专利名称：作为抗纤维化剂的αvβ3和αvβ6整合素拮抗物的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过特异性拮抗物对αv整合素特别是αvβ3和αvβ6整合素的抑制，其中所述的特异性抑制剂优选地是通过对细胞迁移的抑制和对活化肝星状细胞、活化肌成纤维细胞和成纤维细胞、活化上皮细胞和内皮产生促纤维发生分子(例如胶原、TIMP-1)和细胞因子(例如CTGF、TGFβ1，2)的抑制而下调纤维发生的非肽拮抗物例如EMD 409915和EMD 409849、相关化合物和具有相当特异性的化合物。这些拮抗物可以单独或与其他试剂一起有效地防止、减轻或者甚至逆转晚期纤维变性的发展，其中所述晚期纤维变性例如肝脏的纤维变性/硬化和其他器官如肺、肾、肠、胰、皮肤和动脉的纤维变性。
背景技术：
和在先技术活化肝星状细胞和肌成纤维细胞(HSC/MF)在慢性肝脏疾病的发展中起着中心作用。这些细胞沉积了导致纤维变性并最终导致硬化的过多细胞外基质成分。硬化被定义为具有严重血管和功能异常的肝脏构造上的变形。后果是伴随着腹水和食道静脉曲张出血和肝性脑病发展的门高血压并且常常倾向于致死感染。在活化内皮和HSC/MF上某些细胞-细胞受体并且特别是细胞-基质受体(主要是整合素)明显上调，从而传送迁移、生长促进和其他促纤维发生信号。
因此整合素αvβ3的活化介导了对促纤维发生细胞因子如PDGF-AB/BB作出反应的HSC/MF的活化和迁移，并且上调它们对促纤维发生细胞因子例如以自分泌和旁分泌方式刺激胶原合成的CTGF的表达。
同样地，在活化上皮细胞特别是纤维化肝脏的增殖胆管上皮细胞中发现了整合素αvβ6的显著上调，这通过引起基膜和其它促纤维发生蛋白质和活化HSC/MF的生长因子的释放而进一步促进纤维发生。
用特异的αvβ3和αvβ6整合素拮抗物对纤维化肝脏疾病和硬化进行治疗能够阻止内皮细胞、HSC/MF细胞和上皮细胞的迁移和活化，并且因此减轻或者甚至逆转纤维发生。因为与肝脏类似，活化的肌成纤维细胞样细胞和上皮细胞在其它进行性纤维化疾病的发病机制中起着中心作用，因此特异的αvβ3和αvβ6整合素拮抗物也可以用于治疗其它器官例如胰、肠、肺、心脏、肾、动脉或皮肤的纤维化病症。
整合素是介导细胞之间以及细胞与细胞外基质之间相互作用的跨膜细胞受体家族。整合素介导接触的丧失通常导致细胞凋亡。整合素受体由一个α亚基和一个β亚基组成，α亚基和β亚基间至少有24种不同的组合，每一种组合具有自己的结合特异性和信号转导特性。β3链亚家族由αIIbβ3和αvβ3两个整合素组成。αIIbβ3在血小板和巨核细胞上表达并且参与血栓的形成，αvβ3是由内皮细胞、肌成纤维样细胞和一些炎性细胞表达的非血小板整合素(1-3)。β6整合素链主要存在于上皮细胞和某些活化成纤维细胞/肌成纤维细胞，并且与αv亚基形成异源二聚体(4)。
一些报道显示，αvβ3表达的升高与致癌性转化和肿瘤进展即人肿瘤细胞的侵袭和转移特性密切相关。内皮细胞表面αvβ3整合素的诱导表达被认为是内皮细胞迁移、增殖和血管发生所必不可少的(5)。近年来日益明显，整合素介导的对细胞外基质(ECM)蛋白质的粘附是大多数细胞类型生长和存活所必需的(2)。粘附的破坏使细胞停滞在G1期并且导致细胞凋亡。已经发现，αvβ3整合素通过抑制内皮细胞凋亡在血管发生中起着基本的作用(6)。中国仓鼠卵巢细胞中αvβ3的过表达增强了Rho活性和应力纤维的形成(7)，它们是连接粘附、迁移和活化的因素。
