专利名称：人干扰素α2a基因cDNA编码修饰重组序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组蛋白质的高效表达，特别是涉及重组人干扰素α2a的高效表达。
干扰素至少有20种以上的不同亚型。天然α干扰素由165个氨基酸构成，分子量在18.5KD左右。
重组人α2a、α2b干扰素是最早应用分子生物学技术大量生产的细胞因子，由165个氨基酸构成，纯化的重组蛋白分子量在18.5KD左右。有两个二硫键(C1-C98，C29-C138)，他们对干扰素蛋白质的正确折叠和生物学活性十分重要。α2b与α2a除了个别氨基酸残基不同外，其余的氨基酸组成一致α2a在第23位和112位氨基酸均为赖氨酸，而α2b在23位为精氨酸，在112位为门冬氨酸。由于两者在该两个氨基酸上的差别，导致两者在二级结构上略有区别α2a从53位到78位氨基酸仅有一个空间螺旋，而α2b则有两个空间螺旋。两者的主要作用是抗病毒。
美国FDA于1986年首先批准基因工程α2a(Roche公司生产)和α2b(Schering公司生产)干扰素投放市场。Nagata(1980)，Staehelin(1981)，Hochuli(1986)等都将人干扰素基因转入原核表达系统产生了活性人干扰素，但其表达效率低。
侯云德等首创的基因工程α1b干扰素也于1996年上市，随后国内许多研究单位研制开发了α2a、α2b和γ型等型干扰素产品。CN99116955(侯云德等，病毒生物技术国家工程研究中心，1999年12月10日申请)公开了人干扰素α1b型的基因合成、表达质粒构建及其制法。
目前我国有多家公司生产干扰素，由于成本和价格等因素制约，中国消费者中能用得起干扰素的实际市场远远小于理论要求，使干扰素的社会和经济效益远未发挥，其原因是，一方面绝大多数患者因价格较高而用不起，而另一方面生产企业生产开工严重不足，造成这种局面的一个关键难题是基因工程重组干扰素的表达产量以及表达物的自然活性较低。
在用大肠杆菌表达干扰素时，最主要的问题之一是干扰素的表达量不高，目前最高的表达量为每升数十毫克。研究者们试验了多种途径，如采用不同的培养基和培养条件，选择不同的载体和表达菌株，或使用不同的启动子等等来调控干扰素的表达量。另外，由于大肠杆菌表达产物以可溶性和不溶性两种形式存在于大肠杆菌胞浆内。虽然多数研究认为，表达物为可溶性形式时将有利于表达产物的收获和提纯，然而，大肠杆菌胞浆内的还原型条件使得位于胞浆中的可溶性干扰素分子的双二硫键不能正确形成，阻碍了干扰素分子的正确折叠成其自然结构。对于表达的干扰素不溶性形式，其最大的难点也是如何通过复性而获得具有活性的干扰素分子。
本发明的另一目的是提供用适宜于在宿主细胞，特别是大肠杆菌中高效表达重组人干扰素α2a的cDNA。发明详述在重组蛋白质的表达中，现有技术例如，CN99116955(侯云德等专利)通常是使待表达的重组蛋白质的编码DNA序列完全符合所选宿主细胞的密码子偏好，从而希望使所述重组蛋白的表达水平达到最高。
本发明中引用修饰和变换氨基酸的DNA编码的概念，将人干扰素基因cDNA序列中对大肠杆菌表达系统而言的“稀有编码”，转换成适应在大肠杆菌表达系统的DNA编码。对将要在大肠杆菌中表达的重组蛋白质，特别是人干扰素α2a的DNA进行了改变，结果所述重组蛋白质在大肠杆菌中的表达效率有显著的提高。对本发明所涉及的人干扰素α2a基因，编码165个氨基酸，全长为495个核苷酸的人干扰素cDNA序列中，有涉及20个氨基酸残基的23个核苷酸残基被改变，从而形成一个新的、独一无二的编码人干扰素α2a的重组人干扰素cDNA序列“DNA序列号Seq ID No.1”。由于这些含新型核苷酸组合的干扰素α2a修饰重组基因所产生的mRNA的蛋白翻译速度可大幅度提高，进而提高表达量。含有新型人干扰素α2a修饰重组基因的大肠杆菌原核表达系统，在使用普通LB培养基的条件下，每升培养物(约含7-9克湿菌体重)可表达约1000毫克以上的干扰素α2a产物。这从根本上解决了基因工程干扰素表达量的问题。
本发明提供的一具体实施方案是，根据已知的人干扰素α2a中蛋白质设计出特定的基因编码序列Seq ID No.1。
构建含Seq ID No.1的表达载体。启动子以及表达调控序列的选择是由所选的宿主细胞决定的。本领域已知的任何启动子以及表达调控序列均可用于本发明重组蛋白质的表达。
基因工程IFN表达用质粒为自行组装构建，原始质粒为pBR32，在此基础上加入组建的T-7启动子和调节基因复合片段，后接经修饰的IFNα2a基因，分别构成了用于表达α2a的表达质粒，该工程菌菌种为大肠杆菌BL21(DE3)。
