专利名称：用于美化和/或改善哺乳动物皮肤的无发蛋白相互作用伴侣复合物及其方法
技术领域：
本发明涉及无发蛋白(hairless protein)相互作用伴侣复合物、拮抗剂或激动剂活性化合物、包含相同化合物的组合物和产品及其方法。所述复合物可用于筛选检测剂和鉴定能给哺乳动物，尤其是人类皮肤带来实质性的美化和改善效益的化合物。
背景技术：
人们一向沉迷于对外貌，尤其是面容的追求。不过对于皮肤和身体外观的追求也在日益增长。实际上，许多人相信，外貌与自尊、配偶的选择、职业升迁和总体社会认可之间有着内在的联系。人类皮肤的状况典型地在20岁时达到顶峰，后来会变薄并失去弹性。并不令人惊讶的是，美国消费者在2001年在声称能延缓或逆转皮肤老化的产品上花费了约28亿美元。对于改进外貌的需求在不断增加，许多新产品和服务的出现就证明了这点，每种新产品和服务均声称可获得一种所需的改进外貌的效果。
声称对皮肤有多种益处的洗剂(草药的以及其它的)每年在全球被引进皮肤护理市场。其它具有明确定义的化学物质的产品(例如，α-羟基酸、烟酰胺、维甲酸、维生素E、激动素、铜-肽)也可广泛获得。尽管这些产品已经商品化，但对用于预防和逆转皮肤老化的组合物和产品仍然有显著的和未满足的需要。实际上，多种临床的和/或外科手术的程序，包括注射(例如，肉毒杆菌毒素、胶原、透明质酸、角蛋白、硅酮、尸体皮肤提取物)，已经证明对哺乳动物皮肤的美化是有效的。然而，这些程序趋于昂贵且耗费时间，因此通常不适用于大多数消费者。此外，和其它的医疗程序一样，用于哺乳动物皮肤美化的临床的和外科手术的方法需要冒很多风险，并且有副作用。草药疗法也存在于全球的皮肤护理市场，它仍未被证明能给哺乳动物皮肤带来实质性的美化效益。此外，近来关于激素替代疗法的不利发现，已经限制了哺乳动物皮肤美化中的基于药物的疗法的可行性。虽然类药剂营养品(或功能性食品)证明了其在皮肤美化领域是有效的，但在鉴定具有皮肤抗老化有益效果的安全的和有效的化合物方面，仍需要取得相当多的进展。
因此，尽管本领域的技术人员付出了巨大的努力，但仍然存在对鉴定抗老化和逆转老化产品，尤其是既有效又安全的化合物的巨大的并且未被满足的需要。例如，雌激素对皮肤有独特的好处，但是由于它在其它组织中的多样化的作用，也具有多种不可取的副作用，因此限制了它在美容性皮肤护理领域中的使用。雌激素的效果通常通过多种雌激素受体(例如，ERα、ERβ、ERx)的媒介作用而实现，并且已知雌激素受体自身与多种组织中的其它胞质蛋白相互作用。这种困境强调了对鉴定有益于皮肤的药剂的需要，这些药剂对相关的细胞或组织类型是特异的。在基因组学-蛋白质组学和生物信息学工具方面的同时的进步，现在有利于经由经典的分子遗传学和生物化学方法发现细胞和/或组织类型的事件。蛋白复合物通常控制生物学过程，并且因此，鉴定皮肤特异性蛋白复合物和/或相互作用伴侣有利于发现皮肤抗老化“靶”和具有皮肤抗老化有益效果的皮肤化合物。
无发蛋白质一般认为是一种GATA家族锌指蛋白，存在着作用于它的几个相互作用伴侣。实际上，HR的多种相互作用伴侣不断带来对通路作图和发现某种改进皮肤与毛发的产品的一种挑战和机遇。迄今为止，本领域的技术人员仅仅已经鉴定了无发蛋白和哺乳动物毛发生长与保持之间的关系。已经认识到HR发生点突变的个体是无发的，但是在其它方面健康状况良好。美国专利6,348,348，公布于2002年2月19日，Thompson等人，公开了HR直接的和特异性的相互作用于甲状腺激素受体(TR)--调节它的表达的相同蛋白。6,348,348进一步公开了人类患者个体HR序列的氨基酸序列，一种被Ahmad等人公布的人类序列(Science，279，720-724，1998)；一种被Cichon等人公布的人类序列(Hum.Mol.Genet.，7，1671-1679和勘误表，1987-1988，1998)；一种被Thompson公布的大鼠序列(J.Neurosci.，16，7832-7840，1996)；和一种被Cachon-Gonzalez等人公布的小鼠序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，7717-7721，1994)之间的比较。WO 99/38965提供一种编码人无发蛋白的分离的核酸。最后，普通转让美国专利申请10/452,858，提交于2003年6月2日，名称是“Hairless Protein-Interacting PartnerComplexes and Methods Thereof”，描述了用于抑制或增强毛发生长的无发蛋白相互作用伴侣复合物的使用。虽然本领域的技术人员已经鉴定了一些HR和甲状腺激素受体(TRs)之间的相互作用，但上文中在哺乳动物皮肤的角质细胞中的HR和其它蛋白之间的相互作用并未被鉴定。因此，本领域仍存在着对发展特异的蛋白复合物的巨大的和未被满足的需要，该蛋白复合物能用于筛选检测剂，并从而鉴定对哺乳动物皮肤具有一种或多种美化效益的化合物。
发明概述本发明涉及用于筛选和/或发现适于对哺乳动物皮肤提供实质性的美化和改善有益效果的无发蛋白相互作用伴侣复合物(HR-IP)。本发明进一步涉及表现出具有拮抗剂和/或激动剂活性的化合物、包含所述化合物的组合物和产品、以及使用本文公开的化合物和组合物给哺乳动物皮肤带来实质性的美化和/或改善有益效果的方法。本发明者使用了一种改进的酵母双杂交技术以鉴定本文公开的无发蛋白相互作用伴侣复合物，它们的相互作用据信对哺乳动物皮肤的状况有很多影响，这一点从本说明书的公开内容中将变得显而易见。本发明提供的无发蛋白相互作用伴侣被列于表1中，包括涉及细胞周期、细胞分化、转录、核转运、信号转导、细胞完整性和线粒体装置的分子。
因此，在本发明的一方面，提供了一种包含小鼠HRt蛋白-人相互作用伴侣蛋白复合物的组合物，其中人相互作用伴侣蛋白包含一种分子，所述分子选自人角蛋白5；氧固醇受体LXR-β；人活化的STAT-1蛋白抑制剂(PIAS1)；人类类基质抗原2(Homo Sapiens Similar to StromalAntigen 2)；人160kD核孔蛋白(NUP160)；人视黄酸受体γ1；人甲状腺激素受体α；人膜联蛋白A1(脂皮质蛋白-1或P35)；人HIC同工蛋白p32和HIC同工蛋白40；人胰岛素样生长因子结合蛋白6；人线粒体内膜蛋白(Mitofilin)；人假想蛋白；人活化的STAT-3蛋白抑制剂(PIAS3)；人DEAD/H(Asp-Glu-Ala-Asp/His)箱多肽3；人Dpy-30-样蛋白；小鼠维生素D受体(VDR)，以及它们的组合。重申，上述分子可用于筛选检测剂和鉴定可对哺乳动物，尤其是人类皮肤带来实质性的美化和改善有益效果的化合物。
在本发明的另一方面，公开了一种包含人相互作用伴侣蛋白的组合物，该伴侣蛋白被一种核酸编码，所述核酸包括SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ IDNO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16以及它们的组合。
在本发明的另一方面，公开了一种检测分析受试化合物在哺乳动物皮肤美化和/或改善中的激动剂或拮抗剂活性的方法。所述方法包括步骤a)在无受试化合物的情况下测量小鼠HRt蛋白和人相互作用伴侣之间的相互作用水平；b)在有受试化合物的情况下测量小鼠HR蛋白和人相互作用伴侣之间的相互作用水平；其中当步骤b)中的测量水平大于步骤a)中的测量水平时，受试化合物有激动剂活性，而其中当步骤b)中的测量水平小于步骤a)中的测量水平时，受试化合物有拮抗剂活性。
在本发明的另一方面，表现出具有如上文所定义的激动剂和拮抗剂活性的化合物是公开的并受权利要求书保护。所述化合物可以依照本发明，使用下文讨论的检测分析受试化合物的方法被鉴定。本发明的激动剂和拮抗剂化合物可以被释放至一部分哺乳动物皮肤上，预期该部分皮肤从而可得到实质性的改善和/或美化有益效果。所述应用和/或释放可以经由多种途径完成，包括但不限于将所述化合物掺入一种局部用药组合物和/或使用口服的药物载体。
在本发明的另一方面，公开了掺入本发明的一种或多种激动剂和/或拮抗剂活性化合物的组合物。毫无疑问，本发明的受试化合物，无论其表现出的是激动剂还是拮抗剂活性，都可以被配入一种组合物和/或掺入到一种产品中，用于实现对哺乳动物皮肤的实质性的美化和/或改善有益效果，通过回顾本说明书的公开内容这一点将变得显而易见。本发明的组合物和/或产品可以采用多种形状、尺寸和性质，取决于配方设计者的精确的需要、所讨论的化合物的性质和使用这种组合物或产品意欲达到的目的。在本发明的另一方面，本文公开的组合物和/或产品可以掺入一种或多种辅助成分，这一点将在下文中论及。
在本发明的另一方面，公开了一种能给哺乳动物皮肤，尤其是人类皮肤，带来实质性的美化和/或改善有益效果的方法。所述方法包括步骤施用一种表现出激动剂和/或拮抗剂活性的组合物一段时间，其中所述组合物的施用方法可口服或局部用药，所述激动剂和/或拮抗剂活性通过使用本文公开的前述方法决定，所述的一段时间应足以给哺乳动物皮肤带来实质性的美化和/或改善有益效果。在本发明的另一方面，所述方法涉及应用本文公开的包含激动剂和/或拮抗剂化合物的组合物或产品到一部分哺乳动物皮肤上，预期这部分皮肤从而可得到实质性的美化和/或改善有益效果。
发明详述背景和定义本发明涉及无发蛋白相互作用伴侣(HR-IP)、表现出具有激动剂和/或拮抗剂活性的化合物、包含相同化合物的组合物和产品；及其方法。一种修正和改进过的酵母双杂交体系(上文曾论及)被用于鉴定无发蛋白的蛋白相互作用伴侣。酵母双杂交体系通常测量酵母中表达的两种融合蛋白的结合。酵母中发现的相互作用指示了在生理条件下将发生的潜在的相互作用。
本文中所用“无发蛋白(HR)”是指小鼠无发蛋白。所谓“截短的无发蛋白(HRt)”是指提供的SEQ ID NO16的序列，它是小鼠HR蛋白C-末端部分的490至1182氨基酸残基的序列。本领域的技术人员按照本公开内容已知的HR的衍生物、片段、或类似物被认为等同于HR。应该注意并强调的是小鼠HR与人HR有大于80％的部分相同。因此，本文提供的相互作用伴侣被期望以与小鼠HR相互作用相同的方式与人无发蛋白相互作用。因此，一种具有对HRt的活性的拮抗剂和/或激动剂化合物被期望进一步表现出具有对HR的活性。本HRt-IP复合物的拮抗剂或激动剂被进一步期望表现出具有对人无发蛋白相互作用伴侣等同物的活性。
所谓“相互作用伴侣(IP)，”是指一种蛋白质或核酸，它具有对HRt足够的结合亲和力，使得当IP和HRt被融合进一种转录调节因子的分离组分时，HRt-IP亲和力足以允许转录调节因子的组分的再构建，从而允许报告基因的表达。此相互作用可以由于特异性静电的、疏水的、亲水的、熵的或其它HRt的某些部分与IP的某些部分的相互作用而发生，以在可有效地促进相互作用的条件下形成一种稳定的复合物。相互作用伴侣通过表1提供的数据被鉴定。即，相互作用伴侣的鉴定通过利用来自酵母双杂交体系中的阳性结果的核苷酸序列数据进行的同源性搜索得到确定。本领域的技术人员按照本说明书的公开内容所知的在表1中鉴定的相互作用伴侣的衍生物、片段或类似物，被认为等同于相互作用伴侣，并因此完全属于本说明书的公开内容的范围。
所谓“HRt-IP复合物”是指在离子强度、温度、pH等方面处于生理条件下时，与至少一个相互作用伴侣分子相关联的至少一个HRt分子。所述复合物可以是体内的或体外的。
