专利名称：2－氧－3－羟基－lsd的半抗原、免疫原、抗体和偶联物的制作方法
技术领域：
本发明涉及半抗原，该半抗原用来制备在竞争性免疫分析中用来检测LSD主要代谢物2-氧-3-羟基-LSD(2-oxo-3-hyroxy-LSD)的免疫原、抗体和偶联物。
本发明还涉及检测或测定2-氧-3-羟基-LSD的方法和试剂盒，本发明的方法和试剂盒不会与亲本LSD自身或去甲-LSD发生明显交叉反应。
“检测”意思是指对物质的存在与否进行定性分析。
“测定”是指对物质的量进行定量分析。
背景技术：
麦角酸二乙胺(LSD)(图1.1)是一种对精神起作用的强效化合物，被分类为I类给药方案的药物，该化合物可以以药丸、溶液和浸渍糖块、吸水纸或维他命片的形式提供。
LSD是一种非常强的迷幻剂，其效力是二甲4羟色磷酸胺(psilocybin)的10-150倍，是酶斯卡灵(mescaline)的4500-9275倍，该化合物的异构体d-异-LSD(图1.2)没有活性。
由于对LSD在人体中给药的限制增加，因此目前关于LSD在人体中的分布、代谢特点(metabolic profile)以及吸收(extraction)的了解有限。关于LSD在动物中的分布和代谢特点已有相当多的报道，它们发现，在动物中最常见的代谢物是去甲(nor)-LSD(图1.3)、2-氧-3-羟基-LSD(图1.4)、2-氧-LSD、13-羟基-LSD、14-羟基-LSD、N-脱乙基-LSD、N-乙基-N-(2-羟乙基)-LSD(酰胺N)、N-乙基-N-乙烯基-LSD(酰胺N)和麦角酸。主要的代谢物是去甲-LSD3和2-氧-3-羟基-LSD4，其中后者是最近在人尿中进行药物检测时被检测到的，该化合物通过与参考化合物比较LC-MS特性已得到证实。2-氧-3-羟基-LSD4的平均浓度比LSD高20倍。在人尿的常规分析中，也能检测到d-异-LSD2，该化合物被认为是LSD不正当制备的副产品。
由于消耗的剂量非常低(通常40-120μg)，并且由于代谢很快而排泄至尿中的仅有不足1％未发生改变，因此，生物样品中LSD的鉴定对于科学家来说是一个很大的挑战。而且，LSD在酸、热和光照条件下的不稳定性更增加了对其进行鉴定的困难。因为LSD被代谢成许多种化合物，因此大多数已知方法旨在鉴定生物样品中未改变的LSD(或亲本LSD)。
虽然LSD最通常是通过GC-MS在尿中检测，但是免疫分析法，特别是竞争性结合免疫分析法是现有最简单且最省时的筛选方法。竞争性结合免疫分析法，顾名思义，是测量给定量标记抗原(即“检测试剂”，或偶联物)与未知量的未标记抗原(即“样品”)之间竞争结合抗体的情况。
针对LSD的商业免疫分析方法包括放射免疫分析法，该方法非常灵敏，但是必需放射性核素示踪剂(如125I和3H)，而且在有些情况下还需要一个预先吸收步骤。利用放射免疫分析法检测尿中的药物时，通过比较样品和含有500pg/ml LSD的标准品的计数而将样品鉴定为阳性或阴性。
商业上也使用非同位素均相免疫分析来检测LSD。克隆酶供体免疫分析(Cloned Enzyme Donor Immunoassay，CEDIA，Boehringer Mannheim)和酶多重免疫分析(Enzyme Multiplied Immunoassay，EMIT Behring Diagnostics)都是基于酶活化的原理。联机免疫分析(Online Immunoassay)(RocheDiagnostic Systems)是基于溶液中微粒的动力学相互作用。这三种分析法是特别设计用于大量分析或自动分析仪的。微滴板免疫分析(MicroplateImmunoassay，STC Diagnostics)可用于小量检测。这些非同位素LSD免疫分析法与原始的LSD放射免疫分析结果比较一致。
所有现有市售LSD免疫分析法都特别适用于亲本药物，LSD，且表现出与LSD代谢物的低交叉反应性。
例如，US 6207396 B1(Micorgenics Corporation)公开了LSD亲本药物(不是2-氧-3-羟基-LSD)的吲哚环N-1位置发生改变而衍生的半抗原。US6207396 B1中的抗体是d-LSD特异性的，与2-氧-3-羟基-LSD(1.82％)或异LSD(0.04％)不会发生强的交叉反应(见表I)。
