变的淀粉结构)(x2=0.13)或需要2个或更多个剂量的转基因改变淀粉结构的假说(半显性，x2=1.6)。玉米SSb反义分离子支链淀粉精细结构分析为了扩展正常及SSb反-义淀粉的结构比较，通过荧光团标记与电泳比较来自上述这两类淀粉(正常对变化)。从单个玉米谷粒中制备淀粉，按上述去分支并重悬于DMSO中。吸取4μl稀释的样品至0.2mL PCR反应管中，并加入2μl荧光团(于15％乙酸中的0.2M 8-氨基-1,3,6-芘三磺酸(pyrenetrisu lfonic acid)三钠盐)及还原剂(水中1M氰基硼氢化物)。盖紧PCR管并于4000rpm离心2分钟，然后于37°温育16-18小时。在水中制备0.2mg/mL maltohepraose标准并以与淀粉样品相同的方式加以标记。
在0.2mm间隔的玻璃测序板之间倒入下面的胶溶液，即6M尿素中5％聚丙烯酰胺(19∶1丙烯酰胺bis)、1×TBE、0.05％过硫酸铵和0.07％TEMED，测序板加样孔到最下端读数距离(well-to-read)为36cm。聚合3到4h后，插入鲨鱼齿梳并用电泳缓冲液(1×TBE)冲洗加样孔。于上样缓冲液(于80％甲酰胺中5mM的EDTA，以5mg/mL葡聚糖蓝作为观察加样孔的标记)中将荧光团标记的样品稀释200到500倍并将1.5μl上样于交替孔中。Maltoheptaose标准用于定位DP7峰。电泳于51°以3000伏在Perkin-Elmer ABI 377基因测序仪中进行2小时并且用ABI GeneScan软件分析结果。图8为显示ABI结果的图，其描述为DP7与DP30间每条链的相对％。
计算XBG01717-2，一种改变的分离子和XBG01717-7，一种正常的分离子DP7与DP30间链的总摩尔数并且计算这些总链的相对摩尔百分比。此分布描述于图8中，其中显示与DP12和DP26之间链具有更高相对摩尔％的正常分离子XBG01717-7相比，改变的分离子XBG01717-2在DP7与DP11之间链具有更高的相对摩尔％。对于DP7与DP8来说，改变分离子的相对摩尔％是正常分离子的2倍。这些结果显示改变的分离子很短的AP链(DP7到DP10)增加而较大的AP链(DP14到DP23)减少。
序列表<110>E.I.du Pont de Nemours and Company<120>修饰淀粉生物合成酶基因表达从而在谷物作物中生产淀粉<130>BB-1147-A<140><141><150>060/094,436<151>1998-07-28<160>20<170>Microsoft office 97<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>1aagcttgaat tccacagaat cagggtacag g 31<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>2gaaggactgg cactagactg g 21<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>3ggatccgaat tctcctttct cagcaaacgg 30<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述PCR引物<400>4aagcttgaat tcctgggatt gccacctgaa ttg 33<210>5<211>2491<212>DNA<213>玉米<400>5agcgcgcccg aggcggcacc ccaccgtcgt agtagaagac acgggacgca cccccgcagc 60ctcgctcgct cgctcccctc acttcctccc cgcgcgatcc acggcccccg ccccccgcgc 120tcctgtctgc tctccctctc cgcaatggcg acgccctcgg ccgtgggcgc cgcgtgcctc 180ctcctcgcgc gggccgcctg gccggccgcc gtcggcgacc gggcgcgccc gcggcggctc 240cagcgcgtgc tgcgccgccg gtgcgtcgcg gagctgagca gggaggggcc cgcgccgcgc 300ccgctgccac ccgcgctgct ggcgcccccg ctcgtgcccg gcttcctcgc gccgccggcc 360gagcccacgg gtgagccggc atcgacgccg ccgcccgtgc ccgacgccgg cctgggggac 420ctcggtctcg aacctgaagg gattgctgaa ggttccatcg ataacacagt agttgtggca 480agtgagcaag attctgagat tgtggttgga aaggagcaag ctcgagctaa agtaacacaa 540agcattgtct ttgtaaccgg cgaagcttct ccttatgcaa agtctggggg tctaggagat 600gtttgtggtt cattgccagt tgctcttgct gctcgtggtc accgtgtgat