细胞对表面的附着的制作方法

专利名称：细胞对表面的附着的制作方法
技术领域：
本发明涉及在培养期间能够附着并维持细胞的微载体领域。更具体的说，本发明涉及的微载体由包被有增强细胞附着的化合物的多孔基质组成。本发明也包括制备这种微载体和进行细胞培养的方法。
背景使用微载体支持体促进生物细胞生长已有长期且变更的历史。早期这种使细胞生长到可用数量的系统包括各种器皿和烧瓶。有意通过提高培养表面积而提高单位器具体积细胞生产量的努力导致了大盘子的使用。一些这种早期细胞生长系统仍然在小规模、大劳动量的细胞培养方法即足够的场所使用，例如在医院和大学中。
但是，需要有其它方法用以大规模培养细胞。一种普遍的细胞培养方法是滚瓶系统。本质上，一个滚瓶就是一个装有小量营养培养基的圆筒状容器。操作中，滚瓶沿着其纵轴线缓慢旋转，使得营养培养基持续浸润瓶的整个内表面，而细胞就在这个表面上生长。可在滚瓶架上操作许多滚瓶。
另一种普遍的方法是微载体系统。尽管近年来已经引入了其它技术例如膜系统，但微载体系统仍表现为最被广泛采用的方法，其中贴壁细胞的生长可以达到商业上有利的生产率。以这种方式进行的大规模培养优于通过复制如滚瓶系统和其它已知系统进行的大规模培养。另外，微载体生物反应器系统也适于贴壁细胞的大规模自动化培养。
微载体的发展开始于20世纪六十年代末，当时证明在混悬培养模式下，葡聚糖珠可以作为贴壁细胞生长的基质。最早的微载体是基于利用普通的阳离子、强碱性、离子交换基团，例如二乙基氨基乙烷(DEAE)。自此以后，作为微载体已成功使用了许多不同的材料，包括玻璃、聚苯乙烯塑料、丙稀酰胺、固体胶原、多孔胶原、纤维素和液体碳氟化合物。
通过共价键或非共价键将一个或多个黏着肽附着到表面的微载体也被建议使用。例如，美国专利号4,578,079(La Jolla ResearchFoundation)公开了一种示例性组合物，当其固定到基质上时将促进细胞的附着。这种公开的组合物是纤连蛋白的一个小片段，更具体的是包括连接到至少一个其他氨基酸上的Asp-Gly-Asp序列的多肽片段。因此，公开的四肽组合物具有与纤连蛋白基本相同的细胞附着活性，这种附着活性基于生物特异性亲和相互作用。这种组合物的明显缺点是其具有的生物活性，指在例如制药工业或诊断产业的某些应用中，例如由于混入工艺流中而存在的生物活性可能是非所需的。根据说明书在实验中鉴别了4,578,079中要求保护的片段，其中设计是用于选择性合成比先前显示细胞活性片段更小的肽。在4,578,079中陈述了测定显示出活性最小片段的这种方法。此外，作为上述讨论的’079的继续的美国专利6,180,610推断尽管四肽是决定性的，但多肽最适宜的大小是包括定义的四肽的六肽。
也已经知道单个氨基酸可用以提供与所需靶分子作用的基团，如在层析中。例如弱阴离子交换剂Arginine SepharoseTM(精氨酸琼脂糖)(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)由主要通过其α-氨基偶联到颗粒状琼脂糖基质的Arg氨基酸所组成。因此，商业上将精氨酸琼脂糖TM作为层析凝胶提供，其中颗粒平均大小总体上基本小于微载体要求的尺度。
已经出现了其它增强微载体的细胞附着性质的包被材料。例证性实例是CytodexTM1(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，其由交联葡聚糖基质组成，其上包被有一种已知的静电结合细胞的聚阳离子包被材料即二乙基氨基乙烷(DEAE)纤维素。但是这种细胞附着和生长性质并不是对所有类型的细胞都是最适合的，例如低铺板率(plating-efficiency)细胞或分化型细胞或敏感型细胞。因此仍然需要改进的可选择的微载体类型。
为进一步改进细胞附着性质，已经出现了包被有更复杂化合物的微载体。例证性实例是类似于CytodexTM1的CytodexTM3(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，由一种交联葡聚糖基质组成，但是基质包被一层酸变性的猪胶原。但是源自哺乳动物的胶原可限制CytodexTM3在某些方面的应用。