现有技术未发现2-氧-3-羟基-LSD特异性抗体。EP1148339 A2(RocheDiagnostics Corporation)公开了在2-氧-3-羟基-LSD的吲哚环上或在2-氧-LSD上的N-1位置衍生而成的半抗原。EP1148339 A2中，抗2-氧-3-羟基-LSD的抗体与抗亲本药LSD的抗体表现出高水平交叉反应(74.9-84.4％)，而抗2-氧-3-羟基-LSD的抗体与抗第二种代谢物去甲-LSD的抗体表现出低水平交叉反应(1.8-4.6％)。
EP0816364 A1(F.Hoffmann-La-Roche AG)和Bioconjugate Chemistry1997，8，pp896-905分别描述了如何制备在LSD自身吲哚环的N-1位点衍生或由去甲-LSD衍生而成的半抗原。在Bioconjugate Chemistry 1997，8，pp 896-905中，抗免疫原4的抗体与抗d-LSD的抗体表现出100％的交叉反应，与抗去甲-LSD的抗体表现出20％的交叉反应，与抗2-氧-3-羟基-LSD的抗体表现出50％的交叉反应。抗免疫原8的抗体与抗LSD的抗体表现出100％的交叉反应，与抗去甲-LSD的抗体表现出40％的交叉反应，与抗2-氧-3-羟基-LSD的抗体表现出小于20％的交叉反应。
Clin.Chem.23/2，169-174(1977)描述了一种在血清和尿中检测LSD的放射免疫分析法，该方法利用了针对两种不同免疫原的抗血清，这两种免疫原中，LSD自身在吲哚氮原子上发生改变，或经由8β-羧酰胺(carboxamide)的氮而发生改变。
本发明人不了解用交联剂在2-氧-3-羟基-LSD的8β-羧酰胺的氮上衍生得到的任何半抗原。
本发明人也不了解对2-氧-3-羟基-LSD具有特异性而对亲本LSD自身或对去甲-LSD无显著交叉反应的抗体。
发明内容
本发明的一个目标是克服现有技术中的上述所有或部分缺陷，或者提供一种替代方案。
本发明一个优选实施方案的目的是提供一种检测或测定2-氧-3-羟基-LSD的量的方法和试剂盒。
本发明的目的是通过制备一种对2-氧-3-羟基-LSD具有高特异性而与亲本LSD或与去甲-LSD发生非显著交叉反应的抗体，从而克服现有的LSD代谢物免疫分析缺乏特异性的问题。“非显著”是指，将与2-氧-3-羟基-LSD的反应设为100％时，交叉反应性小于约25％，优选小于约10％，更优选小于约7.5％，甚至更优选小于约5％。为了达到这种特异性，本发明所描述的半抗原是在2-氧-3-羟基-LSD的8β-羧酰胺的氮上发生衍生而成。
本发明的一个优选实施方式的另一个目标是提供一种抗体，该抗体至少能与2-氧-3-羟基-LSD的3-羟基-2-吡咯烷酮结构表位相结合。
本发明描述了一种用交联剂在2-氧-3-羟基-LSD(图1-4)的8β-羧酰胺的氮或在2-氧-3-羟基-LSD的N-6衍化而得到的半抗原。
第一方面，本发明提供了具有如下结构式的半抗原 其中R是二价连接基因，X是一个末端基团。
优选的，R包括被取代的或未被取代的、支链的或直链的、饱和的或不饱和的亚烷基半分子(moiety)，被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的环亚烷基半分子，或被取代的或未被取代的亚芳基半分子；X独立的包括羧酸或其酯、醛、硫代羧酸或其酯，优选硫代乙酰基或卤代羧酸或其酯，优选卤代乙酰基。
因此，在以上提到的结构式中，交联剂包含-R-X。
更优选的，R是C1-6，最优选C2-3，被取代的或未被取代的、直链饱和亚烷基半分子。
合适的环亚烷基半分子包括环己烷。
合适的亚芳基半分子包括苯和二甲苯。
优选的，X是羧酸。
最优选的，该半抗原是衍生自2-氧-3-羟基-LSD的下列半抗原 半抗原A在本发明的半抗原A中，R是具有2个碳原子的饱和、未取代、直链亚烷基，本发明所述的半抗原B中，R是具有3个碳原子的饱和、未取代、直链亚烷基。
末端基团X用于将本发明的半抗原偶联到载体材料上，从而制备出相应的免疫原。所得免疫原可给药宿主，以使宿主产生渴望的特异性抗血清，优选多克隆抗血清，该抗血清可随后用于开发灵敏的免疫分析法以检测2-氧-3-羟基-LSD。
因此，本发明也提供了一种免疫原，该免疫原包括本发明的半抗原以及与该半抗原偶联的能够赋予抗原性的载体材料。优选的，该载体材料是蛋白质、蛋白质片段、合成多肽或半合成多肽。
