专利名称：抑制白斑综合征病毒(wssv)感染的组合物和方法
抑制白斑综合征病毒(wssv)感染的組合物和方法相关申请
本申请要求美国临时专利申请No. 60/501, 614 ( 2003年 9月9日递交)的优先权，其内容在此全部引用作为参考。发明背景
病毒性疾病是全球虾水产业中的主要问题，其导致^艮大的 经济损失。白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus (WSSV))是 最重要的病毒性病原体之一。由于WSSV导致的产业损失从1995-2002 年超过了 80亿美元。WSSV感染的坏变得昏睡的，显示食物消耗的降 低，松散的表皮，并且经常在外骨骼下呈现白斑。该病毒感染大多数 的甲壳类动物，但是只对虾是致死的。
WSSV病毒粒子是具包膜的核壳，其为杆状，大约275 x 120 認的大小，在颗粒的一个末端具有尾巴样的突出部分 (Wongsteerasupaya Dis. Aqat. Org. 21: 69-77, 1995)。双链环状 DNA基因组大约305 kb (参见例如van Hulten等人，Virology 286:7-22,2001; WO 01/09340; WO 02/22664;和WO 03/070258)。根 据序列和系统发生分析，WSSV是称为Nimaviridae的新病毒科的白点 病毒属(Whispovirus)的成员，指的是病毒颗粒上的线样的极性延伸。
双链的WSSV基因组包围于蛋白质包膜中，所迷的蛋白质 包膜又被双层脂质膜覆盖。病毒蛋白穿插脂质膜并从成熟的病毒的表 面伸出。所述的病毒蛋白质与奸的肠内层细胞表面上的受体分子相互 作用，使病毒膜与虾的细胞膜非常靠近，因而导致两个膜的融合，使 病毒DNA进入奸细胞。
WSSV基因组已经被测序(van Hulten等人，同上)，并且鉴定了潜在的病毒蛋白。已经确定四种病毒蛋白质作为核壳的一部分 或在病毒外膜表面上表达并定位。Vp28和VpW在病毒表面，Vp3S和 Vp26为核壳的一部分。
免疫学的证据表明VpM在病毒表面发挥作用，介导病毒 感染(VanHulten等人，Virology 285: 228-233， 2001)。这些研究 是利用Vp28的抗体进行的，其抑制蚱细胞的病毒感染。但是现有技术 未确定与受体相互作用的Vp28区域。
本发明提供抑制白斑病毒感染的新的Vp28组合物和方法。发明简述
本发明基于以下的发现，即Vp28是与甲壳类动物(例如 奸)和海洋昆虫上的WSSV受体相互作用的主要蛋白质。本发明因此提 供了通过施用Vp28与其受体相互作用的阻断剂来抑制WSSV感染的方 法。本发明还提供了组合物，例如肽或抗体，其阻断Vp28与受体的结 合，从而防止或抑制WSSV进入细胞。附图筒述
图1举例说明了用包含Vp28或Vp35的多肽(浓度为每吨 25克或每吨5克)喂养虾时对WSSV感染的不同程度的防护效果。也 包括了对照。
图2举例说明了不同饮食的虾暴露于WSSV之后的存活。 定义
此处使用的"Vp28肽"是指由SEQ ID NO : 2的28-204位 的至少8个连续的氨基酸组成的肽。优选地，"Vp28肽"由SEQIDN0: 2 的28-204位的至少44个连续的氨基酸的氨基酸序列组成，即，该 氨基酸序列可能具有SEQ ID NO: 2的28-204位的至少8， 9， 10， 11, 12， 13， 14, 15， 16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25， 26, 27， 28， 29， 30， 31， 32， 33， 34， 35， 36， 37， 38， 39， 40， 41， 42或 43，并优选至少44， 45， 46， 47， 48, 49, 50， 51， 52， 53， 54， 55， 56， 57, 58， 59， 60， 61， 62， 63， 64， 65， 66， 67， 68， 69， 70， 71, 72， 73， 74， 75, 76， 77， 78， 79， 80， 81， 82， 83， 84， 85， 86， 87， 88， 89， 90， 91， 92， 93， 94， 95， 96， 97， 98， 99， 100, 101， 102， 103， 104， 105， 106， 107, 108， 109， 110， 111， 112， 113， 114， 115， 116， 117， 118， 119, 120, 121， 122， 123， 124， 125， 126， 127， 128， 129， 130， 131， 132， 133， 134， 135， 136， 137， 138， 139， 140， 141， 142， 143， 144， 145， 146, 147， 148， 149， 150， 151， 152， 153， 154， 155， 156， 157， 158， 159， 160， 161,162， 163， 164， 165， 166， 167， 168， 169， 170， 171， 172， 173， 174， 175， 176或177个连续的氨 基酸。"Vp28肽"由"Vp28多核苷酸"编码，本申请所用的这两个术语 都包括天然产生的和重组的形式。另外，"Vp28肽"和"Vp28多核苷酸'， 还可能包括包含一个或多个保守性替换的所有变体，其在下面详述， 只要所迷的变体不改变"包含Vp28肽的多肽"抑制对虾属(Penaeus sp.)细胞的WSSV感染的能力。
此处所用的"包含Vp28肽的多肽"是指包含其一部分氨 基酸序列来自Vp28氨基酸序列，即上述的"Vp28肽"，而其氨基酸 序列的其他部分是与Vp28异源的，即来自非全长Vp28氨基酸序列的 来源。
"全长"Vp28蛋白或核酸是指多肽或多核苷酸序列或其变 体，其包含通常包含于一种或多种天然发生的野生型Vp28多核苷酸或 多肽序列中的所有元件。"全长"可能在各种翻译后加工或剪接(包括 可变剪接)阶段之前或之后。SEQ ID NO : 2是全长Vp28多肽的代表 性氨基酸序列。
术语"分离的"、"纯化的"或"生物学纯的"是指充分或基本 上不含有其天然状态下所见的通常与其一起存在的成分的物质。纯度和均质性通常使用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相层 析进行测定。为存在于制剂中的主要物质的蛋白质或核酸是充分纯化 的。特别是，分离的核酸与天然包围该基因并编码蛋白的一些开发阅 读框架分开，所述的蛋白不是该基因编码的蛋白。在一些实施方案中
术语"纯化的"是指核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。优选地，其意味着所迷的核酸或蛋白质是至少85%纯，更优选至少95 %纯，并最优选至少99%纯。在其他实施方案中"纯度"或"纯化"是指 从欲被纯化的组合物中除去至少一种污染物。在这种意义上，纯化不 要求被纯化的化合物是均一的，即100%純。
术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在这里互换使用，是指氨基 酸残基的多聚物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的 天然发生的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸多聚物，也适用于天然 发生的氨基酸多聚物，那些包含修饰的残基的多聚物和非天然发生的 氨基酸多聚物。
术语"氨基酸"是指天然发生的和合成的氨基酸，以及与天 然发生的氨基酸发挥相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然 发生的氨基酸是那些由遗传密码子编码的氨基酸，以及那些后来修饰 的氨基酸，例如羟基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。氨基 酸类似物是指与天然发生的氨基酸具有相同的基本化学结构(例如与 氢结合的a碳，羧基，氨基和R基团)的化合物，例如，高丝氨酸、 正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜(methionine sulfoxide)、甲硫氨酸甲基 锐(methionine methyl suifonium)。这样的类似物可能具有修饰 的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的主链，但是保持与天然发生的氨 基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的 一般化 学结构不同的结构的化合物，但是其发挥与天然发生的氨基酸相似的 功能。
