专利名称：地龙的类多金属硫蛋白及固有生物活性物复配制剂的制作方法
技术领域：
本发明是采用一类新的生物载体——地龙，运用物理化学诱导方法产生类多金属硫蛋白与地龙固有生物活性物——蚓激酶，抗菌肽等地龙提取物，并复配黄芪提取物、丹参提取物、硫辛酸和1，6二磷酸锌果糖等功能成分，作为药物、保健品和化妆品添加剂等用途。
背景技术：
地龙作为中药材已有几千年的药用历史，具有活血化瘀，平喘止咳等功效。近代研究地龙含有蚓激酶，抗菌肽，嘌呤和琥珀酸等生物成分，采集地龙提取物或地龙粉，作为药物成分。专利申请号02124042.6把微量元素硒、锗、锰和锌添加到蚯蚓饲料中，制成富硒、锗蛋白的方法，饲养周期长达40～60天。存在饲养用期长，微量元素的不均匀波动；蛋白质分子量偏大；饲料、土壤中的有害重金属如铅、镉…汞等进入蚯蚓体中等等诸多局限性，从而限制了对它充分、有效的利用。
发明内容
本发明旨在利用新的生物载体——地龙采用有益微量元素特殊的诱导方法，使地龙产生类多金属硫蛋白(Like-polybasicMetallothionein简称L·pMT)并不影响地龙原有的生物活性成分，只是扩展生物的活性物的分子量范围，类多金属硫蛋白的分子量在(16～17)KD，蚓激酶的分子量在(20～30)KD。类金属硫蛋白具有多种生物功能的蛋白质，含有(21～26)％巯基，每个分子含有(5～6)金属离子。类金属硫蛋白的生物学功能是(1)捕捉自由基、(2)抗辐射、(3)重金属解毒剂、(4)有益微量元素调节剂、(5)修复受损细胞。
类金属硫蛋白与蚓激酶，抗菌肽、嘌呤和琥珀酸等不仅互不干扰，相反具有互补和协同效应像是系列化的分子量，在不同的范围。功能基团各不相同。
本发明的特征在于两个方面(1)通过物理、化学诱导方法产生类金属硫蛋白，增加了地龙中活性蛋白质；(2)把多种有益微量元素(Cr、Mn、Zn、Se等)引进活性蛋白中，强化了两者互补和协同作用，扩展了地龙活性金属蛋白的全息效应。
类金属硫蛋白还有一种重要的功能，即土壤中或饲料中的重金属如铅、镉、汞等有毒元素进入地龙活体中，类金属硫蛋白与之络合，起到解毒作用和化险为夷的功效，这是其它方法所不具备的。
类金属硫蛋白是生物体在应激状态下的产物，因而它有镇静，稳定情绪，提高稳定心理阈值的作用。它的抗辐射作用，在治疗前服用本发明的制剂，起到保护机体正常细胞，同时具有增敏作用，强化放疗效果。
本发明选择优良健壮的地龙，经过人工诱导、净化匀浆、离心粗提、离心沉降、柱析精提、超滤脱盐、冷冻干燥得到地龙多组分活性蛋白的冻干粉类金属硫蛋白、蚓激酶、抗菌肽等功能成分。所述工艺程序在低温洁净状态下进行。
人工诱导将鲜活健壮地龙导入诱导床上进行，把氯化锌或硫酸锌、三氯化铬、氯化锰，亚硒酸钠等盐类，分别配制相应浓度的水溶液，然后分别加入到红薯浆中，然后再掺入陈化后植物腐料，制成诱导剂饵料。通过诱导床对地龙进行三方面刺激调控，温度刺激(6℃至34℃，24h)、干湿刺激(湿度在30～80％)、电位刺激(4～5V/30cm)和饥饿刺激，按照诱导-休眠-诱导-休眠交替进行，至第九天进入下步操作程序。
净化匀浆浆诱导后的地龙，清洗，用生理盐水净化内腔泥砂，加入等容量Tris-HCl(0.01mol/L，PH～8，含0.5ml/L生理盐水)缓冲液，捣碎匀浆，然后再加2～4倍体积缓冲液搅匀后静置；粗提离心将匀浆后地龙液，以9000r/min，30min，取上清液；离心沉降将上清液在53℃恒温水浴上加热1h，取上清液；柱析精提将上步上清液在已处理好的Sephadex G-50柱上层析，以缓冲液洗脱；超滤脱盐洗脱液经超滤脱盐，得超滤液；
冷冻干燥脱盐后的地龙提取液，在低温冷冻干燥设备上，取得地龙提取物冻干粉。
本发明诱导产生的类多金属硫蛋白分别为类铬金属硫蛋白(L·CrMT)、类锰金属硫蛋白(L·MnMT)、类锌金属硫蛋白(L·ZnMT)和类硒硫蛋白(L·SeMT)与蚓激酶、抗菌肽等地龙活性成分，复配黄芪提取物、丹参提取物、硫辛酸、1，6二磷酸锌果糖制成肠溶胶囊配比是地龙活性提取物 (52.0-58.0)％黄芪提取物 (12.0-16.0)％丹参提取物 (10.0-15.0)％硫辛酸 (8.0-13.0)％1，6-二磷酸锌果糖(8.0-16.0)％麦芽糊精 (3.0-4.0)％地龙保健胶囊具有溶栓、抗凝、降低血粘度、调节血压、血糖和血脂的顺利代谢功能。地龙活性提取物可以作为药物、保健品和化妆品添加剂的生物活性成分。