本发明另一方面涉及抗本发明的免疫原的抗体，所述抗体至少能与2-氧-3-羟基-LSD的3-羟基-2-吡咯烷酮结构表位相结合。优选的，所述抗体被固定在支持物上。优选的，所述抗体是多克隆抗体，或者是单克隆抗体。
本发明另一方面包括一种含有本发明的半抗原的偶联物，其中的半抗原与可检测的标记物共价连接。优选的，标记物选自酶、发光物质、放射性物质、或它们的混合物，更优选的，标记物是酶，优选过氧化物酶，最优选辣根过氧化物酶(HRP)。或者，或另外，发光物质可以是生物发光材料、化学发光材料或荧光材料。
本发明还提供了一种制备抗体的方法，该方法包括用本发明的免疫原重复给药以免疫动物(优选脊椎动物，最优选哺乳动物)，然后收集被免疫的动物的血清。优选的，该方法还包括将所述的血清抗体固定在支持物上，优选为固相支持物，最优选为聚苯乙烯固相支持物。利用该方法制备的抗体是多克隆抗体。
本发明另一方面包括一种检测或测定样品中的2-氧-3-羟基-LSD的方法，该方法包括将样品与本发明的偶联物或其混合物接触，以及与本发明的抗体或其混合物接触，检测或测定被结合的偶联物，根据标准曲线推导出样品中2-氧-3-羟基-LSD的存在或量。
本发明另一方面包括一种检测或测定2-氧-3-羟基-LSD的试剂盒，该试剂盒含有本发明的偶联物或其混合物，以及本发明的抗体或其混合物。该试剂盒可选择地包括关于使用所述偶联物和抗体以检测或测定样品中的2-氧-3-羟基-LSD的说明书。
优选的，样品是溶液，如生物流体，更优选样品是血清或尿，最优选样品是来自病人的溶液。
在本发明的方法和试剂盒中，优选(免疫原上和偶联物上)各自的交联剂各不相同。
本发明另一方面涉及，本发明的偶联物或其混合物和本发明的抗体或其混合物检测或测定样品(如生物流体)中的2-氧-3-羟基-LSD的用途。
本发明的焦点是2-氧-3-羟基-LSD(图1.4)的特异性抗体的制备。为了获得这种特异性，半抗原A是由2-氧-3-羟基-LSD在N-羧酰胺上发生衍生而成。
半抗原的制备本发明的半抗原A由麦角酸经过三个步骤制备得到(图2)。用1，1’-羰基二咪唑(CDI)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液将麦角酸5的羧基活化，使获得的活化酯中间产物与N-乙基N-(2-乙氧甲酰(carbethoxy))乙胺10(使丙烯酸乙酯与乙胺反应而制得)反应产生酯6，用次氯酸钙氧化酯6的酒石酸盐的吲哚环的双键制得酯2-氧-3-羟基麦角酸N-乙基N-(2-乙氧甲酰)乙酰胺7，所述次氯酸钙是在原位向氢氧化钙中通入氯气反应制得。用氢氧化钾的四氢呋喃水溶液使酯7皂化从而得到半抗原A。
本发明所述的半抗原B由去甲-LSD3经过三个步骤得到(图3)。在氢化钠的DMF溶液存在的情况下，用乙基4-溴代丁酸酯使去甲-LSD3发生N-烷化而产生酯8，使用对酯6进行氧化所用的条件使酯8吲哚环的双键氧化，产生酯2-氧-3-羟基-6-(3-乙氧甲酰)丙基-去甲-LSD9。在四氢呋喃中用氢氧化钾水溶液使酯9皂化从而得到半抗原B。
免疫原和偶联物的制备虽然本发明的半抗原具有确定的结构表位，但是它们本身不具有免疫原性，因此需与载体材料偶联，所述的载体材料通过给药宿主动物能诱导产生免疫反应。合适的载体材料一般包含多氨基酸片段，且包括多肽；蛋白质，如白蛋白、血清蛋白，例如，球蛋白和眼晶状体蛋白及脂蛋白。例如，蛋白质载体材料包括牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、牛γ球蛋白、结合甲状腺素的球蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)等。替代地，可使用含有足够数目的可以利用的氨基的聚(氨基酸)，如赖氨酸，也可以使用其它多种带有反应性功能基团的合成或天然多聚物。具体而言，可将碳水化合物、酵母或多糖偶联到本发明所述半抗原上从而制得本发明所述免疫原。
本发明的每种半抗原也可以与标记物，如酶(例如辣根过氧化物酶)、具有荧光特性的物质或放射性标记偶联，从而产生用于免疫分析的偶联物(或检测试剂)。该荧光物质可以是，例如单价荧光素残基或其衍生物。