PDFG(BB)-PDGFβ-受体系统的上调在在器官如肝脏的纤维发生(即细胞外基质(ECM)的从头形成和沉积)中起着重要的作用(8)。活化的PDGFβ-受体可以与αvβ3整合素一起免疫共沉淀(9)，并且最近表明αvβ3与转化生长因子β(TGFβ)的潜在型结合肽(LAPβ1)的RGD基序相互作用(10)，这表明在其中两个蛋白质的表达起着重要作用的癌症和大量炎性和纤维化疾病中有此种相互作用的参与。
αvβ3对于肉芽组织中平滑肌和内皮细胞的迁移和血管形成是必需的。迄今为止，αvβ3在肝纤维变性和其它器官纤维变性中的潜在作用很大程度上仍然没有研究(11-19)。
整合素αvβ6主要存在于活化上皮细胞和成纤维样细胞。在组织损伤过程中其显著上调(20-22)。缺乏该整合素亚基的小鼠表现出对肺纤维变性诱导的惊人抵抗(20)。在慢性肝脏损伤和纤维变性中常常发现胆管上皮细胞的活化和增殖，并且增殖的胆管上皮细胞是肝纤维变性特别是胆纤维变性中促纤维发生因子例如TGFβ1、TGFβ2和CTGF以及某些ECM蛋白质的主要来源(23，24)。
HSC/MF和肌成纤维细胞被认为是负责在活跃的肝脏纤维发生过程中过量ECM沉积的主要细胞类型。它们合成并释放几种类型的胶原，特别是瘢痕组织的形成原胶原的I型和III型胶原、层粘连蛋白-2、纤连蛋白和胶原酶及其它的主要抑制物TIMP-1(12-19，25-27)。这些细胞的迁移对于它们在肝脏损伤位点的积累是至关重要的。在活化后，培养的HSC/MF会对几种刺激作出反应而迁移，所述刺激包括生长因子例如PDGF-AB、PDGF-BB、血管活性物质如内皮素-1以及趋化因子如单核细胞趋化蛋白(MCP-1)(28-30)。
HSC/MF表达大量的整合素，整合素的配体是主要的ECM分子，整合素能够将细胞外信号从ECM转导进入细胞，这与细胞因子/生长因子相一致(交叉信号转导)(1-3)。可以由整合素来调节HSC/MF的几种活性包括细胞增殖、收缩、迁移和ECM合成(1-3)。此外，整合素还活化潜在TGFβ，从而增强该关键细胞因子的纤维发生活性(10，22)。因此，通过干扰整合素信号对HSC/MF和周围ECM相互作用的药物调节是限制肝纤维变性和其它器官纤维变性的潜在策略。
虽然HSC/MF的体内迁移很难测定，但是能够抑制HSC/MF体外迁移的物质是降低它们在损伤肝脏中积累的主要候选物质。此外，对内皮细胞和胆管上皮细胞和内皮细胞活化、迁移和增殖的抑制进一步抑制了慢性损伤肝脏中的纤维发生。
下面以肝纤维变性为例举例说明慢性纤维化疾病的临床影响。对于所有的纤维化疾病例如影响肺、肾、肠、胰、皮肤或动脉的那些纤维化情况是相似的。据估计，仅仅在具有1亿人口的德国大约有50万人患有肝硬化(慢性肝疾病末期)并且每年因为肝硬化的死亡率在5万和10万之间(12，31)。可以将硬化定义为由于细胞外基质(ECM)的过量积累而导致的肝脏构造的变形，这导致不正常的肝细胞结节、窦周硬化以及血液从代谢活性肝细胞分流。患有硬化的患者会容易地进入具有损伤肝脏合成功能的所有后果(血凝固失调、白蛋白和营养物合成缺陷)的代偿失调肝疾病状态，导致普遍出血、水肿以及导致腹水和食道静脉曲张出血(一种严重感染的倾向)和肝性脑病发展的门高血压。硬化本身易于使人患原发性肝细胞癌。
然而在西方，大约一半的硬化病例是由于酒精滥用引起的，而另一半由多种原因引起，例如(以数量降低的顺序)慢性丙型和乙型肝炎病毒、自身免疫失调(原发性胆汁性肝硬化、典型的自分泌肝炎、原发性硬化型胆管炎)代谢疾病(血色素沉着病、威尔逊病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、酪氨酸血症(tyrosenemia)、糖原贮积病)、囊性纤维化、药物诱导的纤维变性(例如氨甲喋呤)、先天异常(先天性肝纤维变性、胆道闭锁、阿拉日耶综合征)、术后并发症(继发性胆汁性肝硬化)或血管疾病(巴-希综合征)。可以容易地从肝硬化的这些数字和原因延伸至其他西方国家。在非西方国家，伴随着患有乙型和丙型病毒性肝炎数量的升高肝硬化的数量甚至更高。