这里通过氨基酸通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission建议的单字母符号来引用氨 基酸。同样地，核苷酸通过其普遍认可的单字母密码来引用。
"保守性修饰的变体"对氨基酸和核酸序列都适用。对于特 定的核酸序列，保守性修饰的变体是指那些编码相同或基本相同的氨 基酸序列的核酸，或者如果所述的核酸不编码氨基酸序列时，是指基 本相同或相关(例如天然邻接的序列)。由于遗传密码子的简并性， 大量功能上相同的核酸编码大多数的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、 GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个由某一密码子确定的 丙氨酸位置处，该密码子可以被改变为所述的其他相应的密码子，而 不改变编码的多肽。这种核酸变异为"沉默变异"，其是一种保守性 修饰的变异。此处所迷的每一编码多肽的核酸序列还包括该核酸的沉 默变异。本领域的技术人员应认识到在一定的上下文中，核酸中的每 个密码子(除了 AUG，其通常是甲疏氨酸的唯一密码子，还有TGG，其 通常是色氨酸的唯一密码子)都能被修饰产生功能上相同的分子。因 此，通常对于表达产物而非实际的探针序列而言，在所述的序列中包 含了编码多肽的核酸中的沉默变异。
至于氨基酸序列，本领域技术人员应认识到对核酸、肽、 多肽或蛋白质序列的个别的替换、缺失或插入改变、添加或缺失编码 序列中的单个氨基酸或少量氨基酸，如果所述的改变导致用化学类似 的氨基酸替换氨基酸，其是"保守性修饰的变体"。提供功能上类似 的氨基酸的保守性替换表本领域众所周知。除了但是并不排除本发明 的多态性变体、种间同源物以及等位基因，该保守性修饰的变体通常 为如下的互相的保守性替换1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ; 2)天 门冬氛酸(D)，谷氨酸(E) ， 3)天门冬酰胺(N),谷氨酰胺(Q); 4)精氨酸(R)，赖氨酸(K) ; 5)异亮氨酸U),亮氨酸(L)， 甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V) ; 6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y),色 氨酸(W) ; 7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)， 甲石克氨酸(M)(参见例如Creighton， proteins (1984))。
可以通过不同组织水平描述大分子结构例如多肽结构。 对于这种组织的一般描述，参见例如Albert等人，Molecular Biology of the Cell (3rd, 1994)和Cantor&Schimmel， Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules (1980)。 "一级结构，，是指具体肽的氨基酸序列。"二级结构"是指多肽内局 部有序的三维结构。这些结构被称为结构域。结构域是通常形成该多 肽的紧密单元的多肽部分，并通常"至大约500个氨基酸长。典型的
结构域由较弱组织部分例如P-折叠和a-螺旋片段組成。"三级结构" 是指多肽单体的完整的三维结构。"四级结构，，是指通常由独立的三 级单元通过非共价键締合形成的三维结构。
"核酸"或"寡核苷酸"或"多核苷酸"此处所用的语法上的 等价物是指至少两个共价连接在一起的核苷酸。寡核苷酸通常大约5, 6， 7， 8， 9， 10， 12, 15， 25， 30， 40， 50或更多个核苷酸长或多 达大约100个核苷酸长。核酸和多核苷酸是任意长度的多聚物，包括 更长的长度，例如200、 300、 500、 1000、 2000、 3000、 5000、 7000、 10000等。本发明的核酸通常含有砩酸二酯键，但是在某些情况，包 括可能具有可变的主链以及肽核酸主链和键的核酸类似物，包含例如 氨基磷酸酯、硫代砩酸酯(phosphorothioate ) 、 二疏代磷酸酯(phosphorodithioate )或 O-methylphophoroamidite键(参见 Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press)。其他类似物核酸包括那些具有正主链(positive backbone);非离子主链以及非核糖主链的核酸类似物， 包括那些描述于以下文献中的核酸类似物美国专利Nos. 5235033和 5034506 , 以及 ASC Symposium Series 580 , Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui&Cook， Eds的第6 章和第7章。包含一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸定义中。可 以为多种原因对核糖磷酸主链进行修饰，例如，为了增加该分子在生 理环境中的稳定性和半衰期或作为生物芯片上的探针。可以制备天然 发生的核酸和类似物的混合物；或可以制备不同核酸类似物的混合物 以及天然发生的核酸和类似物的混合物。
多种参考文献公开了此类核酸类似物，包括例如氨基磷酸 酯键(Beaucage等人，Tetrahedron 49 (10) ) : 1925 ( 1993 )以及其 中的参考文献；Letsinger， J. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzl 等人，Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977); Utsinger等人，Nucl. Acids Res. 14: 3487( 1986 );Sawai等人，Chem. Lett. 805 (1984)， Letsinger 等人，J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988);以及Pauwels等人，ChemicaScripta 26: 141 91986))，硫代磷酸酯键(Mag等人，Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991);以及美国专利No. 5644048)， 二硫代磷酸酯键 (Briu等人，J. Am.Chem.Soc. 111: 2321 (1989))， O-methylphophoroamidite键(参见Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press)， 和 肽核酸主链和键(参见Egholm， J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992); Meier等人，Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson等人，Nature 380: 207 (1996)，所有这 些被引入以供参考)。其他类似物核酸包括具有正主链(Denpcy等人， Pro" Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995);非离子主链(U.S. Patent Nos. 5, 386, 023， 5, 637, 684， 5, 602, 240， 5,216,141和 4, 469, 863; Kiedrowshi等人，Angew. Chem. Intl. Ed. English 30: 423 (1991); Letsinger等人，J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); Letsinger等人，Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 (1994); ASC Symposium Series 580， "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y, S. Sanghui和P. Dan Cook, 第2章 和第3章；Mes歸eker等人，Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994); Jeffs等人，J. Biomolecular NMR 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996))和非核糖主链的核酸，包括描 述于下列文献中的那些U.S.专利Nos. 5， 235， 033和5， 034， 506， 以及ASC Symposium Series 580， "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook, 第 6 章和第7章。包含一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义中 (参见Jenkins等人，Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169-176)。 Rawls， C & E News June 2， 1997笫35页中也描述了几种核酸类似物。所 有这些参考文献在此引用以供参考。