美国专利6,214,618涉及用于细胞培养的微载体珠，并更具体的说，涉及在这类产物中避免动物蛋白的问题。推荐的解决方案是用酸性溶液洗涤苯乙烯共聚物和表面的三甲胺组成的微载体珠，使该微载体珠适合细胞培养。
美国专利6,378,527(Chondros Inc.)涉及到一种手术操作，其中将病人的软骨细胞取出并快速增殖然后再移植入所述病人体内用于修复软骨。为增殖软骨细胞，这些细胞被培养、涂平板并最后生长到包含一种多糖衍生物的支架上，该衍生物通过多糖如葡聚糖和聚胺交联得到。更具体的说，该多糖首先被氧化成二醛衍生物，然后与无毒聚胺反应以形成亚胺交联结构，这个交联结构可进一步加氢形成更加稳定的胺键。公开的微载体的一个优点在于其使软骨细胞增殖和II型胶原形成。另一优点在于当其在体外应用时，该微载体将降解为无毒成分而留下软骨细胞在原位形成软骨组织。
显然，仍需要有可选的和/或改进的用于细胞培养的微载体，同时也需要有新颖的制备这种微载体的方法。也更广泛的需要改进细胞和其它表面间的相互作用。这包括将分析表面用于多种应用例如药物筛选、生物活性化合物研究、细胞表面受体研究和环境污染物监测中。
发明简述本发明一方面提供一种使细胞附着和细胞培养的新型微载体。根据本发明这可通过将阳离子化合物经胍基(例如基于电荷相互作用)固定到微载体表面实现。
本发明另一方面提供一种用于细胞附着和培养的微载体，其不含有任何得自哺乳动物的产物。
本发明的又一方面提供用于细胞附着和培养的微载体，其毒性和污染物容易控制。
本发明另外的方面提供制备使细胞附着和细胞培养的新型聚阳离子微载体的方法。根据本发明这可通过一种方法实现，其中包含至少一个胍基的化合物与一个环氧化物激活的基质表面接触，从而固定于其表面。
本发明又一个另外的方面提供细胞培养方法，其中在一个或多个包被了阳离子化合物的微载体表面在提供生存力的环境下培养细胞，所述细胞经阳离子包被提供的胍基附着于微载体。
本发明进一步的方面及优点将在下文中详述。
附图简述

图1显示了实施例1中解释的本发明微载体上非洲绿猴肾细胞株系细胞(Vero细胞)培养中细胞数目如何随培养时间而变化。
图2显示了实施例1中解释的本发明微载体上非洲绿猴肾细胞株系细胞(Vero细胞)培养中细胞数目如何随培养时间而变化。
定义本文所用术语“微载体”以其常规含义用于支持细胞培养的颗粒状物质。因此，在本申请中，术语“微载体”用于指，其表面上固定有能使细胞附着的化合物的基质。
术语“聚阳离子”微载体是指微载体表面的净电荷为正电荷。
术语“基质”是指载体的核心，即可附着细胞的物质。
术语基质的“表面”包括基质的外表面以及，如果基质多孔还包括孔表面。
发明详述本发明的第一个方面涉及一种微载体，阳离子化合物经胍基固定到其表面。在上下文中，应理解术语“化合物”指被固定于微载体表面的一定量的所述化合物，而不是其单个分子。因此，由于每个微载体都固定优选包被有多个所述化合物分子，所以每个微载体将呈现出净正电荷，并因此可称为“聚阳离子”。
在一个实施方案中，本发明微载体能够通过阳离子化合物与细胞间的电荷相互作用附着细胞。在上下文中，应理解“附着”指细胞被良好锚定足以使细胞生存。在一个实施方案中，阳离子化合物与蛋白相互作用，优选与色氨酸侧链相互作用。在另一实施方案中，这种相互作用是上述情况的混合。
通过转移固定到基质表面以提供包被的本发明阳离子化合物，其本质上无反应活力，这意味着实际上它与细胞接触但不在任何实质水平上参与与其它物质的反应。此外，该化合物是生物可容的，也就是它对接触到的细胞和环境中的其它生物物质没有有害作用。因此该化合物是无毒的。在上下文中出现的细胞的“附着”，也被称为细胞的锚定，是指细胞的结合强度足以进行培养。
众所周知，细胞通常不能在高pH环境下存活。因此，在一个实施方案中，本发明微载体的表面pH约为7。在一个特定实施方案中，固定的阳离子化合物在基质上形成弱碱性包被。
在本发明微载体优选实施方案中，固定的化合物包含一个或两个氨基酸。在一个有利的实施方案中，化合物包含一个特征为不能改变电荷及不与酸性部分自催化形成酰胺键的氨基酸。在一个特定实施方案中，氨基酸的氨基基团有反应活性并能够通过形成氨基甲酸酯改变电荷。
