白介素－11融合蛋白的制作方法

专利名称：白介素－11融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗或预防血小板减少症、冯维勒布兰德氏病(vWD)或炎性疾病诸如炎性肠病(IBD)的新型组合物。
背景技术：
白介素11(IL-11)的生理学功能白介素-11(IL-11)是促进巨核细胞生成及血小板生成的造血细胞因子，其作用途径是通过刺激原始干细胞、多能及定向祖细胞增殖(与其它造血生长因子像IL-3、IL-6、GM-CSF协同作用)导致巨核细胞成熟和血小板生成增加。由于上述活性，它具有刺激红细胞生成的副作用，但对嗜中性粒细胞增殖几乎没有影响。它还对肠粘膜细胞具有营养作用。另外，IL-11通过肝细胞诱导急性期蛋白(铁蛋白、触珠蛋白、CRP、纤维蛋白原)分泌。它还通过抑制巨噬细胞及T细胞效应物功能表现出抗炎特性。它抑制体外活化的巨噬细胞产生TNFα、IL-1β、IL-12、IL-6及NO。在生理学上，IL-11由多种基质细胞产生，像成纤维细胞、上皮细胞、软骨细胞及成骨细胞。在正常个体中，通常在血浆中无法检测到IL-11。IL-11的降解和清除还不太清楚。
IL-11的生物化学性质IL-11是由178个氨基酸(AA)组成的19kDa的多肽，加上21个氨基酸的分泌前导序列，不含潜在的糖基化残基、二硫键或其它翻译后修饰，与IL-6相近似。它与含有IL-11特异的α受体亚基及混杂的(promiscuous)β亚基的多亚基受体复合体(gp130)结合。
重组人IL-11(Genetics Institute/Wyeth的Oprelvekin，Neumega_)是在大肠杆菌中产生的缺少氨基末端脯氨酸的2-178位氨基酸的IL-11。这可能是从宿主细胞完成分泌所必需的，但据报道不会影响细胞因子的活性。
化学疗法诱导的血小板减少症血小板减少症是因为恶性肿瘤接受长期或攻击性化学疗法的患者的一个严重问题。有些化学治疗剂诸如碳铂(Carboplatin)，表现出显著的、剂量限制性的毒性，并累积作用。
目前，输注血小板是血小板减少症的标准治疗方法。然而，输注血小板是昂贵的，并具有同种异体免疫及血源性疾病传播的严重危险。大约5％-30％的输注血小板通常与发热性、非溶血性反应有关。另外，血小板是有限的资源，且保质期仅为5天。因此，为了预防或治疗血小板减少症，促进血小板生成的试剂是输注血小板的诱人替代方法。重组人IL-11(Oprelvekin，Neumega_)于1997年在美国批准用于化学疗法诱导的血小板减少症的次级预防。其它潜在适应症包括炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、银屑病(牛皮癣)及冯维勒布兰德氏病(von Willebrand’s disease)。
IL-11与清蛋白融合的预期优点血小板减少症的安全且有效治疗仍是未得到满足的医学需要。重组人IL-11(Oprelvekin，Neumega_)的人体半衰期非常短，为6.9小时，同时治疗窗狭窄。
通过融合清蛋白来延长血浆半衰期及提高生物利用度，预期可导致安全性与功效模式得到改进。这意味着可以通过较低剂量和/或较长服药间隔达到并维持治疗性血浆水平，同时避免了毒性阈值以上的峰水平。
目前，Neumega_是用于治疗化学疗法诱导的血小板减少症唯一获得批准的药物，这表明此领域具有很大的未满足的医学需要。Neumegad_显示出高发生率的毒性作用，诸如水肿及心血管功能紊乱，连同低效能，尤其是在血小板减少症的严重病例中。

发明内容
本发明涉及包含与清蛋白或其片段或变体融合的IL-11的蛋白质。所述融合蛋白在本发明中统称为“本发明清蛋白融合蛋白”。与未融合的IL-11相比，这些本发明融合蛋白表现出延长的体内半衰期和/或延长的治疗活性。
本发明包括治疗性清蛋白融合蛋白、组合物、药物组合物、制剂及试剂盒。本发明还包括编码本发明清蛋白融合蛋白的核酸分子，以及包含这些核酸的载体，经这些核酸和载体转化的宿主细胞，及使用这些核酸、载体和/或宿主细胞制备清蛋白融合蛋白的方法。
本发明还涉及用于治疗和预防血小板减少症的组合物和方法。本发明还涉及抗炎治疗及预防的组合物和方法。另外，本发明涉及用于治疗和预防冯维勒布兰德氏病的组合物和方法。
附图简要说明

图1将rhIL-11或C末端IL-11-清蛋白融合蛋白静脉内施用于兔后的IL-11血浆浓度。
图2将rhIL-11或C末端IL-11-清蛋白融合蛋白皮下施用于兔后的IL-11血浆浓度。
图3将rhIL-11或N末端IL-11-清蛋白融合蛋白静脉内施用于大鼠后的IL-11血浆浓度。
图4将rhIL-11或N末端IL-11-清蛋白融合蛋白皮下施用于大鼠后的IL-11血浆浓度。
图5用IL-11处理首次进行实验的大鼠后的血小板水平变化过程。
图6用IL-11处理接受化疗的大鼠后的血小板水平变化过程。
图7小鼠IBD模型应用IL-11后的体重变化(按基线的％)。
图8小鼠IBD模型应用IL-11后的目测评分(腹泻及显著直肠出血)。
图9小鼠IBD模型应用IL-11后的结肠长度。
图10小鼠IBD模型应用IL-11后的组织学疾病评分。
图11本发明的各种化合物的SDS凝胶及Western印迹。
本发明的详细说明本发明涉及包含与IL-11偶联的清蛋白的融合蛋白。这样的肽包括但不限于与gp130受体复合体结合的肽。这些肽包括具有血小板生成或抗炎特性的IL-11或其片段或变体。
本发明使用的术语“蛋白质”及“肽”为非限制性的，包括蛋白质和多肽以及肽。
另外，可以将化学实体与本发明的融合蛋白共价附着或融合或者联合使用，用于增强生物学活性或调节生物学活性。
本发明清蛋白融合蛋白预期可延长IL-11的体内半衰期。所述融合了清蛋白的肽/蛋白质的体外或体内半衰期较未连接清蛋白的肽/蛋白质的半衰期延长了2倍，或5倍，或更多。另外，预期本发明清蛋白融合蛋白可降低治疗性肽的服药频率。与未连接清蛋白的治疗性肽的服药频率相比，服药频率降低了至少1/4，或至少1/2，或更多。
预期本发明清蛋白融合蛋白可在体外和/或体内延长肽的保质期，和/或稳定肽和/或其在溶液中(或于药物组合物中)的活性。这些清蛋白-融合蛋白，可以为治疗剂，预期可减少这样一种需要，即为预防诸如非特异性结合等因素引起的蛋白质损失而使用大大过量的载体蛋白(诸如未融合的清蛋白)来配制蛋白质溶液。半衰期延长定义为根据下述实施例4在6月龄雄性Wistar大鼠皮下注射后的第一个24小时测量到的半衰期较未融合IL-11化合物至少高2倍(优选至少高5倍、10倍、20倍或30倍)。
本发明还包括编码清蛋白融合蛋白的核酸分子，以及包含这些核酸的载体，经这些核酸和载体转化的宿主细胞，及使用这些核酸、载体和/或宿主细胞制备清蛋白融合蛋白的方法。本发明还包括转基因生物体，该转基因生物体经修饰后含有本发明的核酸分子，该核酸分子任选经修饰后表达由该核酸分子编码的清蛋白融合蛋白。
本发明还包括包含本发明清蛋白融合蛋白及药学可接受稀释剂或载体的制药学制剂。这样的制剂可以存放在试剂盒或容器中。这样的试剂盒或容器可以与关于保质期延长的蛋白质的说明书一起包装。这样的制剂可用于预防、治疗、改善患者诸如哺乳动物或人的血小板减少症或炎性疾病诸如炎性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、冯维勒布兰德氏病等或是相关紊乱的方法，包括将制药学制剂施用于患者的步骤。
本发明还包括用于潜在将与使用中等较高浓度的细胞因子的治疗相关的副作用(如注射部位反应、血浆容量增加、心律不齐、头痛、恶心、发热、皮疹、虚弱、腹泻、头晕、过敏反应)降至最低的方法，包括将本发明清蛋白融合细胞因子施用于所述哺乳动物。
本发明包括预防、治疗或改善血小板减少症或炎症疾病诸如炎性肠病、银屑病、类风湿性关节炎等的方法，包括将本发明的包含IL-11肽/蛋白质(或其片段或变体)的清蛋白融合蛋白以有效治疗、预防或改善疾病或紊乱的量施用于需要这样的预防、治疗或改善的哺乳动物。在本发明中，IL-11还称为“治疗性蛋白质”。
本发明包括包含与清蛋白或多拷贝清蛋白(包括其片段及变体)融合的IL-11(包括其片段及变体)的清蛋白融合蛋白。
本发明还包括用于延长IL-11在哺乳动物中的半衰期的方法。该方法将IL-11与清蛋白连接而形成清蛋白融合IL-11，并将清蛋白融合IL-11施用于哺乳动物。通常，清蛋白融合IL-11的半衰期较未连接清蛋白的IL-11的半衰期可延长至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或至少50倍。
本发明例示的是包含与IL-11融合的清蛋白的融合蛋白。本发明还包括与本技术领域现有方法相比有所改进的制备治疗性产品的方法。例如，本发明提供了制备具有活性IL-11部分的蛋白质的改进方法。下文进一步详细描述了本发明的各个方面。
清蛋白术语“人血清清蛋白(HSA)”和“人清蛋白(HA)”在本发明可互换使用。术语“清蛋白”及“血清清蛋白”意义更广，包括人血清清蛋白(及其片段和变体)以及来自其它物种的清蛋白(及其片段和变体)。
如本发明所使用，“清蛋白”统称具有清蛋白的一种或多种功能活性(如生物学活性)的清蛋白蛋白质或氨基酸序列，或清蛋白片段或变体。具体而言，“清蛋白”是指人清蛋白或其片段(参见EP 201 239、EP 322 094及WO 97/24445)，尤其是WO 03/066824和WO 01/79480的表1和序列SEQ IDNO18中显示的成熟形式人清蛋白，或本发明序列SEQ ID NO17的202-762位残基，或来自其它脊椎动物的清蛋白或其片段，或这些分子的类似物或变体或其片段(例如WO 95/23857的经修饰清蛋白)。
用于本发明清蛋白融合蛋白的人血清清蛋白可含有参照序列SEQ IDNO18的下述两组点突变中的其中之一或二者兼之亮氨酸-407突变为丙氨酸、亮氨酸-408突变为缬氨酸、缬氨酸-409突变为丙氨酸、及精氨酸-410突变为丙氨酸；或精氨酸-410突变为丙氨酸、赖氨酸-413突变为谷氨酰胺、及赖氨酸-414突变为谷氨酰胺(参见如国际公开号WO95/23857，将其完整并入本发明作为参考)。在其它实施方案中，含有上述两组点突变中的其中之一或二者兼之的本发明清蛋白融合蛋白对酵母Yap3p蛋白水解裂解具有改进的稳定性/抗性，使得酵母宿主细胞中表达的重组清蛋白融合蛋白产量提高。
如本发明所使用，足以延长治疗性蛋白质的体内半衰期、治疗活性或保质期的清蛋白部分是指与未融合状态的治疗性蛋白质的体内半衰期、治疗活性或保质期相比在长度或结构上足以稳定、延长清蛋白融合蛋白中治疗性蛋白质部分的体内半衰期、治疗活性或保质期的清蛋白部分。清蛋白融合蛋白中的清蛋白部分可包含上述全长HA序列，或者可包含其能够稳定或延长治疗活性的一种或多种片段。这样的片段的长度可为10个或更多氨基酸，或者可包含HA序列的约15、20、25、30、50、100、150或更多连续氨基酸，或者可包含HA特定结构域的部分或全部。