其他类似物包括肽核酸(PM)，其为肽核酸类似物。与天 然发生的核酸的高电荷磷酸二酯键主链不同，这些主链在中性条件下 基本是非离子性的。这产生两个优点。首先该PNA主链表现改善的杂
交动力学。由于错配的与完全匹配的碱基对，PNA在熔点温度(TJ上具 有较大的变化。由于内部错配DNA和RNA通常在Tm上表现2-4X:的 下降。对于非离子型PNA主链，所述的下降接近7-9"C。类似的，由 于他们的非离子性质，连接在这些主链上的碱基的杂交对于盐浓度相 对不敏感。另外，PNA不被细胞酶降解，因此能更稳定。
核酸可能是所述的单链的或双链的，或含有双链或单链序 列都有的部分。本领域技术人员应当理解，单链的描述也限定了互补 链的序列；因此，此处描述的序列也提供了该序列的互补序列。核酸 可能是DNA (基因组的和cDNA) 、 RM或杂合子，其中核酸可能包含 脱氧核糖核酸和核糖核酸的组合，以及碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸 腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、次黄嘌呤核苷、黄嘌呤、次黄嚟呤、异胞 嘧咬(isocytosine)、异鸟噤呤(isog磁ine)等的组合。"转录本" 通常是指天然产生的RNA，例如pre-mRNA、 hnMA或mRNA。此处所用 的术语"核苷"包括核苷酸和核苷以及核苷酸类似物和修饰的核苷，如 氨基修饰的核苷。另外，"核苷"包括非天然产生的类似物结构。因此 例如肽核酸的单一单元，每个都包含碱基，在此称为核苷。
在提到细胞或核酸、蛋白质或载体时使用的术语"重组的" 是指所述的细胞、核酸、蛋白质或栽体已经通过引入异源核酸或蛋白 质或天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或者所述的细胞衍生自如此 修饰的细胞。因此，例如重组的细胞表达在该细胞的天然形式(非重 组的)内不存在的基因，或者表达异常表达、低表达或根本不表达的 天然基因。此处的术语"重组核酸"是指未在天然情况通常发现的形式 的、 一般通过例如使用聚合酶和核酸内切酶的核酸操作最初在体外形 成的核酸。以这种方式获得了可操作连接的不同的核酸。因此，通过 连接通常不相连的DNA分子而体外形成的线性的分离的核酸或表达载 体都被认为是本发明目的的重組的。应当理解一旦制备了重组的核酸 并重新引入宿主细胞或生物体，其将非重组地复制，即使用宿主细胞 的体内细胞机制而不是体外操作；但是，该核酸一旦被重組制备，尽管 其后是非重组复制的，但是其仍然被认为是本发明目的的重组的。类 似地，"重组蛋白质"是使用重组技术制备的蛋白质，即通过上述的重 组核酸的表达制备的蛋白质。
当用于核酸部分时术语"异源的"是指该核酸包含两个或 多个亚序列，所述的亚序列在自然中通常不以相同的相互关系存在。 例如，所述的核酸通常是重组产生的，具有两个或多个序列，例如来 自安排用于制备新的功能性核酸的不相关基因，例如来自 一个来源的 启动子和来自另一来源的编码区。类似地，异源蛋白质通常指两个或 多个亚序列，它们在自然中不以相同的相互关系存在(例如融合蛋白 质)。
"启动子"是指指导核酸转录的一系列核酸控制序列。此处 所用的启动子包括在转录起始位点附近的必要核酸序列，例如在聚合 酶II型启动子的情况下的TATA元件。启动子可选地还包括远侧增强 子或抑制子元件，其可以位于远离转录起始位点多达几千碱基对处。
"组成型"启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的 启动子。"诱导型"启动子是环境或发育调节下有活性的启动子。术语 "可操作连接，，是指核酸表达控制序列(如启动子或系列转录因子结 合位点)与另一核酸序列之间的功能性连接，其中所述的表达控制序 列指导相应于另一序列的核酸序列的转录。
"表达载体"是重組或合成产生的核酸构建体，具有一系列 的特定的核酸元件，所述的元件能使特定的核酸在宿主细胞中转录。 所述的表达载体可以是质粒、病毒的一部分或核酸片段。通常所迷的 表达载体包括与启动子可操作性连接的欲被转录的核酸。
短语"与…选择性(或特异性)杂交"是指如果在复杂 混合物(例如总细胞或文库DM或RM)中存在特定的核苷酸序列，在严紧杂交条件下某一分子只与所述的特定的核苷酸序列结合、形成双 链(duplexing)或杂交。
短语"严紧杂交条件"是指这样一种条件，在该条件下，探针将与通常在核酸的复杂混合物中的其靶亚序列杂交，但是不与其 他序列杂交。严紧条件是序列依赖性的，在不同的情况会不同。较长
的序列在较高的温度下特异性杂交。有关核酸杂交的广泛的指南参见
Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)。对于特定的序列，在限定的离子强度pH下，通常选 择严紧条件为低于热熔解温度(Tm) 5-IOC。 L是一定的离子强度、 pH和核酸浓度下的温度，在该温度平衡时50%的与靼物质互补的探 针与靶序列杂交(当靶序列过剩时，在L，在平衡时50%的探针被占 用)。严紧条件是如下的条件盐浓度低于大约1. 0 M钠离子，通常 大约O. 01 -l.OM钠离子浓度(或其他盐)，pH7.0 — 8.3， 对 于短探针(例如10-50个核苷酸)温度为至少大约30°C，对于长探针 (例如大于50个核苷酸)是至少大约60t:。也可以通过加入去稳定剂 如甲酰胺获得严紧条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是 背景的两倍，优选10倍于背景杂交。示例性的严紧杂交条件可以如下 50%甲酰胺，5x SSC，和1% SDS， 42"€温育，或，5x SSC， 1% SDS， 65 n温育，在65。C用0. 2x SSC和0.1°/。 SDS洗涤。对于PCR，通常大 约36t:的温度用于低严紧性扩增，但退火温度可能根据引物的长度在 大约-48X:变化。对于高严紧性PCR扩增，典型的温度是大约62 C，但高严紧性退火温度可以根据引物长度和特异性为大约50'C至 大约65X:。对于高和低严紧性扩增的典型循环条件包括90'C - 95*C 30sec-2min.的变性阶段，持续30 sec. - 2 min.的退火阶段，和 大约72X: 1 - 2 min的延伸阶段。在例如Innis等(1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications， Academic Press, Inc. N.Y.中提供了用于低和高严紧性扩增反应的方案和指南。在严紧条件下彼此不杂交的核酸如果他们编码的多肽实质 上相同，那么他们仍是实质上相同的。这种情况发生在例如当使用遗
传密码子所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时。在这种情况下， 所述的核酸通常在中度严紧杂交条件下杂交。示例性的"中度严紧杂 交条件"包括在40%的甲酰胺、1MNaCl、 1。/。SDS的緩冲液中37C杂
交，在1XSSC中45n的洗涤。阳性杂交是背景的至少两倍。本领域 技术人员应该容易地认识到可以使用替代的杂交和洗涤条件来提供类 似的严紧性条件。在许多参考文献中提供了确定杂交参数的另外的指 南，例如Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001) 和 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人，eds. ， 1994).