ggttgtaatg 660cccagatatt taaatggtac ctccgataag aattatgcaa atgcatttta cacagaaaaa 720cacattcgga ttccatgctt tggcggtgaa catgaagtta ccttcttcca tgagtataga 780gattcagttg actgggtgtt tgttgatcat ccctcatatc acagacctgg aaatttatat 840ggagataagt ttggtgcttt tggtgataat cagttcagat acacadtcct ttgctatgct 900gcatgtgagg ctcctttgat ccttgaattg ggaggatata tttatggaca gaattgcatg 960tttgttgtca atgattggca tgccagtcta gtgccagtcc ttcttgctgc aaaatataga 1020ccatatggtg tttataaaga ctcccgcagc attcttgtaa tacataattt agcacatcag 1080ggtgtagagc ctgcaagcac atatcctgac cttgggttgc cacctgaatg gtatggagct 1140ctggagtggg tattccctga atgggcgagg aggcatgccc ttgacaaggg tgaggcagtt 1200aattttttga aaggtgcagt tgtgacagca gatcgaatcg tgactgtcag taagggttat 1260tcgtgggagg tcacaactgc tgaaggtgga cagggcctca atgagctctt aagctccaga 1320aagagtgtat taaacggaat tgtaaatgga attgacatta atgattggaa ccctgccaca 1380gacaaatgta tcccctgtca ttattctgtt gatgacctct ctggaaaggc caaatgtaaa 1440ggtgcattgc agaaggagct gggtttacct ataaggcctg atgttcctct gattggcttt 1500attggaaggt tggattatca gaaaggcatt gatctcattc aacttatcat accagatctc 1560atgcgggaag atgttcaatt tgtcatgctt ggatctggtg acccagagct tgaagattgg 1620atgagatcta cagagtcgat cttcaaggat aaatttcgtg gatgggttgg atttagtgtt 1680ccagtttccc accgaataac tgccggctgc gatatattgt taatgccatc cagattcgaa 1740ccttgtggtc tcaatcagct atatgctatg cagtatggca cagttcctgt tgtccatgca 1800actgggggcc ttagagatac cgtggagaac ttcaaccctt tcggtgagaa tggagagcag 1860ggtacagggt gggcattcgc acccctaacc acagaaaaca tgttgtggac attgcgaact 1920gcaatatcta catacaggga acacaagtcc tcctgggaag ggctaatgaa gcgaggcatg 1980tcaaaagact tcacgtggga ccatgccgct gaacaatacg aacaaatctt ccagtgggcc 2040ttcatcgatc gaccctatgt catgtaaaaa aaggaccaaa gtggtggttc 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420agatctcatc caatcttcaa gctctgggtc accagatcca agcatgacaa attgaacatc 480ttcccgcatg agatctggta tgataagttg aatgagatca atgcctttct gataatccaa 540ccttccaata aagccaatca gaggaacatc aggccttata ggtaaaccca gctccttctg 600caatgcacct ttacatttgg cctttccaga gaggtcatca acagaataat gacaggggat 660acatttgtct gtggcagggt tccaatcatt aatgtcaatt ccatttacaa ttccgtttaa 720tacactcttt ctggagctta agagctcatt gaggccctgt ccaccttcag cagttgtgac 780ctcccacgaa taacccttac tgacagtcac gattcgatct gctgtcacaa ctgcaccttt 840caaaaaatta actgcctcac ccttgtcaag ggcatgcctc