在酵母双杂交体系中，报告基因的转录(例如，LACZ、MEL1、HIS3、ADE1、URA3)取决于通过两种每种融合到“半个”调节因子的蛋白的相互作用实现的Gal 4调节因子的重建。当此两种蛋白有足够的结合亲和力以相互作用时，此相互作用导致GAL 4调节因子的再构建，重建于是激活了报告基因的转录。在本发明的上下文中，调节因子的“一半”是一种DNA结合结构域(BD)，而调节因子的另“一半”是一种激活结构域(AD)。当一种“诱饵”蛋白被融合到结合结构域，并且一种“捕获”蛋白被融合到激活结构域时(反之亦然)，“诱饵”和“捕获”蛋白间的足够的结合亲和力允许BD和AD的再构建以允许报告基因被激活。这种检测分析法因此是一种“诱饵”和“捕获”蛋白间的亲和力测试。酵母双杂交技术已经被描述于，例如，美国专利5,986,055，公布于1999年11月16日，Yang，M.，等人，引入本文以作参考。本发明者已经使用一种改进的酵母双杂交技术，详细描述于下文。
在本发明的上下文中，所述“诱饵”蛋白是一种小鼠无发蛋白(HRt)的C-末端部分，该小鼠无发蛋白具有氨基酸残基490至1182(以SEQID NO16提供，编码所述氨基酸490至1182的核酸序列被以SEQ IDNO17提供)“Structure and Expression of the Hairless Gene ofMice，”Begona，M.，等人，J.Proc.Natl.Acad.Sci，USA 917717-7721，1994)(GenBank序列号Z 32675)。HR蛋白(氨基酸残基490-1182)包含锌指结构域(595至620)和三个以前被鉴定对HR功能有可能重要的PEST结构域。重申，小鼠HR非常类似于人HR。事实上，PEST序列常被用作快速蛋白降解的信号。此信号可以是组成性的或条件性的。M.Rechsteiner和S.W.Rogers(PEST sequencesandregulation by proteolysis，TIBS 21，1996年7月)已开发出PEST-FIND计算机程序以客观测定一种蛋白是否包含PEST区域。相关的算法定义PEST序列为一种以任何顺序包含至少一个P、E/D、和S/T的12个或更多氨基酸残基的亲水延伸，所述算法在PC/GENE(OMIGA)中是可利用的。PEST序列必须进一步被碱性氨基酸残基K、A或H侧面相接，但是碱性残基不允许出现在PEST序列中。PEST-FIND产生一个从约+50至-50的值。为了分类，小于零的值表示可能的PEST区域，但是大于+5的值表示PEST区域高可能性地存在。例如，PEST结构域位于HR蛋白(氨基酸残基490至1182)的以下区域在氨基酸残基522和546间的PEST结构域12.26；在氨基酸残基709和722间的PEST结构域7.56；和在氨基酸残基729和744间的PEST结构域21.71。
在本发明的上下文中，“捕获”蛋白被人角质化细胞AD-cDNA文库编码。当两种互补交配型酵母，一种包含BD-HRt融合蛋白，而另一种包含AD-人cDNA蛋白，交配时，其后代表达每一种融合蛋白。那些对HRt具有足够亲和力的AD-蛋白将结合HRt并允许BD和AD重建以激活报告基因。因此，来自双杂交体系的阳性结果证明了小鼠HRt和人角质化细胞蛋白之间的亲和力和相互作用。
所谓HR-IP相互作用的“拮抗剂”是指一种对HR-IP复合物的结合有抑制活性的试剂。此结合可以被一种对HR和IP间的相互作用的影响效果抑制，或被对HR或IP单独的影响效果抑制，该单独的影响效果影响HR和IP间总体的相互作用。
所谓HR-IP相互作用的“激动剂”是指一种对HR-IP复合物的结合有增强或刺激活性的试剂。此结合可以被一种对HR和IP间的相互作用的影响效果刺激，或被对HR或IP单独的影响效果抑制，该单独的影响效果影响HR和IP间总体的相互作用。拮抗剂或激动剂的鉴定通过允许HR和IP在受试试剂存在的情况下相互作用而进行。相对于无受试试剂情况下HR-IP的相互作用，有受试试剂存在时HR-IP相互作用的减少或增加通常指示此受试试剂对此相互作用对有影响作用，这一点将在下文中进一步描述。
所谓“美化和/或改善有益效果，”是指本发明的无发蛋白相互作用伴侣复合物可以被用于筛选和/或鉴定对HR-IP复合物的结合具有拮抗剂和激动剂活性的化合物，所述化合物可给哺乳动物皮肤带来以下的一种或多种有益效果改善的表皮屏障功能和水合作用、脂肪减少、增强的屏障修复、预防与逆转皮肤褶皱和毛发生长延迟。
因为小鼠HR有与人HR大于80％的相同性，本发明者有合理的把握期望本发明提供的与小鼠HRt相互作用的人蛋白将也与人HRt相互作用。同样的，本发明者期望证明是小鼠HRt-人相互作用伴侣相互作用的激动剂或拮抗剂的受试化合物也是人HRt-人相互作用伴侣的激动剂或拮抗剂。
在本发明的HR-相互作用伴侣蛋白组合物中，保守性氨基酸置换(例如，Glu/Asp、Val/Ile、Ser/Thr、Arg/Lys和Gln/Asn)将被认为是等效的，因为这些氨基酸残基对的化学相似性将被期望导致功能等价。保存HR-相互作用伴侣蛋白生物学功能的氨基酸置换将保存诸如疏水性、亲水性、侧链电荷或尺寸这样的性质。功能的等价通过将等效对的相互作用与最初的对相比较而被测定。本发明范围所包括的是HR-相互作用蛋白片段、衍生物、或者在翻译过程中或在翻译后被改变的类似物的复合物，例如，通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、脂肪酰化、硫酸盐化、通过已知的保护/阻塞基团的衍生化、蛋白水解裂解、连接到一种抗体分子或其它细胞配体等。
在本发明的HR-相互作用伴侣核酸组合物中，一种是在严紧杂交条件下杂交到相互作用伴侣核酸的核酸分子的互补体的分子，将被认为是等效的，因为可以期望这种分子如一种相互作用伴侣核酸一样导致功能的等效。功能的等效通过将等效对的相互作用与最初的对相比较而被测定。杂交的严紧条件取决于多种因素，例如杂交分子的长度、盐浓度、温度和变性试剂的存在或不存在，例如。高严紧性条件可以包括在以下条件下杂交约42℃和约50％甲酰胺，0.1mg/mL被修饰的鲑鱼精DNA，1％SDS，2X SSC，10％硫酸葡聚糖，在约65℃，约2X SSC，和1％ SDS条件下进行第一次洗涤，然后在约65℃和约0.1X SSC条件下进行第二次洗涤。可供选择地，高严紧性条件可以包括在以下条件下杂交约42℃和约50％甲酰胺，0.1mg/mL被修饰的鲑鱼精DNA，0.5％ SDS，5XSSPE，1X Denhardt试剂，然后在室温和2X SSC，0.1％ SDS条件下进行两次洗涤，并在55℃至60℃之间和0.2X SSC，0.1％ SDS条件下进行二次洗涤。
HR-IP复合物可以被用于制备多克隆或单克隆抗体、抗体片段、人源化抗体、单链抗体，以用于亲和纯化、检测和/或其它功能性研究。生产抗体的方法是本领域熟知的，并且能按照本说明书的公开内容应用于HR-IP复合物。对HR-IP复合物的HR部分或IP部分具有结合特异性的抗体可以通过用HR或IP进行的吸附从抗-HR-IP制制剂中移除。保留的抗体将对复合物具有特异性。
小鼠HR突变背景无发(HR)基因在很多组织中被表达，主要在皮肤中，HR基因的突变引起典型的无毛小鼠皮肤显型。突变型HR小鼠品系表现出尤其涉及T细胞和巨噬细胞的免疫缺陷，以及一种年龄相关的免疫缺陷和一种加速的胸腺萎缩。(参见The thymus of the hairless rhino-j(hr/rh-j)mice.Jose等人J Anat 2001年4月；198(Pt 4)399-406)。
无发小鼠(hr/hr)最初的无毛突变型首先在分子水平被描述特征。鼠白血病病毒pmv43插入HR基因的内含子6引起异常剪接，正确剪接的HR以正常水平的约5％被表达。因此，这种型的小鼠表达小量的正确HR蛋白。(参见Role of endogenous retroviruses as mutagensthe hairless mutation of mice.Stoye等人Cell 1988，54383-391)。
Rhino Yurlovo小鼠(hrrhY)在HR基因的外显子16中的核苷酸位置3520处有一段13bp插入序列。这引起在插入位置的下游264bp处的外显子17中，和外显子19中的内部中止密码子上游139bp处的移码突变和提前终止。(参见Molecular basis for the rhino Yurlovo(hrrhY)phenotypeSevere skin abnormalities and femalereproductive defects associated with an insertion in thehairless gene.Panteleyev等人，Exp.Dermatol.1998，7281-288)。
Rhino小鼠(hrrh-8j)在外显子4核苷酸位置1910和1911处的一段2bp的置换，导致在位置511(Q511H)处的谷氨酰胺到组氨酸的氨基酸取代，和在邻近氨基酸512(K512X)处的赖氨酸到无意义密码子的取代。Rhino是一种功能性的HR基因缺失。(参见Molecular basisfor the rhino(hrrh-8j)phenotypeA nonsense mutation in the mousehairless gene.Ahmad等人，Genomics 1998，53383-386)。
Rhino小鼠(hrrhChr)C至T转变导致在氨基酸位置467(R467X)处的一种精氨酸残基(CGA)到提前终止密码子(TGA)的转变。(参见Molecular basis of a novel rhino(hrrhChr)phenotypea nonsensemutation in the mouse hairless gene.Ahmad等人Exp.Dermatol.1998，7298-301)。
Rhino小鼠(hrrh/hrrh)由于在外显子6中的提早中止，表达HR的一种截短的版本(C-末端氨基酸711至1189缺失)(参见Thehairless gene of the mouserelationship of phenotypic effectswith expression profile and genotype.Gonzalez等人Dev Dyn.1999年10月；16(2)113-26)。
在人HR中引起先天性毛发缺乏的突变图谱