"抗体"是指免疫球蛋白家族的糖蛋白或包含免疫球蛋白 片段的多肽，能够非共价、可逆地并以特异方式结合相应的抗原。典 型的抗体结构单位是四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成， 每对具有一条"轻链"(大约25 kD)和一条"重链"(大约50-70 kD)， 通过二硫键连接。公认的免疫球蛋白基因包括K 、入、a、 y、 5、 s和u恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。将轻链分为K 或入类。重链分为y、 u、 a、 5或s类，其依次分别限定了免疫球 蛋白种类IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。每条链的N-末端限定了可变区， 其大约100-H0或更多个氨基酸，主要负责抗原识别。术语可变轻链 (Vl)和可变重链(VJ分别是指轻链和重链的这些区。
此处所用的术语抗体包括单克隆和多克隆抗体，以及包括 体内产生的抗体，例如用抗原免疫的动物产生的抗体，以及体外产生 的抗体，例如杂交瘤产生的抗体。该术语还包括单链抗体(ScFv)。
可以使用本领域已知的任何技术制备单克隆或多克隆抗 体(参见例如Kohler & Milstein， Nature 256: 495-497, 1975 ; Kozbor等人，Immunology Today 4: 72,1983 ; Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan IL Uss， Inc.， 1985)。可以修改制备单链抗体的技术(U. S.专利No. 4,946， 778) 用于制备本发明的多肽的抗体。还可以使用转基因小鼠或其他生物如 其他哺乳动物来表达人源化抗体。或者可以使用噬菌体展示技术来鉴 定特异性结合选择的抗原的抗体和异聚的Fab片段(参见例如， McCafferty等人，同上；Marks等人，Biotechnology, 10: 779-783,1992)。此处所用的用来描述抗原(例如Vp28多肽)和抗体之间 的相互作用的术语"特异性结合"是指结合于特定抗原上的抗体的检测 是抗所述抗原的抗体的存在所决定的，所述的抗体通常存在于其他抗 体和蛋白质的不均一群体中。在指定的免疫测定条件下，指定可检测 的信号至少是背景信号的两倍。因此，特异性的抗原抗体结合应该产 生至少两倍于背景的信号，更通常是高于背景IO倍至IOO倍的信号。此处所用的术语"白斑综合征病毒(WSSV)感染的抑制"是 指在易感种动物中WSSV感染的发生率和严重程度的降低，如暴露于 WSSV后显示疾病症状(包括死亡)的动物数量的降低所显示的。如果 相对于对照群体，某一肽降低感染性至少10%,通常至少20%，典型 地至少50%或更高时就实现了 WSSV感染的抑制。此处所用的术语"甲壳类动物"包括任何和所有的甲壳类物 种，包括通常称为"虾"、"螃蟹"和"龙虾"，如双虾属(Penaeus )、 Litopenaeus、 Marsupenaeus、 Fenneropenaeus和Farfantepenaeus
的那些甲壳类动物。 发明详述
I. 介绍本发明是基于以下的发现，即病毒蛋白质Vp28介导WSSV和 细胞表面受体的结合，所述的结合是WSSV感染过程中的必要步骤。因 此，本发明提供了抑制WSSV感染的有效的手段，即通过给予易受WSSV 感染的物种无病毒的Vp28蛋白，由此细胞表面受体将不能被WSSV利 用。在本发明中已经对Vp28片段(以及其相应的编码多核苷酸序列) 的阻断WSSV结合、并因此抑制WSSV感染的能力进行了进一步鉴定。 因此，包含至少一个该Vp28的此类功能性片段的多肽可以被用于抑制 虾、龙虾、螃蟹、喇蛄(crawfish)和其他甲壳类动物的WSSV感染。
II. Vp28多肽 Vp28多肽是具有抑制WSSV感染能力的Vp28的片段。此 类片段包含SEQ ID NO: 2中28-204位的至少8个连续的氨基酸残基。 所述的多肽可以是任何长度，但是优选大小是150或更少的氨基酸。
示例性的片段如SEQ ID N0s : 3-8所示。Vp28多肽包括保持WSSV抑 制活性的包含保守性替换(例如Val替换Leu， Asp替换Glu， Lys替 换Arg或His,以及Gly替换Ser或Thr )的变体。
WSSV-抑制活性可以使用本领域已知的技术容易地确定。 例如，可以使用实施例2举例说明的方法评价一个肽的抑制坏或其他 甲壳类动物群体的WSSV感染的能力。通常通过测定感染后动物的存活 确定感染。如果相对于对照群体， 一个肽降低了至少10%，通常至少 20%,通常至少50%或更多的感染性，则实现了WSSV抑制。
正如本领域技术人员所理解的，也可以使用终点法 (endpoint)而非存活来测定WSSV感染的水平。例如，可以使用WSSV 蛋白的抗体，包括本发明Vp28多肽的抗体确定感染性来确定感染水 平。A.原核和真核生物中重组体产量
可以使用重组遗传学领域的常规技术，根据编码此处所述 多肽的多核苷酸序列制备本发明的Vp28多肽。教导本发明中使用的 一般重组技术方法的基础教材包括Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler， Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990); 以及 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等人，eds., 1994))。
核酸的大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)表示。这是根据琼脂糖或丙稀酰胺凝胶电泳，根据测序的核酸或根据公开的DM序列的估计。蛋白质的大小以千道尔顿UDa)或辱基酸残基数表示。蛋白质大小是从凝胶电泳、测序的蛋白质或从衍生的氨基酸序列或从公开的蛋白质序列进行估计的。
不可商业获得的寡核苷酸可以根据Beaucage &Caruthers，Tetrahedron Letts. 22: 1859-1862 (1981)首次描述的固相氨基磷酸三酯法，使用自动化合成仪，按照Van Devanter等人，NucleicAcids Res. 12: 6159-6168 (1984)所述化学合成。通过天然丙稀酰
胺凝胶电泳或通过如Pearson & Reanier， J. Chrom. 255: 137-149 (1983)所述的阴离子交换HPLC纯化寡核苷酸。可以在克隆后使用例如Wallace等人，Gene 16: 21-26 (1981)的用于测序双链模板的链终止法验证克隆的基因和合成的寡核 苷酸的序列。
表达系统为获得编码Vp28多肽的核酸的高水平表达，通常可以将 编码Vp28多肽的多核苷酸亚克隆入含有指导转录的强启动子、转录/ 翻译终止子以及如果对于编码蛋白质的核酸时的用于翻译起始的核糖 体结合位点的表达载体中。合适的细菌启动子本领域公知，并在例如 Sambrook等人(同上)以及Ausubel等人(同上)中描述。用于表达 Vp28多肽的细菌表达系统可在例如大肠杆菌(E. coli)、芽孢杆菌 属(Bacillus sp.)、沙门氏菌属(Salmonella)和柄杆菌属 (Caulobacter)中获得。用于此类表达系统的试剂盒可以商业获得。 用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统为本领域公知， 并且可商业获得。在一个实施方案中，所迷的真核表达载体是腺病毒 载体、腺伴随载体或反转录病毒载体。用于指导异源核酸表达的启动子取决于具体的应用。所述 的启动子可选地位于离该异源转录起点的距离与其在天然环境下离转 录起点的距离相同。但是正如本领域已知，该距离可以发生一些变异 而不影响启动子功能。除了所述的启动子，所述的表达载体通常含有转录单元或 表达盒，其含有Vp28多肽编码核酸在宿主细胞中表达所需的另外的元 件。因此典型的表达盒含有可操作连接于编码Vp28多肽的核酸序列的 启动子以及转录本有效多腺苷酸化所需的信号、核糖体结合位点以及 翻译终止。编码Vp28的核酸序列可能通常与可切割的信号肽序列连 接，以促进转化的细胞的编码的蛋白质的分泌。该信号肽可包括来自 组织纤溶酶原激活剂、胰岛素和神经元生长因子以及烟芽夜蛾