在用本发明的半抗原制备免疫原或偶联物时，如果所述半抗原中存在巯基，即其中的X是硫代羧酸或硫代羧酸酯，则首先利用异双功能连接物将顺丁烯二酰亚胺、卤-或乙烯基砜基团引至载体材料或标记物(酶或标记)，所述异双功能连接物如N-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰基氧)琥珀酰亚胺酯(GMBS)，琥珀酰亚胺基4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，(m-顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰)-N-羟基琥珀酰亚胺(MBS)，琥珀酰亚胺基4-(ρ-顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)，N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸盐(SLAB)，溴乙酰氨基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸盐(SPDP)，或乙烯基砜(Pierce ChemicalCompany，USA)。经过如此修饰的载体材料或标记物因此可通过半抗原上的巯基来偶联。对于没有巯基的半抗原(如本发明的半抗原A)，不需要利用标准的偶联方法(用混合酸酐、EDC或琥珀酰亚胺活化半抗原)来预先修饰载体材料或标记物就可进行偶联。
为了证实半抗原与载体材料发生了充分的偶联，在免疫接种之前，用基质辅助UV激光解吸/离子化飞行时间质谱分析(MATDI-TOF MS)来评估每种免疫原。在使用优选的载体材料(如牛血清白蛋白)的情况下，优选每个载体分子最少使用6个半抗原分子。本发明的每种免疫原都能用于免疫，以产生本发明的抗体。
对免疫原进行MATDI-TOF分析的常规方法使用Voyager STR Biospectrometry Research Station激光解吸质谱分析仪配合延迟的抽提来进行MALDI-TOF质谱分析。将需要分析的每一样品取等份试样，在0.1％的三氟乙酸(TFA)水溶液中稀释，以制备1mg/ml的样品溶液。等份试样(1μl)用芥子酸基质来分析，以牛血清白蛋白(Fluka)为外在标准品。图5显示了BSA载体材料的分析结果。如图所示，存在一个主要信号，它表示该样品的平均质子化质量(protonated mass)为m/z 66400。在m/z33202处的信号与带有双倍电荷(doubly-charged)的主要成分相符。
抗血清的制备为了生产多克隆抗血清，将本发明的每种免疫原与弗氏(Freund’s)佐剂混合，将混合物注射到宿主动物(如兔、绵羊、小鼠、豚鼠或马)中。此后还进行多次注射(加强免疫)，取血清样进行抗体滴度测定。当达到最佳滴度时，将宿主动物放血以产生适量体积的特异性抗血清。抗体纯化需要达到的程度根据其用途而定。对多种用途而言，根据无需纯化，但是，在其它情况(如需要将抗体固定至固相支持物时)，可采用纯化步骤除去不需要的物质并消除非特异性结合。
本发明的特异性抗体可在生物化学测定法中用作试剂以检测或测定生物流体中的2-氧-3-羟基-LSD。
在以下实施例中，除非另有说明，百分比采用的是体积百分比(v/v)。
图1显示LSD及相关化合物的结构。
图2示意2-氧-3-羟基LSD的半抗原A和免疫原A的制备。
图3示意2-氧-3-羟基LSD的半抗原B和免疫原B的制备。
图4示意2-氧-3-羟基LSD的竞争性ELISA微滴板试验。
图5显示了BSA载体材料的分析结果。
图6显示2-氧-3-羟基麦角酸N-乙基N-(2-羧基)乙酰胺与BSA的偶联物(免疫原A)的MALDI-TOF检测结果。
图7显示2-氧-3-羟基-6-(3-羧基)丙基-去甲-LSD与BSA的偶联物(免疫原B)的MALDI-TOF检测结果。
图8显示N-乙基N-(2-乙氧甲酰)乙胺连接物10的红外光谱(FT-IR)。
图9显示麦角酸N-乙基N-(2-乙氧甲酰)乙酰胺6的红外光谱(FT-IR)。
图10显示2-氧-3-羟基麦角酸N-乙基N-(2-乙氧甲酰)乙酰胺7的红外光谱(FT-IR)。
图11显示6-(3-乙氧甲酰)丙基-去甲-LSD 8的红外光谱(FT-IR)。
图12显示2-氧-3-羟基-6-(3-乙氧甲酰)丙基-去甲-LSD9的红外光谱(FT-IR)。
图13显示2-氧-3-羟基-6-(3-羧基)丙基-去甲-LSD(半抗原B)的红外光谱(FT-IR)。