本发明清蛋白融合蛋白中的清蛋白部分可为正常HA的变体。本发明清蛋白融合蛋白中的治疗性蛋白质部分也可为本发明描述的治疗性蛋白质的变体。术语“变体”包括插入、删除及替代，无论是保守的还是非保守的，这样的变化基本上不改变清蛋白的渗透、有用配体结合及非免疫原性特性中的一项或多项，或活性位点，或给予治疗性蛋白质以治疗活性的活性结构域。
具体而言，本发明清蛋白融合蛋白可以包含人清蛋白的天然存在多态变体及人清蛋白片段，例如EP 322 094中公开的那些片段(即HA(1-n)，其中n为369至419)。清蛋白可衍生自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人、牛、绵羊或猪。非哺乳动物清蛋白包括但不限于鸡和鲑鱼。清蛋白融合蛋白中的清蛋白部分相对于治疗性蛋白质部分可来自不同的动物。
一般来说，HA片段或变体的长度至少为100个氨基酸，任选至少150个氨基酸。HA变体可包含或由HA的至少一个完整结构域组成，例如结构域1(SEQ ID NO18的1-194位氨基酸)，结构域2(SEQ ID NO18的195-387位氨基酸)，结构域3(SEQ ID NO18的388-585位氨基酸)，结构域1+2(SEQ ID NO18的1-387位氨基酸)，结构域2+3(SEQ IDNO18的195-585位氨基酸)，或结构域1+3(SEQ ID NO18的1-194位氨基酸+SEQ ID NO18的388-585位氨基酸)。每一个结构域本身由两个同源亚结构域构成，即1-105、120-194、195-291、316-387、388-491及512-585，柔性亚结构域间接头区包含残基Lys106至Glu119，Glu292至Val315及Glu492至Ala511。
本发明清蛋白融合蛋白中的清蛋白部分可包含HA的至少一个亚结构域或结构域或其保守修饰体。如果融合蛋白以亚结构域为基础，那么有些或所有邻近接头可任选用于连接治疗性蛋白质部分。
清蛋白融合蛋白一般而言，本发明涉及清蛋白融合蛋白及治疗、预防或改善疾病或紊乱的方法。如本发明所使用，“清蛋白融合蛋白”指通过至少一个分子的清蛋白(或其片段或变体)与至少一个分子的治疗性蛋白质(或其片段或变体)融合而形成的蛋白质。本发明清蛋白融合蛋白包含至少治疗性蛋白质的片段或变体和至少人血清清蛋白的片段或变体，它们通过诸如基因融合(即清蛋白融合蛋白是由其中编码完整或部分治疗性蛋白质的多核苷酸以相同读码框与编码完整或部分清蛋白的多核苷酸连接的核酸翻译生成的)彼此相互连接。治疗性蛋白质和清蛋白，一旦成为清蛋白融合蛋白的一部分，可称为清蛋白融合蛋白的“部份”、“区域”或“模块(moiety)”。
在一个实施方案中，本发明提供了包含或由治疗性蛋白质和血清清蛋白蛋白质组成的清蛋白融合蛋白。在其它实施方案中，本发明提供了包含或由治疗性蛋白质的生物学活性和/或治疗活性片段和血清清蛋白蛋白质组成的清蛋白融合蛋白。在其它实施方案中，本发明提供了包含由治疗性蛋白质的生物学活性和/或治疗活性变体和血清清蛋白蛋白质组成的清蛋白融合蛋白。在其它实施方案中，清蛋白融合蛋白的血清清蛋白蛋白质成分是血清清蛋白的成熟部分。
在其它实施方案中，本发明提供了包含或由治疗性蛋白质和血清清蛋白的生物学活性和/或治疗活性片段组成的清蛋白融合蛋白。在其它实施方案中，本发明提供了包含或由治疗性蛋白质和血清清蛋白的生物学活性和/或治疗活性变体组成的清蛋白融合蛋白。在有些实施方案中，清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分是治疗性蛋白质的成熟部分。
在其它实施方案中，本发明提供了包含或由治疗性蛋白质的生物学活性和/或治疗活性片段或变体和血清清蛋白的生物学活性和/或治疗活性片段或变体组成的清蛋白融合蛋白。在有些实施方案中，本发明提供了包含或由治疗性蛋白质的成熟部分和血清清蛋白的成熟部分组成的清蛋白融合蛋白。
在一个实施方案中，清蛋白融合蛋白包含HA作为N端部分，且包含治疗性蛋白质作为C端部分。或者，也可使用包含HA作为C端部分且包含治疗性蛋白质作为N端部分的清蛋白融合蛋白。
在其它实施方案中，清蛋白融合蛋白在清蛋白的N末端和C末端都融合有治疗性蛋白质。在一个实施方案中，在N末端和C末端融合的治疗性蛋白质为相同的治疗性蛋白质。在另一个实施方案中，在N末端和C末端融合的治疗性蛋白质为不同的治疗性蛋白质。在另一个实施方案中，在N末端和C末端融合的治疗性蛋白质为可用于治疗或预防相同疾病、紊乱或状况的不同治疗性蛋白质。在另一个实施方案中，在N末端和C末端融合的治疗性蛋白质为可用于治疗或预防本领域共知的通常在病人中同时存在的疾病或紊乱的不同治疗性蛋白质。
除了清蛋白部分融合在治疗性蛋白质部分的N末端和/或C末端的清蛋白融合蛋白以外，本发明清蛋白融合蛋白还可通过将感兴趣的治疗性蛋白质或肽插入HA的内部区域产生。例如，在HA分子的蛋白质序列中，α-螺旋的终点及起点之间存在许多环状结构或转角，它们通过二硫键得以稳定。根据HA的晶体结构(PDB标识符1AO6、1BJ5、1BKE、1BMO、1E7E至1E7I及1UOR)，环状结构的大部分由分子主体向外延伸。这些环状结构可用于插入或内部融合治疗活性肽特别是需要二级结构以具有功能的治疗活性肽或治疗性蛋白质，本质上产生具有特定生物学活性的清蛋白分子。
人清蛋白结构中可插入肽或多肽以产生本发明清蛋白融合蛋白的环状结构包括缬氨酸54-天冬酰胺61、苏氨酸76-天冬氨酸89、丙氨酸92-谷氨酸100、谷氨酰胺170-丙氨酸176、组氨酸247-谷氨酸252、谷氨酸266-谷氨酸277、谷氨酸280-组氨酸288、丙氨酸362-谷氨酸368、赖氨酸439-脯氨酸447、缬氨酸462-赖氨酸475、苏氨酸478-脯氨酸486、及赖氨酸560-苏氨酸566。在其它实施方案中，将肽或多肽插入成熟人清蛋白(SEQ IDNO18)的缬氨酸54-天冬酰胺61、谷氨酰胺170-丙氨酸176、和/或赖氨酸560-苏氨酸566环状结构。
待插入的肽可来自筛选特定生物学活性的噬菌体展示或合成肽文库，或来自具有所需功能的分子的活性部分。另外，可在特殊环状结构中产生随机肽文库，或通过将随机肽插入HA分子的特定环状结构中，并在其中展现所有可能的氨基酸组合。
这样的文库可通过下列方法之一在HA或HA结构域片段上产生(a)将HA或HA结构域片段的一个或多个肽环中的氨基酸进行随机突变。可以这种方式突变环状结构内的一个、多个或所有残基；
(b)在HA或HA结构域片段(即内部融合)的一个或多个环状结构中进行长度为Xn(其中X是氨基酸，n是残基数目)的随机肽的置换或插入；(c)除(a)和/或(b)以外的N末端、C末端、或N末端和C末端肽/蛋白质融合蛋白。
还可以通过将针对不同靶筛选得到的肽移植到相同的HA或HA结构域片段中，使HA或HA结构域片段成为多功能的。
插入人血清清蛋白环状结构中的肽的实例为治疗性蛋白质肽或其肽片段或肽变体。例如，插入人血清清蛋白环状结构的肽可包括T-20和/或T-1249肽或其肽片段或肽变体。更具体的说，本发明包括在人血清清蛋白的环状结构中插入了长度为至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、或至少40个氨基酸的肽片段或肽变体的清蛋白融合蛋白。本发明还包括在人血清清蛋白N末端融合了长度为至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、或至少40个氨基酸的肽片段或肽变体的清蛋白融合蛋白。本发明还包括在人血清清蛋白C末端融合了长度为至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、或至少40个氨基酸的肽片段或肽变体的清蛋白融合蛋白。
一般而言，本发明清蛋白融合蛋白可有一个HA衍生区域和一个治疗性蛋白质衍生区域。然而，各种蛋白质的多个区域可用于构建本发明清蛋白融合蛋白。相似地，超过一种治疗性蛋白质可用于构建本发明清蛋白融合蛋白。例如，可将治疗性蛋白质融合到HA的N末端及C末端两个末端。在这样一种构造中，治疗性蛋白质部分可为相同或不同的治疗性蛋白质分子。双功能清蛋白融合蛋白的结构可表示为X-HA-Y或Y-HA-X或X-Y-HA或HA-X-Y或HA-Y-X-HA或HA-X-X-HA或HA-Y-Y-HA或HA-X-HA-Y或X-HA-Y-HA或多重组合和/或将X和/或Y插入HA序列内任何位置。
双功能或多功能清蛋白融合蛋白可根据功能、半衰期等以各种比率制备。双功能或多功能清蛋白融合蛋白还可以制备成经由HA相对末端的蛋白质或肽将融合蛋白的治疗性蛋白质部分靶向靶器官或细胞类型。
作为已知治疗分子的融合体的替代方法，可通过筛选作为HA或HA结构域片段N末端、C末端、或N末端和C末端融合体而构建的文库来获得肽，它们通常为6个、8个、12个、20个或25个或Xn个(其中X是氨基酸(aa)，n是残基数目)随机氨基酸，表现了所有可能的氨基酸组合。这种方法的特殊优点是可在HA分子上的原位选择肽，因此肽的特性就像选择的那样，而不会像由任何其它方法衍生肽然后附着到HA上的情况那样发生潜在改变。
另外，本发明清蛋白融合蛋白可在融合部分之间包含接头肽，在模块之间提供更大物理间隔，并由此使治疗性蛋白质部分的可达性最大化，例如与其相关受体结合。接头肽可由氨基酸组成，使其具柔性或更具刚性。
因此，如上所述，本发明清蛋白融合蛋白可有以下通式R2-R1、R1-R2、R2-R1-R2、R2-L-R1-L-R2、R1-L-R2、R2-L-R1、或R1-L-R2-L-R1，其中R1是至少一种治疗性蛋白质、肽或多肽序列(包括其片段或变体)，并且不必是相同的治疗性蛋白质，L是接头，R2是血清清蛋白序列(包括其片段或变体)。例示性接头包括(GGGGS)N(SEQ ID NO8)或(GGGS)N(SEQID NO9)或(GGS)N，其中N是大于或等于1的整数，G表示甘氨酸，S表示丝氨酸。当R1是二个或多个治疗性蛋白质、肽或多肽序列时，这些序列可任选由接头连接。
在其它实施方案中，包含治疗性蛋白质的本发明清蛋白融合蛋白具有与未与清蛋白融合的相同治疗性蛋白质的保质期或体内半衰期或治疗活性相比延长的保质期或体内半衰期或治疗活性。保质期通常指溶液中的或有些其它贮存制剂中的治疗性蛋白质的治疗活性保持稳定而无治疗活性过度丧失的时间期限。许多治疗性蛋白质在其未融合状态下高度易变。如下所述，这些治疗性蛋白质在引入本发明清蛋白融合蛋白后其典型的保质期显著延长。