用含Seq ID No.1的表达载体转化宿主细胞。本发明所用的宿主细胞可以是本领域已知的任何用于表达重组蛋白质的宿主细胞，包括真核细胞，例如酵母细胞、CHO等，或者原核细胞，例如大肠杆菌5Hα、BL21(DE3)等。
在本领域技术人员已知的条件下培养所述宿主细胞，收集培养物，提取人干扰素α2a。
图2所显示的是含有编码人干扰素蛋白分子不同基因序列表达株表达样品SDS-PAGE电泳结果(Coomassie blue染色)。左边第1行是蛋白分子量标准品。第2号样品是含人干扰素自然基因序列的表达株的表达物。其中各行样品为1为蛋白标准品对照，2为含天然人干扰素基因表达株表达样品，3和4为含人干扰素α2a修饰重组基因表达株表达样品。各表达株的培养条件相同。结果显示含有编码人干扰素α2a修饰重组基因序列表达株的18.3KD蛋白质条带丰厚清晰，表达量明显高于含自然基因序列表达株的表达量。
图3是干扰素样品SDS-PAGE凝胶扫描图.样品经扫描可见，仅可见干扰素α2a主蛋白扫描峰，表明该样品已达到电泳级纯度，纯度值为100％，估计纯度至少大于90％。
下列实施例用于具体说明本发明的实施方案实施例1 人干扰素α2a基因编码修饰重组和高效表达本研究的起始点是将天然人干扰素α2a cDNA序列中氨基酸编码进行人工修饰重组。按照已发表的天然人干扰素cDNA序列(Manual et.al.Gene 10110，1980，Streuliet al.Science 2091343-1347，1980，Goeddle et al.，Natrue 29020-26 1981，GENEBANK)，比较各cDNA序列中氨基酸编码分布情况，确定人工修饰其中涉及编码20个氨基酸残基DNA编码中的23个核苷酸残基。见表1。
表1人干扰素α2a基因DNA修改位点位点 编码氨基酸 原始码修改后的编码124~126 Pro(脯氨酸) CCT CCG163~165 Leu(亮氨酸) CTC CTG178~180 Arg(精氨酸) AGG CGC190~192 Leu(亮氨酸) CTT CTG205~207 Lys(赖氨酸) AAG AAA223~225 Gly(甘氨酸) GGA GGC229~231 Pro(脯氨酸) CCC CCG412~414 Ile(异亮氨酸) ATA ATT418~420 Gly(甘氨酸) GGG GGT424~426 Gly(甘氨酸) GGG GGT430~432 Thr(苏氨酸) ACA ACC439~441 Pro(脯氨酸) CCC CCG493~495 Thr(苏氨酸) ACT ACG496~498 Leu(亮氨酸) CTC CTG523~525 Pro(脯氨酸) CCT CCG541~543 Val(缬氨酸) GTC GTG565~567 Phe(苯丙氨酸) TTT TTC574~576 Ser(丝氨酸) TCA AGC577~579 Thr(苏氨酸) ACA ACC592~594 Ser(丝氨酸) AGT AGC经修饰重组的人干扰素α2a cDNA序列均有23处和其天然的cDNA序列不同(
图1)。但其编码形成的干扰素α2a蛋白多肽氨基酸残基序列和天然干扰素α2a蛋白多肽氨基酸残基序列一样。实施例2 用于克隆表达人干扰素α2a的质粒载体构建一、构建表达载体1原始质粒为pBR322(4361bp)。
2在pBR322第29位的HindIII酶切位点上插入人工合成的含有T-7启动子、Lac启动调节序列和用于插入目的基因的酶切位点序列的DNA片断(102bp)。3使用BamH1和Bsp681内切酶切除pBR322所含有的部分TeT基因(约600bp)，并在该区域插入Lac基因(1079bp)。
4重建的质粒约为5000bp，包含有原始pBR322的基本框架、新插入的T-7启动子、用于调节表达的LacI基因。二、构建表达质粒1将经修饰的人IFNα2a基因片断，分别克隆于位于T-7启动子下游的酶切位点上，形成可以表达IFNα2a的表达质粒。
2采用电穿孔转化法，将IFNα2a表达质粒转入含有DE3(T-7 DNA聚合酶)基因的B21、Jm101等菌株中，筛选出可高效表达人IFNα2a的工程菌株，定名为IFNα2a表达菌株。
另外，还可按常规方法(Sambrook et al.Molecular Cloning---A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)，将修饰完成的干扰素α2a修饰重组基因片段克隆于表达质粒载体上，经序列测定无误后，转入E.coli原核表达系统进行表达。