突变位置参见GeneBank序列号AF039196(核苷酸序列)和NP_005135(氨基酸序列)APL＝并发丘疹的毛发缺乏症AUC＝先天性全身脱毛症参考文献Zlotogorski等人，(2002a)，Clinical and moleculardiagnostic criteria of congenital atrichia with papularlesions，J Invest Dermatol.2002，118887-890。Ahmad等人(1999a)，Genomic organization of the humanhairless gene(HR)andidentification of a mutation underlying congenital atrichia inthe Arab Palestinian family，Genomics 56，141-148。Sprecher等人(1999b)，Atrichia with popular lesions resulting from a nonsensemutation within the human hairless gene，J.Invest.Dermatol113，687-690。Ahmad等人(1999b)，A homozygous nonsense mutationin thezinc-finger domain of the human hairless gene underlinescongenital atrichia，J Invest Dermatol 113，281-283。Ahmad等人(1998b)，A miss sense mutation in the zinc-finger domain of thehuman hairless gene underlines congenital atrichia in a familyof Irish travelers，Am J Hum Genet 63，984-991。Aita等人(2000)，A novel missense mutation(C622G)in the zinc-fingerdomain of the human hairless gene associated with congenitalatrichia and popular lesions，Exp Dermatol 9，157-162。Kruse等人(1999)，Hairless mutations in two kindreds with autosomalrecessive popular atrichia，J Invest Dermatol 113，954-959。Zlotogorski等人(1998)，Congenital atrichia in five ArabPalestinian families resulting from a deletion mutation in thehuman hairless gene，Hum Genet.1998，103400-404。Cichon等人(1998)，Cloning，genomicorganization，alternative transcriptsand mutational analysis of the gene responsible for autosomalrecessive universal congenital alopecia，Hum Mol Genet 7，1671-1679。Kruse等人(1999)，Hairless mutations in two kindreds withautosomal recessive popular tarichia，J Invest Dermatol 113，954-959。Klein等人(2002)，A novel missense mutation affectingthe human hairless thyroid receptor interaction domain 2 causescongenital atrichia，J Invest Dermatol 119，920-922。Ahmad等人(1998a)，Alopecia universalis associated with mutation in thehuman hairless gene，Science 279，720-724。Zlotogorski等人(2002b)，Evidence for pseudodominant inheritance of atrichiawith papular lesions，J Invest Dermatol 2002，118881-886。Sprecher等人(1999a)，Identification of a genetic defect in thehairless gene in atrichia with popular lesionsevidence forphenotypic heterogeneity among inheritedatrichia，Am J Hum Genet64，1323-1329，所有这些专利均引入本文以供参考。
第一方面HRt蛋白-人相互作用伴侣蛋白复合物依照本发明的第一方面，提供了一种包含小鼠HRt蛋白-人相互作用伴侣蛋白复合物的组合物，其中人相互作用伴侣蛋白包含一种分子，所述选自人角蛋白5；氧固醇受体LXR-β；人活化的STAT-1蛋白抑制剂(PIAS1)；人类类基质抗原2；人160kD核孔蛋白(NUP160)；人视黄酸受体γ1；人甲状腺激素受体α；人膜联蛋白A1(脂皮质蛋白-1或P35)；人HIC同工蛋白p32和HIC同工蛋白40；人胰岛素样生长因子结合蛋白6；人线粒体内膜蛋白(Mitofilin)；人假想蛋白；人活化的STAT-3蛋白抑制剂(PIAS3)；人DEAD/H(Asp-Glu-Ala-Asp/His)箱多肽3；人Dpy-30-样蛋白；小鼠维生素D受体(VDR)，以及它们的组合。本文公开的分子已经使用一种改进的酵母双杂交技术加以鉴定，如下文所述。事实上，上述分子可用于筛选受试试剂和鉴定能给哺乳动物，尤其是人类皮肤带来实质性的美化和改善有益效果的化合物。
在本发明的另一方面，提供了人相互作用伴侣蛋白，编码该伴侣蛋白的核酸包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16以及它们的组合。所述核核酸序列额外可用于筛选受试试剂和鉴定能给哺乳动物，尤其是人类皮肤带来实质性的美化和/或改善有益效果的化合物。依照本说明书的公开内容接下来的部分，可以测试化合物对HR-IP复合物的激动剂和/或拮抗剂活性，所述化合物包括本文公开的分子和核酸序列。
第二方面HR-IP复合物的拮抗剂和/或激动剂化合物依照本发明的第二方面，表现出具有对HR-IP复合物的拮抗剂和/或激动剂活性的化合物被公开并受受权利要求书保护。当然，前述部分描述的人相互作用伴侣蛋白可以被用于筛选适于结合到HR-IP复合物的拮抗剂和/或激动剂化合物。所述化合物与HR-IP复合物的相互作用有利于它们在组合物和产品、消费者以及其它方面的应用，用于给哺乳动物皮肤带来一种或多种实质性的美化和/或改善有益效果。本发明的拮抗剂和/或激动剂化合物可以使用一种新型检测分析法(描述于下文)进行鉴定，然后使用本文公开的其它方法进行纯化。
筛选HR-IP复合物的拮抗剂或激动剂
HR-IP复合物或编码HR-IP复合物的核酸可以被用于筛选结合到HR-IP复合物的化合物，并且这些化合物从而可用作HR-IP复合物的激动剂或拮抗剂。因此本发明提供用于检测或者增强或者抑制HR和一种相互作用伴侣的相互作用的分子的检测分析法。例如，这些分子可以是小分子、多肽、经修饰的多肽、核酸配体、核酸或经修饰的核酸。一种调节HR-IP活性的分子通过将一种受试分子在与HR和IP一起接触之前，先与HR或者IP接触进行鉴定，或者通过一种在HR、IP和受试分子之间的三通路结合进行鉴定。HR-IP相互作用的调节可以通过测量复合物的稳定性、复合物的亲和力或结合、复合物的形成率、复合物的量、或复合物的另一种功能，而得到测量。相对于无测试分子情况下的参数，这些参数中任何一种的升高或降低指示受试分子是复合物的一种激动剂或拮抗剂。鉴定这些激动剂或拮抗剂的方法可以使用本文所述的改进的酵母双杂交检测分析法进行，或者可以例如在体外进行。
接受拮抗剂或激动剂活性筛选的受试试剂可以以具体化合物的混合物的形式被提供，或者以化合物文库、肽文库、抗血清、反义核酸、随机或组合文库、化学合成文库、重组文库、或基于体外翻译的文库的形式被提供。试剂可以作为HR-IP相互作用的竞争性或非竞争性抑制剂接受活性筛选。尤其是，HR或IP的片段或类似物可以接受这种抑制剂活性筛选。试剂可以被筛选抑制或增强在含水或生理学结合条件下的HR和IP结合，在这种条件下，HR-IP的结合会在无受试试剂的情况下发生。减少结合的试剂被鉴定为复合物的拮抗剂，而增强结合的试剂被鉴定为复合物的激动剂。
典型的结合条件是，例如，一种10mM至250mM NaCl、5mM至50mMTris-HCl，pH 5至8，0.5％ Triton X-100的水溶液。金属螯合剂或二价阳离子可以被加入以促进结合。结合温度可以包括冰浴温度至42℃。孵育时间足以允许出现结合平衡态。本领域的技术人员按照本说明书的公开内容所知的方法可以被用于检测分析HR和一种相互作用伴侣以及一种受试试剂之间的结合，这其中包括使用可检测的标记和对复合物的形成进行定量。
一种酵母双杂交检测分析体系可以被用于检测一种试剂对HR-IP结合的拮抗剂或激动剂活性，它类似于美国专利5,986,055所阐明的检测分析体系，该专利公布于1999年11月16日，用于CDK2-相互作用蛋白，引入本文以供参考。双杂交检测分析法如本发明的实施例所述的步骤进行，在受试试剂存在的情况下进行时除外。相对于无受试试剂时所表现出的活性，报告基因活性的升高或降低指示受试试剂对相互作用对具有影响。
这种体系的组分包括一种可重建的转录调节因子和一种报告基因。可重建的转录激活因子包含一种DNA结合结构域(BD)和一种激活结构域(AD)，当重建实现的时候，激活结构域诱导报告基因的转录。编码HRt、片段、衍生物或其类似物的核苷酸序列被融合到DNA结合结构域或者激活结构域，并且编码一种由表1鉴定的相互作用伴侣的核苷酸序列被融合到BD或AD中的另一种上。DNA结合结构域可以是任何一种DNA结合结构域，只要它特异性的识别一段在对报告基因有活性的启动子内的DNA序列。激活结构域具有对转录调节因子的结合结构域的活性。报告基因被可操作地连接到一种包含对DNA结合结构域的结合位点的启动子上。例如，BD-HR到AD-IP的结合导致BD-AD转录调节因子的重建，该转录调节因子激活报告基因的表达。报告基因转录的激活发生在细胞内，例如，在原核或真核细胞中，优选地在细胞培养物中。报告基因编码一种可检测的标记分子，该分子能产生可检测的信号，例如一种荧光蛋白或一种能被容易地可视化的蛋白，或能被特异性的抗体或酶，例如LacZ或α-半乳醣苷酶识别，并被容易地检测分析的蛋白。
选择的酵母的菌株具有可选择的标记，此标记赋予该菌株在不支持不表达可选择的标记的细胞生长的条件下生长的能力，例如，可选择的标记是一种提供一种必需的营养物质的酶，其中进行相互作用检测分析的细胞缺乏这种酶，并且选择培养基缺乏这种营养物质。报告基因处于自身启动子的调控之下，此启动子天然包含一个DNA结合蛋白的结合位点，或者在异源或合成启动子的调控之下。
具有可分离的结合和转录激活结构域的转录调节因子蛋白的例子包括，例如，S.cerevisiae的GAL4、GCN4和ARD1蛋白，以及人雌激素受体。用于融合蛋白的DNA结合结构域和激活结构域不需要来自同一种转录调节因子。例如，可使用一个GAL4或一个LEXA DNA结合结构域，或者可使用一个GAL4或单纯疱疹病毒VP16激活结构域。在一个实施方案中，酵母转录因子GAL4通过蛋白-蛋白相互作用被重建，并且宿主菌株是GAL4的突变体。其它根据本说明书的公开内容的实施方案对本领域的技术人员是已知的。
为了有利于分离被编码的相互作用伴侣，融合构造可以进一步包含编码亲和力标记的序列，例如谷胱甘肽-S-转移酶或麦芽糖-结合蛋白或一种HR或HRt抗体的抗原表位，用于亲和纯化以结合到HR-IP。其中IP是一种核酸，亲和力标记可以是一种与核酸IP互补的杂交核苷酸序列。
发生相互作用的宿主细胞可以是报告基因的转录能在其中发生并被检测到的任何细胞，既可以是原核细胞也可以是真核细胞，包括但不限于哺乳动物(例如猴子、鸡、小鼠、大鼠、人、牛)、细菌、和昆虫细胞，优选酵母细胞。编码并能表达结合结构域融合蛋白、转录激活结构域融合蛋白和报告基因产物的表达构造，通过包含表达构造的细胞的交配，或者通过例如细胞融合、转化、电穿孔或显微注射，被在宿主细胞中提供。使用的宿主细胞不应表达结合与被DNA结合结构域融合蛋白所识别位点相同的DNA位点的内源的转录因子。此外，宿主细胞应是突变型，或者换句话讲，缺乏本检测分析中所使用的报告基因的内源的、功能性的形式。