保质期“延长的”的本发明清蛋白融合蛋白相对于接受相同贮存和处理条件的标准品表现出更大的治疗活性。标准品可为未融合的全长治疗性蛋白质。当清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分是该蛋白质的类似物、变体、或有其它改变或不包含完整序列时，治疗活性的延长或者可与该类似物、变体、改变的肽或不完整序列的未融合等同物相当。作为实例，在给定时间点进行比较时，本发明清蛋白融合蛋白可保留接受相同贮存及处理条件的标准品的治疗活性的100％或大于其治疗活性的105％、110％、120％、130％、150％或200％。然而，应注意到，治疗活性取决于治疗性蛋白质的稳定性，并且可低于100％。
保质期也可根据贮存后残余的治疗活性来评估，针对贮存开始时的治疗活性进行标准化。保质期延长的本发明清蛋白融合蛋白表现出治疗活性延长，可保留接受相同条件的等价未融合治疗性蛋白质的治疗活性的大于约50％、治疗活性的约60％、70％、80％、或90％或更多。
治疗性蛋白质如上所述，本发明清蛋白融合蛋白包含至少治疗性蛋白质的片段或变体及至少人血清清蛋白的片段或变体，它们通过基因融合相互结合。
如本发明使用，“治疗性蛋白质”指具有一种或多种治疗和/或生物学活性的IL-11或其片段或变体。因此，本发明清蛋白融合蛋白可含有至少治疗性蛋白质的片段或变体。另外，术语“治疗性蛋白质”可指治疗性蛋白质的内源性或天然存在的相关物。变体包括突变体、类似物、模拟物及同系物，包括治疗性蛋白质的内源性或天然存在的相关物。
表现出“治疗活性”的多肽或“治疗活性”蛋白质指具有与治疗性蛋白质诸如本发明描述的或本领域已知的一种或多种治疗性蛋白质相关的一种或多种已知的生物学活性和/或治疗活性的多肽。作为非限制性实例，“治疗性蛋白质”是可用于治疗、预防或改善疾病、状况或紊乱的蛋白质。
如本发明所使用，“治疗活性”或“活性”可指其效果与在人中的期望治疗结果、或与非人哺乳动物或其它物种或生物体中的期望效果一致的活性。治疗活性可在体内或体外测量。例如，期望效果可在细胞培养中分析。如本领域所述，许多治疗性蛋白质通常可获得这样的体外或细胞培养测定法。
与本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质可通过附着一个或多个寡糖基团而进行修饰。称作糖基化的修饰可显著影响蛋白质的物理性质，而且在蛋白质稳定性、分泌和局部化方面是重要的。这样的修饰在WO 03/066824和WO 01/79480中有详细描述，将其引入本发明作为参考。
与本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质及其类似物和变体可以进行修饰，由于对其核酸序列的操作或其表达的其它条件使得由表达该蛋白的宿主细胞在一个或多个位点进行糖基化发生改变。例如，可通过清除或引入糖基化位点而产生糖基化异构体，例如通过氨基酸残基替代或删除，诸如以谷氨酰胺替代天冬酰胺，或者可通过在不会使其糖基化的宿主细胞如大肠杆菌或糖基化缺陷的酵母中表达蛋白质而产生非糖基化重组蛋白。这些方法的实例在WO 03/066824和WO 01/79480中有更为详细的描述，将其引入本发明作为参考，并且是本领域已知的。
在各个实施方案中，本发明清蛋白融合蛋白具有与清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质的治疗活性和/或生物学活性对应的治疗活性和/或生物学活性。在其它实施方案中，本发明清蛋白融合蛋白的治疗活性蛋白质部分是参考序列的片段或变体，并具有相应治疗性蛋白质的治疗活性和/或生物学活性。
多肽和多核苷酸片段及变体片段本发明还涉及本发明的治疗性蛋白质、清蛋白、和/或清蛋白融合蛋白的片段。即使由蛋白质的N末端删除一个或多个氨基酸导致治疗性蛋白质、清蛋白、和/或清蛋白融合蛋白的一种或多种生物学功能改变或丧失，但其它治疗活性和/或功能活性(如生物学活性、多聚能力、结合配体的能力)可仍然保留。例如，在由N末端消除完整多肽的少于多数残基时，具有N末端删除的多肽诱导和/或结合识别完整或成熟形式多肽的抗体的能力将保留。缺乏完整多肽N末端残基的特定多肽是否保留这样的免疫学活性可容易地通过本发明描述的及本技术领域其它途径已知的常规方法确定。删除了大量N末端氨基酸残基的突变蛋白质不大可能保留有些生物学或免疫学活性。实际上，由少至6个氨基酸残基构成的肽常可引发免疫反应。
因此，与本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质片段包括全长蛋白质以及由参考多肽的氨基酸序列的氨基末端删除了一个或多个残基的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
另外，与本发明清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分对应的血清清蛋白多肽片段包括全长蛋白质以及由参考多肽(即血清清蛋白)的氨基酸序列的氨基末端删除了一个或多个残基的多肽。编码这些多肽的多核苷酸的也包括在本发明内。
另外，本发明清蛋白融合蛋白的片段包括全长清蛋白融合蛋白以及由清蛋白融合蛋白的氨基末端删除了一个或多个残基的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
本发明还提供了由与本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质的氨基酸序列的羧基末端删除了一个或多个残基的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
另外，本发明提供了由与本发明清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分(即血清清蛋白)对应的清蛋白蛋白质的氨基酸序列的羧基末端删除了一个或多个残基的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
另外，本发明提供了由本发明清蛋白融合蛋白的羧基末端删除了一个或多个残基的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
另外，任何上述N末端或C末端删除可结合产生N末端和C末端删除的参考蛋白(如表1中提及的治疗性蛋白质，或血清清蛋白(如SEQ ID NO18)，或本发明清蛋白融合蛋白)。本发明还提供了由氨基和羧基两个末端删除了一个或多个氨基酸的多肽。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
本申请还涉及包含与本发明所列参考多肽序列(如治疗性蛋白质、血清清蛋白蛋白质或本发明清蛋白融合蛋白)至少60％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的多肽的蛋白质或其片段。在有些实施方案中，本申请涉及包含与上述具有N末端和C末端删除的氨基酸序列的参考多肽至少60％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的多肽的蛋白质。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
本发明的其它多肽片段为包含或由表现出治疗性蛋白质或血清清蛋白清蛋白的多肽序列的治疗活性和/或功能活性(如生物学活性)的氨基酸序列组成的片段，其中氨基酸序列为片段。
其它多肽片段为生物学活性片段。生物学活性片段为表现出与本发明多肽的活性相似但不必相同的活性的片段。片段的生物学活性可包括改进的期望活性，或降低的非期望活性。
变体“变体”指与参考核酸或多肽不同但保留其本质特性的核酸或多肽。通常，变体总体上非常相似，并在许多区域与参考核酸或多肽相同。
如本发明所使用，“变体”指在序列上分别与治疗性蛋白质、清蛋白、和/或本发明清蛋白融合蛋白不同但保留本发明其它地方描述的或本领域其它途径已知的至少一种其功能和/或治疗特性的本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分、本发明清蛋白融合蛋白的清蛋白部分、或清蛋白融合蛋白。通常，变体总体上非常相似，并在许多区域与本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质、本发明清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分对应的清蛋白蛋白质、和/或本发明清蛋白融合蛋白的氨基酸序列相同。编码这些变体的核酸也包括在本发明内。
本发明还涉及包含或由与例如本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质、本发明清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分对应的清蛋白蛋白质(如SEQ ID NO18或其片段或变体)、和/或本发明清蛋白融合蛋白的氨基酸序列等氨基酸序列至少60％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列组成的蛋白质。还提供了这些多肽的片段(如本发明所述的那些片段)。本发明包括的其它多肽为由在严谨杂交条件下(如于约45℃在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与滤膜结合的DNA进行杂交，然后于约50-65℃在0.2xSSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次)、在高度严谨条件下(如于约45℃在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)与滤膜结合的DNA进行杂交，然后于约68℃在0.1xSSC、0.2％SDS洗涤一次或多次)、与编码本发明氨基酸序列的核酸分子的互补链发生杂交的多核苷酸编码的多肽；；或在本领域技术人员知道的其它严谨杂交条件下(参见例如Ausubel，F.M.等人编，1989，《Current protocol in Molecular Biology》，Greenpublishing associates公司及John Wiley & Sons公司，New York，第6.3.1-6.3.6页和第2.10.3页)。编码这些多肽的多核苷酸也包括在本发明内。