对这些肝脏疾病的病因疗法是有限的(12，31)。因此，甚至最好的可用药物疗法也仅能消除患有慢性病毒性肝炎的患者体内的40％的乙型肝炎病毒和30-40-50％的丙型肝炎病毒。这些疗法常常包括使用6-12个月以上的干扰素，并且因此价格昂贵且具有明显的副作用。一个日益突出的健康问题是丙型肝炎的流行(32)，丙型肝炎使80-90％的感染人群变成慢性感染并且在西欧患病率为0.5-1％、美国为1-1.5％、东欧和亚洲大约2％并且在象埃及的一些国家中高达20％。一些肝脏疾病例如自分泌失调可以通过试剂如皮质类固醇(在典型的自分泌肝炎中使用)和熊去氧胆酸(在原发性胆汁性肝硬化中使用)进行症状性治疗或者可能稍稍延缓硬化的进程。其它肝疾病如果在早期发现则可以进行预防。实例为在血色素沉着病中的静脉切开术和在威尔逊病中使用螯合剂如D-青霉素胺。由于供体不足和高成本，肝移植只能在少数选择性终末期肝疾病的病例中进行。
上述的有害刺激如肝细胞毒素包括酒精、嗜肝病毒、对肝的免疫反应、代谢疾病和胆汁淤滞可以引发肝纤维发生，即细胞外基质(ECM)过量合成和沉积。在急性肝疾病例如自限性病毒性肝炎中，纤维发生是通过纤维分解即过量ECM的去除来平衡的。然而，重复遭受足够严重程度的有害刺激或附加有害影响(例如在许多慢性肝疾病中存在的慢性丙型肝炎和饮酒的结合)使ECM的代谢移向纤维发生，导致纤维变性或硬化(12-19，32)。在纤维发生中，肝细胞或胆管上皮细胞的损伤导致单核细胞的活化、纤维发生因子的释放和肝间充质细胞的活化。活化库普弗细胞(即肝特异巨噬细胞)以及增殖的胆管上皮被认为是最终靶向活化HSC/MF的潜在纤维发生细胞因子和生长因子的最初来源，HSC/MF是负责ECM在肝脏中过量沉积的那些细胞类型(12-19，32)。如上面所提到，两种细胞在所有其它间充质-上皮和血管器官中均有其相关性(14，33-44)。当通常静止的HSC/MF由纤维发生生长因子活化或者其正常三维基质环境被破坏时，它们将转化成具有高增殖潜能和产生过量ECM分子能力的细胞表型。这种转化的通常特征是获得肌成纤维细胞标记α-平滑肌肌动蛋白，该转化是使潜在致命伤口快速闭合的保护性过程中的中心部分。如果伤害试剂仅存在较短的时间阶段，则该过程通常是自限性的，当该过程持续活化时则导致纤维变性和硬化。不得不再次强调，导致肝纤维变性和硬化的细胞和因子与导致其它器官纤维变性和瘢痕化的那些细胞和因子几乎是相同的。
因此，在导致肝脏(12-19，32)和其它器官例如心脏、肾、肺、动脉、皮肤、肠和胰(14，33-44)的纤维变性的许多慢性疾病中，持续伤害不能够被阻止，最多仅仅是减轻。此外，患者通常表现为已经进入结构和功能损害的晚期。这使得有必要开发疗法，以停止器官纤维变性进程或者甚至逆转晚期瘢痕化。这些疗法应该是口服有效、经济合理并且没有有害副作用。
发明简述本发明的一个目标是提供治疗病理性状况的方法，其中在所述状况中活化成纤维细胞、肌成纤维样细胞和肌成纤维细胞以及活化内皮细胞和上皮细胞产生和/或诱导过量的细胞外基质，导致有害的瘢痕化。这与肝纤维变性和硬化有关，但是也与其它器官例如肺、肾、肠、胰、皮肤和动脉的纤维变性有关，这些组织的纤维变性会经历几乎相同的病理过程。
本发明的另一个目标是提供治疗病理状况的物质组合物，通过物质组合物可以抑制活化成纤维细胞、肌成纤维样细胞和肌成纤维细胞以及活化内皮细胞和上皮细胞，并且因此至少部分抑制瘢痕化。