用于在酵母中表达两种融合蛋白的多种载体和宿主菌株是已知的，并且能被使(见美国专利5,986,055，公布于1999年11月16日)。例如，酵母菌株或由此制造的衍生物菌株，它们中能被使用的是N105，N106，N1051，N1061，和YULH，Y190MATa，ura3-52，his3-200，lys2-801，ade2-101，trp1-901，leu2-3，112，gal4.δ.，gal80.δ.，cyh.sup.r 2，LYS2∷GAL1.sub.UAS-HIS3.sub.TATA HIS3，URA3∷GAL1.sub.UAS-GAL1.sub.TATA-lacZ.CG-1945MATa，ura3-52，his3-200，lys2-801，ade2-101，trp1-901，leu2-3，112，gal4-542，gal80-538，cyh.sup.r 2，LYS2∷GAL1.sub.UAS-HIS3.sub.TATAHIS3，URA3∷GAL1.sub.UAS17mers(x3)-CYC1.sub.TATA-1acZ.Y187MAT-.α.，ura3-52，his3-200，ade2-101，trp1-901，leu2-3，112，gal4.δ.，gal80.δ.，URA3∷GAL1.sub.UAS-GAL1.sub.TATA-lacZ.SFY526MATa，ura3-52，his3-200，lys2-801，ade2-101，trp1-901，leu2-3，112，gal4-542，gal80-538，can.sup.r，URA3∷GAL1-lacZ.HF7cMATa，ura3-52，his3-200，lys2-801，ade2-101，trp1-901，leu2-3，112，gal4-542，gal80-538，LYS2∷GAL1-HIS3.URA3∷GAL1.sub.UAS17MERS(X3)-CYC1-lacZ..YRG-MATa，ura3-52，his3-200，lys2-801，ade2-101，trp1-901，leu2-3，112，gal4-542，gal80-538 LYS2∷GAL1.sub.UAS-GAL1.sub.TATA-HIS3，URA3∷GAL1.sub.UAS17mers(x3)-CYC1-1acZ。
质粒能够在宿主酵母细胞中自主复制，并且优选地能够在大肠杆菌中增殖。质粒包含一种指导DNA结合或激活结构域融合基因转录的启动子，和一种转录终止信号。质粒也优选地包含一种可选择的标记基因，允许对包含质粒的细胞的选择。质粒可以是单拷贝的或多拷贝的。有酵母着丝粒的单拷贝酵母质粒也可以被用于表达激活和DNA结合结构域融合蛋白。在另一个实施方案中，融合构造可以经由同源重组，使用本领域的技术人员按照本说明书的公开内容已知的方法被直接引入酵母染色体中。
编码分离的融合蛋白的质粒可以通过共转化被引入包含一个或多个报告基因的单个宿主细胞中(例如，一种单倍体酵母细胞)，以进行对HRt-IP相互作用的检测分析。可供选择地，两种融合蛋白通过交配(例如对酵母细胞)或细胞融合(例如对哺乳动物细胞)被引入单个细胞中。在交配型检测分析中，已经分别用一种结合结构域融合表达构造和一种激活结构域融合表达构造转化的相反交配型的单倍体酵母细胞的结合，将两种构造传递到同一个双倍体细胞中。酵母菌株的交配型可以通过HO基因的转化而被操纵。
一方面，酵母相互作用交配检测分析通过使用两种不同类型的宿主细胞，酵母Saccharomyces cerevisiae的菌株型a和α，而被应用。一种酵母细胞，例如a菌株细胞，包含HRt核苷酸序列和转录激活因子如GAL4的DNA-结合结构域的融合序列。在这种酵母细胞中表达的杂交蛋白能够识别报告基因上的DNA-结合位点。第二种酵母宿主细胞，例如α菌株细胞，包含通过表1提供的数据而被鉴别的核苷酸序列，该序列融合到转录激活因子的激活结构域上。在一个实施方案中，融合蛋白构造以质粒的形式被引入到宿主细胞中。
噬菌体载体可以被用于表达DNA结合结构域和/或激活结构域融合蛋白。与质粒载体相比，从噬菌体载体通常可以更快更容易地制备文库。
报告基因包括例如URA3、HIS3、lacZ、MEL1、GFP、荧光素酶、LEU2、LYS2、ADE2、TRP1、CAN1、CYH2、GUS、CUP1、或CAT。LEU2、LYS2、ADE2和TRP1的表达通过在特别定义的培养基中的生长而得到检测；GUS、lacZ、MEL1、和CAT可以通过熟知的酶检测分析法而得到检测；CAN1和CYH2通过在存在刀豆氨酸和放线菌酮的情况下的选择而得到检测。GFP通过其天然荧光得到检测。在另一个实施方案中，报告基因的转录通过本领域的技术人员按照本说明书的公开内容已知的连接复制检测分析法而得到检测。在另一个实施方案中，报告基因的表达通过免疫测定而得到检测。报告基因lacZ的活性通过测量可检测的信号如X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)而得到检测。
在无转录激活结构域融合蛋白的情况下，DNA结合结构域融合蛋白产生的转录活化引起的假阳性通过阴性选择得到预防或减少。
在本发明的一个实施方案中，编码相互作用伴侣对的DNA序列通过分别进行反应进行扩增而被分离。扩增通过本领域的技术人员已知的聚合酶链式反应进行，所述扩增反应使用对DNA-结合结构域融合序列或激活结构域融合序列具有特异性的寡核苷酸引物对。本领域已知的其它扩增方法可以被使用，包括但不限于连接酶链反应，使用Qβ，复制酶，等等。
双杂交筛选II包装B筛选双杂交筛选II包装B体系，购自Dualsystems Biotech AG ofZurich，Switzerland，被用于鉴定人角质化细胞中的HR相互作用伴侣。这种筛选方法的详尽描述可自Dualsystems Biotech获得，可通过发送电子邮件请求到info@dualsystems.com或经由因特网自http//www.dualsystems.com获得。这种筛选方法通常涉及的步骤有构建并验证一种诱饵载体；转化大规模的文库并选择阳性克隆；分离并限制阳性克隆的分析；再转化并测试克隆的诱饵可靠性；对诱饵可靠克隆测序。精确的载体文库(pACT2)以及使用的全核苷酸序列的信息可见于Clontech的网站，http//www.clontech.com。
HR-IP复合物的纯化HR-IP复合物可以通过本领域已知的标准方法从天然来源或表达复合物的重组宿主细胞中被分离并纯化，包括但不限于柱层析(例如，离子交换、亲和、凝胶排阻、反相高压、快速蛋白液相等)、差速离心、差别溶解度、或其它在蛋白复合物或蛋白-核酸复合物纯化中使用的标准技术。相互作用蛋白的氨基酸序列可以从编码它的嵌合基因的核酸序列中被推断出来。从而，所述蛋白质或其衍生物可以通过本领域已知的标准化学或重组方法得到合成。
第三方面包含HR-IP的激动剂和/或拮抗剂化合物的制剂和产品及其给药方法在本发明的另一方面，被证实对无发蛋白相互作用复合物具有激动剂和/或拮抗剂活性的化合物，可以被配制到用于给哺乳动物皮肤带来一种或多种实质性的美化和/或改善有益效果的组合物或产品中。组合物中通过本发明的方法鉴定的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质的浓度，可以是在一个广泛的范围内，最多可以是饱和溶液，优选地为按重量计0.01％至99％。有效施用的最大量受活性物质渗入皮肤的速率限制。通常，有效量的范围是每平房厘米皮肤100微克至3000微克。组合物每天可以被施用一次或两次，或者甚至更频繁地施用，持续从2周至6个月的一段时间以获得在美化和/或改善哺乳动物皮肤上的可察觉的效果。
组合物可以通过任何适用的方法施用至局部。被局部地施用到皮肤的局部组合物可以采用的形式包括溶液、油、乳膏、油膏剂、凝胶、洗剂、洗发剂、免洗型和漂洗型毛发调理剂、乳液、清洁剂、润湿剂、喷雾剂、皮肤贴剂等。组合物可以包括一种无毒的皮肤病学可接受的、适于在皮肤上涂敷的媒介物或载体。合适载体的实施例为丙酮、醇类、或一种能有效地递送活性化合物的乳膏、洗剂或凝胶。此外，可以在媒介物中加入一种渗透增强剂以进一步增强制剂的效果。
本发明的包含拮抗剂活性物质或激动剂活性物质的组合物和产品，应被施用到哺乳动物，尤其是人类皮肤的一个区域，该区域期望获得实质性的美化和/或改善有益效果。例如，女性可以选择施用包含HR-IP激动剂的组合物到她面部、臂部、颈部的一部分，或皮肤的任何其它期望获得实质性的美化和/或改善的区域。同样的，男性可以通过施用这种组合物到需要治疗的区域或期望给予治疗的区域以提高他的皮肤的健康和活力。当任何如上文所定义的实质性的美化和/或改善有益效果被察觉到时，即证明了哺乳动物皮肤得到了美化和/或改善。
取决于选择的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质、所得组合物设计的用途和配方设计者的需要和/或能力，本领域的普通技术人员将能够选择合适的辅助成分和量配制到上述组合物中，并且不用进行不适当的试验。实际上，本发明的产品和制剂的组合的和系统的使用，可用于美化和改善其所施用到的哺乳动物皮肤，尤其是人类皮肤的状态。依照本发明的这一方面，所述产品和制剂可采用各种形状和形态，这取决于本发明专业人员的具体需要和/或能力，以及其应用所追求的目的。在任何情况下，据信依照本发明施用所述组合物可导致细纹和皱纹的显著减少，以及哺乳动物皮肤，尤其是人类皮肤总体外观的改善。
此外，掺入到本发明的产品和制剂的拮抗剂活性物质和/或激动剂活性物质化合物的量和/或比率将取决于使用此产品和/或制剂所期望达到的目的。尽管如此，在本发明的一个方面中，本文所公开的产品和制剂将包括为约0.0001％至约10％，优选0.05％至约10％，更优选约0.1％至约5％，最优选约0.5％至约3％的或者拮抗剂活性物质或者激动剂活性物质的化合物。在本发明的另一个方面中，本文所公开的产品和制剂还将包括一种拮抗剂活性物质和一种激动剂活性物质化合物的组合。在上述情况中，本发明的产品和制剂包括约0.05％至20％，优选约0.1％至约3％的拮抗剂活性物质化合物，和约0.01％至约5％，优选约0.05％至约1％的激动剂活性物质化合物。
依照本发明的另一个方面，公开了包含本发明的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物的个人护理产品。适宜但非限制性的产品形式包括乳液、凝胶、洗液、乳膏、油膏、摩丝、喷剂、雾剂、棒状物、粉末、擦拭物以及它们的组合。包含拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物的合适的个人护理产品包括但当然地不限于洗手皂、抗菌洗手液、沐浴液、漱口水、牙膏、沐浴胶、洗发剂、护发剂、润手乳液和/或爽身水、护颜乳液、面霜、粉底、唇膏、胭脂、除臭剂，以及它们的组合。在本发明的另一个方面，本发明的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物被掺入到一种或多种家庭护理产品中。实际上，适用于本发明目的的家庭护理产品包括，但不限于硬质表面清洁剂、除臭剂、织物护理组合物、织物清洁组合物、人工盘碟洗涤剂、自动盘碟洗涤剂、地板护理组合物、厨房清洁剂或消毒剂、浴室清洁剂或消毒剂，以及它们的组合。