具有与本发明查询氨基酸序列至少例如95％“同一”的氨基酸序列的多肽意指主题多肽的氨基酸序列与查询序列相同，只是查询氨基酸序列的每100个氨基酸主题多肽序列可包含多达5个氨基酸的改变。换言之，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列的多肽，可以在主题序列中插入、删除、或用另一种氨基酸替代多达5％的氨基酸残基。参考序列的这些改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或是那些末端位置之间的任何位置，各自分散于参考序列的残基之间或参考序列内一个或多个邻近群组中。
作为实践，任何特定多肽是否与例如本发明清蛋白融合蛋白或其片段(诸如清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分或清蛋白融合蛋白的清蛋白部分)的氨基酸序列至少60％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一，可以使用已知的计算机程序常规确定。这样的程序及其使用方法在如WO 03/066824及WO 01/79480(第41-43页)中有描述，将其引入本发明作为参考。
本发明的多核苷酸变体可在编码区、非编码区、或二者兼之中包含改变。多核苷酸变体包括包含产生沉默替代、添加、或删除但不改变所编码多肽的特性或活性的改变的那些变体。这样的核苷酸变体可因遗传密码子的简并性由沉默替代产生。多肽变体包括其中少于50个、少于40个、少于30个、少于20个、少于10个、或5-50个、5-25个、5-10个、1-5个、或1-2个氨基酸以任意组合遭到替代、删除或添加的变体。可以为了多种原因而产生多核苷酸变体，如为了特定宿主优化密码子表达(将人mRNA的密码子改变成微生物宿主诸如酵母或大肠杆菌优选的密码子)。
在另一个实施方案中，为了在酵母或哺乳动物中进行表达而优化编码本发明清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的多核苷酸。在另一个实施方案中，为了在酵母或哺乳动物细胞中进行表达而优化编码本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的多核苷酸。在又一个实施方案中，为了在酵母或哺乳动物细胞中进行表达而优化编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸。
在一个备选实施方案中，经过密码子优化的编码本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的多核苷酸在本发明所述严谨杂交条件下不与编码治疗性蛋白质的野生型多核苷酸发生杂交。在另一个实施方案中，经过密码子优化的编码本发明清蛋白融合蛋白的清蛋白部分的多核苷酸在本发明所述严谨杂交条件下不与编码清蛋白蛋白质的野生型多核苷酸发生杂交。在另一个实施方案中，经过密码子优化的编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸在本发明所述严谨杂交条件下不与编码治疗性蛋白质部分或清蛋白蛋白质部分的野生型多核苷酸发生杂交。
在另一个实施方案中，编码本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的多核苷酸不包含或由治疗性蛋白质的天然存在序列组成。在另一个实施方案中，编码本发明清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分的多核苷酸不包含或由清蛋白蛋白质的天然存在序列组成。在一个备选实施方案中，编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸不包含或由治疗性蛋白质部分或清蛋白蛋白质部分的天然存在序列组成。
在另一个实施方案中，由于天然存在的野生型多核苷酸，治疗性蛋白质可以通过生物淘洗从随机肽文库选出。
天然存在的变体称为“等位基因变体”，指占据生物体染色体上指定基因座的基因几种备选形式中的一种。(《Genes II》，Lewin，B.编，John Wiley &Sons，New York，1985)。这些等位基因变体可在多核苷酸和/或多肽水平有所不同，并包括在本发明内。另外，非天然存在的变体可通过诱变技术或通过直接合成而产生。
使用蛋白质工程及重组DNA技术的已知方法，可以产生变体以改进或改变本发明多肽的特征。例如，可从本发明多肽的N末端或C末端删除一个或多个氨基酸而无生物学功能的实质性丧失。参见Ron等人，J.Biol.Chem.2682984-2988，1993(KGF变体)及Dobeli等人，J.Biotechnology7199-216，1988(干扰素γ变体)。
另外，充足的证据表明变体常保留与天然存在蛋白质相似的生物学活性(如Gayle及其同事，J.Biol.Chem.26822105-22111，1993)(IL-1a变体)。
另外，即使从多肽的N末端或C末端删除一个或多个氨基酸导致一种或多种生物学功能的改变或丧失，但其它生物学活性仍可保留。例如，在从N末端或C末端消除少于分泌形式的大多数残基时，删除变体诱导和/或结合识别分泌形式的抗体的能力仍可能保留。缺乏蛋白质的N末端或C末端残基的特定多肽是否保留这样的免疫原性活性可通过本发明描述的或本领域其它途径已知的常规方法容易地确定。
由此，本发明还包括具有功能活性(如生物学活性和/或治疗活性)的多肽变体。在其它实施方案中，本发明提供了具有与清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质的一种或多种生物学活性和/或治疗活性对应的功能活性(如生物学活性和/或治疗活性，诸如表1中“生物学活性”栏中所公开的)的清蛋白融合蛋白变体。这样的变体包括根据本领域已知的一般规则选出的删除、插入、倒置、重复及替代，从而对活性几乎无影响。
在其它实施方案中，本发明的变体具有保守替代。“保守替代”指群组内交换，诸如脂肪族或疏水性氨基酸丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸的置换，羟基残基丝氨酸及苏氨酸的置换，酸性残基天冬氨酸及谷氨酸的置换，酰胺残基天冬酰胺及谷氨酰胺的置换，碱性残基赖氨酸、精氨酸及组氨酸的置换，芳香族残基苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的置换，小型氨基酸丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸及甘氨酸的置换。
例如Bowie等人，“Deciphering the Message in Protein SequencesTolerance to Amino Acid Substitutions”，Science2471306-1310，1990中提供了关于如何进行表型沉默的氨基酸替代的指导，其中作者指出有两种主要策略用于研究氨基酸序列对改变的耐受。
如作者所述，蛋白质惊人地耐受氨基酸替代。作者还指出哪些氨基酸变化可能在蛋白质中的某些氨基酸位置是允许的。例如，大多数埋入(在蛋白质的三级结构中)的氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链的特色通常很少是保守的。另外，耐受的保守氨基酸替代涉及脂肪族或疏水性氨基酸丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸的置换，羟基残基丝氨酸及苏氨酸的置换，酸性残基天冬氨酸及谷氨酸的置换，酰胺残基天冬酰胺及谷氨酰胺的置换，碱性残基赖氨酸、精氨酸及组氨酸的置换，芳香族残基苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的置换，小型氨基酸丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸及甘氨酸的置换。
除保守氨基酸替代外，本发明的变体还包括(i)包含一个或多个非保守氨基酸残基的替代的多肽，其中遭到替代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的残基，或(ii)包含一个或多个具有取代基的氨基酸残基的替代的多肽，或(iii)与另一种化合物诸如提高多肽稳定性和/或溶解性的化合物(例如聚乙二醇)融合或化学缀合的多肽，(iv)包含额外氨基酸诸如例如IgG Fc融合区肽的多肽。根据本发明的教授，认为这样的变体多肽属于本领域技术人员的范围内。
例如，包含用其它带电荷或中性氨基酸替代带电荷氨基酸的氨基酸替代的多肽变体可以产生具有改良特征诸如较少聚集的蛋白质。制药学制剂的聚集既降低活性，又因聚集物的免疫原性活性提高清除率。参见Pinckard等人，Clin.Exp.Immunol.2331-340，1967；Robbins等人，Diabetes36838-845，1987；Cleland等人，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Systems10307-377，1993。
在具体实施方案中，本发明的多肽包含或由本发明所述治疗性蛋白质和/或人血清清蛋白、和/或本发明清蛋白融合蛋白的氨基酸序列的片段或变体组成，其中与参考氨基酸序列相比，所述片段或变体具有1-5个、5-10个、5-25个、10-50个或50-150个氨基酸残基添加、替代、和/或删除。在某些实施方案中，氨基酸替代是保守的。编码这些多肽的核酸也包括在本发明中。
本发明的多肽可以由通过肽键或修饰肽键(即肽电子等排体)彼此连接的氨基酸构成，可含有20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。多肽可通过天然过程诸如翻译后加工，或通过本领域众所周知的化学修饰技术进行修饰。这样的修饰在基础教科书及更为详细的专题著作中以及在多卷的研究文献中有详细描述。修饰可发生在多肽中的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链及氨基或羧基末端。应该知道相同类型的修饰可在指定多肽中在几个位点以相同或不同程度存在。另外，指定多肽可含有许多类型的修饰。多肽例如因遍在蛋白化作用可为分支，并可为有分支或无分支的环状。环状、分支及分支环状多肽可由翻译后天然过程产生或通过合成方法制备。修饰包括乙酰化作用、酰化作用、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、亚铁血红素模块的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基作用、共价交联形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化作用、γ-羧化作用、糖基化作用、GPI锚形成、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻基化作用、氧化作用、PEG化作用、蛋白水解加工、磷酸化作用、异戊烯化作用、外消旋作用、硒化、硫酸化作用、转运RNA介导的将氨基酸添加到蛋白质中诸如精氨酰化及遍在化作用。