具体实施例方式
实施例实施例1N-乙基N-(2-乙氧甲酰)乙胺连接物10的合成在0℃，将丙烯酸乙酯(8.0ml，73.92mmol)于40ml四氢呋喃(THF)中的溶液逐滴加到110ml 2M乙胺的四氢呋喃(THF)溶液中，将反应混合液室温搅拌过夜。使反应溶液通过棉塞过滤，减压浓缩，得到名为化合物10(9.01g，84％)的澄清溶液。
υmax/cm-13319.68，2969.10，1732.07，1191.87(FT-IR图8)实施例2麦角酸N-乙基N-(2-乙氧甲酰)乙酰胺6的合成麦角酸5(934mg，3.27mmol)在40ml干的二甲基甲酰胺(DMF)中的混合物用1’1-羰基二咪唑(CDI，795mg，4.91mmol)处理，在氮气下室温搅拌1小时。逐滴加入N-乙基-N-(2-乙氧甲酰)乙胺连接物10(1.90g，13.08mmol)在10ml干的二甲基甲酰胺(DMF)中的溶液，将反应混合溶液室温搅拌过夜。反应混合物经减压浓缩，将得到的残余物溶于200ml氯仿中。该氯仿溶液用100ml水洗两次，用无水硫酸钠干燥，经减压浓缩得到粗制的题述化合物6(2.2g)，为油的形式。它无需进一步纯化就可用于以下实施例。
υmax/cm-13121.90，2987.10，2848.65，1735.30，1676.97，1202.97(FT-IR图9)实施例32-氧-3-羟基麦角酸N-乙基N-(2-乙氧甲酰)乙酰胺7的合成将酒石酸(2.52g，16.79mmol)溶于40ml水中，并在冰上冷却。向该混合物中加入2.2g粗制的麦角酸N-乙基N-(2-乙氧甲酰)乙酰胺6(1.29g，3.27mmol；基于来自上述实施例的100％产量)。将氯气(1.55g，21.83mmol)溶入氢氧化钙(0.81g，10.93mmol)在240ml水中形成的溶液中，以此制备次氯酸钙溶液。使浑浊液通过0.45μM滤膜除去任何不溶物质，用冰冷却。将麦角酸N-乙基N-(2-乙氧甲酰)乙酰胺酒石酸酯溶液加到170ml新制备的次氯酸钙溶液中。将反应混合物在0-5℃搅拌30min，用80ml饱和碳酸氢钠溶液稀释，用6×100ml氯仿抽提。将氯仿抽提物合并，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。使所得残余物在硅胶上层析，获得2-氧-3-羟基麦角酸N-乙基N-(2-乙氧甲酰)乙酰胺7(385mg，28％)，这是一种无定形的黑褐色固体(在硅胶上用25％甲醇的氯仿溶液作为洗脱剂时，Rf为0.53)。
υmax/cm-13180.04，2980.66，2937.48，2803.85，1731.59，1669.11，1448.37，1385.34(FT-IR图10)实施例42-氧-3-羟基麦角酸N-乙基N-(2-羧基)乙酰胺(半抗原A)的合成2-氧-3-羟基麦角酸N-乙基N-(2-乙氧甲酰)乙酰胺7(63.6mg，0.15mmol)在5ml四氢呋喃(THF)和5ml水中形成混合物。向该混合物中加入固体氢氧化钾(12.5mg，0.22mmol)，室温搅拌反应3小时(h)，直到经TLC分析表明反应完全。用1N HCl将反应溶液中和到pH7，减压浓缩干燥。将得到的残余物溶于10％甲醇的氯仿混合物中，过滤除去无机盐。将溶剂蒸发后得到2-氧-3-羟基麦角酸N-乙基N-(2-羧基)乙酰胺(半抗原A)(45mg，76％)，这是一种无定形的棕色固体(在硅胶上用20％甲醇的氯仿溶液作为洗脱剂时，Rf为0.52)。
υmax/cm-13297，2963，1723，1557，1099，1020，802(FT-IR)实施例52-氧-3-羟基麦角酸N-乙基N-(2-羧基)乙酰胺与BSA的偶联物(免疫原A)将2-氧-3-羟基麦角酸N-乙基N-(2-羧基)乙酰胺(半抗原A)(45mg，0.11mmol)溶于1ml二甲基甲酰胺(DMF)中。向其中加入二环己基碳二亚胺(DCC)(27.9mg，0.14mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(15.6mg，0.14mmol)，将该混合物室温搅拌过夜。所形成的二环己基脲过滤除去，将该溶液逐滴加入将BSA(150mg)溶于6mL 0.05M碳酸氢钠溶液(pH8.5)所得到的溶液中，将混合物4℃搅拌过夜，避光。然后将该溶液在4℃用5L PBS(pH7.2)透析过夜，冷冻干燥。