(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶的信号肽。如果基因组DM 被用作结构基因，则表达盒的其他元件可以包括增强子，带有功能性 剪接供体和受体位点的内含子。除了启动子序列外，表达盒还应该包含结构基因下游的转 录终止区以提供有效的终止。所述的终止区可从与启动子序列相同的 基因获得或可从不同的基因获得。用于将遗传信息转移进细胞的特别的表达载体不是非常 关键的。可以使用用于在真核或原核细胞中表达的任何常规载体。标 准的细菌表达载体包括质粒，例如基于pBR322的质粒，pSKF,pET23D， 以及融合表达系统，如GST和LacZ。也可以将表位标签添加到重组蛋 白上以提供方便的分离方法，例如c-myc。含有来自真核病毒的调节元件的表达载体通常用于真核 表达载体，例如SV40载体，乳头瘤病毒载体以及衍生自EB (Epstein-Barr )病毒的载体。其他示例性真核载体包括pMSG， pAV009/A+， pMT010/A+， pMAMneo-5，杆状病毒pDSVE，以及其他允许 在下列启动子的指导下表达蛋白质的载体SV40早期启动子、SV40 晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、Rous肉瘤 病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他显示对真核细胞中表达有效的 启动子。 —些表达系统具有提供基因扩增的标志，如胸苷激酶、潮 霉素B磷酸转移酶以及二氢叶酸还原酶。或者，不包括基因扩增的高 产量表达系统也是合适的，如在昆虫细胞中使用杆状病毒载体，其中 Vp28多肽编码核酸在多角体蛋白启动子或其他强杆状病毒启动子的 指导下。通常包含于表达载体中的元件也包括在大肠杆菌中起作 用的复制子，能筛选带有重组质粒的细菌的编码抗生素抗性的基因， 以及在质粒非必须区域的唯一限制性位点以插入真核序列。所选择的 特定的抗生素抗性基因不是关键的，本领域已知的许多抗性基因中的 任一种都适合。如果必要，可以任选原核序列，只要其不干扰真核细
胞中DM的复制。如上所迷，本领域技术人员应认识到可以对任何Vp28多 肽或其编码序列产生多种保守性替换而仍然保持其WSSV阻断活性。另 外，也可以对多核苷酸编码序列产生修饰以在特定表达宿主中提供偏 爱密码子使用而不改变Vp28多肽的氨基酸序列。
转染方法使用标准的转染方法来产生表达大量Vp28多肽的细菌、 哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后使用标准方法纯化所述多肽(参 见例如Colley等人，J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology， vol. 182 (Deutscher， ed. ， 1990))。通过标准方法进行真核和原核细胞的转 化(参见例如，Morrison, J. Bact. 132: 349-351 (1977); Clark-Curtiss&Curtiss， Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu 等人，eds， 1983).可使用任何众所周知的方法将外原核苷酸序列引入宿主 细胞中。这些方法包括使用磷酸钙转染、polybrene、原生质体融合、 电穿孔、脂质体、显微注射、plasma载体、病毒载体以及任何其他 已知的用于将克隆的基因组DNA、 cDNA、合成DNA或其他外源遗传物 质引入宿主细胞的方法(参见例如Sambrook等人，同上)。只要所使 用的特定遗传工程方法能成功地将至少一种基因引入能表达Vp28多 肽的宿主细胞。
重組多肽的纯化将表达载体引入到所述的细胞之后，在有助于所述的Vp28 多肽表达的条件下培养所述被转化的细胞，使用标准方法从所述的培 养物中回收所述的多肽(参见例如，Scopes, Protein Purification : Principles and Practice (1982); U. S.专利No. 4, 673， 641; Ausubel等人，同上；以及Sambrook等人，同上)。
1.来自重组细菌的蛋白质的纯化当本发明的Vp28多肽在转化的细菌中大量重组产生时
(通常在启动子诱导之后，但表达可能是组成性的)，蛋白质可能形 成不溶性的聚集体。有几种方案可以适于蛋白质包含体的纯化。例如， 聚集体蛋白(以下称为包含体)的纯化通常涉及通过通常但不限于在
大约100-150|ug/ml的溶菌酶和非离子去污剂0.1 % Nonidet P40的 緩沖液中温育来破坏细菌细胞而提取、分离和/或纯化包含体。可以使 用Polytron grinder(Brinkman Instruments, Westbury， NY)研磨细 胞悬液。或者，可以在水上超声细胞。另外的裂解细菌的方法描述 Ausubel等人(同上)和Sambrook等人(同上)中，并且为本领域 技术人员所已知。 —般离心所述的细胞悬液，将含有包含体的沉淀重悬于不 溶解包含体但洗涤所述的包含体的緩冲液中，例如20mMTris-HCl (pH 7.2)， 1 mM EDTA， 150 mM NaCl和2% Triton-X 100 (—种非离子 去污剂)。可能需要重复洗涤步骤以尽可能多地除去细胞碎屑。保留 的包含体沉淀可重悬于合适的緩沖液中(例如20mM磷酸钠，pH6. 8， 150 niM NaCl)。其他合适的緩沖液对本领域技术人员而言是显而易见 的。洗涤步骤后，加入既是强的氢受体又是强的氢供体的溶剂 (或者各具有所述特性之一的溶剂的组合)溶解包含体。然后形成包 含体的蛋白质可能通过用相容性的緩冲液稀释或透析复性。合适的溶 剂包括但不限于尿素(大约4 M-大约8 M)、甲酰胺(至少大约80%， 体积/体积)，和盐酸胍(大约4M至大约8M)。 一些能增加形成聚集体 蛋白质溶解的溶剂如SDS (十二烷基硫酸钠)和70%的曱酸不适于用于 该方法中，因为可能引起蛋白质的不可逆的变性，从而缺乏免疫原性和 /或活性。尽管盐酸胍和类似的试剂是变性剂，但是其变性不是不可逆 的，除去(例如通过透析)或稀释所述的变性剂，可以产生复性，使 得重新形成免疫学和/或生物学活性的目的蛋白质。溶解后，所述的蛋 白质可以与其他细菌蛋白质通过标准的分离技术分离。或者，可以从细菌周质中纯化蛋白质，例如重组的Vp28 多肽。如果重組蛋白被运到细菌周质中，则可以通过冷的渗透压休克
(cold osmotic shock)以及其他本领域技术人员已知的方法分离细 菌周质部分(参见Ausubel等人，同上)。为了从周质中分离重组蛋白， 将所述的细菌细胞离心形成沉淀。将该沉淀重悬于含有20%蔗糖的緩 冲液中。为裂解细胞，将细菌离心并将沉淀重悬于冰冷的5 mM MgS04 中，并在水浴中保持大约IO分钟。离心细胞悬液，倾析上清并保存。 通过本领域技术人员公知的标准的分离技术可以将存在于上清中的重 组蛋白与宿主蛋白分离。
2.用于纯化的标准蛋白分离技术
(a) 溶解度分级分离(Solubility Fractionation)经常作为初始步骤，并且如果蛋白混合物复杂时，初始的 盐分级分离可以从目的重组蛋白(例如重组Vp28多肽)分离许多不需 要的宿主细胞蛋白质(或来自细胞培养基的蛋白质)。优选的盐是硫 酸铵。硫酸铵通过有效降低蛋白混合物中的水量而沉淀蛋白。然后蛋 白质基于其溶解度发生沉淀。越加疏水的蛋白越容易在较低的硫酸铵 浓度下沉淀。典型的方案是向蛋白溶液中加入饱合的硫酸铵使所得的 硫酸铵浓度为20 - 30%。这将沉淀大多数疏水性蛋白质。弃掉沉淀(除 非目的蛋白是疏水性的)，并向上清中加入硫酸铵至已知沉的蛋 白的浓度。然后在緩冲液中溶解沉淀，并且如果必要通过透析或渗滤 除去过量的盐。其他根据蛋白溶解度的方法(例如冷乙醇沉淀)为本 ^域技术人员所公知，且也可以用于分级分离复杂蛋白质混合物。
(b) 大小差异过滤基于计算分子量，可以使用不同孔径(pore size)的膜 (例如Amicon或Millipore膜)的超滤将较大和较小的蛋白质分离。 第一步，用具有比目的蛋白(例如Vp28多肽)分子量低的分子量截留 值的孔径的膜超滤蛋白质混合物。然后用具有大于目的蛋白质的分子