另外，可将化学实体共价附着至清蛋白融合蛋白以增加或调节特定的功能性或生物学活性，诸如通过Current Opinions in Biotechnology10324，1999中公开的方法。
本发明包括的其它翻译后修饰包括例如由于原核宿主细胞表达引起的N-连接或O-连接糖链、N-末端或C-末端加工、将化学模块附着至氨基酸骨架、N-连接或O-连接糖链的化学修饰、及N-末端甲硫氨酸残基的添加或删除。清蛋白融合蛋白还可用例如但不限于化学治疗剂诸如药物、和/或可检测标记物诸如酶、荧光、同位素和/或亲和标记物进行修饰，使蛋白质得以检测和分离。这样的修饰的实例在例如WO 03/066824及WO 01/79480(第105-106页)中给出，将其引入本发明作为参考。
功能活性“具有功能活性的多肽”指能够表现出与治疗性蛋白质的全长、原蛋白、和/或成熟形式相关的一种或多种已知功能活性的多肽。这样的功能活性包括但不限于生物学活性、抗原性(与抗多肽抗体结合(或与多肽竞争结合)的能力)、免疫原性(产生与本发明特定多肽结合的抗体的能力)、与本发明多肽形成多聚体的能力、以及与多肽的受体或配体结合的能力。
“具有生物学活性的多肽”指根据具有没有剂量依赖性的特定生物学测定法的测量，表现出与本发明治疗性蛋白质包括成熟形式的活性相似但不必相同的活性的多肽。在剂量依赖性存在的情况中，不需要与多肽的相同，但指定活性的剂量依赖性与本发明多肽实质性相似。
在其它实施方案中，本发明清蛋白融合蛋白具有与治疗性蛋白质(或其片段或变体)在未与清蛋白融合时相关的至少一种生物学活性和/或治疗活性。
可以使用本领域已知的常规或修改的测定法及本发明描述的测定法来分析本发明清蛋白融合蛋白的功能活性(如生物学活性)。具体而言，可分析清蛋白融合蛋白的功能活性。另外，本领域技术人员可使用分析IL-11活性的测定法常规分析与本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分对应的治疗性蛋白质片段的活性。另外，本领域技术人员可使用本领域已知的和/或在WO 03/066824及WO 01/79480的实施例部分描述的测定法常规分析与本发明清蛋白融合蛋白的清蛋白蛋白质部分对应的清蛋白蛋白质片段的活性。
另外，本发明描述的(参见实施例和表1)及本领域其它途径已知的测定法可常规用于测量本发明清蛋白融合蛋白及其片段、变体及衍生物引发与本发明清蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分和/或清蛋白部分相关的生物学活性和/或治疗活性(体外或体内)的能力。其它方法为本领域技术人员所知并属于本发明范围内。
融合蛋白的表达本发明清蛋白融合蛋白可作为重组分子由酵母、微生物诸如细菌、或人或动物细胞系分泌而产生。任选地是，多肽由宿主细胞分泌。
对于本发明例示的清蛋白融合蛋白的表达，成功使用了WO 95/33833中例示的HSP150基因遭到破坏的酵母菌株、或WO 00/44772中例示的PMT1基因遭到破坏的酵母菌株(以降低/消除清蛋白融合蛋白的O-连接糖基化作用)、或WO 95/23857中例示的YAP3基因遭到破坏的酵母菌株，连同WO 90/01063中例示的酵母PRB1启动子、HAS/MFα-1融合前导序列、US 5,637,504中例示的酵母ADH1终止子、LEU2选择标记及非整合载体pSAC35。
预期可用于本发明的其它酵母菌株、启动子、前导序列、终止子、标记及载体在WO 03/066824及WO 01/74980(第94-99页)中有描述，将其引入本发明作为参考。
本发明还包括细胞，任选经转化表达本发明清蛋白融合蛋白的酵母细胞。除了经转化宿主细胞本身外，本发明还涉及那些细胞在营养培养基中的培养物，任选单克隆(克隆上同质的)培养物或由单克隆培养物衍生的培养物。如果多肽是分泌的，则培养基将含有多肽，带有细胞，或如果细胞已被过滤或离心去除则不带有细胞。许多表达系统为已知的并可使用，包括细菌(例如大肠杆菌及枯草杆菌)、酵母(酿酒酵母、乳克鲁维氏酵母及巴斯德毕赤氏酵母)、丝状真菌(例如曲霉)、植物细胞、动物细胞及昆虫细胞。
所需蛋白质以常规方法产生，例如由插入宿主染色体或游离质粒中的编码序列产生。使用任何常用方法例如电穿孔以所需蛋白质的编码序列转化酵母。通过电穿孔转化酵母的方法在Becker和Guarente，Methods Enzymol.194182，1990中有描述。
成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞可通过众所周知的技术进行鉴定。例如，可培养由导入表达构建体产生的细胞以产生所需多肽。收获细胞、裂解、并使用诸如Southern，J.Mol.Biol.98503，1975或Berent等人，Biotech.3208，1985描述的方法对DNA内容物检验DNA的存在。或者，可以使用抗体来检测上清液中蛋白质的存在。
有用的酵母质粒载体包括pRS403-406及pRS413-416，一般可从Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA92037，USA获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405及pRS406为酵母整合质粒(YIp)，掺入了酵母选择标记HIS3、TRP1、LEU2及URA3。质粒spRS413-416为酵母着丝粒质粒(YCp)。
用于在酵母中表达以制备清蛋白融合蛋白的载体包括pPPC0005、pScCHSA、pScNHSA、及pC4HAS，它们于2001年4月11日保藏于美国典型培养物保藏中心，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia20110-2209，且在WO 03/066824及WO 01/79480中有描述，将其引入本发明作为参考。
期望可用于在酵母中表达清蛋白融合蛋白的另一种载体为pSAC35载体，它在Sleep等人，BioTechnology 842，1990中有描述，将其完整引入本发明作为参考。质粒pSAC35为US 5,637,504中描述的非整合类载体。
已开发许多方法用于经互补粘端将DNA与载体可操作连接。例如，可以将互补同聚物束添加至将要插入载体DNA中的DNA片段。然后，将载体及DNA片段通过互补同聚物尾之间氢键连接以形成重组DNA分子。
含有一种或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA片段和载体的方法。将通过限制性内切核酸酶消化产生的DNA片段用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I进行处理，这些酶以其3′-5′外切核酸水解活性消除凸出的5′单链末端，并用聚合活性填平凹进的3′末端。因此，这些活性的结合产生末端补平的DNA片段。然后，在存在能够催化平端DNA分子连接的酶诸如噬菌体T4 DNA连接酶的条件下将末端补平的DNA片段与摩尔数大大过量的接头分子一起保温。由此，反应产物为在其末端携带多聚接头序列的DNA片段。然后，用合适的限制酶切割这些DNA片段，并与已用产生与DNA片段末端匹配的末端的酶切割过的表达载体进行连接。
含有多种限制性内切核酸酶位点的合成接头可从许多商业来源购得。
如果例如要制备HA变体的话，根据本发明修饰DNA的一种理想方法为使用Sailci等人，Science239487-491，1988公开的聚合酶链式反应。在此方法中，酶促扩增的DNA的侧翼即两种特异的寡核苷酸引物，它们本身掺入扩增的DNA中。特异引物可含有限制性内切核酸酶识别位点，使用本领域已知的方法可用于克隆到表达载体中。
设想可作为表达清蛋白融合蛋白的宿主用于本发明实践的酵母的例示属有毕赤氏酵母属(Pichia)(从前归入汉逊酵母属Hansenula)、糖酵母属(Saccharomyces)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、孢圆酵母属(Torulaspora)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、固囊酵母属(Citeromyces)、囊酵母属(Pachysolen)、接合糖酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、木霉属(Trichoderma)、头孢属(Cephalosporium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属(Neurospora)、亚罗氏酵母(Yarrowia)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、红冬孢属(Rhodosporidium)、白冬孢酵母(Leucosporidium)、Botryoascus、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、拟内孢霉属(Endomycopsis)等等。属包括选自下组的属糖酵母属、裂殖糖酵母属、克鲁维氏酵母属、毕赤氏酵母属、及Torulaspora。糖酵母属的实例为啤酒糖酵母(S.cerevisiae)、意大利糖酵母(S.italicus)及鲁式糖酵母(S.rouxii)。其它物种的实例及其转化方法在WO 03/066824及WO 01/79480(第97-98页)中有描述，将其引入本发明作为参考。