在一个实施方案中，固定的化合物包含除赖氨酸(Lys)外的任何单氨基酸。为了给微载体表面提供上述弱碱性包被，固定化合物可包含一个或多个碱性氨基酸。因此，在一个有利实施方案中，化合物是精氨酸(Arg)。由于Arg的酸性羧酸酯基团，这个实施方案为细胞培养提供了与上述市售DEAE-包被的微载体相比具更低的表面pH，并结果是更适宜pH的微载体。一个特定实施方案是固定有基于精氨酸化合物的微载体，优选固定附着有缓冲基团的精氨酸。这样一个化合物可用通式Arg-X定义，其中X是一个缓冲酸性基团。在另一个实施方案中，化合物由两个或更多不同氨基酸组成，因而在基质表面将固定有两个或更多不同配基。例如，化合物可由精氨酸和天冬氨酸的混合物组成。
在一个可选择的实施方案中，固定的化合物是，或者包含二肽。因此，在一个实施方案中，二肽是精氨酸-谷氨酸(Arg-Glu)或精氨酸-天冬氨酸(Arg-Asp)。但是，也可考虑其它二肽，只要它们提供给微载体为细胞附着和生长所需的本文公开的性质。在一个特定实施方案中，一个或多个附加基团例如缓冲基团，可连接到二肽上。
因此，概括来说，在一个实施方案中，固定化合物选自单个氨基酸例如Arg；两个氨基酸的混合物，例如Arg和Asp；或者二肽，例如Arg-Glu、Arg-Asp或者Arg-Arg。在最优实施方案中，固定化合物选自单个氨基酸，例如Arg；和二肽，例如Arg-Glu、Arg-Asp或者Arg-Arg。
本发明所用的氨基酸和二肽易于从商业来源获得，例如得自Merck(精氨酸Merck ref.797；Arg-GluMerck ref.798)。可选择的，其由本领域技术人员使用熟知的重组或化学技术例如固相合成来制备它们。简而言之，通过与保护的α氨基酸偶联从肽的C末端起始固相合成得到适当的树脂；如参见美国专利4,244,946号。
因此，固定到本发明微载体基质上的化合物约为一个氨基酸大小，或者可能是偶联成二肽的两个氨基酸。考虑到上述美国专利4,578,079号(La Jolla Researsh Foundation)的结论，也就是纤连蛋白的最小可能片段应是四肽或优选甚至六肽，本发明的发现显然是出乎意料的。
另外，本发明的微载体与细胞的附着作用显然是基于电荷相关相互作用，因此化合物为正电荷从而使带负电荷的细胞能够附着。这与上述’079中讨论的纤连蛋白片段例如Arg-Gly-Asp不同，其如本文所述有与纤连蛋白基本相同的生物特异亲和细胞附着活力。
在本发明微载体的一个可选择的实施方案中，固定化合物包含嘌呤，或者嘌呤的混合物。在一个具体实施方案中，嘌呤是腺嘌呤或鸟嘌呤。因此，化合物可包含核苷酸或核苷酸相关化合物。
因为每个胍基辅助细胞结合，所以固定在基质表面的化合物可被认为是一个配基，其功能团就是胍基。在微载体的一个具体实施方案中，配基浓度范围为0.1-3.0μmol/mg微载体干重。因此，在例证性实施方案中，配基浓度为如0.2、0.4、0.7、1.2、2.5或3.0μmol/mg微载体干重。在一个具体实施方案中，固定化合物是Arg，配基浓度约为0.7μmol/mg微载体干重。在一个可选择的实施方案中，固定化合物是一个二肽，配基浓度约为相同量。本发明微载体的一个例证性重量密度范围为1.02-1.05g/cm3，但是更重或更轻的物质可能更适合于具体应用。
在一个有利的实施方案中，本发明微载体的基质是交联的糖，或者包含这种糖的必需部分。在一个具体实施方案中，制备微载体的原料选自琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、魔芋、角叉藻聚糖、胞外多糖和藻酸盐。因此在一个有利的实施方案中，本发明微载体是凝胶。在最有利的实施方案中，微载体表现多孔结构，这样促使细胞生长进入到颗粒中，同时也提供最大量的可用营养物。
本发明微载体原料可通过标准方法方便的制得，例如反转混悬凝胶化(inverse suspension gelation)(S HjertenBiochim Biophys Acta79(2)，393-398(1964))。可选择的，基础基质为商业上可得的产品，例如SepharoseTMFF(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。平均上，本发明微载体平均颗粒大小为40-300μm，例如100-250μm，例如约230μm(在0.9％NaCl中)。在最优选实施方案中，本发明微载体至少约为170μm(在0.9％NaCl中)。