量的分子截留值的膜对超滤的保留物进行超滤。重组的蛋白质将通过 膜进入滤液中。然后可以如下所述对滤液进行层析。
(c) 柱层析可以基于目的蛋白(如Vp28多肽)的大小、表面静电荷、
疏水性和对配体的亲和性将其与其他蛋白质分开。另外，可以将针对
Vp28多肽产生的抗体缀合到柱基质上，免疫纯化Vp28多肽。所有这 些方法为本领域所公知。对本领域技术人员而言，很显然层析技术可以以任何规模 并使用来自许多不同的制造商(例如Pharmacia Biotech)的设备进 行。
B. Vp28多肽的化学合成另外，本发明的Vp28多肽可使用常规的肽合成或其他本 领域公知的方案化学合成。可以使用类似于Merrifield等人，J.Am. Chem. Soc. ， 85: 2149-2156 (1963); Barany和Merrifield， Solid-Phase Peptide Synthesis, The Peptides : Analysis, Synthesis, Biology Gross and Meienhofer (eds.)， Academic Press, N. Y. ， vol. 2， pp. 3-284 (1980);和Stewart等人，Solid Phase Peptide Synthesis 2nd ed.， Pierce Chem. Co. ， Rockford， 111. (1984)中所描述的方法的方法 通过固相肽合成方法合成多肽。合成过程中，逐步加入具有保护的侧 链的N-a-保护的氨基酸逐渐生成通过其C-末端连接至固相支持物 即聚苯乙烯珠子的多肽链。通过将N- a-去保护的氨基酸的氨基基 团与N- a-保护的氨基酸的a羧基连接合成所述的肽，其中所述的N -a-保护的氨基酸已经通过使其与如二环己基碳二亚胺的试剂反应 而被活化。游离的氨基基团与活化的羧基的连接导致肽键的形成。最 常用的N - cc-保护基团包括酸不稳定的Boc和碱不稳定的Fmoc。适用于用作固体支持物的材料本领域技术人员公知并且 包括但不限于下列囟代曱基树脂，如氯代甲基树脂或溴代甲基树脂； 羟甲基树脂；酚树脂，如4- (a- [2， 4- 二曱氧基苯基]-Fmoc-氨基 曱基)苯氧基树脂；叔烷氧基羰基-酰肼化树脂等。此类树脂可商业获 得，并且他们的制备方法为本领域普通技术人员所已知。简言之，首先将C-末端N-oc-保护的氨基酸附着于固相 支持物。然后除去N-a-保护基团。去保护的a-氨基连接到下一个N-
a-保护的氨基酸的活化的a羧基。重复该过程直至合成所需的肽。 然后将得到的肽从不溶性多聚物支持物上切割下来，并将氨基酸侧链 去保护。可以通过缩合保护的肽片段衍生较长的肽。关于合适的化学、 树脂、保护基团、被保护的氨基酸和试剂的细节都是本领域所公知的， 因此不在此详细讨论(参见Atherton等人，Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, I壯Press (1989)， 和Bodanszky， Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2nd Ed. ， Springer-Verlag (1993))。III.本发明的Vp28多肽抗体的制备
可以通过多种来源获得本发明的Vp28多肽的抗体。这些 抗体可能是天然产生的抗体，其需要分离、純化和优选地定量。这些 抗体也可能是人工的它们可能是嵌合抗体或重组产生的抗体，包括 单链抗体(ScFv)。A.天然产生的抗体 1.产生具有所需的特异性的抗体
产生与目的免疫原特异性反应的单克隆和多克隆抗体的 方法为本领域技术人员已知(例如参见Coligan， Current Protocols in I咖unology Wiley/Greene， NY，1991 ; Harlow and Lane, Antibodies : A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY， 1989; StUes等人(eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos， CA，及其中引用的参考 文献；Goding， Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice (2d ed. ) Academic Press, New York, NY, 1986; 和Kohler and Milstein Nature 256: 495-497, 1975)。这些技术包括通过选择噬菌 体或类似栽体中的重组抗体文库的抗体的抗体制备(参见Huse等人， Science 246:1275-1281， 1989; 和 Ward等人，Nature 341: 544-546，1989)。
为了制备具有对本发明的Vp28多肽的所需特异性的抗 体，可以从WSSV感染的细胞分离天然产生的多肽(例如包含SEQ ID NO :3或4的多肽)用于免疫合适的动物，例如小鼠，兔子或灵长类。标 准的佐剂如弗氏佐剂(Freund's adjuvant)可以用于标准的免疫程序 中。或者可以将来自Vp28多肽的合成的肽缀合栽体蛋白并随后用作免 疫原。
通过取测试血样并测定对目的抗原的反应性滴度来监测 动物对免疫原制剂的免疫应答。当获得合适高滴度的该抗原的抗体时， 可以从所述的动物收集血液并制备抗血清。进一步分级分离所述的抗 血清以富集与抗原特异性反应的抗体，并随后进行抗体的纯化，参见 Harlow和Lane (同上)，下文提供了抗体纯化的一般描述。
可使用本领域技术人员熟悉的多种技术获得单克隆抗体。 典型地，将用目的抗原免疫的动物的脾细胞一般通过与骨髓瘤细胞融 合而永生化(参见Kohler和Milstein， Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976)。其他的永生化方法包括例如用EB病毒、致癌基因或 逆转录病毒的转化，或其他本领域已知的方法。针对具有所需特异性 和对抗原的亲和性的抗体的产生对单一永生化细胞产生的集落进行筛 选，并且可通过多种方法增加该细胞产生的单克隆抗体的产量，包括 注射入脊推动物宿主的腹腔。
另外，本发明的Vp28多肽的抗体可由从已经被通过施用 Vp28多肽免疫的动物取出的卵产生。优选的动物包括禽类，如鸡(特 别是产蛋母鸡、鸭、火鸡等。可通过例如肌内注射、皮下注射、静脉 注射或口服将Vp28多肽递送到动物体内。注射多肽的量可为lOjig-lmg或根据动物的条件变化，并且重复施用多肽直到卵黄中的抗体量 达到最大。可以根据常规的抗体分离方法从所述的卵中纯化抗Vp28 多肽的抗体。所述的卵本身可以千燥的、粉状的或含水形式用作抗体 的来源。详细的描述可参见WO 03/070258，其在此全文引用作为参考。
另外，也可以根据Huse等人(同上)概述的一般方法通 过筛选人B细胞cDNA文库鉴定编码具有所需特异性抗体或该抗体的结 合片段的核酸序列，重组产生单克隆抗体。通过重组方法进行抗体制 备的更详细的描述可以参见以后部分。2.抗体纯化
用于蛋白质纯化的标准方法，例如那些描述于早前部分的 方法，都适于本发明的Vp28多肽抗体的纯化。 B.人工制备的抗体1. 一般方法
除了天然产生的抗体外，也可使用人工制备的抗体实施本 发明。用于重组制备具有所需特异性的抗体的一般方法为相关领域的 技术人员所已知，并描述于许多出版物中。例如参见U. S.专利No. 5， 665， 570。简而言之，可以通过多种克隆技术方法例如基于聚合酶 链式反应(PCR)的克隆方法筛选B细胞cDNA文库鉴定编码具有所需 特异性的抗体的基因，并随后在合适的宿主细胞中表达。对于重组DNA 技术的一般描述参见例如Sambrook和Russell, Molecular CloningA Laboratory Manual 3d ed. 2001; Kriegler， Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual 1990 ; 以及Ausubel 等人， Current Protocols in Molecular Biology 1994。