用于转化酿酒酵母的方法在EP 251744、EP 258067及WO 90/01063中有概括教授，将它们都引入本发明作为参考。适用于酿酒酵母的启动子包括与PGKI基因、GAL1或GAL10基因、CYCI、PH05、TRPI、ADHI、ADH2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸盐脱羧酶、磷酸果糖激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶、葡糖激酶的基因、α-交配因子信息素(一种交配因子外激素)有关的启动子、PRBI启动子、GUT2启动子、GPDI启动子、及牵涉部分5’调控区与部分其它启动子5’调控区或与上游激活位点(如EP-A-258067的启动子)的杂合体的杂合启动子。
用于粟酒裂殖糖酵母的便于调节的启动子为如Maundrell，J.Biol.Chem.26510857-10864，1990描述的来自nmt基因的硫胺素可抑制启动子，以及如Hoffman和Winston，Genetics124807-816，1990描述的葡萄糖可抑制jbp1基因启动子。
转化毕赤氏酵母以表达外源基因的方法在例如Cregg等人，1993及各种Phillips专利(如US 4 857 467，将其引入本发明作为参考)中有教授，毕赤氏酵母表达试剂盒可从Invitrogen BV，Leek，Netherlands及Invitrogen公司，San Diego，California购得。合适的启动子包括AOX1及AOX2。Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.1323459-3465，1986包括有关汉逊氏酵母载体及转化的信息，合适的启动子为MOX1及FMD1；而EP 361991，Fleer等人，1991及Rhone-Poulenc Rorer的其它出版物教授如何在克鲁维氏酵母中表达外源蛋白。
转录终止信号可为含有转录终止及多腺苷酸化的合适信号的真核基因3′侧翼序列。合适的3′侧翼序列可为例如基因中与所用表达控制序列天然连接的那些，即可与启动子相对应。或者，它们可以是不同的，在那种情况中，任选使用酿酒酵母ADH1基因的终止信号。
所需清蛋白融合蛋白可最初以分泌前导序列表达，它可为在所选择的酵母中有效的任何前导序列。在酿酒酵母中有用的前导序列包括来自交配因子多肽(MFα1)的前导序列及EP-A-387319的杂合前导序列。这样的前导序列(或信号)在成熟清蛋白释放到周围培养基中之前由酵母切除。另外，这样的前导序列包括JP 62-096086(授权号为911036516)中公开的酿酒酵母转化酶(SUC2)、酸性磷酸酶(PHO5)、MFα-1的前序列、β-葡聚糖酶(BGL2)及杀伤毒素、糖化糖酵母(S.dastaticus)葡萄糖淀粉酶II、卡尔斯伯糖酵母(S.carlsbergensis)α-半乳糖苷酶(MEL1)、乳克鲁维氏酵母杀伤毒素、及假丝酵母葡萄糖淀粉酶的前导序列。
清蛋白融合蛋白的重组及合成生产的其它方法本发明包括编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸，以及含有这些多核苷酸的载体、宿主细胞及生物体。本发明还包括通过合成及重组技术生产本发明清蛋白融合蛋白的方法。多核苷酸、载体、宿主细胞及生物体可通过本领域已知的方法分离及纯化。
可用于本发明的载体可为例如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明多核苷酸的载体为能够在期望复制和/或表达多核苷酸的宿主中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般而言，多核苷酸和/或载体可用于任何细胞，无论真核或原核，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CHO、NSO及幼仓鼠肾细胞)或小鼠(如L细胞)细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。各种类型宿主细胞的合适载体的例子参见如Ausubel，F.等人，《Current Protocols in Molecular Biology》，Greene Publishing Associates及Wiley-Interscience，1992及Sambrook等人，1989。然而，应该注意到在使用复制缺陷的逆转录病毒载体时，病毒一般仅在互补的宿主细胞中增殖。
含有这些多核苷酸的宿主细胞可用于表达大量的蛋白质，它们可用于如药物、诊断剂、疫苗及治疗剂。可通过本领域已知的或本发明描述的方法分离及纯化蛋白质。
可将编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸与含有用于在宿主中增殖的选择标记的载体连接。通常，可将质粒载体掺入沉淀物，诸如磷酸钙沉淀物，或是与带电荷脂质的复合物。如果载体是病毒，可在体外用合适的包装细胞系进行包装，然后转导到宿主细胞中。
应将多核苷酸插入片段与待合适启动子可操作连接，该启动子与将要表达该多核苷酸的宿主细胞相容。启动子可为强启动子和/或可诱导启动子。启动子的实例包括λ噬菌体PL启动子，大肠杆菌lac、trp、phoA及tac启动子，SV40早期及晚期启动子，及逆转录病毒LTR启动子，仅列举少数。其它合适启动子为熟练技术人员已知。表达构建体进一步包含转录起始、终止的位点及在转录区中用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的转录本的编码部分可在待翻译多肽的起点包含翻译起始密码子并在终点的合适位置包含终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如本发明所示，表达载体可包含至少一种选择标记。这样的标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合成酶、或新霉素抗性，以及用于培养大肠杆菌及其它细菌的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的代表性实例包括但不限于细菌细胞，诸如大肠杆菌、链霉菌属及鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，诸如酵母细胞(如酿酒酵母细胞或巴斯德毕赤氏酵母(ATCC编号201178))；昆虫细胞，诸如果蝇S2及Spodoptera Sf9细胞；动物细胞，诸如CHO、COS、NSO、293及Bowes黑素瘤细胞；及植物细胞。适用于上述宿主细胞的培养基及培养条件为本领域已知。
在一个实施方案中，编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可与信号序列融合，该信号序列将指导本发明蛋白质定位至原核或真核细胞的特定隔室，和/或指导本发明蛋白质由原核或真核细胞分泌。例如，在大肠杆菌，希望指导蛋白质表达至周质空间。本发明清蛋白融合蛋白可与之融合以指导多肽表达至细菌周质空间的信号序列或蛋白质(或其片段)的实例包括但不限于pelB信号序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列、MBP、ompA信号序列、周质大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基的信号序列及碱性磷酸酶的信号序列。可用于构建将指导蛋白质定位的融合蛋白的数种载体可通过商业途径获得，诸如可从New England Biolabs获得的pMAL系列载体(特别是pMAL-p系列)。在一个具体实施方案中，编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸可与pelB果胶酸裂合酶信号序列融合以提高所述多肽在革兰氏阴性细菌中的表达及纯化效率。参见美国专利号5,576,195及美国专利号5,846,818，将其内容完整引入本发明作为参考。
可用于与本发明清蛋白融合蛋白融合以指导其在哺乳动物细胞中分泌的信号肽的实例包括但不限于MPIF-1信号序列(如GenBank编号AAB51134的1-21位氨基酸)、斯钙素(stanniocalcin)信号序列(MLQNSAVLLLLVISASA，SEQ ID NO10)及共有信号序列(MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG，SEQ ID NO11)。可与杆状病毒表达系统结合使用的合适信号序列是gp67信号序列(如GenBank编号AAA72759的1-19位氨基酸)。
使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作为选择标记的载体可分别在存在药物甲硫氨酸砜亚胺(methione sulphoximine)或甲氨喋呤的条件下进行扩增。基于谷氨酰胺合酶的载体的一个优点是可使用谷氨酰胺合酶阴性的细胞系(如鼠骨髓瘤细胞系，NSO)。通过提供其它抑制物来阻止内源基因发挥功能，谷氨酰胺合酶表达系统还可在谷氨酰胺合酶表达细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中起作用。谷氨酰胺合酶表达系统及其成分在如下PCT发表物中有详细描述WO 87/04462、WO 86/05807、WO 89/01036、WO89/10404、及WO 91/06657，将其完整引入本发明作为参考。另外，谷氨酰胺合酶表达载体可从Lonza Biologics公司(Portsmouth，NH)获得。
使用GS表达系统在鼠骨髓瘤细胞中表达及生产单克隆抗体在Bebbington等人，Bio/techhology10169，1992及Biblia和Robinson，Biotechnol.Prog.111，1995中有描述，将其引入本发明作为参考。
本发明还涉及含有载体构建体的宿主细胞，诸如本发明所描述的，另外还包括含有通过本领域已知技术与一种或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作连接的本发明核苷酸序列的宿主细胞。宿主细胞可为高等真核细胞，诸如哺乳动物细胞(如人衍生细胞)，或低等真核细胞，诸如酵母细胞，或者宿主细胞可为原核细胞，诸如细菌细胞。可选择调节所插入基因序列的表达并以所需特定方式加工基因产物的宿主菌株。由某些启动子的表达可在存在某些诱导物的条件下提高，由此可控制基因工程多肽的表达。另外，不同的宿主细胞具有蛋白质翻译和翻译后加工及修饰(如磷酸化、切割)的特征及特定机制。可选择合适的细胞系以确保所表达外源蛋白质的所需修饰和加工。