表达所需的培养基为常规LB培养基。以配制1升培养基为培养单位，蛋白胨(Trypton)10克，酵母提取物(Yeast Extract)10克，盐(NaCl)5克，双蒸水1000毫升。培养采用37℃恒温，振荡培养，以IPTG诱导剂诱导表达。从接种菌种到收获培养物的全过程时间为7小时左右，每升培养物可收获7-9克湿菌体。实施例3 天然人干扰素α2a cDNA编码氨基酸序列与重组修饰人干扰素α2a cDNA编码氨基酸N端序列及C端序列比较对基因重组修饰后的人干扰素α2a基因表达的干扰素蛋白质N末端18个氨基酸序列测定，结果为18K-CDLPQ THSLG SRRTL MLL(鉴定单位MIDWESTANALYTICAL，INC.，11141E SOUTH TOWNE SQUARE St.Louis，MO 63123)，C端为glutamic acid(E)(鉴定单位COMMONWEALTH BIOTECHNOLOGIES，INC.，601 BiotechDrive，Richmond，VA 23235)，证实重组修饰人干扰素α2a的氨基酸序列与天然干扰素α2a的氨基酸序列完全一致。实施例4 结果和蛋白质产物活性鉴定按照国家标准，通过对产物的氨基酸序列测定、效价测定、蛋白质含量测定、分子量测定、比活性测定、纯度测定以及特异性鉴别分析，发现每升菌液可表达约1000毫克以上的人基因工程干扰素蛋白，经过特定复性工艺，每升培养物可获得有活性的IFN蛋白600～800毫克。复性后收获干扰素蛋白质分子量与标准品一致，在18～20KD之间，获得的干扰素活性可达5.0×107～1.2×108U/mg，纯度为90％以上，与标准天然IFNα2a具有相同的免疫原性和抗原性，符合重组人干扰素α2a原料鉴定的要求，可作为生产原料。
序列表<110>武汉柏傲生物工程有限公司<120>人干扰素α2a基因cDNA编码修饰重组序列<140><141>2002-10-<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>495(核苷酸)<212>cDNA<213>人工序列<223>合成<400>1TGTGAT121 CTGCCGCAAA CCCACAGCCT GGGTAGCAGG AGGACCTTGA TGCTGCTGGC ACAGATGAGG181 AAAATCTCTC TGTTCTCCTG CTTGAAAGAC AGACATGACT TTGGCTTTCC GCAGGAGGAG241 TTTGGCAACC AGTTCCAAAA GGCTGAAACC ATCCCTGTCC TCCATGAGAT GATCCAGCAG301 ATCTTCAATC TCTTCAGCAC AAAGGACTCA TCTGCTGCTT GGGATGAGAC CCTCCTAGAC361 AAATTCTACA CTGAACTCTA CCAGCAGCTG AATGACCTGG AAGCCTGTGT GATTCAGGGT421 GTGGGTGTGA CCGAGACTCC GCTGATGAAA GAGGACTCCA TTCTGGCTGT GAGGAAATAC481 TTCCAAAGAA TCACGCTGTA TCTGAAAGAG AAGAAATACA GCCCGTGTGC CTGGGAGGTT541 GTGAGAGCAG AAATCATGAG ATCTTTCTCT TTGAGCACCA ACTTGCAAGA AAGCTTAAGA601 AGTAAGGAAT GA
权利要求
1.经修饰的含有Seq ID No.1的编码天然人干扰素α2a的核苷酸序列。
2.含权利要求1核苷酸序列的重组载体。
3.用权利要求2的重组载体转化的宿主细胞。
4.根据权利要求3的宿主细胞，是原核细胞。
5.根据权利要求4的宿主细胞，是大肠杆菌细胞。
6.人干扰素α2a的生产方法，其特征在于将权利要求3或4的宿主细胞在可以表达所述细胞的条件下培养，收集培养物，提取人干扰素α2a。
全文摘要
本发明涉及对人干扰素α2a天然基因序列中部分不适合在原核表达系统中翻译氨基酸的编码进行修饰,形成高表达的新cDNA序列。含有新cDNA序列的原核表达株,在常规培养条件下,每升菌液可表达1000毫克以上的干扰素蛋白,且其氨基酸序列结构与天然的序列结构完全一致,活性可达5.0×10
文档编号C07K14/435GK1422954SQ0214621
公开日2003年6月11日 申请日期2002年10月16日 优先权日2002年10月16日
发明者白宪鹤, 林雨霖 申请人:武汉柏傲生物工程有限公司