用于重组产生具有所需特异性的抗体的另外的方法依赖 嵌合抗体技术。 一般而言，克隆编码非人单克隆抗体(如鼠抗体)的可变区的基因并与人恒定区的编码序列连接产生所谓的"人源化"抗 体。参见例如U. S.专利Nos. 5， 502， 167; 5， 607， 847; 5， 773， 247。 该通过宿主细胞产生的人源化嵌合抗体适于构建要求保护的液体IgG 和IgM标准物(calibrators)。2. 转染和表达
多种转染方法、宿主细胞系、和表达栽体都适于重组抗体 的表达。这些主题的详细描述可见早前的讨论Vp28多肽重组制备的部 分。3. 重组抗体的纯化
可通过上述的标准技术将重组抗体纯化到充分纯，包括利 用如硫酸铵等物质的选择性沉淀；柱层析，凝胶过滤，免疫纯化方法 和其他方法参见例如U. S.专利No. 4, 673， 641; Scopes, Protein Purification : Principles and Practice, 1982; Sambrook 和 Russell，同上；以及Ausubel等人，同上)。 IV. Vp28多肽及其抗体的施用 A.通过饲喂施用
本发明的Vp28多肽或其抗体可以通过铜喂施用于动物， 例如虾。在此类实施方案中，所述的多肽或抗体优选以保护所述的多 肽或抗体不受降解的方式配制。本领域中描述了许多此类制剂。例如， Vp28多肽或Vp28抗体可以下列制剂饲喂给动物，在该制剂中所述的 多肽或抗体被制备成乳剂，例如与油体(oil-bodies )联合。此类制 剂在例如美国专利Nos. 5, 948， 682 ; 6， 146， 645;和6， 210,742 中已有描述。
通过饲喂施用的Vp28多肽或其抗体的量可以变化，但是 通常以大约0. 5g-500g/吨(ton)祠料的量存在，并且经常以大约 lg-100g/吨伺料的量存在，通常为5-25或50g/吨饲料的量。
可以在生长的任何阶段通过饲喂施用Vp28多肽或其抗 体。优选可以在动物离开孵化场以后的任何时候在他们容易暴露于 WSSV的地方施用该多肽或抗体。
在一定的时间间隔将含有Vp28多肽或其抗体的伺料提供 给坏以维持保护。例如，对于在PL15或以上阶段的虾，优选每天给予 该祠料3 - 4次；对于较大的动物，至少每天给予两次该祠料。典型地， 铜喂频率不低于每天一次。B.通过重组藻类施用
施用本发明的Vp28多肽或重组抗体的另外的方法是使用 重组藻类递送系统，如美国专利申请No. 20030022359所描述的，此 处全文引用。简而言之，所述的递送系统是转基因藻类，其包含转基 因，所述的转基因包含编码至少一种肽例如Vp28多肽的多核苷酸，以及用于驱动所述的多核苷酸在藻类中表达的启动子。优选地，所述的 转基因进一步包含终止转录的终止子以及转录所需的所有其他遗传元 件。所述的转基因藻类优选进一步表达该肽。
重组Vp28多肽或抗体的递送可通过口服施用上述的转基 因藻类实现，或将被处理的动物浸入包含水和所述的转基因藻类的混 悬液中。实施例
提供以下的实施例只是为了例证而不是为了限制。本领域 技术人员将容易认识到可改变或修饰许多非关键参数来产生基本相似 的结果。实施例1.病毒蛋白和蛋白片段的表达
评估了来自WSSV的四种主要核壳和包膜蛋白质。使用 MacVector软件包模拟了每种蛋白质的一级和二级结构基序。使用多 重预测算法(multiple predictive algorithms)对基于每种蛋白质 的氨基酸序列对二级结构特征的预测进行了检验。平均来自每种预测 方法的结果，并使用该信息以及另外的对亲水性、表面概率、挠性和 抗原性指数的预测性信息选择欲在融合系统中表达的每种蛋白质部 分。可能潜在地与病毒宿主中的细胞受体相互作用的病毒蛋白质的部 分可能暴露于蛋白质的表面。另外，每种蛋白质的相互反应性部分可 能被包含于单一结构域中。通过使用预测性信息，选择将预计与细胞 受体相互作用的每种病毒蛋白质的可能部分。
4吏用Invitrogen/>司的PurePro Caulobacter表达系统 表达蛋白质。该系统具有大约每升培养基1克被表达的蛋白的非常高 水平产量的潜力。这是一个优势，因为需要大量的蛋白质进行商业应 用。该系统也分泌蛋白质至培养基中，在那里其可以被容易地浓缩和 纯化。另外，Caulobacter在非常廉价的培养基中生长良好，因此降 低了制备成本。
修改表达方案以使用标准的发酵设备制备分泌的可溶性 蛋白形式的表达的蛋白融合体，这消除或简化了被表达的融合蛋白的 溶解、复性和纯化。实施例2.使用Vp28蛋白质片段对WSSV感染的抑制
如下进行使用Vp28片段对WSSV感染的抑制。使用总共12 只9升的塑料水族箱(31 ppt盐度30匸)来从动物被接收到实验结束时 安置动物。所述的箱子在两上分离的架系统(rack system)上随机分 布，每个架系统具有其自己的水循环系统。除了测试组，还使用两个 岗哨箱(sentinel tank)和两个阳性对照箱来分别监测从暴露箱的可 能的病原体逃逸以及确定病毒的毒力。
制备6种实验性祠料用于生物测定。两种病毒融合蛋白， 一种含有Vp28片段，另一种含有Vp35片段，单独使用或以两种不同 的浓度组合使用来制备挤压的祠料。在组织感染前祠喂未成熟的南美 白对蚱(Penaeus vannamei)该实验饲料72小时。
如下检验WSSV的感染性。关闭水循环系统，加入等于箱 中总生物量5%的量的新鲜制备的WSSV阳性虾组织。使虾饲喂所述的 感染组织2小时，然后重新启动水循环系统。几乎所有的组织通常在 最初的几分钟内被消耗掉，但是所述的虾还在静水中孵育以最大接触。 在连续的3天进行该过程。
在将坏暴露于WSSV感染的组织后，以每小时4. 5升的速 率更换水(每天更换1， 200% )。温度维持在30。C。在病原体暴露之 后，继续祠喂坏合适的实验饮食或对照饮食。对下列事项每天监测动 物两次，共14天祠喂形式的改变、改变的行为、形态改变以及死亡。 濒死的虾从箱中除去并冻存在-80。C用于以后的PCR分析。在30天终 止时，计数所有存活的虾，处死并存档用于以后的PCR分析。
结果表明祠喂含有表达的Vp28片段融合蛋白的饮食的虾 防止虾感染WSSV感染。平均80%的接受每吨25克或每吨5克的Vp28 融合体的箱中的虾存活，而低于25%的对照虾存活。Vp35融合蛋白没 有表现对WSSV攻击的任何防护作用。那些在祠料中接受Vp28和Vp35 融合蛋白混合物的动物也表现相对对照的增强的存活。实施例3.白斑综合征病毒攻击
将太平洋白虾(南美白对虾(Peneaus vannamei)，平均 重量5g)分组，并装在位于水生生境架系统(Aquatic Habitats rack system )上的9升的流通箱中。每只箱有4 - 8只动物，每组3只箱子。
将人工海盐溶解于Nano纯的蒸馏水中至28ppt的最终盐度，并保持在 28"C。将虾置于9个箱中，并饲喂3种不同祠料中的一种。对照饲料 是Zeigler Brothers SI-35生长(grow-out)饲料。两种实验饲料 使用磨细的SI-35为基质在实验室制备。IgY饲料具有以0.1%加入的 抗Vp28 IgY。 Vp28铜料通过加入40ml/kg的来自CP Kelco run AB04903的粗液体培养基(估计的Vp28融合体浓度为10-40克/吨最 终的饲料)来制备。在该实验中，Vp28融合体是通过Invitrogen's PurePro Caulobacter Expression System制备的Vp28片段1E (SEQ ID NO: 4)与来自Caulobacter cresentus的表面阵列蛋白RsaA融合 的重组多肽。抗Vp28 IgY是在鸡中产生的针对Vp28融合体的抗体。 所述的液体培养基已经被冷冻6个月，并在使用前慢慢融化。融化的 液体培养基和反萃取(back-extracted)的最终饲料的Western印迹 显示融合体90%完整。如实施例2所述将虾暴露于WSSV进行攻击。 在最初WSSV暴露10天后以及在最终暴露7天后，给予不同祠料的不 同组的存活显示于图2中。