MALDI-TOF检测(图6)表明，存在一个主要信号，其指示该样品具有m/z 70351的一个平均质子化质量。在m/z 35248处的信号与带有双倍电荷的主要成分相符。这些数据表明平均每个BSA分子结合了9.8个半抗原A分子。
实施例66-氰基-去甲-LSD的合成在氮气下向溴化氰(2.96g，27.95mmol)在150ml干氯仿中的回流溶液中逐滴加入麦角酸二乙酰胺1(2.00g，6.19mmol)在100ml干氯仿中的溶液。将反应物回流加热4小时，冷却到室温。用150ml的1％(w/v)酒石酸溶液抽提有机相两次，将合并的含水洗涤液用100ml氯仿抽提，将合并的有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。用乙酸乙酯在硅胶上对黑色残余物进行层析，待溶剂蒸发后，得到6-氰基-去甲-LSD(879mg，42％)，这是浅黄色固体。
υmax/cm-13192，2933，2212，1636，1449，986实施例7去甲-LSD3的合成在氮气条件下，用锌粉(1.53g，23.39mmol)处理6-氰基-去甲-LSD(879mg，2.63mmol)在8ml乙酸和2ml水中的混合物，并在回流条件下加热6小时。使溶液冷却，通过水洗除去过量的锌，将反应溶液减压浓缩至小体积，将浓缩物用10ml水稀释。在0℃将该溶液的pH用浓缩的氨水溶液调节到pH9。所得粘性沉淀用50ml氯仿抽提4次，合并氯仿抽提液，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到去甲-LSD3(625mg，77％)，这是一种浅褐色的无定形固体(在硅胶上用20％甲醇的氯仿溶液作为洗脱剂时，Rf为0.47)。
υmax/cm-13260，2974，2934，1620，1447实施例86-(3-乙氧甲酰)丙基-去甲-LSD8的合成用乙基溴代丁酸酯(290μL，2.02mmol)、碳酸钾(839mg，6.06mmol)和催化量的碘化钾处理去甲-LSD3(625mg，2.02mmol)在5ml干二甲基甲酰胺(DMF)中的混合物，在氮气条件下40℃搅拌过夜。将反应溶液减压浓缩至残量，用5％甲醇的氯仿溶液在硅胶上层析，待溶剂挥发后得到6-(3-乙氧甲酰)丙基-去甲-LSD8(368mg，43％)(在硅胶上用20％甲醇的氯仿溶液作为洗脱剂时，Rf为0.77)。
υmax/cm-13268.56，2975.19，2934.49，1731.00，1623.51(FT-IR图11)实施例92-氧-3-羟基-6-(3-乙氧甲酰)丙基-去甲-LSD9的合成将6-(3-乙氧甲酰)丙基-去甲-LSD8(368mg，0.87mmol)加到酒石酸(196mg，1.31mmol)溶于20ml水中并在冰上冷却而形成的混合液中。将氯气(1.55g，21.83mmol)溶入氢氧化钙(0.81g，10.93mmol)在240ml水中形成的溶液中，以此制备次氯酸钙溶液。使浑浊液通过0.45μM滤膜除去任何不溶物质，用冰冷却。将6-乙氧甲酰丙基-麦角酸二乙酰胺酒石酸酯溶液加入到45ml新制备的次氯酸钙溶液中，在0℃-50℃搅拌反应30min。反应物用80ml饱和碳酸氢钠溶液稀释，用6×100ml氯仿抽提。将氯仿抽提物合并，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。使所得残余物在硅胶上层析，得到2-氧-3-羟基-6-(3-乙氧甲酰)丙基-去甲-LSD9(102mg，26％)，这是一种无定形的棕色固体(在硅胶上用10％甲醇的氯仿溶液作为洗脱剂时，Rf为0.44)。
υmax/cm-13242.29，2976.74，1727.98，1615.25，1447.09，1214.64(FT-IR图12)实施例102-氧-3-羟基-6-(3-羧基)丙基-去甲-LSD(半抗原B)的合成将2-氧-3-羟基-6-(3-乙氧甲酰)丙基-去甲-LSD9(90mg，0.20mmol)溶于3ml四氢呋喃(THF)及3ml水中，向该混合物中加入固体氢氧化钾(22mg，0.40mmol)。室温搅拌反应3h，直至经TLC分析表明反应完成。反应液用1N HCl中和至pH7，减压浓缩干燥。将残余物溶于10％甲醇的氯仿混合物中，将无机盐过滤除去。蒸发溶剂，得到泡沫状棕色固体2-氧-3-羟基-6-(3-羧基)丙基-去甲-LSD(半抗原B)(86mg，102％)。