ctcgcccatt cagggaatac 900ccactccaga gctccatacc attcaggtgg caacccaagg tcaggatatg tgcttgcagg 960ctctacaccc tgatgtgcta aattatgtat tacaagaatg ctgcgggagt ctttataaac 1020accatatggt ctatattttg cagcaagaag gactggcact agactggcat gccaatcatt 1080gacaacaaac atgcaattct gtccataaat atatcctccc aattcaagga tcaaaggagc 1140ctcacatgca gcatagcaaa ggagtgtgta tctgaactga ttatcaccaa aagcaccaaa 1200cttatctcca tataaatttc caggtctgtg atatgaggga tgatcaacaa acacccagtc 1260aactgaatct ctatactcat 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权利要求
1．一种生产转化谷物作物的方法，包括(a)制备包括编码非-GBSSⅠ淀粉合酶结构基因或其片段之核酸片段的嵌合基因，其中的结构基因或其片段的上游一侧以有义或反义的方向可操作地连接到编码指导玉米谷物作物组织中基因表达启动子的核酸片段上，并且其下游一侧可操作地连接到编码用于转录终止的适当调节序列的核酸片段上；和(b)用步骤(a)的嵌合基因转化谷物作物，与源自不具有所述嵌合基因谷物作物的淀粉精细结构相比，其中所述的嵌合基因的表达导致源自所述转化谷物作物谷粒的淀粉精细结构的改变。
2．权利要求1的方法，其中所述的谷物作物为玉米品种。
3．权利要求2的方法，其中编码淀粉合酶结构基因或其片段的核酸片段源自玉米。
4．权利要求3的方法，其中的编码淀粉合酶结构基因或其片段的核酸片段编码玉米SS1淀粉合酶的全部或一部分。
5．权利要求4的方法，其中的编码淀粉合酶结构基因或其片段的核酸片段与分离的列于SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12中成员的核酸片段基本上类似。
6．权利要求1的方法，其中的淀粉精细结构的改变包括所述淀粉中直链淀粉分子组分对支链淀粉分子组分比例的改变。
7．权利要求1的方法，其中的淀粉精细结构的改变包括所述淀粉中支链淀粉组分的分子量分布的改变。
8．权利要求1的方法，其中的淀粉精细结构的改变包括所述淀粉中直链淀粉组分的分子量分布的改变。
9．权利要求1的方法，其中编码淀粉合酶结构基因或其片段的核酸片段在上游一侧以有义或反义的方向可操作地连接到编码指导玉米胚乳组织中基因表达的启动子上和在下游一侧连接到编码合适的转录终止调节序列的核酸片段上。
10．通过权利要求1的方法制备的玉米品种或其任何子代。
11．权利要求9的玉米品种，与未转化玉米谷粒中分离的淀粉的直链淀粉分子组分相比，其中从所述玉米品种谷粒中分离淀粉的直链分子组分有显著增加。
12．从通过权利要求1方法制备的玉米品种或其任何子代的谷粒中分离的淀粉。
13．从通过权利要求1方法制备的谷物作物品种或其任何子代中制备的面粉。
14．一种制备增稠食料的方法，包括合并食料、水和有效量的获自权利要求13的面粉并在必要时煮制此得到的组合物从而制备增稠的食料。
15．一种用嵌合基因转化的玉米品种及其子代，其中的嵌合基因包括编码玉米SSⅠ淀粉合酶结构基因或其片段的核酸片段，而所述核酸片段在上游一侧以有义或反义的方向可操作地连接到编码指导玉米胚乳组织中基因表达的启动子上和在下游一侧连接到编码合适的转录终止调节序列的核酸片段上。
16．权利要求3的方法，其中所述的编码淀粉合酶结构基因或其片段的核酸片段编码玉米SSb淀粉合酶的全部或一部分。
17．权利要求4的方法，其中的编码SSb淀粉合酶结构基因或其片段的核酸片段与选自SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:20的分离的核酸片段基本上类似。
18．权利要求1的方法，其中所述的淀粉精细结构的改变包括降低所述淀粉中支链淀粉DP7对DP10组分的相对摩尔数。
19．一种通过权利要求1方法制备的具有下降的退化趋势的淀粉。
全文摘要
本发明公开了利用cDNA克隆构建有义和反义基因用于抑制玉米中淀粉合酶的酶促活性。更为具体地,本发明涉及一种控制谷物作物谷粒中淀粉精细结构的方法,包括:(1)制备包括编码淀粉合酶结构基因或其片段核酸片段的嵌合基因,其中的结构基因或其片段上游一侧以有义或反义的方向可操作地连接到编码指导玉米胚乳组织中基因表达启动子的核酸片段,并且下游一侧可操作地连接到编码用于转录终止的适当调节序列的核酸片段上;和(2)用所述的嵌合基因转化谷物作物,与源自不具有所述嵌合基因谷物作物的淀粉精细结构相比,其中所述嵌合基因的表达导致源自所述转化谷物作物谷粒的淀粉精细结构的改变。
文档编号C12N15/29GK1314946SQ99809049
公开日2001年9月26日 申请日期1999年7月26日 优先权日1998年7月28日
发明者K·E·布罗格利, J·E·莱特纳 申请人:纳幕尔杜邦公司