在本发明的另一方面，本发明的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物被单独地和/或组合地掺入一种皮肤护理产品。在本发明的一个方面，护肤产品包含一种皮肤病学可接受的载体，以便于将本发明的化合物安全递送到哺乳动物皮肤所需的区域上。在本发明的另一方面中，本发明的护肤产品包括某些辅助成分。所述辅助剂包括，但当然地不限于抗微生物和抗真菌活性物质、表面活性剂、脱屑活性物质、抗痤疮活性物质、抗皱纹活性物质、抗萎缩活性物质、抗氧化剂、自由基清除剂、螯合剂、类黄酮、抗炎剂、抗蜂窝组织剂、局部麻醉剂、晒黑活性物质、防晒活性物质、调理剂、增稠剂、防粘剂、芳香剂、皮肤增感剂、止汗剂，以及它们的混合物。实际上，每种上述辅助成分的完整描述和实施例阐述于转让给The Procter and Gamble Company，Cincinnati，Ohio的美国专利6,294,186中，并且将该文献引入本文以供参考。在本发明的另一个方面中，可将本文所公开的化合物掺入到护肤产品的纺织或无纺擦拭物形式中，尤其是由Procter and Gamble Company，Cincinnati，Ohio所销售的上述产品。在本发明的另一方面，本文公开的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物被掺入一种局部的皮肤护理产品中，包括但不限于洗剂、乳膏、凝胶和油膏，尤其是那些被The Procter and Gamble Company ofCincinnati，Ohio销售的产品。实际上，本发明的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物被掺入的合适的皮肤护理产品的精确形式，将取决于所述产品配方设计者的需要和/或能力。
化合物、组合物和产品的施用在本发明的另一方面，本文公开的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物被配制到组合物和/或产品中，施用到哺乳动物，尤其是人类的皮肤上。在本发明的一个方面，本文所公开的局部用制剂，包括安全有效量的美化和/或改善药剂和其它适合于增强其所施用到的哺乳动物皮肤外观的成分。
所谓“安全有效量”是指化合物或组合物的掺入量足够高，以致可显著改善皮肤外观，但又足够低，以致可阻止那些实际上会降低皮肤外观和美感的副作用。实际上，用于本发明化合物和/或组合物中的试剂的安全有效量将根据下列一种或多种因素而变化要求治疗的皮肤特性、要求治疗的皮肤年龄和物理状况、任何存在的皮肤状况的严重程度、治疗计划持续的时间、任何协同治疗的存在和特性、打算使用的具体试剂、所用的具体赋形剂以及本发明化合物和组合物的配方设计者的需要和/或能力。尽管如此，通过用动物模型进行的常规实验，可确定将掺入到本发明组合物中的该试剂的适宜量，其中所述试剂优选为本文所公开的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物。实际上，上述的一种模型包括，但当然地不限于无损伤且年老的鼠科哺乳动物的皮肤模型，且尤其是人类的皮肤模型。
本发明的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物可以系统地施用，例如口服和/或非肠道使用，包括皮下或静脉注射，和/或鼻内使用，但尤其是透皮使用。在本发明的一个方面中，可将本文所公开的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物以单位剂型直接施用到需要治疗的哺乳动物皮肤上。掺入到单位剂型中的本发明化合物的确切量，将取决于上文所公开的一种或多种因素，且尤其是本发明组合物配方设计者的需要和/或能力，以及需要治疗的哺乳动物皮肤特性。
在本发明的另一个方面，供本发明化合物和组合物使用的剂型还包括鼻内使用、透皮使用、直肠使用、舌下使用、口服，以及它们的组合。在本发明的另一个方面，可使用适用于本发明的一种或多种载体，以实现本发明化合物和组合物的给药，且尤其是用于注射或外科植入。所述载体包括，但当然地不限于水凝胶、可控或持续释放的装置、聚乳酸、胶原基质，以及它们的组合。在本发明的另一方面，植入装置被涂敷以本文公开的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物和/或制剂。在本发明的另一个方面，将本文所公开的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物和/或制剂溶于缓冲剂中，并和胶原凝胶混合，用于涂敷在植入装置的多孔末端上。
实际上，在本发明的另一个方面中，可口服施用本文所公开的化合物。在该方面中，适于施用本发明化合物和制剂的口服形式包括，但当然地不限于脂质体、类脂乳液、蛋白质支架、其它赋形剂，以及它们的组合。本文所用术语“赋形剂”旨在包括任何本领域普通技术人员已知的生理惰性、药理无活性的物质。适用于本发明的赋形剂应与要使用的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质的具体成分的物理和化学特性，以及需要施用的哺乳动物皮肤基质相容。在本发明的一个方面，适用于本发明的赋形剂包括，但不限于聚合物、树脂、增塑剂、填充剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂体系、表面活性剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、药品级染料、颜料，以及它们的组合。
制品的制造在本发明的另一方面，包含本发明的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物和/或一种或多种上述产品的制品旨在用于个人护理、皮肤护理和家庭护理。本发明的制品包括一种或多种如上文所述的产品，所述制品可被装入带有一套消费者使用说明的容器或分配器中。本发明的制品典型地包括(a)容器或分配器，(b)产品，和(c)一套使用说明，以将所述产品施用到适宜基质上，以给哺乳动物皮肤带来实质性的美化和改善有益效果。适用于本发明制品的容器和/或分配器包括，但不限于PET瓶和盆、流动包装袋、泡沫分配器、喷雾分配器，以及它们的组合。重申，本发明的制品还包括一套与容器相结合的使用说明。“与...相结合”是指可直接将该使用说明本身印刷在容器或分配器上，或者该使用说明可以不同的形式呈现，包括，但不限于小册子、印刷广告、电子广告和/或语言通信，以便使该制品的消费者知道这套使用说明。
这套使用说明典型地包括与使用所述产品，以将本发明的拮抗剂活性物质或激动剂活性物质化合物施用在需要治疗的适宜基质上有关的指导。这套使用说明可进一步包括将本发明化合物保留在所处理的基质上而不会将该化合物从所处理的基质上漂洗掉或用别的方法去除的指导。尽管如此，与本发明制品包括在一起的准确的使用说明，将取决于需包括使用说明的具体化合物和产品，以及该产品所计划施用到的基质。在本发明的另一方面，本制品中包括的说明书反映了本文公开并受权利要求书保护的方法。
第四方面使用化合物组合物和产品的方法在本发明的另一方面，公开了使用受权利要求书保护的化合物、组合物和产品以给哺乳动物皮肤带来一种或多种实质性的美化和/或改善有益效果的方法。在本发明的一个方面，公开了用以改善和/或美化哺乳动物皮肤的方法。所述方法包括下述步骤施用一种或多种激动剂和/或拮抗剂化合物到期望获得改善和/或美化的哺乳动物皮肤的一部分，并任选地在给药后(如果是局部给药)移除所述化合物。在本发明的另一方面，公开了一种施用包含本发明的激动剂和/或拮抗剂化合物的组合物的方法。所述方法包括下述步骤施用所述组合物或产品到期望获得美化和/或改善的哺乳动物皮肤的一部分，并任选地在给药后(如果是局部给药)移除所述组合物或产品。实际上，本文所公开方法的系统的使用，可给使用了本文所公开方法的哺乳动物，尤其是人类皮肤带来一种或多种实质性的美化和/或改善有益效果。
在本发明的另一方面，公开了使用本文所述的化合物、组合物和/或产品治疗哺乳动物表皮皮肤的方法。所述方法通常涉及下述步骤施用本文公开的化合物、组合物和/或产品到期望获得美化和/或改善的一部分哺乳动物表皮皮肤，并任选地在给药后(如果是局部给药)移除所述化合物、组合物和/或产品。
在本发明的另一方面，公开了一种使用人鞘脂类激活因子蛋白美化和/或改善哺乳动物皮肤的方法，所述皮肤为或者表皮或者其它部分皮肤。所述方法包括下述步骤施用人鞘脂类激活因子蛋白到期望获得美化和/或改善的哺乳动物皮肤的一部分，并任选地在给药后(在局部给药的情况下)移除所述化合物。应注意的是，本发明者以前已经公开了与GeneBank访问号M60255相联系的人鞘脂类激活因子蛋白是一种无发蛋白的相互作用伴侣，无发蛋白抑制和/或刺激毛发生长。然而，上文中人鞘脂类激活因子蛋白未被公开可用于哺乳动物皮肤的美化和/或改善。
依照本发明的另一方面，公开了使用本发明的化合物、组合物和/或产品控制体重增加和/或减少的方法。所述方法同样通常涉及下述步骤施用本化合物、组合物和/或产品到期望获得体重控制的哺乳动物的一个区域，并任选地在给药后(如果是局部给药)移除所述化合物、组合物和/或产品。不希望受理论的约束，据信本发明的无发蛋白相互作用复合物，具体地讲LXR，影响哺乳动物体重的增加和减少。这种相信基于已公布的文献指出无发蛋白也在脂肪中表达，并且其自身表达在高血糖症发展期间是下调的。参见Nadler等人(2000)；The Expression ofadipogenic genes is decreased in obesity and diabetes mellitus，Proc Natl Acad Sci(USA)97，11371-11376。此外，其它文献已经公开了LXR在脂肪中表达丰富，并且与脂肪形成的控制相关。实际上，LXR通过其上调类固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的能力，介导脂肪合成酶(包括乙酰CoA羧化酶、脂肪酸合成酶、硬脂酰-CoA脱氢酶等)的上调。LXR还已经被公开上调脂蛋白脂肪酶的表达。参见Schultz JR，等人，Role of LXRs in control of Lipogenesis，Tularik Inc.，SouthSan Francisco，California 94080(USA)。