在一个可选择的实施方案中，本发明微载体包含交联的合成聚合物，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等，它们可自身进行修饰以实现化合物的最优固定即配基偶联，和细胞培养。
在本发明微载体的最有利实施方案中，化合物通过仲胺固定到基质表面上。有关用于制备本发明微载体的方法的进一步细节将在下文本发明第二方面描述中提供。
本发明也包括上述用于细胞培养微载体的应用。因此，本发明一个方面提供了由上述权利要求中任一项的至少一种微载体组成的细胞培养支持物。
本发明第二方面涉及到制备聚阳离子微载体的方法，通过使一种至少含一个胍基的化合物与一个经环氧化物活化的基质结合，以固定该化合物。环氧化物活化可为碱性例如pH 9或酸性催化。在这个领域中，基质的环氧化物活化是熟知的并是普遍使用的固定技术；参见Immobilized Affinity Ligand Techniques，Hermanson等，Greg T.Hermanson，A. Krishna Mallia和Paul K. Smith，Academic Press，INC，1992。固定在一个控制pH的溶液里进行最为有利。关于通过本发明的方法来制备微载体的更多细节可在上文中本发明的第一方面相关内容中找到。
基质可以是上述原料中的任何一种，例如由一种交联聚糖制成的基本上球状多孔珠。在上述环氧化物活化的一个步骤里，糖类基质被烯丙基化，例如下文实验说明部分所述。相反的，如果基质由合成的聚合物制成，那么烯丙基一般已经存在于基质中，因此不需要烯丙基化步骤。
固定化合物也可如本发明第一方面所描述。因此在一个实施方案中，固定化合物选自单个氨基酸，例如Arg；两个氨基酸的混合物，例如Arg和Asp；或者二肽，例如Arg-Glu、Arg-Asp或者Arg-Arg。在最优实施方案中，固定化合物选自单个氨基酸，例如Arg；和二肽，例如Arg-Glu、Arg-Asp或者Arg-Arg。
在固定化合物是一个二肽的情况下，偶联可以是在含有两种氨基酸的溶液里发生的转移反应，即第一个氨基酸然后第二个氨基酸的逐步偶联反应。将化合物固定到本发明种类的支持物表面的方法，是本领域技术人员所熟知的。
第三方面，本发明涉及到使细胞附着于表面的方法，其中包含至少一个胍基的阳离子化合物被用来使细胞附着于所述表面。在一个实施方案中，附着作用是通过电荷作用进行的。在最优选的实施方案中，化合物是精氨酸(Arg)。表面可以是如微载体表面、膜表面、织物表面、芯片例如微芯片表面、毛细管例如微毛细管表面或者导管表面。在一个具体实施方案中，本发明的表面是一个织物表面，在附着细胞后可用于多种用途。本发明的方法可用于如生产过程中的分析目的，和/或用于治疗用途，如用于治疗灼伤病人的薄纱(tissue)。
另外，本发明涉及到为高通量筛选(HTS)定位细胞方法，包括与上文本发明第三方面一致的限定的方法。
第四方面，本发明涉及到细胞培养方法，其中细胞在一个或多个包被了一种阳离子化合物的微载体表面于提供生存条件的环境下培养，所述细胞通过阳离子包被提供的胍基附着到微载体上。在一个实施方案中，细胞附着基于电荷相互作用。在最有利的实施方案中，微载体为如上文所述。在这个上下文里，技术人员将理解提供生存条件是指为每种细胞供给合适的温度、营养和更多条件。因此，细胞已经附着于其上的微载体在合适容器中保持溶解或悬浮状态，优选在温度控制下并伴有搅拌。根据本发明培养的细胞可以是任何真核细胞或原核细胞，优选是真核细胞，例如哺乳动物细胞，如重组细胞系、植物细胞等。在一个实施方案中，细胞为完全(truly)贴壁细胞，例如原代细胞或上皮形态细胞。在一个尤其有利的实施方案中，细胞为低铺板率细胞或分化型细胞或敏感型细胞，例如肝细胞或内分泌细胞。在下文实验部分中，本发明的这个方面通过用一个成纤维细胞系称为Vero细胞来阐明，这是一个来自非洲绿猴肾脏的严格贴壁成纤维细胞。
在一个实施方案中，本发明的方法包括更进一步的步骤，即从所述微载体收获有活力的细胞。在一个实施方案中，培养的细胞在后续步骤中被用于分析和/或治疗目的。在一个替代的实施方案中，培养的细胞在后续步骤被用于支持培养病毒、细菌、霉菌、真菌或藻类。这个实施方案有利于疫苗制备相关方法和其它用途。