已经发现，使用整合素抑制物、优选αv整合素抑制物、更优选αvβ3和αvβ6拮抗物可以成功治疗上述疾病和病理状况，由此整合素抑制物可以包括肽和非肽分子。优选地，整合素抑制物EMD 409915和EMD 409849是在该情况下十分有效的药物，它们是在先技术已知的或者可以根据标准技术容易制备。
EMD 409915是3-苯并[1，2，5]噻二唑-5-基-3-{6-[2-(6-甲氨基-吡啶-2-基)-乙氧基]-1H-吲哚-3-基}-丙酸。
EMD 409849是3-{3-苄氧基-2-[5-(吡啶-2-基氨基)-戊酰基氨基]-丙酰基氨基}-3-(3，5-二氯-苯基)-丙酸。
这些拮抗物单独或与其它试剂一起可以有效地防止、减轻或者甚至逆转晚期纤维变性的发展，所述纤维变性例如肝脏的纤维变性/硬化和其它器官如肺、肾、肠、胰、皮肤和动脉的纤维变性。
附图简述
图1.10-9-10-6M EMD409915对用PDGF-BB(10ng/ml)处理的a)大鼠HSC细胞系CFSC-2G细胞和b)原代大鼠HSC/MF的影响。在20小时内测定细胞迁移。数据表示为≥3次以上独立实验之一，每次实验包含三份重复，并且数据显示为平均值±SEM(相对于最初划痕宽度缩小的％)。
图2.10-10-10-6M EMD409915对胎牛血清(FCS)刺激的HSC/MF细胞迁移的影响。在20小时内测定细胞迁移。数据表示为≥3次以上独立实验之一，每次实验包含三份重复，并且数据显示为平均值±SEM(相对于最初划痕宽度缩小的％)。
图3.通过BrdU掺入测量的在10-6-10-8M EMD 409915存在下由PDGF-BB(10ng/ml)刺激24小时的HSC/MF中DNA的合成。数据表示为≥3次以上独立实验之一，每次实验包含四份重复，并且数据显示为平均值±SEM(任意单位)。
图4.通过BrdU掺入测量的在10-6-10-8M EMD 409915存在下由10％FCS刺激的HSC/MF中DNA的合成。数据表示为≥3次以上独立实验之一，每次实验包含四份重复，并且数据显示为平均值±SEM(任意单位)。
图5.在PDGF-BB(10ng/ml)存在下用10-6-10-8M EMD 409915处理24小时的CFSC-2G细胞中CTGF表达。数据表示为≥3次以上独立实验之一，每次实验包含四份重复，并且数据显示为平均值±SEM(任意单位)。
图6.继发性胆汁性肝纤维变性中a.)前胶原α1(I)、b.)TGFβ1和c.)CTGF的表达。通过实时PCR用来自大鼠肝脏(假手术大鼠(Sham)和由于胆道闭塞6周而纤维变性的大鼠(BDL))的总RNA进行测定。每一个柱形条代表来自三个个体动物的肝脏RNA样品，数据显示为平均值±SEM(任意单位)。
图7.肝纤维变性中a)β3整合素和b)β6整合素的表达。通过实时PCR用来自大鼠肝脏(假手术大鼠(Sham)和由于胆道闭塞6周而纤维变性的大鼠(BDL))的总RNA进行测定。每一个柱形条代表来自三个个体动物的肝脏RNA样品，数据显示为平均值±SEM(任意单位)。
优选实施方案的详述方法HSC分离和培养简言之，使用16-18G插管经门静脉用无钙HBSS(Gybco，UK)原位灌注肝脏5分钟，接着用0.1％链霉蛋白酶E(Sigma)灌注10-15分钟，然后用溶于Dulbecco改良的Eagle培养基的0.025％ IV型胶原酶(Sigma)灌注10-15分钟。将消化后的肝脏切除，轻轻切碎，并且在溶于Dulbecco改良的Eagle培养基(添加有25mM HEPES)的0.04％链霉蛋白酶、0.025％胶原酶、0.002％ DNA酶(Sigma)中于37℃进一步孵育10-30分钟，孵育中轻轻搅动。在用100μM尼龙纱布过滤之后，通过低速离心去除实质细胞。