其它文献已经揭示，氧固醇作为内源肝脏X受体(LXR)配体的发现和随后在小鼠中进行的基因打靶研究提供了LXR在胆固醇代谢中起重要作用的有力证据。这里一种合成的、非类固醇的LXR-选择性激动剂系列，用T0314407和T0901317表示，显示了LXR的一种新的生理作用。小鼠和仓鼠口服T0901317显示，LXR激活主要脂肪酸生物合成基因(脂肪生成)的协同表达，并增加两种动物中的血浆甘油三酯和磷脂水平。细胞培养和动物中的补充研究说明血脂的增加经由LXR介导的固醇调节元件-结合蛋白1(SREBP-1)脂肪合成程序的诱导。参见Stulnig等人2002，Novel roles of liver X receptors exposed by geneexpression profiling in liver and adipose tissue，Mol Pharmacol.62，1299-1305。Stulnig等人2002，Liver X receptors downregulate11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 expression andactivity，Diabetes 51，2426-2433。Ross等人2002，Microarrayanalyses during adipogenesisunderstanding the effects of Wntsignaling on adipogenesis and the roles of liver X receptoralpha in adipocyte metabolism，Mol Cell Biol 22，5989-5999。Matsuzaka等人2002，Cloning and characterization of a mammalianfatty acyl-CoA elongase as a lipogenic enzyme regulated bySREBPs，J Lipid Res 43，911-920。Zhang等人2001，Regulation oflipoprotein lipase by the oxysterol receptors，LXRalpha andLXRbeta，J Biol Chem 276，43018-43024。Yoshikawa等人2001，Identification of liver X receptor-retinoid X receptor as anactivator of the sterol regulatory element-binding protein 1cgene promoter，Mol Cell Biol 21，2991-3000。Laffitte等人2001，LXRs control lipid-inducible expression of the apolipoprotein Egene in macrophages and adipocytes，Proc Natl Acad Sci USA 98，507-512。
在本发明的另一方面，公开了使用本发明的化合物、组合物和/或产品治疗糖尿病的方法。所述方法包括下述步骤施用本发明的化合物、组合物和/或产品到需要治疗糖尿病的哺乳动物，并任选地在给药后(如果是局部给药)移除所述化合物、组合物和/或产品。
制备性实施例实施例1-无发蛋白的相互作用伴侣(IP′s)本实施例使用酵母双杂交技术提供无发蛋白(HR)相互作用伴侣(HR-IP)。相应于HR蛋白的C-末端部分(氨基酸残基490至1182，下文中表示为HRt)的HR cDNA，被克隆到双杂交诱饵载体上以便在酵母中表达Lex A DNA BD-HRt。用以激活结构域(AD)载体建立的人角质化细胞cDNA文库转化表达BD-HRt的酵母细胞。本发明提供的合成的相互作用伴侣被列于表1中，包括涉及细胞周期、细胞分化、转录、核转运、信号转导、细胞完整性和线粒体装置的分子。因此，HRt(和HR)表现为连接良好、多功能的蛋白质。
材料小鼠早期毛发生长初期cDNA文库由Procter & Gamble人员使用标准技术构建。大肠杆菌表达质粒pET32a(目录号69015-3；Novagen′spET原核表达体系的组分质粒)和大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞(目录号69387-3)购自Novagen(Madison，WI)。定制的寡核苷酸由Procter & Gamble人员使用标准技术合成或由BD BiosciencesClontech(PaloAlto，CA)制造。DNA序列测定由Procter & Gamble人员使用标准技术进行或外包给Seqwright Inc(Houston，TX)。DNA序列分析和数据库同源性搜索使用SeqWeb 1.2版进行(与WisconsinPackage 10.1版联合使用)。多种微生物培养基购自BD BiosciencesClontech(PaloAlto，CA)和DIFCO Becton Dickinson MicrobiologySystems(Sparks，MD)。多种用于培养大肠杆菌和酵母的预制培养平板购自Gibson Laboratories(Lexington，KY)。Matchmaker two-hybridSystem 3(目录号K1612-1)、pre-transformed human brainMatchmaker cDNA library in pACT2 vector(目录号HY4004AH，LotNo.9070550)、Advantage 2 PCR kit(目录号K1910-1)、和Matchmaker AD LD-insert screening amplimer sets(目录号9103-1)，购自BD Biosciences Clontech(PaloAlto，CA)。雄性小鼠(C3H品系)购自Harlan Labs(Indianapolis，IN)。NAIR lotion hairremover(4分钟方案)购自当地的一个Walgreens商店。Dolgel凝胶(5％异丁苯丙酸)购自Life Extension International Center Inc.(Coral Gables，FL)。限制性内切酶、T4 DNA连接酶、分子量标记、琼脂糖和其它常用分子生物学试剂购自Life Technologies(Gaithersburg，MD)。
小鼠无发(HR)cDNA的克隆和特性描述设计了寡核苷酸以对所需的小鼠HR cDNA部分进行PCR-扩增，这基于公布的小鼠HR的序列“Structure and Expression of the HairlessGene of Mice，”Begona，M.，等人，J.Proc.Natl.Acad.Sci，USA917717-7721，1994)(GenBank序列号Z32675)。寡核苷酸还被设计包含限制性内切酶的识别位点以用于对PCR产物的后续操作，所述限制性内切酶如Eco RI、Xba I、Not I和Bam HI限制性内切酶。具体地讲，Eco RI和Not I的限制性内切酶位点(在下面显示的寡核苷酸序列中用下划线和斜体字注明)对后来的克隆和操纵是尤其有用的。正向和反向寡核苷酸引物对5′-CCG GAA TTC GTC ACC CAG TGC CAA AGC TGT(SEQID NO100)和5′-CGG GAT CCT CTA GAG CGG CCG CTT ATT ATT TAGCTT CCT GTA ACG CCCC(SEQ ID NO101)被用于PCR扩增HR cDNA，所述HR cDNA对应于来自小鼠早期毛发生长初期cDNA文库的HR的核苷酸1845至3923。PCR扩增使用Advantage 2 PCR试剂盒提供的标准PCR规程进行。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，并发现有预期大小的产物(约2Kb)。PCR产物用Eco RI和Not I限制性内切酶切割。限制性酶切产物进行凝胶纯化并插入pET32a的Eco RI和Not I位点，以便插入产生一种与上游序列的框内融合。产生的质粒被命名为pET32a-HRt。这种质粒被用于核苷酸序列的确认以及大肠杆菌中的蛋白表达。核苷酸序列显示在三个位点(核苷酸位点2166，从C到T的变化引起密码子从AGC到AGT的变化；核苷酸位点2611，从C到T的变化引起密码子从GAC到GAT的变化；核苷酸位点2916，从T到C的变化引起密码子从CCT到CCC的变化)与已公布的序列相比发生了改变(SEQ ID NO102)。SEQ ID NO103的氨基酸数1对应于HR蛋白C-末端部分的氨基酸残基490。这种截短的HR(HRt)cDNA对应于HR蛋白C-末端部分的氨基酸残基490至1182。
尽管如此，上文所引的变化均没有导致氨基酸的变化。本质上本文克隆的HRt被预测编码一种与小鼠HRt相同的蛋白产物。锌指区域(氨基酸595-620)和三个PEST结构域位于HR的490至1182氨基酸部分。本发明者预期PEST结构域(区域522至546得分12.26，区域709至722得分7.56，而区域729至744得分21.71)对HR功能是重要的。小鼠HR大于80％的部分与人类HR相同。PEST序列常常被发现作为快速蛋白降解的信号。PEST序列是组成性的或条件性的信号。组成性是指“同样的，”而条件性的是指“在修饰的基础上”(例如磷酸化、光诱导的顺式-反式异构化、配体结合等)。为了客观地测定一种蛋白是否包含PEST区域，M.Rechsteiner和S.W.Rogers开发了一种被称为PEST-FIND的计算机程序(PEST Sequences and Regulation byProteolysis，TIBS 21，July 1996)。算法在PC/GENE(OMIGA)中是可利用的，所述算法定义PEST序列为一种以任何顺序或组合包含至少一个Pro、Glu/Asp和Ser/Thr的12个或更多氨基酸残基的亲水延伸。它们还必须与碱性氨基酸残基Lys、Ala或His侧面相接，但是碱性残基不允许出现在PEST序列中。PEST-FIND产生为约+50至-50的一个分数。根据定义，＞0的分数指示一个可能的PEST区域，但是＞+5的值指示高度可能的PEST区域。本文提到的PEST区域也有众多可能的蛋白激酶C和酪蛋白激酶II磷酸化位点。上文引用的PEST分数处于文献中曾经报道的最好结果内。
pET32a-HRt也是一种可诱导的大肠杆菌表达质粒。蛋白表达使用供应商提供的大肠杆菌表达标准规程进行研究。对分离自被诱导蛋白表达的四倍体大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-HRt克隆的总蛋白进行的SDS-PAGE(10％至20％)分析显示，在诱导2h后即有符合HR t融合蛋白的期望大小的蛋白产物的高水平表达。对照品系大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a与大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-HRt克隆相比，未表现出在高分子量区域诱导了任何蛋白的表达。这项研究证实了来自HRt插入片断的蛋白产物的表达。此蛋白产物不是在非变性条件下可复性的。
克隆HRt到GAL4结合结构域(BD)酵母双杂交(Y2H)载体上来自pET32a-HRt的HRt插入序列被切下成为EcoRI-Xho I片段(就在HRt插入序列附近即有一个唯一的的Xho I位点)，并插入到Y2H-BD载体pGBKT7(目录号K1612-B；Matchmaker two-hybrid System3的一个组分(目录号K1612-1)BD Biosciences Clontech，PaloAlto，CA)的Eco RI-Sal I位点以获得pGBKT7-HRt，在pGBKT7-HRt中HRt被框内融合到GAL4 DNA BD中(此质粒同样被命名为GAL4 BD-HRt)。此质粒在对HRt-IP相互作用(参见实施例2和3)的激动剂和拮抗剂的S.cerevisiae AH109菌株筛选中与AD-IP结合。然而，为了首先筛选IP，来自GAL BD-HRt的HRt被切下并插入到双杂交诱饵载体(此质粒同样被命名为LexA BD-HRt)上。