最后，本发明涉及到表面固定有来自鱼类的明胶的微载体。明胶是一种复杂的混合物，但是其中的蛋白含有大量阳离子肽和一些蛋白。固定鱼明胶的基质可以是上文本发明第一方面所述的任何一种。既然这样的微载体上没有哺乳动物蛋白存在，考虑到可获得Cytodex 3TM(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)的微载体，本发明这方面是有利的。另外，明胶可提供促进细胞生长的生长因子，也可在微载体相互碰撞或其与培养容器表面碰撞时为附着细胞提供机械保护。
附图详述图1显示了实施例1中解释的本发明微载体上非洲绿猴肾细胞株系细胞(Vero细胞)培养中细胞数目如何随培养时间而变化。在图1中，Y轴表示细胞数目(每毫升悬液中细胞数目)，X轴表示时间。在约168小时，描述使用本发明的培养情况的最上面的线(菱形)已经达到约1.40E+06；而为市售交联葡聚糖颗粒的对照CytodexTM1(Amersham Biosciences，Uppsala，Swenden)(圆形)达到约8.00E+05，且为包被有明胶的市售交联葡聚糖颗粒的另一对照实例CytodexTM3(Amersham Biosciences，Uppsala，Swenden)(三角形)在相应时间点只达到1.00E+06以下。因此，图1清晰显示出本发明微载体可提供的细胞数目显著高于市售微载体，并因此提高了生产率。
图2显示了实施例1中解释的本发明微载体上非洲绿猴肾细胞株系细胞(Vero细胞)培养中细胞数目如何随培养时间而变化。图2所示图形，除菱形代表实施例2中使用微载体培养的结果以外与图1类似。再一次的，本发明微载体显示相对于市售微载体显著提高了生产率。
实验部分本实施例仅为说明性目的提供，不应如附加的权利要求书定义那样限制本发明。所有下列给出的及在本说明书中其它地方出现的参考文献通过引用结合到本文中。
实施例1SephadexTMG-50 Fine的烯丙基化取32g干SephadexTMG-50 Fine(Amersham Biosciences，Uppsala，Swenden)，在玻璃容器中与388ml水混合，溶胀1h。SephadexTMG-50Fine的溶胀为每克干重约12ml。
溶胀的凝胶转移到一个装有机械搅拌器的三颈圆底烧瓶中，搅拌下向圆底烧瓶中加入44g Na2SO4。浆状物加热至30℃，并在30℃下保持1.5小时。然后加入80ml NaOH(50％w/w)和0.6gNaBH4。再加热浆状物至50℃，加入80ml烯丙基缩水甘油醚(AGE)。在50℃下反应持续一夜。
加入乙酸(60％w/w)中和pH至6.5-7.5以停止反应。在玻璃滤器上用4倍凝胶体积的水洗涤凝胶，再用3倍凝胶体积的乙醇洗涤，最后用6倍凝胶体积的水洗涤。
根据标准方法在RADIOMETER ABU 93 TRIBURETTEHE上用0.1M AgNO3测定烯丙基含量。烯丙基含量测定为101μmol/ml凝胶。
烯丙基化的SephadexTMG-50 Fine的精氨酸偶联取250ml烯丙基化的凝胶转移到一个装有搅拌器的三颈圆底烧瓶中，加入63ml水和10.3g NaAc*3H2O。逐滴滴加溴水直至出现稳定的黄色。反应继续进行5min。通过加入甲酸钠直到黄色消失终止反应。搅拌浆状物30分钟，然后在玻璃滤器上吸干。
将凝胶加入到一个盛有251ml水和36.9gL-精氨酸的溶液的圆底烧瓶中。加热浆状物至45℃，并用NaOH(50％w/w)调pH值至11.4。在30min和60min后测量pH值，并调至11.4。在45℃下反应持续一夜。
在一个玻璃滤器上依次用与1倍凝胶体积的0.1M Tris，pH 8及与1倍凝胶体积的0.1M NaOAc，pH 4洗涤凝胶，共进行8个循环。最后用8倍凝胶体积的水洗涤凝胶。
根据标准方法在RADIOMETER ABU 93 TRIBURETTEHE上用0.1M HCl测定氯离子容量。氯离子容量测定为0.58μmol/mg干凝胶。
实施例2烯丙基化的SephadexTMG-50 Fine的精氨酸偶联与实施例1类似，但使用得自实施例1的烯丙基化的SephadexTMG-50 Fine 50ml，12.5ml水、2.06g NaAc*3H2O，50ml水及7.33g L-精氨酸。