本申请中引用的所有专利、专利申请和其他公开包括公开 的氨基酸或多核苷酸序列在此整体引入作为参考，用于所有目的。 序列表SEQ ID NO :1编码Vp28的核酸，CDS 323.937 登录号AF173993121 181 241 301 361 421 481 541 G01 661 721 781 841 901 961 1021 1081SEQ ID NO : 2 Vp28全长多肽序列MDLSFTLSVVSAILAITAVIAVFIVIFRYHKTVTKT正THTDNIET丽DENLRIPVTAEV GSGYFKMTDVSFDSDTLGKDCIRNGKSDAQMKEEDADLVITPVEGRALEVTVGQNLTTFGAPIAATAGGNLFDMYVHVTYSGTETESEQ ID NO : 3 Vp28多肽片段4C (SEQ ID NO : 2的107-150, 44a- a-)cccaagagagcaaaacttcttcccca^ca_a_tctcctcgactsttctggcagacacatccgttgasggaatagaccctggcttactgtsacgtaaaaggcgacagctcgc仁tgccaattgtcctgttacgtactctgtggtttcacgaggttgtcatcaccttttttt仁tgtcctcgccgaaaaaaactcgtcatggatctttctttcactctttcggtcgtgtcggccatcctcgccstcactgctgtgattgctgtatttattgtgatttttaggtatcatcgaaacccaacatggatgcsttcctgtgactgctgaggttggatcaggct3cttceiagatgactgatgtgtcctttgattgggcaaaacaatggaaagtctgatgcacagaagatgcggatcttgtcatcactcccgtgcactcgaagtgactgtggggcagaatctcacctttgaggggtgtggaacgaaaga_tca_acatcactggttaacccatraaaggcctttgtcggtagctcC33C3CCtCCtccttcacccccgtctctattgatgaggatgaagttggcacctttgtgtgtggt3ccacctttggcgcaccaattgcagctaccgccggtggaaatcttttcgacatgfcacgtgcacgtcacctactctggcactgagaccgagtaaataaatcgtgcttttttstatagttaatattacaacaataagaattgaggaaaattttattgacctacttaaccttcttgctagtttaagtgactggawagtttagcaatattatccttgaacgggaaacatgcaccaatta
ALEVTVGQNLTFEGTFKVWNNTSRKIMTGMQMVPKINPSKAFVSEQ ID NO : 4 Vp28多肽片段IE (SEQ ID NO : 2的28—114 87 a. a.)RYHNTVTI(TIETHTDNIETNMDENLRIPVTAEVGSGYFKMTDVSFDSDTLGKIKIRNG KSDAQMKEEDADLVIT VEGRALEVTVGQSEQ ID NO : 5 Vp28多肽片段5A (SEQ ID NO : 2的102-204 103 a.a.)PVEGRALEVTVGQNLTFEGTFKVWNNTSRKINITGMQMVPK諸SKAFVGSSNTSSF TPVSIDEDEVGTFVCGTTFGAPIAATAGGNLFDMYVHVTYSGTETBSEQ ID NO : 6 Vp28多肽片段6A (SEQ ID NO : 2的150-204， 55 a, a,)SEQ ID NO : 7 Vp28多肽片段3E (SEQ ID NO : 2的28-204， 177a.a.)RYHNTVTKTIETHTDNIETNMDENLRIPVTAEVGSGYFKMTDVSFDSDTLGKIKIRNGGTETESEQ ID NO: 8 Vp28片段2D (SEQ ID NO: 2的28-150, 123 a. a.)RYHNTVTKT正THTDNIETNMDENLRIPVTAEVGSGYFKMTDVSFDSDTLGKJKIKNGKINPSKAFV
权利要求
1.分离的多肽，其包含Vp28肽，所述的Vp28肽由SEQ ID NO2的28-204位的至少44个连续氨基酸的氨基酸序列组成，其中，所述的多肽抑制甲壳类动物的白斑综合征病毒(WSSV)感染。
2. 权利要求1的分离的多肽，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID N0: 2 的28 - 204位的至少50个连续氨基酸。
3. 权利要求1的分离的多肽，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID NO: 2 的28 - 204位的至少100个连续氨基酸。
4. 权利要求1的分离的多肽，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID N0: 3、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。
5. 权利要求l的分离的多肽，其中所述的Vp28肽由SEQ ID NO: 7 的氨基酸序列组成。
6. 权利要求1的分离的多肽，其中所述的曱壳类动物是对坏属成员。
7. 编码多肽的分离的核酸，其中所述的多肽包含Vp28肽，所述的 Vp28肽由SEQ ID NO: 2的28 - 204位的至少44个连续氨基酸组成，其 中，所述的多肽抑制曱壳类动物的白斑综合征病毒(WSSV)感染。
8. 权利要求7的分离的核酸，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID NO: 2 的28 - 204位的至少50个连续氨基酸。
9. 权利要求7的分离的核酸，其中所述的Vp28肽包含SEQIDNO:2 的28 - 204位的至少100个连续氨基酸。
10. 权利要求7的分离的核酸，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。
11. 权利要求7的分离的核酸，其中所述的Vp28肽由SEQ IDNO: 7的氨基酸序列组成。
12. 权利要求7的分离的核酸，其中所述的甲壳类动物是对虾属成员。
13. 抑制甲壳类动物白斑综合征病毒(WSSV)感染的方法，所述的方法包括给所述的甲壳类动物施用多肽，其包含Vp28肽，所述的Vp28 肽由SEQ ID NO: 2的28 - 204位的至少44个连续氨基酸的氨基酸序列 组成。
14. 权利要求13的方法，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID N0:2的 28 - 204位的至少50个连续氨基酸。
15. 权利要求13的方法，其中所述的Vp28肽包含SEQ IDN0:2的 28 - 204位的至少100个连续氨基酸。
16. 权利要求13的方法，其中所述的Vp28肽包含SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8。
17. 权利要求13的方法，其中所述的Vp28肽由SEQ ID N0:7的氨 基酸序列组成。
18. 权利要求13的方法，其中所述的施用包括给所述的甲壳类动 物喂祠所迷的多肽。
19. 权利要求13的方法，其中所述的甲壳类动物是对虾属成员。
20. 抑制甲壳类动物白斑综合征病毒(WSSV)感染的方法，所述的 方法包括给所述的甲壳类动物施用多肽，该多肽包含SEQ ID N0:2的氨 基酸序列。
21. 甲壳类动物的祠料，其中所述的饲料包含权利要求1中所示的 多肽或包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列的多肽。
22. 权利要求21的祠料，其中所述的甲壳类动物是对虾属成员。
全文摘要
本发明涉及用于抑制甲壳类动物，特别是对虾属种(Penaeus sp.)的甲壳类动物的白斑综合征病毒(WSSV)感染的新组合物。更具体而言，所述的新组合物包含多肽或特异结合所述多肽的抗体，其中所述的多肽的氨基酸序列对应于WSSV的表面蛋白Vp28的至少一部分。还公开了编码本发明的Vp28多肽的多核苷酸序列。还公开了使用所述新组合物抑制甲壳类动物的WSSV感染的方法。
文档编号C07H21/04GK101166752SQ200480028623
公开日2008年4月23日 申请日期2004年9月9日 优先权日2003年9月9日
发明者K·R·克里姆佩尔 申请人:艾克博蒂技术公司