υmax/cm-13242.47，2979.73，1720.79，1605.03(FT-IR图13)实施例112-氧-3-羟基-6-(3-羧基)丙基-去甲-LSD与BSA的偶联物(免疫原B)将2-氧-3-羟基-6-(3-羧基)丙基-去甲-LSD(半抗原B)(32mg，0.08mmol)溶于0.5ml二甲基甲酰胺(DMF)中。向其中加入二环己基碳二亚胺(DCC)(18.5mg，0.09mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(10.4mg，0.09mmol)，将该混合物室温搅拌过夜，所形成的二环己基脲通过过滤除去，将该溶液逐滴加入到BSA(100mg)在6ml 0.05M碳酸氢钠溶液(pH8.5)中所形成的溶液中，在4℃将混合物避光搅拌过夜，然后将该溶液在4℃用5L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.2)透析24小时(换液2次)，然后冻干。
MALDI-TOF检测(图7)表明，存在一个主要信号，其指示该样品具有m/z 69699的一个平均质子化质量。在m/z 34862处的信号与带有双倍电荷的主要成分相符。这些数据表明平均每个BSA分子结合了8.1个半抗原B分子。
实施例12半抗原A与标记物(辣根过氧化物酶(HRP))的偶联将10mg EDC溶于800μl水中，立即加入到所述半抗原(1mg)在200μlDMF中所形成的溶液中。将所得溶液轻轻混合，然后加入到HRP(20mg)的1ml水溶液中。混合后，加入5mg硫代-NHS，在室温黑暗条件下将整个反应混合物保温过夜。使所得偶联物通过流过两个PD10柱(PharmaciaBiotech)而纯化，用20mM PBS，pH7.2洗脱，然后在4℃用20mM PBS，pH7.2透析过夜。
实施例13针对实施例5所得免疫原A的抗体的制备实施例5所得免疫原水溶液用弗氏完全佐剂(FCA)进行配制，使4mg/ml免疫原在50％(v/v)FCA中形成乳液。三只绵羊用这种乳液免疫(第一次免疫)，在每个动物的腰窝部位皮下注射4个点，每个点注射0.25ml，下一次免疫(第一次加强免疫)含有2mg/ml免疫原，后续各次免疫(第2-25次加强免疫)含有1mg/ml免疫原。所有的加强免疫都在50％(v/v)弗氏不完全佐剂(FIA)中乳化，并以与第一次免疫相同的方式每月给药，持续一年。每一次加强免疫的7-14天后采集血样，处理每个样品以生产抗血清，该抗血清用辛酸和硫酸铵沉淀进一步纯化，从而产生免疫球蛋白G(IgG)级分。用竞争性ELISA微滴板测定法检测该IgG级分，如下面实施例14所述。
实施例14针对2-氧-3-羟基-LSD的竞争性ELISA的开发将针对本发明免疫原A(实施例5)的抗血清中的IgG级分稀释于10mMTris，pH8.5溶液中，然后用该溶液包被强结合力的96孔聚苯乙烯微滴板(125μl/孔)。用标准ELISA棋盘格技术(standard ELISA Chequerboard technique)检测相应的抗体包被稀释物。平板在37℃保温2小时，用含有Tween20的Tris盐缓冲液(TBST)洗4次，轻轻拍干，用TBST制备2-氧-3-羟基-LSD的标准溶液，浓度为0，10，50，100，250，500，1000和2000ng/ml，每一浓度的标准溶液取50μl加入相应的孔中(图4)。将本发明的偶联物(检测试剂)稀释在含有EDTA、D-甘露醇、蔗糖、乙基汞硫代水杨酸钠(thimerosal)和BSA的Tris缓冲液(pH7.2)中，相应稀释液用标准ELISA棋盘格技术检测，并取75μI加入相应的孔中(图4)。平板在37℃保温2小时。过量的未结合的偶联物通过在10分钟内用TBST洗6次而除去。
将125μl四甲基联苯胺(TMB)底物溶液加到平板的每个孔中，将平板在室温避光温育15-20分钟。向每个孔中加入125μl 0.2M H2SO4来终止反应。用微滴板读取仪读取450nm处的吸收值。该试验所得数据如下表1所示。