HRt相互作用的人角质化细胞cDNA文库筛选以pACT2载体建立的Clontech Human Keratinocyte GAL4 cDNA文库(复杂性2.5×106)被用于筛选HRt相互作用蛋白。一种Leu-，Trp-酵母菌株具有酵母双杂交相互作用的HIS3和LACZ报告基因(菌株L41)，首先用LexA BD-HRt质粒)转化此菌株，使之具有Trp+显型。筛选所得的L41/LexA BD-HR转化株以确保LexA BD-HRt蛋白的表达，并筛选缺乏对报告基因HIS3和LACZ的自主激活的菌株。此菌株被用角质化细胞AD-cDNA文库转化并置于Trp-Leu-His-平板上以选择相互作用阳性克隆。选择平板上出现的菌落随后被检测其在X-GAL平板上的LACZ表达。共有90个菌落被鉴定。从此90个克隆中提取AD-质粒并再检测其HRt诱饵可靠性。五十四个分离的克隆被证实是阳性的。预期阳性克隆包含与BD-HRt相互作用的AD-IP(相互作用伴侣)。为了证实IP的特征，对IP进行了测序，并使用SeqWeb 1.2版(结合WisconsinPackage Version 10.1)进行匹配到人基因组数据库的DNA序列分析和同源性数据库检索。
若干个与HRt相互作用的人相互作用伴侣得到鉴定，如表1中所列。具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ IDNO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14和SEQ ID NO15的蛋白似乎是新蛋白。
表1BD-HRt(小鼠)与以AD-载体建立的人角质化细胞c-DNA文库的相互作用*表示AD-HRt(小鼠)与BD-VDR(小鼠)的相互作用
实施例2-筛选破坏酵母菌株中BD-HRt＞＜AD-IP相互作用的化合物AH109被用于化合物筛选。AH109(Matchmaker双杂交体系3的一个组分(目录号K1612-1)BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)是一种合适的Y2H相互作用的酵母报告基因菌株。它包含ADE2、HIS3、lacZ和MEL1报告基因，每个报告基因使用不同的GAL4-响应启动子。多种Y2H重组质粒通过使用乙酸锂介导的酵母转化规程被转入酵母菌株AH109，该规程由Y2H体系的供应商(BD Biosciences Clontech，PaloAlto，CA)提供。组合的AD和BD质粒的转化细胞基于它们能在Leu和Trp双去除培养基(DDO)上生长的能力而得到选择。
AD和BD融合蛋白间的相互作用(Y2H相互作用)将使GAL 4蛋白的AD和BD结构域彼此更加靠近，从而重建一种功能性的GAL 4蛋白。这将允许转化细胞在Leu、Trp、His、Ade四去除培养基(QDO)上生长。在QDO上的生长率，以及MEL1(α-半乳糖苷酶)或lacZ(β-半乳糖苷酶)活性的测量将提供对Y2H相互作用程度的或多或少的定量测量。
AH109(BD-HRt＞＜AD-IP)菌株在Leu、Trp、His、Ade QDO上，而不在Leu、Trp DDO上的生长抑制，被用作一种对破坏HRt-IP相互作用的化合物的初筛。筛选了多种化合物文库。以新鲜培养的酵母细胞接种具有200μl的QDO和DDO培养基的微平板，所述酵母细胞在650nm(OD650)的光密度为0.01至0.03，用多种受试化合物处理该微平板。受试化合物20mM的贮备液在DMSO中制备，检测时的终浓度为400μM。平板在25℃下，无摇动进行培养。在加入化合物后进行OD650的首次测量，并在随后的8至10天中进行记录。预期未加入化合物的孔(阳性对照)达到饱和生长(在培养的3天内达到约0.7)。仅有培养基，无细胞培养的孔预期在检测分析的整个时期内保持最初的OD650值(～0.03)。相对于一种不相关的Y2H相互作用(p53＞＜T抗原)检测分析，测得来自此检测分析的阳性化合物。pGBKT7-53和pGADT7-T质粒被用于建立一种不相关的(对HRt)Y2H相互作用，其中p53蛋白与T抗原相互作用。这些质粒是Matchmaker双杂交体系3(目录号K1612-1，BDBiosciences Clontech，Palo Alto，CA)的部分。
实施例3-筛选增强或破坏BD-HRt＞＜AD-IP相互作用的化合物在多种受试化合物存在时生长于Leu、Trp、His TDO中的AH109(BD-HRt＞＜AD-IP)菌株的α-半乳糖苷酶活性的增加或降低，被用于筛选BD-HRt＞＜AD-IP相互作用的激动剂或拮抗剂。筛选了多种化合物文库。
以新鲜培养的酵母细胞接种具有TDO培养基的微平板，所述酵母细胞在650nm(OD650)的光密度为0.05，用多种受试化合物在100至400uM或用赋形剂对照(DMSO)处理该微平板。受试化合物10至20mM的贮备液在DMSO中制备，检测时的终浓度为100至400μM。最终的包含细胞、TDO和化合物(或单独的DMSO)受试混合物被调节为100ul，并且DMSO的量被保持在或低于2％。平板在25℃下，无摇动培养3至4天。平板在加入检测分析缓冲剂之前被短暂地搅拌以获得均一的细胞悬浮液。报告基因酶(α-半乳糖苷酶)活性的检测分析通过在30摄氏度下与100ul检测分析缓冲液[包含0.025M对硝苯基α半乳糖苷(PNPG)的乙酸缓冲液(0.2M，pH 4.5)]一起培养2至5小时而进行。培养时间可以减少或增加，取决于对给定的BD-HRt＞＜AD-IP对的α-半乳糖苷酶活性程度。平板被短暂地搅拌以获得均一的细胞悬浮液，并测量在650nM(OD650)ref和410nm(OD410)ref的吸光度。OD650ref作为细胞密度的基准值，而OD410ref作为在检测分析中随产物(对硝基酚)生成而出现的黄颜色出现之前的基准值。为检测颜色发展，加入100ul的0.1M碳酸钠溶液，并在静置至少1分钟后测量OD410exp。相对α-半乳糖苷酶活性使用以下关系式进行计算相对活性＝[OD410exp-OD410ref×0.67]/OD650ref
相对于一种不相关的Y2H相互作用(p53＞＜T抗原)检测分析，检测来自此检测分析的阳性化合物以确保此化合物是BD-HRt＞＜AD-IP相互作用特异性的。
实施例4-筛选与AD-HRt的相互作用我们已经观察到，对某些IP如甲状腺激素受体(TR)，在AD-HRt＞＜BD-TR中的相互作用远强于在BD-HRt＞＜AD-TR构造中的相互作用。基于此观察结果，我们猜想是一些IP可能进入了BD-HRt＞＜AD-cDNA文库筛选而未被发现，而额外的对HRt的I P也可以通过使用一种AD-HRt＞＜BD-cDNA文库筛选而被发现。
在BD-HRt＞＜AD-cDNA文库筛选中的一种遗漏的候选物质是维生素D受体(VDR)。基于维生素D对皮肤和毛发的重要性，包括同编码HR的基因的突变一样，哺乳动物VDR基因的突变在人和小鼠中导致先天性的毛发损失这样的报导(参见Vitamin D in Dermatology，Ed.Kragballe.K.，Marcel Dekker，Inc.，New York，Basel.Taneja等人的(2000)，我们推测维生素D受体(VDR)可能是HRt的一种IP。为了检测这种有趣的可能性，使用小鼠VDR cDNA(GenBank Acc# BC006716)构建了AD-VDR和BD-VDR构造，并分别检测其与BD-HRt和AD-HRt的相互作用。如预测的那样，BD-VDR与AD-HRt发生强的相互作用。此外，使用实施例3所述的检测分析法，我们能表明通过在亚-微摩尔浓度检测的VDR配体25-羟基维生素D3(25HC)1α(Sigma，H-4014)，25-羟基维生素D3(25 DHC)(Sigma，H-1530)，相互作用被增强了3倍。有趣的是，我们还发现BD-VDR与AD-TRβ相互作用，并且此相互作用被25 HC增强约2倍，而不被25 DHC改变。
所有引用文献的相关部分均引入本文以供参考；任何文献的引用不应被解释为其是本发明的现有技术。
尽管已用具体实施方案来说明和描述了本发明，但对于本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和保护范围的情况下可作出许多其它的变化和修改。因此，有意识地在附加的权利要求书中包括本发明范围内的所有这些变化和修改。
序列表<110>宝洁公司(THE PROCTER & GAMBLE COMPANY)<120>用于美化和/或改善哺乳动物皮肤的无发蛋白相互作用伴侣复合物及其方法<130>9423<160>16<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>660<212>DNA<213>人角蛋白5<400>1gccctcctgg aggtatccaa gaggtcactg tcaaccagag tctcctgact cccctcaacc60tgcaaatcga ccccagcatc cagagggtga ggaccgagga gcgcgagcag atcaagaccc120tcaacaataa gtttgcctcc ttcatcgaca aggtgcggtt cctggagcag cagaacaagg180ttctggacac caagtggacc ctgctgcagg agcagggcac caagaccgtg aggcagaacc240tggagccgtt gttcgagcag tacatcaaca acctcaggag gcagctggac agcatcgtgg300gggaacgggg ccgcctggac tcagagctaa gaaacatgca ggacctggtg gaagacttca360agaacaagta tgaggatgaa atcaacaagc gtaccactgc tgagaatgag tttgtgatgc420tgaagaagga tgtagatgct gcctacatga acaaggtgga gctggaggcc aaggttgatg480cactgatgga tgagattaac ttcatgaaga tgttctttga tgcggagctg tcccagatgc540agacgcatgt ctctgacacc tcagtggtcc tctccatgga caacaaccgc aacctggacc600tggatagcat catcgctgag gtcaaggccc agtatgagga gattgccaac cgcagccgga660<210>2<211>746<212>DNA<213>人普遍存在受体<400>2aagattcgga aacagcagca gcaggagtca cagtcacagt cgcagtcacc tgtggggccg60cagggcagca gcagctcagc ctctgggcct ggggcttccc ctggtggatc tgaggcaggc120agccagggct ccggggaagg cgagggtgtc cagctaacag cggctcaaga actaatgatc180cagcagttgg tggcggccca actgcagtgc aacaaacgct ccttctccga ccagcccaaa240gtcacgccct ggcccctggg cgcagacccc cagtcccgag atgcccgcca gcaacgcttt300gcccacttca cggagctggc catcatctca gtccaggaga tcgtggactt cgctaagcaa360gtgcctggtt tcctgcagct gggccgggag gaccagatcg ccctcctgaa ggcatccact420