将本发明核酸及核酸构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法来实现。这样的方法在许多标准实验室手册里有描述，诸如Davis等人，《Basic Methods In Molecular Biology》，1986。特别设想了，本发明的多肽实际上可由缺乏重组载体的宿主细胞表达。
除了包括本发明描述的含有载体构建体的宿主细胞以外，本发明还包括脊椎动物起源的，特别是哺乳动物起源的原代、继代、及永生化宿主细胞，它们经改造以删除或置换内源遗传物质(如与治疗性蛋白质对应的编码序列可用与治疗性蛋白质对应的清蛋白融合蛋白置换)，和/或包含遗传物质(如可包含异源多核苷酸序列，诸如例如与治疗性蛋白质对应的本发明清蛋白融合蛋白)。与内源多核苷酸可操作连接的遗传物质可激活、改变、和/或扩增内源多核苷酸。
另外，本领域已知的技术可用于通过同源重组使异源多核苷酸(如编码清蛋白蛋白质或其片段或变体的多核苷酸)和/或异源控制区(如启动子和/或增强子)与编码治疗性蛋白质的内源多核苷酸序列可操作连接(参见如US 5,641,670；WO 96/29411；WO 94/12650；Koller等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA868932-8935，1989；及Zijlstra等人，Nature342435-438，1989，将每一篇的公开书完整引入本发明作为参考)。
有利地，本发明清蛋白融合蛋白可通过众所周知的方法从重组细胞培养物回收及纯化，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲合层析、羟磷灰石层析、疏水电荷相互作用层析及凝集素层析。在有些实施方案中，高效液相层析(“HPLC”)可用于纯化。
在有些优选的实施方案中，本发明清蛋白融合蛋白使用上文列出的一种或多种层析方法进行纯化。在其它实施方案中，本发明清蛋白融合蛋白使用一种或多种下述层析柱进行纯化，Q Sepharose FF柱、SP Sepharose FF柱、Q Sepharose高效柱、Blue Sepharose FF柱、Blue柱、苯基Sepharose FF柱、DEAE Sepharose FF或甲基柱。“Sepharose”是商标。
另外，本发明清蛋白融合蛋白可使用WO 00/44772中描述的方法进行纯化，将其完整引入本发明作为参考。本领域技术人员可容易地修改其中描述的方法，以用于纯化本发明清蛋白融合蛋白。
可以由通过重组技术从真核或原核宿主产生的产物中回收本发明清蛋白融合蛋白，包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫及哺乳动物细胞。根据在重组生产过程采用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。另外，本发明清蛋白融合蛋白也可包含在某些情况下是由于宿主介导的过程产生的初始修饰甲硫氨酸残基。由此，本领域众所周知的是由翻译起始密码子编码的N-末端甲硫氨酸通常在所有真核细胞中在翻译后由任何蛋白质高效消除。尽管在大多数原核生物中大多数蛋白质上的N-末端甲硫氨酸也遭到有效消除，但对于有些蛋白质来说，根据N-末端甲硫氨酸与之共价连接的氨基酸的本质，原核生物中的消除过程是无效的。
可将本发明清蛋白融合蛋白及结合治疗性蛋白质或其片段或变体的抗体与标记序列诸如肽融合，以便于纯化。在一个实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，诸如pQE载体(QIAGEN公司，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)中提供的标签，等等，其中许多可通过商业途径购得。如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86821-824，1989中所述，例如六组氨酸为融合蛋白提供了方便的纯化。其它可用于纯化的肽标签包括但不限于“HA”标签，对应于衍生自流感血凝素蛋白质的表位(Wilson等人，Cell37767，1984)，及“FLAG”标签。
另外，可将本发明清蛋白融合蛋白与治疗性模块诸如细胞毒素，如抑制细胞或杀死细胞的试剂、治疗剂或放射性金属离子，如α发射源诸如例如213Bi缀合。这样的制剂的实例在WO 03/066824及WO 01/79480(第107页)中有描述，将其引入本发明作为参考。
还可将清蛋白融合蛋白附着于固相支持物，特别可用于本发明清蛋白任何代表所结合的、与之结合的、或与之联合的多肽的免疫分析或纯化。这样的固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
本发明还提供了本发明清蛋白融合蛋白的化学修饰衍生物，它可提供其它优点，诸如提高多肽的溶解性、稳定性及循环时间增加，或降低免疫原性(参见美国专利号4,179,337)。有关聚乙二醇使用的实例在WO 01/79480(第109-111页)中有描述，将其引入本发明作为参考。
本发明清蛋白融合蛋白的存在及数量可使用本领域众所周知的免疫测定法ELISA来确定。
多肽的用途本发明鉴定的每一种多肽可以多种方式使用。下面的描述应认为是例示性的，并采用已知技术。
本发明清蛋白融合蛋白可用于哺乳动物，优选人中的各种紊乱的治疗、预防和/或诊断。这样的紊乱包括但不限于血小板减少症、冯维勒布兰德氏病(vWD)及炎性疾病，诸如炎性肠病(IBD)。
另外，本发明清蛋白融合蛋白可用于治疗或预防疾病或状况。另外，本发明清蛋白融合蛋白可用作预防措施。清蛋白融合蛋白可用于测定生物学样品中的多肽水平。本发明清蛋白融合蛋白还可用于引发抗体，后者可用于测量来自重组细胞的治疗性蛋白质、清蛋白蛋白质、和/或本发明清蛋白融合蛋白的蛋白质表达，作为评估宿主细胞转化的方法，或用于测量生物学样品中的蛋白质表达。另外，本发明清蛋白融合蛋白可用于测试本发明描述的生物学活性。
转基因生物体表达本发明清蛋白融合蛋白的转基因生物体也包括在本发明中。转基因生物体为经重组、外源或克隆遗传物质转染的遗传修饰生物体。这样的遗传物质常称为转基因。转基因的核酸序列可包含一种或多种转录调控序列及其它核酸序列诸如内含子，它们可能是所编码蛋白质的最佳表达和分泌所必需的。转基因可设计成指导所编码蛋白质以这样的方式表达，即有利于由生物体或由生物体产生的产物如生物体的乳汁、血液、尿液、卵、毛发或种子中回收该蛋白质。转基因可由自与靶动物物种相同的物种或不同的物种的基因组衍生的核酸序列组成。转基因可整合至基因组中该特定核酸序列在其它情况下通常未发现的基因座或该转基因的正常基因座。
术语“种系细胞系转基因生物体”是指这样的转基因生物，其中将遗传改变或遗传信息导入种系细胞，从而赋予转基因生物体将遗传信息传递给后代的能力。如果这样的后代实际上具有一些或所有该改变或遗传信息，那么它们也是转基因生物体。该改变或遗传信息对于受者所述的生物体物种可以是外源的，外源仅就特定个体受者而言，或者可为受者已具有的遗传信息。在后一种情况中，改变的或引入的基因的表达可与天然基因有所不同。
转基因生物体可为转基因人、动物或植物。转基因体可通过多种不同方法产生，包括转染、电穿孔、显微注射、胚胎干细胞中的基因打靶及重组病毒和逆转录病毒感染(参见如美国专利号4,736,866；美国专利号5,602,307；Mullins等人，Hypertension 22(4)630-633，1993；Brenin等人，Surg.Oncol.6(2)99-110，1997；Tuan编，Recombinant Gene Expression Protocols，《Methods in Molecular Biology》，No.62，Humana Press，1997)。将核酸片段导入重组的胜任的哺乳动物细胞的方法可为有利于多种核酸分子共转化的任何方法。本领域技术人员可容易获得用于产生转基因动物的详细流程，包括美国专利号5,489,743及美国专利号5,602,307中公开的方法。WO 03/066824及WO 01/79480(第151-162页)描述了其它信息，将其引入本发明作为参考。
基因疗法编码本发明清蛋白融合蛋白的构建体可用作基因治疗方案的一部分，以投递治疗有效剂量的清蛋白融合蛋白。用于在体内将核酸导入细胞的一种方法是通过使用含有编码本发明清蛋白融合蛋白的核酸的病毒载体。用病毒载体感染细胞具有的优点是大部分靶细胞可接受核酸。另外，在病毒载体内编码的分子，如病毒载体中含有的cDNA在接纳了病毒载体核酸的细胞中高效表达。所述清蛋白融合蛋白延长的质粒半衰期甚至可补偿潜在的低表达水平。
逆转录病毒载体及腺伴随病毒载体可用作在体内转移编码清蛋白融合蛋白的外源核酸分子的重组基因投递系统。这些载体提供使核酸进入细胞的高效投递，且所转移的核酸稳定整合到宿主的染色体DNA中。这样的载体的实例、使用它们的方法、及其优点以及非病毒投递方法在WO 03/066824及WO 01/79480(第151-153页)中有详细描述，将其引入本发明作为参考。
编码本发明清蛋白融合蛋白的基因的基因投递系统可通过多种方法中的任何一种导入患者体内。例如，基因投递系统的药学制剂可通过例如静脉内注射而系统导入，而蛋白质在靶细胞中的特异转导主要因由基因投递载体提供的转染特异性、由于控制报告基因表达的转录调控序列引起的细胞类型或组织类型表达、或其组合而发生。在其它实施方案中，重组基因的最初投递更多的因导入动物具有相当局限性而受到限制。例如，基因投递载体可通过导管(见美国专利号5,328,470)或通过定向注射(如Chen等人，PNAS 913054-3057，1994)导入。基因疗法构建体的药学制剂可本质上由可接受稀释剂中的基因投递系统组成，或者可含有基因投递载体埋入其中的缓释基质。在清蛋白融合蛋白可从重组细胞，如逆转录病毒载体完整产生的情况中，药学制剂可含有产生清蛋白融合蛋白的一种或多种细胞。其它基因治疗方法在WO 03/066824及WO 01/79480(第153-162页)中有描述，将其引入本发明作为参考。
药物组合物或治疗性组合物本发明清蛋白融合蛋白或其配制剂可通过任何常规方法施用，包括肠胃外(如皮下或肌肉内)注射或静脉内输液。治疗可以由单次服药或一段时间的多次服药组成。另外，单次服药或多次服药以低于未与清蛋白融合的治疗性蛋白质的频率施用。
尽管有可能单独施用本发明清蛋白融合蛋白，但是期望它连同一种或多种可接受载体以制药学配制剂存在。载体就与清蛋白融合蛋白相容且对其受者无害而言必须是“可接受的”。通常，载体为无菌且无热原的水或盐水。本发明清蛋白融合蛋白因为其在溶液中延长的保质期特别适于在水性载体诸如无菌无热原的水、盐水或其它等渗溶液中进行配制。例如，本发明的药物组合物可事先以水性形式很好地进行配制，例如在配药前数周或数月或更长时间。