实施例152-氧-3-羟基-LSD在竞争性ELISA中与LSD及其代谢物的交叉反应用TBST制备LSD及其代谢物的标准溶液，浓度为0、10.0、50.0、100.0、250.0、500.0，1000和2000ng/ml。在此竞争性ELISA中使用每个系列的标准液作出标准曲线，用于测定该免疫分析中与LSD及其代谢物的交叉反应，通过下列公式计算交叉反应％CR＝IC502-氧/IC50LSD×100其中％CR是交叉反应的百分比，IC502-氧是导致50％信号位移(displacement)时2-氧-3-羟基-LSD的浓度，IC50LSD是导致50％信号位移时LSD或LSD代谢物的浓度。
表1用针对免疫原A(半抗原A-BSA)(实施例5)和偶联物A(半抗原A-HRP)的抗血清作为检测试剂(实施例12)，通过2-氧-3-羟基-LSD的竞争性微滴板试验所得的交叉反应数据。
A450＝450nm处的吸收值B＝xng/ml浓度的标准溶液在450nm处的吸收值B0＝0ng/ml浓度的标准溶液在450nm处的吸收值％CR＝基于对2-氧-3-羟基-LSD的特异性的交叉反应百分比结果证明，该试验对2-氧-3-羟基-LSD具有高度特异性，而与LSD和去甲-LSD的交叉反应水平非常低。
权利要求
1.一种具有下列结构式的半抗原 其中R是二价连接基因，X是末端基团。
2.权利要求1的半抗原，其中R包括取代或未取代的、支链或直链、饱和或不饱和的亚烷基半分子；取代或未取代的、饱和或不饱和的环亚烷基半分子；或者，取代或未取代的亚芳基半分子；且X独立地包括羧酸或其酯、醛、硫代羧酸或其酯，优选硫代乙酰基或卤代羧酸或其酯，优选卤代乙酰基。
3.权利要求2的半抗原，其中R是C1-6的取代或未取代的直链饱和亚烷基半分子，最优选C2-3的取代或未取代的直链饱和亚烷基半分子。
4.权利要求2或3的半抗原，其中X是羧酸。
5.权利要求4的半抗原，该半抗原是由2-氧-3-羟基-LSD衍生的下列半抗原 半抗原A
6.权利要求3的半抗原，其中R是具有2个碳原子的、饱和的、未取代的直链亚烷基。
7.一种免疫原，其含有与能赋予抗原性的载体材料偶联的、权利要求1-6任一项所述半抗原。
8.针对权利要求7所述免疫原的抗体，该抗体至少能与2-氧-3-羟基-LSD的3-羟基-2-吡咯烷酮结构表位相结合。
9.一种偶联物，其含有权利要求1-6任一项的半抗原，该半抗原与可检测的标记物共价连接。
10.权利要求9的偶联物，其中的标记物选自酶、发光物质、放射性物质，或它们的混合物。
11.制备权利要求8所述抗体的方法，该方法包括下述步骤用权利要求7的免疫原重复给药以免疫动物，优选脊椎动物，最优选哺乳动物，然后收集被免疫的动物的血清。
12.检测或测定样品中的2-氧-3-羟基-LSD的方法，该方法包括将样品与权利要求9或10的偶联物或其混合物接触，以及与权利要求8的抗体或其混合物接触；检测或测定所结合的偶联物；并根据标准曲线推导出样品中2氧-3-羟基-LSD的存在或2-氧-3-羟基-LSD的量。
13.检测或测定2-氧-3-羟基-LSD的试剂盒，该试剂盒含有权利要求9或10的偶联物或其混合物，以及权利要求8的抗体或其混合物。
14.权利要求9或10的偶联物或其混合物，以及权利要求8的抗体或其混合物的用途，用于检测或测定样品中的2-氧-3-羟基-LSD，如生物流体中的2-氧-3-羟基-LSD。
15.特异性针对2-氧-3-羟基-LSD的抗体，该抗体对LSD和对去甲-LSD的交叉反应小于5％。
全文摘要
本发明描述了一种半抗原，其在2－氧－3－羟基－LSD的8β－羧酰胺的氮上用交联剂衍化而成。本发明也提供了一种免疫原，该免疫原包括上述半抗原和一个与半抗原结合的能够产生抗原性的载体材料；本发明还提供了一种含有上述半抗原的偶联物，其中的半抗原共价结合有一个可检测的标记物。另外，本发明涉及针对上述免疫原的抗体。最后，本发明涉及检测或测定生物体液中的2－氧－3－羟基－LSD的方法和试剂盒。本发明的抗体对2－氧－3－羟基－LSD具有高度的特异性，而与LSD和去甲－LSD无显著交叉反应。
文档编号C07K16/44GK1450065SQ0214003
公开日2003年10月22日 申请日期2002年12月20日 优先权日2001年12月20日
发明者罗伯特·I·麦康奈尔, 伊尔·O·本齐克, 斯蒂芬·P·菲茨杰拉德, 约翰·V·拉蒙特 申请人:兰多克斯实验室有限公司