根据标准方法在RADIOMETER ABU 93 TRIBURETTEHE上用0.1M HCl测定氯离子容量。氯离子容量测定为0.58μmol/mg干凝胶。
实施例33.1在不同培养系统中培养Vero细胞如下文所述，用同样方法制备所有不同的微载体类型(基于CytodexTM载体)。在这些条件下，一个铺满层为约1×105细胞/cm2，并且在一个更长的时间内用于接种临界细胞数为1-2×104/cm2。这些是T瓶数据。
所有操作均在一个遮盖物下于无菌条件中使用无热原材料进行。培养基温度保持在37℃，pH值约为7.2。
3.1.1在T瓶中培养Vero细胞在T瓶(NunclonTMΔSurface；Nunc Brand Products)中单层Vero细胞情况下，用胰蛋白酶或螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)脱附细胞。
首先，将上清液倒入废液瓶，并用PBS(wo Ca2+/Mg2+)洗涤细胞一次。在下一步中，根据下列表1将胰蛋白酶/EDTA加入到T瓶并在细胞层上散布。
表1 T瓶中培养Vero细胞

在室温下孵育若干分钟后，敲击T瓶使细胞脱附，然后根据表1立即加入胰蛋白酶抑制剂。在下一步中，加入条件培养基(见表1)。
然后，按分传比(split ratio)的概念分传细胞。每周按1∶3比例传代Vero细胞两次(根据培养表面计算需要体积)。
在培养箱中，用9％(v/v)CO2和增湿空气，在37℃下培养细胞。
3.1.2在滚瓶中培养Vero细胞使用175cm2T瓶中的铺满培养物接种到850cm2的滚瓶中(Corning)。按上文3.1.1所述脱附细胞。用200ml条件培养基重悬细胞并转移到滚瓶中。将120ml无菌CO2充入滚瓶中并在37℃下以0.2rpm在滚瓶器上培养。
用类似程序脱附来自滚瓶培养的细胞。将上清液倒入废液瓶，并用PBS(wo Ca2+/Mg2+)洗涤细胞层一次。将PBS也倒入废液瓶，然后根据表2加入胰蛋白酶/EDTA。
表2 滚瓶中培养Vero细胞

室温下孵育若干分钟后，敲击下滚瓶中的细胞再根据表2加入抑制剂。用条件培养基重悬细胞(见表2)。然后可将细胞悬液分装到几个滚瓶中，每个滚瓶用培养基添加到200ml，并将120ml无菌CO2充入每个滚瓶中。在37℃下以0.2rpm转速培养细胞。
3.1.3用EDTA脱附Vero细胞为接种微载体培养物，用EDTA法将细胞从表面上脱附。
用无菌PBS(wo Ca2+/Mg2+)从0.16％(w/w)EDTA储藏液稀释到0.02％(w/w)溶液，并水浴加热到37℃。倒掉铺满培养细胞层的上清液，用PBS(wo Ca2+/Mg2+)洗涤细胞层一次。根据表3用如3.1.1和3.1.2所述方法脱附细胞。
表3 用EDTA脱附Vero细胞

不必加入任何种类的抑制剂，因为EDTA将与培养基中的二价离子螯合。如表1或表3所述加入相同量的培养基。
然后将细胞悬液分装到几个容器中，并如3.1.1和3.1.2所述进行培养。
3.2旋动瓶中在微载体上培养Vero细胞所有操作均于无菌和无热原条件下在一个遮盖物下进行。
3.2.1旋动瓶中微载体的平衡和用量将至少方程1中体积的微载体加入到50ml试管中。在载体沉降后，除去PBS并加入等量的培养基。载体重悬，沉降后也除去培养基。重复该程序4次。最后PBS的稀释倍数应高于10。
Vcarriar=n×VCulture×c×SV1000Eq.1]]>VCarrier＝×VCu1ture×c×SV/1000VCarrier………溶胀后载体体积(ml)VCulture………培养物最终体积(ml)n………………旋动管数目c………………载体浓度(g/L)SV……………溶胀微载体体积(mg/L)最后一次洗涤且载体沉降后，用移液管除去培养基，使最后体积的50％为沉降微载体。按方程2的体积从这个混悬物转移到一个旋动管中。
VSpinner＝2×VCulture×c×SV/1000 Eq.2VSpinner………每支旋动管载体混悬物体积(ml)VCulture………培养物最终体积(ml)c………………载体浓度(g/L)SV……………溶胀微载体体积(mg/L)盛有培养基和载体的旋动管平衡在一个培养箱中过夜(37℃，9％(v/v)CO2)。