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<210>9<211>323<212>DNA<213>人HIC同工蛋白p32和同工蛋白p40<400>9aagccctcgc tcccgggccc gtggggccgc agcgcgtggc cgaggcgggc ggcggccagc60tgggctccac agcccaggga aaatgtgata aagacaatac tgagaaagat ataactcaag120ctaccaatag ccacttcaca catggagaga tgcaagacca gtccatttgg ggaaatcctt180cggatggtga actcattaga acccaacctc agcgcttgcc tcagcttcag acttcagcac240aggtgccaag tggtgaggaa ataggcaaga taaagaacgg ccacacaggt ctgagcaatg300gaaatggaat tcaccacggg gcc323<210>10<211>610<212>DNA<213>人胰岛素样生长因子结合结构域蛋白6<400>10ccaggaggcg ccttggcgcg gtgcccaggc tgcgggcaag gggtgcaggc gggttgtcca60gggggctgcg tggaggagga ggatgggggg tcgccagccg agggctgcgc ggaagctgag120ggctgtctca ggagggaggg gcaggagtgc ggggtctaca cccctaactg cgccccagga180ctgcagtgcc atccgcccaa ggacgacgag gcgcctttgc gggcgctgct gctcggccga240ggccgctgcc ttccggcccg cgcgcctgct gttgcagagg agaatcctaa ggagagtaaa300ccccaagcag gcactgcccg cccacaggat gtgaaccgca gagaccaaca gaggaatcca360ggcacctcta ccacgccctc ccagcccaat tctgcgggtg tccaagacac tgagatgggc420ccatgccgta gacatctgga ctcagtgctg cagcaactcc agactgaggt ctaccgaggg480gctcaaacac tctacgtgcc caattgtgac catcgaggct tctaccggaa gcggcagtgc540cgctcctccc aggggcagcg ccgaggtccc tgctggtgtg tggatcggat gggcaagtcc600ctgccagggt 610<210>11<211>718<212>DNA<213>人线粒体内膜蛋白<400>11aaacccacac ctgcactttc agaagaagca tcctcatctt ctataaggga gcgaccacct60gaagaagttg cagctcgcct tgcacaacag gaaaaacaag aacaagttaa aattgagtct120ctagccaaga gcttagaaga tgctctgagg caaactgcaa gtgtcactct gcaggctatt180gcagctcaga atgctgcggt ccaggctgtc aatgcacact ccaacatatt gaaagccgcc240atggacaatt ctgagattgc aggcgagaag aaatctgctc agtggcgcac agtggagggt300
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<211>422<212>PRT<213>小鼠维生素D受体<400>16Met Glu Ala Met Ala Ala Ser Thr Ser Leu Pro Asp Pro Gly Asp Phe1 5 10 15Asp Arg Asn Val Pro Arg Ile Cys Gly Val Cys Gly Asp Arg Ala Thr20 25 30Gly Phe His Phe Asn Ala Met Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe35 40 45Arg Arg Ser Met Lys Arg Lys Ala Leu Phe Thr Cys Pro Phe Asn Gly50 55 60Asp Cys Arg Ile Thr Lys Asp Asn Arg Arg His Cys Gln Ala Cys Arg65 70 75 80Leu Lys Arg Cys Val Asp Ile Gly Met Met Lys Glu Phe Ile Leu Thr85 90 95Asp Glu Glu Val Gln Arg Lys Arg Glu Met Ile Met Lys Arg Lys Glu100 105 110Glu Glu Ala Leu Lys Asp Ser Leu Arg Pro Lys Leu Ser Glu Glu Gln115 120 125Gln His Ile Ile Ala Ile Leu Leu Asp Ala His His Lys Thr Tyr Asp130 135 140Pro Thr Tyr Ala Asp Phe Arg Asp Phe Arg Pro Pro Ile Arg Ala Asp145 150 155 160Val Ser Thr Gly Ser Tyr Ser Pro Arg Pro Thr Leu Ser Phe Ser Gly165 170 175Asp Ser Ser Ser Asn Ser Asp Leu Tyr Thr Pro Ser Leu Asp Met Met180 185 190Glu Pro Ala Ser Phe Ser Thr Met Asp Leu Asn Glu Glu Gly Ser Asp195 200 205Asp Pro Ser Val Thr Leu Asp Leu Ser Pro Leu Ser Met Leu Pro His210 215 220Leu Ala Asp Leu Val Ser Tyr Ser Ile Gln Lys Val Ile Gly Phe Ala225 230 235 240Lys Met Ile Pro Gly Phe Arg Asp Leu Thr Ser Asp Asp Gln Ile Val245 250 255Leu Leu Lys Ser Ser Ala Ile Glu Val Ile Met Leu Arg Ser Asn Gln260 265 270Ser Phe Thr Leu Asp Asp Met Ser Trp Asp Cys Gly Ser Gln Asp Tyr275 280 285Lys Tyr Asp Ile Thr Asp Val Ser Arg Ala Gly His Thr Leu Glu Leu290 295 300
Ile Glu Pro Leu Ile Lys Phe Gln Val Gly Leu Lys Lys Leu Asn Leu305 310 315 320His Glu Glu Glu His Val Leu Leu Met Ala Ile Cys Ile Val Ser Pro325 330 335Asp Arg Pro Gly Val Gln Asp Ala Lys Leu Val Glu Ala Ile Gln Asp340 345 350Arg Leu Ser Asn Thr Leu Gln Thr Tyr Ile Arg Cys Arg His Pro Pro355 360 365Pro Gly Ser His Gln Leu Tyr Ala Lys Met Ile Gln Lys Leu Ala Asp370 375 380Leu Arg Ser Leu Asn Glu Glu His Ser Lys Gln Tyr Arg Ser Leu Ser385 390 395 400Phe Gln Pro Glu Asn Ser Met Lys Leu Thr Pro Leu Val Leu Glu Val405 410 415Phe Gly Asn Glu Ile Ser420
权利要求
1.一种特征在于包含小鼠HRt蛋白-人相互作用伴侣蛋白复合物的组合物，其中所述人相互作用伴侣蛋白的特征在于包含一种分子，所述分子选自人角蛋白5；人普遍存在受体；人活化的STAT-1蛋白抑制剂；人类基质抗原2；人160kDa核孔蛋白；人视黄酸受体γ1；人甲状腺激素受体α；人膜联蛋白A1；人HIC同工蛋白p32和同工蛋白40；人胰岛素样生长因子结合结构域蛋白6；人线粒体内膜蛋白；人内质网硫氧还蛋白超家族成员；人活化的STAT-3蛋白抑制剂；人DEAD箱多肽3；人Dpy-30-样蛋白；小鼠维生素D受体，以及它们的组合。
2.一种特征在于包含小鼠HRt蛋白-人相互作用伴侣蛋白复合物的组合物，其中所述人相互作用伴侣被一种核酸编码，所述核酸选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ IDNO16以及它们的组合。
3.一种检测分析一种受试化合物对如权利要求1所述的组合物的激动剂或拮抗剂活性的方法，所述方法的特征在于包括a)测量在缺乏受试化合物的情况下，小鼠HRt蛋白和所述人相互作用伴侣蛋白之间的相互作用的水平；b)测量在存在受试化合物的情况下，小鼠HRt蛋白和所述人相互作用伴侣蛋白之间的相互作用的水平；其中当步骤b)中所述的测量水平大于步骤a)中所述的水平时，所述测试化合物具有激动剂活性，并且其中当步骤b)中所述的测量水平小于步骤a)中所述的水平时，所述受试化合物具有拮抗剂活性。
4.一种检测分析一种受试化合物对如权利要求2所述的组合物的激动剂或拮抗剂活性的方法，所述方法的特征在于包括a)测量在缺乏受试化合物的情况下，小鼠HRt蛋白和所述人相互作用伴侣蛋白之间的相互作用的水平；b)测量在存在受试化合物的情况下，小鼠HRt蛋白和所述人相互作用伴侣蛋白之间的相互作用的水平；其中当步骤b)中所述的测量水平大于步骤a)中所述的水平时，所述受试化合物具有激动剂活性，并且其中当步骤b)中所述的测量水平小于步骤a)中所述的水平时，所述受试化合物具有拮抗剂活性。
5.一种美化和/或改善有此需要的哺乳动物个体皮肤的方法，所述方法的特征在于包括将一种对如权利要求1所述的组合物具有拮抗剂活性的化合物施用到需要治疗的一部分哺乳动物皮肤上的步骤。
6.一种美化和/或改善有此需要的哺乳动物个体皮肤的方法，所述方法的特征在于包括将一种对如权利要求1所述的组合物具有激动剂活性的化合物施用到需要治疗的一部分哺乳动物皮肤上的步骤。
7.一种美化和/或改善有此需要的哺乳动物个体皮肤的方法，所述方法的特征在于包括将一种对如权利要求2所述的组合物具有拮抗剂活性的化合物施用到需要治疗的一部分哺乳动物皮肤上的步骤。
8.一种美化和/或改善有此需要的哺乳动物个体皮肤的方法，所述方法的特征在于包括将一种对如权利要求2所述的组合物具有激动剂活性的化合物施用到需要治疗的一部分哺乳动物皮肤上的步骤。
全文摘要
无发蛋白(hairless protein)相互作用伴侣复合物、激动剂和/或拮抗剂化合物、包含相同化合物的组合物和产品，及其方法。无发蛋白对美化和/或改善哺乳动物皮肤是不可缺少的。因此，这些相互作用复合物对筛选用于美化和/或改善哺乳动物皮肤的受试化合物是有用的。
文档编号C07K14/47GK1882837SQ200480033617
公开日2006年12月20日 申请日期2004年11月9日 优先权日2003年11月13日
发明者K·斯里科里斯纳, R·A·勒伯夫 申请人:宝洁公司