通过在1500g于11％和13％梯度的Nycodenz(Sigma)两步离心(不减速)进行富集，之后从梯度界面中收集HSC部分并且以溶于DMEM(补充有10％ FCS、青霉素和链霉素)中的0.5×106/cm2的密度铺板。24小时后更换培养基，并且每48小时再次更换培养基。通过台盼蓝排除法估算分离细胞的生存力，并且生存力通常大于95-98％。通过其典型的形态学外观证实HSC分离物的纯度胞质中脂滴(在390nm激发下显示略呈绿色的自身荧光)和星样的外形。通过吞噬3μm橡胶珠的能力估算库普弗细胞污染，在分离后库普弗细胞低于3-5％并且在第一次传代之后几乎检测不到。如果没有另外说明，对于所有实验使用介于第一次传代和第三次传代之间的细胞。
此外，还使用了HSC细胞系CFSC-2G(适度活化，由美国华盛顿特区的M.Rojkind博士惠赠)。
动物实验在手术显微镜(OPMI6-S，Zeiss，德国)下将平均体重206±19g的雄性成年Wistar大鼠开展显微手术(45-47)1.在用100mg/kg的盐酸氯胺酮(Ketanest，Parke-Davis，德国)和10mg/kg的5，6-二氢-2-(2，6-二甲代苯氨基)-4H-1，3-噻嗪-氢氯化物(Rompun，Bayer，德国)麻醉后从腹中线切开；2.剥离总胆管、插入特氟隆导管(Abbocath-T 26 G，Venisystems，美国)并且用5-0丝线(Perma-hand，Ethicon，德国)在远端完全结扎且近端不完全结扎；3.以0.02ml/100g体重的剂量逆行注射泛影酸钠(Ethibloc，Ethicon德国)；4.去除导管，近端结扎封闭，在结扎和伤口封闭之间切断胆管。在胆管闭塞(BDO)之后，给与动物正常的食物(Altromin，Lage，德国)并允许动物自由饮水。
进行胆管闭塞大鼠的早期死亡(1小时至3天)是由于胆汁溢出造成的并且死亡率总计为9％。由于在该模型中，只有在胆管闭塞2周后纤维变性才明显，所以没有必要将之前死亡的动物进行统计学分析。6周后，在ketanest/rompun麻醉下通过刺破右心室并放血将大鼠处死。将肝脏和脾脏称重，并且将1-2g的左肝叶和右肝叶小片用4％福尔马林固定或者用液氮迅速冷冻用于组织学、mRNA和羟脯氨酸(HYP)测定。
划痕测定法通过测定划痕面积的缩小判断细胞迁移。将细胞以60000个细胞/孔的密度接种于24孔板。当细胞达到汇合时，用无血清的培养基饥饿24小时，然后使用无菌移液管尖在细胞单层上划痕。划痕后，用渐增浓度(10-10-10-6M)的αvβ3整合素抑制物预处理细胞30分钟，然后在无血清存在下用10ng/ml浓度的PDGF-BB处理。在15-20小时后，使用带有网格测微尺的特殊目镜测量每孔三个不同点的划痕面积的缩小。
Brd U掺入为了估计细胞增殖，使用如BrdU掺入法确定DNA从头合成。将细胞以20000个细胞/孔的密度接种于96孔板中含有10％胎牛血清(FCS)的生长培养基中。24小时后，将培养基换成无胎牛血清的培养基并培养24小时，然后用包含10ng/ml浓度的PDGF-BB、αvβ3整合素抑制物(10-9-10-6)或者无抑制物的培养基孵育20小时。在孵育的最后几小时，将细胞用BrdU脉冲标记并且用ELISA试剂盒(Roche)和微孔板读数仪测定其掺入。
实时PCR使用RNApure商业试剂盒(PeqLab，Erlangen，德国)并根据制造商的建议从细胞裂解液中分离总RNA。将0.5mg总RNA逆转录得到模板cDNA。