具体实施例方式
根据本发明的方法，结合实施例说明如下人工诱导(1)首先配制微量元素的水溶液，各微量元素溶液浓度如下Cr4.8g/L，Mn5.6g/L，Zn11.6g/L，Se3.6g/L(2)地龙诱导饵料，用红薯糊加入陈化后植物腐料中；(3)微量元素溶液添加量，按每公斤饵料添加50ml溶液，每一种微量元素为一组分，分别进行诱导；(4)诱导程序诱导-休眠-诱导-休眠。首先将鲜活健壮的地龙导入诱导床，投给一日量的饵料，紧接进行三方面刺激调控温度刺激，从室温降至6℃维持8h，逐步升温至34℃，维持8h，降温升温各4h。干湿刺激，湿度在(30-80)％范围内调节，在低温时为高湿度，在高温时低湿度。电压刺激，在休眠期在诱导床上加上电位差4～5V/30cm刺激3S间隙30S总共电激三次。
以上刺激交替进行四个周期，到第九天进行下步骤操作；净化匀浆诱导后的地龙，清洗再用生理盐水净化地龙内腔泥砂，加入等容量的Tris-HCl(0.01mol/L PH～80.5ml/L生理盐水)缓冲液，捣碎匀浆后，加3.6倍容积缓冲液，搅匀后稍静置；粗提离心将匀浆后地龙液，以9000r/min 30min，取上清液；离心沉降将上清液在53℃恒温水浴上加热1h，以10000r/min离心分离1h，取上清液；柱析精提将上步清液，注入已处理好的Sephadex G-50柱上层析，以缓冲液洗脱，收集洗脱液；超滤脱盐洗脱液经超滤脱盐，在低温冷冻干燥设备上，得到地龙提取物冻干粉。
将四种地龙活性冻干粉L·CrMT L·MnMT L·ZnMT L·SeMT按5∶50∶160∶1组分比例混合抣匀后，再按下列复配成地龙保健胶囊地龙复合冻干粉 54.0％黄芪提取物 15.0％丹参提取物 11.0％硫辛酸 8.0％1，6二磷酸锌果糖 9.0％麦芽糊精 3.0％所有操作在较低室温和洁净环境中操作。
权利要求
1.地龙通过物理化学诱导产生的类多金属硫蛋白与地龙固有的蚓激酶、抗菌肽等生物活性物，用生化方法提取后，复配黄芪提取物、丹参提取物、硫辛酸，1，6二磷酸锌果糖等制剂，类多金硫蛋白是由类铬金属硫蛋白、类锰金属硫蛋白、类锌金属硫蛋白和类硒硫蛋白的复合物，类多金属硫蛋白的分子量约(16～17)KD，含有(21％～26％)的巯基，每个分子含(5～6)个金属离子。
2.根据权利要求1所述的物理化学诱导方法和操作程序，采用控温刺激，控湿刺激，电位刺激和饥饿刺激，周期交替进行，并按诱导—休眠—诱导—休眠操作程序诱导。诱导期为四个周期(约8～10天)。
3.根据权利要求1和2所述的诱导剂由无机铬盐、锰盐、锌盐和亚硒酸盐等配制一定浓度(Cr4.8g/L、Mn5.6g/L、Zn11.6g/L、Se3.6g/L)的溶液，以50ml/kg微量元素溶液量，均匀加入饵料制成诱导饵料。
4.根据权利要求权利要求2和3所述的诱导饵料由各个微量元素盐类配成相应浓度的溶液，分别添加到由红薯糊和陈化后的植物腐料，(1∶5.0～10.0)配成诱导饵料。
5.根据权利要求1所述的地龙复配成分是地龙活性复合提取物 (52.0～58.0)％黄芪提取物 (12.0～16.0)％丹参提取物 (10.0～15.0)％硫辛酸 (8.0～13.0)％1，6磷酸锌果糖 (8.0～16.0)％麦芽糊精(3.0～4.0)％地龙活性复合提取物的复合成分和比例类铬金属硫蛋白 相对比例5.0类锰金属硫蛋白 相对比例5.0类锌金属硫蛋白 相对比例160.0类硒硫蛋白 相对比例1.0
全文摘要
本发明利用地龙通过物理、化学诱导产生的类多金属硫蛋白(L－polybasic Metallothionein简称L·pMT)与地龙固有的蚓激酶、抗菌肽等生物活性物，用生化方法提取后，复配黄芪提取物、丹参提取物、硫辛酸，1，6二磷酸锌果糖等功效成分，配成制剂。类多金属硫蛋白由L·CrMT、L·MnMT、L·ZnMT和L·SeMT复合构成地龙活性提取物的组分，类多金属硫蛋白与蚓激酶相互强化相互协同和互补效应，具有降低血粘度、溶栓抗凝、调整血压、血糖、血脂代谢等保健功能。作为药物，保健品和化妆品添加剂等用途。
文档编号C07K14/435GK1759856SQ200410067090
公开日2006年4月19日 申请日期2004年10月12日 优先权日2004年10月12日
发明者陶芒, 庄力枫 申请人:庄力枫