3.2.1旋动培养的接种如3.1.1和3.2.2所述在175cm2T瓶中或在850cm2滚瓶中培养细胞。用EDTA法脱附滚瓶培养细胞(见3.1.3)。在接种过程中将不同培养瓶的细胞汇合并保持在37℃。根据方程3计算一个实验所需的瓶数。
NFlask＝(CCSpinner×VCulture×n)/AFlask×105Eq.3NFlask………瓶子数目CCSpinner………最终接种细胞浓度(细胞数/ml)VCulture………培养物最终体积(ml)n………………旋动管数目AFlask………培养面积(cm2)T175型为175cm2或R850型为850cm2用锥虫蓝染色法估计总细胞浓度和生存力。
每个旋动瓶接种体的体积用方程4计算。
Vinoc＝(CCinocr×VCulture×100)/(CCTotal×Fviab) Eq.4Vinoc…………每支旋动管接种体体积(ml)VCulture………培养物最终体积(ml)CCTotal………总接种体细胞浓度(细胞数/ml)VCulture………培养物最终体积(ml)Fviab…………生存能力(％)所有实验最后培养体积均选用40ml，这意味着每个旋动瓶(125ml烧瓶；Techne)的顶部空间约为200ml空气。
为了接种，仔细旋转移动旋动瓶，并用一根磁力搅拌棒固定夹子。在20秒内将接种物逐滴滴加到载体悬液中。然后，37℃下在一个旋动管台(Cellspin；Integra Biosciences)上按静止25分钟、35rpm搅拌5分钟循环间断搅拌混合培养物6小时。在此时间段后，用新鲜培养基添加体积到40ml，再开始以35rpm持续搅拌。在这个时间点，取出第一份样品(见3.2.3)。每24小时取样一次。
48小时后，更换20ml培养基，并充入混合气体(75％N2、20％O2、5％CO2；每旋动瓶换气750ml；Linde)。从这时开始，每24h更换一次培养基和混合气体。
3.2.3旋动培养物的取样3.2.3.1细胞浓度的估测为常规取样，通过计算释放胞核来测定细胞浓度。在这个方法中，在微载体上生长的细胞在一种低渗溶液中孵育，在该溶液中用结晶紫对溶胞释放的胞核进行染色(Microcarrier cell culture；Pharmacia Biotech；2000)。
从旋动培养物取出1.5ml匀质样品，然后取1ml加到一个1.5mlEP管中，通过重力使载体沉积；剩余0.5ml样品用于拍照(见3.2.3.2)。再用一支移液管吸掉EP管中的上清液。根据估计细胞浓度，加入0.5或1.0ml结晶紫(见3.3.1)，通过振荡样品混合。这个样品于37℃下孵育1小时，期间并时时振荡。
孵育结束后，用血细胞计数器计算释放的胞核并计算细胞浓度(方程5)。
这些样品在4℃下能保持稳定一周。
CCSpinner＝RN×VCV×1000/(SQ×VSample)Eq.5CCSpinner………细胞浓度(细胞数/ml混悬物)RN………………计算胞核总数VCV……………结晶紫液体积(ml)SQ……………细胞计数格数目VSample………样品体积(ml)3.2.3.2微载体培养物拍照如3.2.3.1所述取样，其中0.5ml加入到一个EP管中。重力沉降载体后倒掉上清液，加入0.25ml苏木素溶液(见3.3.2)并仔细混合。然后室温孵育几个小时(至少2h，o/n更佳)。为进行显微拍照，每份样品取30μl加入到一个96孔板的一个孔中(Cat.No.269620；NuncBrand Products)。并在显微镜下拍摄数码照片。
3.3溶液3.3.1用于计算释放胞核的结晶紫溶液柠檬酸0.1mol/L 19，21g/LFWC6H8O7＝192，1g/mol结晶紫0.1％ 1g/LRO-水该溶液用一张滤纸过滤并保存在4℃下。
3.3.2微载体的苏木素染色苏木素 0.1％(w/w) 1g/LNaIO30.02％(w/w) 0.02g/LKAl(SO4)2×12H2O 1％(w/w) 10gL FW＝474.38g/mol室温下溶解于900ml RO-水中并室温搅拌o/n。搅拌后加入以下物质。
水合氯醛 5％(w/w) 50g/LFWC2H3Cl302＝165.4g/mol柠檬酸0.1％(w/w)1g/L FWC6H807＝192，1g/mol用RO水稀释溶液至1000ml并用滤纸过滤。