根据制造商的说明书，通过使用LightCycler系统(Roche)的RT-PCR定量相对的转录物水平，在15μl的总反应体积中使用1.5μl的模板cDNA稀释液，反应体系中包含“LightCycler FastStart DNA Master杂交探针试剂盒”(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，德国)所提供的TaqDNA聚合酶、dNTP混合物、反应缓冲液和3.0mM MgCl2。对于每一个所测量的转录物，将一个样品的1∶2-1∶32的稀释系列用作标准。利用LightCycler软件使用“成比例的二阶导数最大化”选项分析数据。为了对结果进行归一化，在平行反应中扩增β2微珠蛋白或者GAPDH管家基因。
使用Primer Express软件(Perkin Elmer)基于所公布序列设计TaqMan探针和引物组。在MWG Biotech AG(Ebersberg，德国)合成有意引物和反义引物(每一引物0.5μM)和0.125μM 5’磷酸化探针(在5’端用报告染料(FAM)标记并且在3’端用淬灭剂分子(TAMRA)标记)。用于测量特异靶基因表达的引物组总结于下表
对于β3和β6整合素稳态转录物水平的定量，使用了带有作为荧光团的SYBR green(Molecular Probes，Eugene，OR)的实时PCR。为了将特异的PCR产物同非特异产物和引物二聚体区别开来，进行熔解曲线分析。因为不同的DNA产物在不同的温度下熔解，所以可以将真正产物同引物二聚体或非特异产物区别开。
所有实验均使用肌成纤维样细胞系CFSC-2G(来源于硬化的大鼠肝的HSC细胞系)和原代大鼠HSC/MF的细胞培养物进行。为了研究αvβ3整合素抑制物对细胞迁移的影响，将细胞接种于24孔板并且在达到汇合后在缺乏FCS的条件下饥饿24小时。划痕并且在10-6-10-9M的αvβ3整合素抑制物存在或缺乏的条件下用10ng/ml的PDFG-BB处理细胞。在17-20小时后，测定迁移的速度，表示为最初划痕宽度的缩小。
αvβ3整合素抑制物以剂量依赖方式强烈的抑制PDGF-BB诱导的划痕区的细胞迁移。在10-6M浓度时，在所使用的所有细胞类型中均观察到迁移被完全抑制(图1)。令人惊奇地是，αvβ3整合素抑制物对FCS刺激的细胞迁移没有影响(图2)，这可能是由于FCS引发迁移所涉及的其它的、显然更正常的途径刺激所致。甚至在浓度降低的FCS(0.25％)时EMD409915对迁移也没有任何明显的抑制作用(数据未显示)。这些观察表明PDGF诱导的HSC/MF迁移是特异的并且强烈地依赖于αvβ3。因此引人注目的是，通过β3整合素抑制可以以十分特异的方式阻断纤维化肝和其它纤维化器官中的HSC/MF迁移而不明显地干扰“正常的”迁移。
为了检查αvβ3抑制物是否对细胞增殖具有相似的作用，将细胞在无血清培养基中饥饿24小时，然后用10ng/ml浓度的PDGF-BB和10-8-10-6M的αvβ3抑制物处理24小时。在这些条件下，αvβ3抑制物对PDGF-BB刺激的所有细胞类型的细胞增殖没有任何影响(图3)。对血清刺激的细胞增殖同样也没有任何影响(图4)。
为了研究αvβ3整合素抑制物是否对HSC/MF mRNA中ECM表达具有影响，通过实时PCR测定了一系列主要的促纤维发生分子和抗纤维发生分子如前胶原α1(I)、TGFβ1、TGFβ2、MMP-3、MMP-13、MMP-2、结缔组织生长因子(CTGF)和TIMP-1的表达。当细胞汇合时，在无血清培养基中将细胞饥饿24小时，然后用αvβ3抑制物预处理30分钟并且用PDGF-BB(10ng/ml)再处理24小时。如图5所示，在CFSC-2G细胞中，αvβ3抑制物以剂量依赖方式下调CTGF表达，在10-6M浓度时抑制最大。其它ECM分子转录物水平没有变化(数据未显示)。