该溶液在6℃下保存，并在2年内可用。
3.3.3用于细胞脱附的胰蛋白酶胰蛋白酶0.1％(w/w) 1g/LGibco 27250-042EDTA0.02％(w/w) 0.2g/L溶解于PBS(w/o Ca2+/Mg2+)中，然后用0.2μm滤膜过滤除菌。也在4℃或-20℃下保存。
3.3.4用于细胞脱附的胰蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂 1mg/mlSigma T 6522溶解于PBS(w/o Ca2+/Mg2+)中，然后用0.2μm滤膜过滤除菌。也在4℃或-20℃下保存。
权利要求
1.一种微载体，所述微载体的表面经胍基固定有阳离子化合物。
2.权利要求1的微载体，所述微载体能够经阳离子化合物与细胞间的电荷相互作用附着细胞。
3.权利要求1或2的微载体，其中所述阳离子化合物在微载体表面形成聚阳离子包被。
4.前述权利要求中任一项的微载体，其中所述阳离子化合物在微载体表面形成弱碱性包被。
5.前述权利要求中任一项的微载体，其中所述阳离子化合物包含一个或两个氨基酸。
6.权利要求5的微载体，其中所述阳离子化合物由精氨酸(Arg)组成。
7.权利要求5的微载体，其中所述阳离子化合物由二肽组成。
8.权利要求7的微载体，其中所述二肽为精氨酸-谷氨酸(Arg-Glu)或精氨酸-天冬氨酸(Arg-Asp)。
9.前述权利要求中任一项的微载体，其中所述阳离子化合物经仲胺固定于微载体表面。
10.前述权利要求中任一项的微载体，其中所述微载体由交联糖组成。
11.一种细胞培养支持物，所述支持物由前述权利要求中任一项的至少一种微载体组成。
12.一种制备微载体的方法，所述方法包括使包含至少一个胍基的化合物与环氧化物激活的基质表面接触，从而经胍基将化合物固定于所述表面。
13.权利要求12的方法，其中所述化合物包含一个或两个氨基酸。
14.权利要求13的方法，其中所述化合物由精氨酸(Arg)组成。
15.权利要求13的方法，其中所述化合物由二肽组成。
16.权利要求12的方法，其中所述化合物包含一个或多个核苷酸。
17.权利要求12-16中任一项的方法，其中所述基质为交联糖。
18.权利要求12-17中任一项的方法，其中所述由此制备的微载体如权利要求1-10中任一项所定义。
19.一种使细胞附着于表面的方法，其中使用包含至少一个胍基的阳离子化合物使细胞附着于所述表面。
20.权利要求19的方法，其中所述附着经电荷相互作用。
21.权利要求19或20的方法，其中所述阳离子化合物由精氨酸(Arg)组成。
22.权利要求19-21中任一项的方法，其中所述表面为微载体、膜、织物、载玻片、芯片、毛细管或器皿的表面。
23.权利要求19-22中任一项的方法，其中所述细胞附着用于分析或生产目的。
24.一种用于高通量筛选(HTS)的定位细胞方法，所述方法使用权利要求19-23中定义的方法。
25.一种细胞培养方法，其中在一个或多个包被了阳离子化合物的微载体表面并在提供生存力的环境下培养细胞，所述细胞经阳离子包被提供的胍基附着于微载体。
26.权利要求25的方法，其中所述细胞附着基于电荷相互作用。
27.权利要求26的方法，其中所述阳离子化合物由精氨酸(Arg)组成。
28.权利要求26或27的方法，所述方法进一步包括从所述微载体收获活细胞的步骤。
29.权利要求26或27的方法，所述方法进一步包括将细胞用于分析和/或治疗目的的步骤。
30.权利要求25的方法，所述方法包括将细胞用于支持培养病毒、细菌、霉菌、真菌或藻类的进一步步骤。
全文摘要
本发明涉及微载体，其表面经胍基固定有阳离子化合物。该微载体能够附着细胞，例如经电荷相互作用附着细胞，并有利于用作细胞培养的支持体。所述化合物可包含一个或两个氨基酸，如精氨酸或二肽。本发明还涉及制备聚阳离子微载体的方法，该方法包括将包含至少一个胍基的化合物固定在环氧化物活化的基质上。
文档编号C07C29/00GK1863819SQ200480029074
公开日2006年11月15日 申请日期2004年10月5日 优先权日2003年10月6日
发明者J·范阿尔斯蒂恩, H·贝里, A·布于尔林 申请人:阿默森生物科学有限公司