为了研究肝纤维变性过程中整合素表达的模式，使用了完全胆梗阻6周的大鼠模型，该模型导致的硬化中分别为4倍或10-12倍的相对(每克肝)和绝对(每个总肝)肝胶原积累。与假手术动物相比，胆道闭塞6周后前胶原α1(I)、TGFβ1、TGFβ2和CTGF的mRNA表达明显上调(分别为25、10、200和190倍)(图6)。
同时在硬化的肝脏中观察到αvβ3 mRNA适当上调(图7a)，而β6整合素亚基明显过表达(180倍)(图7b)。在纤维化疾病并且具体而言在肝纤维变性中从来没有呈现出β6整合素的这种强烈上调。负责这种上调的细胞主要是增殖的胆管上皮细胞(而且还有HSC/肌成纤维细胞)，除了活化的HSC/MF外，这些细胞分泌大量的促纤维发生细胞因子例如TGFβ和CTGF，并且因此成为肝纤维变性治疗的主要靶点。
此外，我们最近在胆道闭塞进行性大鼠纤维变性模型中开展的先导实验(每组5-6个动物)表明通过EMD 409849使β6整合素特异性抑制可以明显改善继发性胆汁性肝纤维变性，在胆道闭塞5-6周后总的肝脏胶原降低50-70％。
综合这些数据表明，通过特异性低分子量肽以及特别是其非肽类似物使整合素αvβ3和αvβ6抑制是改善、阻止或者甚至逆转那些在很大程度上需要治疗的肝脏和其它器官纤维变性(11-19，33-44)的有利工具。
因此，用于本发明的化合物和/或它们的生理可接受盐和/或它们的生理可接受衍生物可以用作通过将适当剂量形式与至少一种赋形剂或辅助剂和一种或多种另外的活性化合物(如果期望)混合来生产药物组合物或制剂。因此，所得到的组合物或制剂可以用作人用药物或兽用药物。适宜的赋形剂是适于肠施用(例如口服或直肠施用)或肠胃外施用且不与本发明化合物起反应的有机或无机物质，例如水、植物油、苄醇、聚乙二醇、三醋酸甘油酯和其它脂肪酸甘油酯、明胶、大豆卵磷脂、糖类如乳糖或淀粉、硬脂酸镁、滑石粉或纤维素。
对于口服施用，特别是使用片剂、包衣片剂、胶囊剂、糖浆剂、juice或者滴剂。特别感兴趣的是具有肠包衣或胶囊壳的包衣片剂和胶囊剂。对于直肠施用使用栓剂，并且对于肠胃外施用使用溶液优选油溶液或者水溶液以及混悬液、乳剂或者植入剂。
还可以将根据本发明的化合物冻干，并且所得到的冻干物可以用于例如生产注射制剂。所指出的组合物或制剂可以是无菌的和/或包含辅助剂例如防腐剂、稳定剂和/或润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲物质、着色剂和/或芳香剂。如果希望，还可以包含一种或多种另外的活性化合物例如一种或多种维生素、利尿剂、抗炎症化合物、抗糖尿病剂、镇痛剂、消炎药以及本发明化合物以外的化合物，例如非本发明的化合物、如本文所描述的在病症、临床表现和/或综合征的诊断、预防和/或治疗中使用以便进一步促进或提高化合物的治疗效果和/或耐受的化合物。
可以根据本领域已知的方法或者与其类似的方法得到或生产本发明的药物组合物。通常，可以使用非化学方法生产本发明的药物组合物，其中所述的非化学方法例如通过将活性成分与例如生理性可接受赋形剂、辅助剂、佐剂和载体混合并且将混合物转变成预期剂量形式，例如通过成型方法制成片剂或者将活性成分溶解于溶剂中而制成溶液。总之，将活性成分与一种或多种赋形剂(例如固体、液体和/或半固体赋形剂)或者一种或多种辅助剂以及与一种或多种另外的活性成分(如果期望时)组合制成药物组合物。
这些制剂可以用作人用药物或者兽用药物。适宜的赋形剂是适于肠施用(例如口服)、肠胃外施用或局部施用且不与新化合物起反应的有机或无机物质，例如水、植物油、苄醇、烷撑二醇、聚乙二醇、三醋酸甘油酯、明胶、糖类如乳糖或淀粉、硬脂酸镁、滑石粉或凡士林。适于口服施用的制剂特别是片剂、丸剂、包衣片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、juice或者滴剂，适于直肠施用的制剂是栓剂，适于肠胃外施用的制剂是溶液剂(优选油溶液或水溶液)以及混悬剂、乳剂或者植入剂，并且适于局部应用的制剂是软膏剂、乳膏剂或散剂。还可以将新化合物冻干并且所得到的冻干物可以用于制备注射制剂。所指出的制剂可以是无菌的和/或包含辅助物质例如润滑剂、防腐剂、稳定剂和/或润湿剂、乳化剂、改变渗透压的盐、缓冲物质、染料、芳香剂和/或众多另外的活性成分例如一种或多种维生素。
对于吸入喷雾施用，可以采用喷雾剂，其中活性成分或者溶解或悬浮于抛射剂气体或者抛射剂气体混合物中(例如CO2或者含氯氟烃)。此时的活性成分可以有利地以微粉化形式使用，在这种情况下可以存在一种或多种生理可接受溶剂例如乙醇。可以借助于常规吸入器施用吸入溶液。
因此，拮抗物的优选施用剂量为每一剂量单位大约0.001-200mg、更优选大约0.01-100mg、甚至更加优选大约0.01-50mg并且具体而言为0.01-30mg。
每日剂量优选大于或等于大约0.0001mg/kg、更优选大于或等于大约0.001mg/kg、甚至更优选大于或等于大约0.005mg/kg、大于或等于大约0.01mg/kg或者大于或等于大约0.1mg/kg。每日剂量优选小于或等于大约30mg/kg、更优选小于或等于大约20mg/kg、甚至更优选小于或等于大约15mg/kg、小于或等于大约5mg/kg或者小于或等于大约1mg/kg体重。
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权利要求
1.αv整合素拮抗物用于制造治疗哺乳动物中病理状况的药物的用途，其中在所述的病理状况中涉及活化成纤维细胞或肌成纤维细胞。
2.根据权利要求1的用途，其中αv整合素拮抗物是αvβ3拮抗物。
3.根据权利要求1的用途，其中αv整合素拮抗物是αvβ6拮抗物。
4.根据权利要求2或3的用途，其中αv整合素拮抗物选自(i)3-苯并[1，2，5]噻二唑-5-基-3-{6-[2-(6-甲氨基-吡啶-2-基)-乙氧基]-1H-吲哚-3-基}-丙酸，和(ii)3-{3-苄氧基-2-[5-(吡啶-2-基氨基)-戊酰基氨基]-丙酰基氨基}-3-(3，5-二氯-苯基)-丙酸。
5.根据权利要求1-4中任何一项的用途，其中病理状况是纤维变性或者纤维化疾病。
6.根据权利要求5的用途，其中纤维变性是纤维化肝脏疾病。
7.根据权利要求6的用途，其中所述纤维化肝脏疾病是肝硬化。
8.根据权利要求5的用途，其中所述拮抗物抑制PDGF诱导的HSC/MF迁移和/或活化。
9.根据权利要求5的用途，其中所述拮抗物抑制瘢痕化。
全文摘要
本发明涉及通过特异性拮抗物对αv整合素特别是αvβ3和αvβ6整合素的抑制，其中所述的特异性抑制剂优选地是通过对细胞迁移的抑制和对活化肝星状细胞/肌成纤维细胞、活化上皮细胞和内皮产生促纤维发生分子(例如胶原、TIMP－1)和细胞因子(例如CTGF)的抑制而下调纤维发生的非肽拮抗物、相关化合物和具有相当特异性的化合物。这些拮抗物可以单独或与其它试剂一起有效地防止、减轻或者甚至逆转晚期纤维变性的发展，其中所述晚期纤维变性例如肝脏的纤维变性/硬化和其它器官如肺、肾、肠、胰、皮肤和动脉的纤维变性。
文档编号C07D213/74GK1863520SQ200480028670
公开日2006年11月15日 申请日期2004年9月16日 优先权日2003年10月1日
发明者S·戈德曼, D·舒潘, E·帕岑科尔, Y·波波夫, M·鲍尔, M·韦森内尔, A·约恩齐克 申请人:默克专利有限公司