考虑到清蛋白融合蛋白在水性配制剂中延长的保质期，可制备含有清蛋白融合蛋白的配制剂。如上所述，许多这些治疗性蛋白质在与HA融合后其保质期显著增加或延长。
在气雾剂施用是合适的情况中，本发明清蛋白融合蛋白可使用标准流程配制成气雾剂。术语“气雾剂”包括本发明清蛋白融合蛋白的任何气生悬浮相，它能够吸入细支气管或鼻道。具体而言，气雾剂包括本发明清蛋白融合蛋白的气生悬浮液小滴，可在计量服药吸入器或雾化器或在喷雾器中生成。气雾剂还包括本发明化合物悬浮在空气或其它载体气体中的干粉组合物，它可使用例如吸入器装置通过吸入而投递。
配制剂可方便地以单位剂量形式呈现，并可通过药学领域众所周知的任何方法进行制备。所述方法包括使清蛋白融合蛋白与构成一种或多种助剂的载体结合。一般而言，配制剂通过使活性成分与液体载体或精细分裂的固体载体或二者兼之均匀及密切结合而制备，然后，如果需要的话，使产物成型。
适于肠胃外施用的配制剂包括水性及非水性无菌注射溶液，它可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂及使得配制剂适于预期受者的溶质；以及水性及非水性无菌悬浮液，它可含有悬浮剂及增稠剂。这些配制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶、小药瓶或注射器，并可贮存在冷冻-干燥(冻干)条件下，仅在临使用前需要添加无菌液体载体，例如注射用水。现配注射溶液及悬浮液可从无菌粉剂制备。因为许多本发明清蛋白融合蛋白表现出延长的血清半衰期，剂量配制剂可含有与指定治疗性蛋白质的未融合标准配制剂相比较低摩尔浓度或较低剂量的治疗性蛋白质部分。
作为一个实例，当本发明清蛋白融合蛋白包含一个或多个治疗性蛋白质区时，剂量形式可在清蛋白融合蛋白的功效相对于治疗性蛋白质的功效之比率的基础上进行计算，同时考虑与天然治疗性蛋白质相比清蛋白融合蛋白延长的血清半衰期及保质期。例如，在由全长HA与全长治疗性蛋白质融合而组成的清蛋白融合蛋白中，单位形式的等价剂量将表现出更大重量的试剂，但服药频率可降低。
本发明的配制剂或组合物可与关于保质期延长的清蛋白融合蛋白成分的说明书或包装插页一起包装，或一起包括在试剂盒中。例如，所述说明书或包装插页可给出考虑到本发明清蛋白融合蛋白延长的保质期而推荐的贮存条件，诸如时间、温度和光线。所述说明书或包装插页还可给出本发明清蛋白融合蛋白的具体优点，诸如易于贮存可能需要在野外、受控医院以外、临床或诊所条件下的配制剂。如上所述，本发明的配制剂可为水性形式，并可在差于理想环境的条件下贮存而无活性的明显丧失。
本发明还提供了通过在制药学可接受载体中对患者施用有效量的本发明清蛋白融合蛋白或编码本发明清蛋白融合蛋白的多核苷酸(“清蛋白融合蛋白多核苷酸”)来治疗和/或预防疾病或紊乱(诸如例如本发明公开的任何一种或多种疾病或紊乱)的方法。
将要施用的本发明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸的有效剂量可通过本领域技术人员熟知的流程来测定，它们使用本领域技术人员熟知的方法给出了诸如生物学半衰期、生物利用度、及毒性等参数，包括使用来自常规体外及体内研究的数据。
考虑到个体患者的临床状况(尤其是单独使用清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸进行治疗的副作用)、投递部位、施药方法、施药方案、及从业人员知道的其它因素，按照与优良医疗实践一致的方式配制并施用清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸。本发明中使用的“有效量”由此通过此类考虑因素而确定。
例如，确定将投递物质的有效量可取决于许多因素，包括例如物质的化学结构及生物学活性、患者的年龄和体重、需要治疗的确切状况及其严重性、以及施药路径。治疗频率取决于许多因素，诸如每次服药施用的清蛋白融合蛋白或多核苷酸构建体的数量，以及受试者的健康情况和病史。确切数量、服药次数、及服药时间将由主治医师或兽医来确定。
本发明清蛋白融合蛋白及多核苷酸可施用于任何动物，优选哺乳动物及鸟类。优选的哺乳动物包括人、犬、猫、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛、马及猪，特别优选人。
作为一般性建议，本发明清蛋白融合蛋白与未融合治疗性蛋白质相比将以较低剂量(以未融合治疗性蛋白质的摩尔数为基础)服药或以较低频率施药。本发明清蛋白融合蛋白是有益的，因为它们可模拟“经典药物”的持续输液，即对于相同的抑制活性需要较少的蛋白质当量。
清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可通过口服、直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过粉剂、软膏、凝胶剂、滴剂或透皮贴剂)、口含、或口或鼻喷雾来施用。“制药学可接受载体”指任何无毒固体、半固体或液体充填剂、稀释剂、包囊材料或配制剂辅助材料。本发明使用的术语“肠胃外”指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下及关节内注射及输液在内的施药模式。
本发明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸还适于通过持续释放系统来施用，诸如WO 03/066824及WO 01/79480(第129-130页)中所描述的，将其引入本发明作为参考。
对于肠胃外给药，在一个实施方案中，清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸通常这样配制，即在所需纯度以单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液或乳状液)与制药学可接受载体混合，制药学可接受载体即在采用的剂量和浓度对受者无毒并与配制剂其它成分相容的载体。例如，配制剂任选不含氧化剂及已知对治疗剂有害的其它化合物。
本发明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸可单独施用或联合其它治疗剂。可与本发明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸联合施用的治疗剂包括但不限于如WO 03/066824及WO 01/79480(第132-151页)中描述的抗逆转录病毒剂如蛋白酶、逆转录酶、整合酶及组装抑制剂、化学治疗剂、抗生素、甾体及非甾体抗炎剂、常规免疫治疗剂、和/或治疗性处理，将其引入本发明作为参考。联合施药可作为混合物伴随施用，分开但同时施用，或顺序施用。这包括联合的试剂作为治疗性混合物一起施用，还包括联合的试剂分开但同时施用的流程，如通过分开的静脉内路径进入同一个体。“联合”施用还包括首先施用指定化合物或试剂中的一种然后施用第二种的分开施用。
适用于本发明的药物组合物包括其中含有效量的活性成分以达到其预期目的的组合物。在某些实施方案中，本发明清蛋白融合蛋白和/或多核苷酸与抗逆转录病毒剂、核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、和/或蛋白酶抑制剂(PI)联合施用。
本发明还提供了制药学包装或试剂盒，内有充填了含本发明清蛋白融合蛋白的药物组合物的一种或多种成分的一种或多种容器。任选与这样的容器有关的可为由管制药品或生物制品生产、使用或销售的政府机构规定的形式的通告，该通告反映了由该机构批准进行对人施药的生产、使用或销售。
已经概括的描述了本发明，参照下列实施例可更容易的理解本发明，下列实施例是作为示例提供的，并非作为限制。
在没有进一步说明的情况下，应该认为，通过使用前述说明和下述例示性实施例，本领域普通技术人员可制备或利用本发明检测出的改变，并可实践所主张的方法。因此，下述指导性实施例具体指出了本发明的某些实施方案，而且不应解释为以任何方式限制公开的剩余内容。
实施例1清蛋白融合IL-11的制备重组清蛋白表达载体pAYE645和pAYE646在WO 2004/009819中已有描述。含有HSA/MFα-1融合前导序列以及提供合适转录启动子及转录终止子序列的酵母PRBI启动子及酵母ADH1终止子的质粒pAYE645在WO2004/009819中有描述。将质粒pAYE645用限制酶AflII完全消化并用限制酶HindIII部分消化，分离含有酵母PRB1启动子3′端及清蛋白编码序列的DNA片段。用AflII/HindIII消化专利申请书WO 00/44772中描述的质粒pBD2241，并分离含有酵母PRB1启动子5′端及酵母ADHI终止子的DNA片段。然后将来自pAYE645的AflII/HindIIIDNA片段克隆到AflII/HindIIIpDB2241载体DNA片段中，产生质粒pDB2302。用PacI/XhoI完全消化质粒pDB2302，分离6.19kb片段，用T4 DNA聚合酶及dNTP将凹进的末端补平，并重新连接，产生质粒pDB2465。用ClaI使质粒pDB2465线性化，用T4 DNA聚合酶及dNTP将凹进的末端补平，并重新连接，产生质粒pDB2533。用BlnI使质粒pDB2533线性化，用T4 DNA聚合酶及dNTP将凹进的末端补平，并重新连接，产生质粒pDB2534。用BmgBI/BglII完全消化质粒pDB2534，分离6.96kb DNA片段，并与两种双链寡核苷酸接头其中其一连接，即VC053/VC054和VC057/VC058，产生质粒pDB2540，或与VC055/VC056和VC057/VC058连接，产生质粒pDB2541。
VC0535’-GATCTTTGGATAAGAGAGACGCTCACAAGTCCGAAGTCGCT-CACCGGT-3’(SEQ ID NO1)VC0545’-pCCTTGAACCGGTGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCTCT-CTTATCCAAA-3’(SEQ ID NO2)VC0555’-GATCTTTGGATAAGAGAGACGCTCACAAGTCCGAAGTCG-CTCATCGAT-3’(SEQ ID NO3)VC0565’-pCCTTGAATCGATGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCTCTCT-TATCCAAA-3’(SEQ ID NO4)VC0575’-pTCAAGGACCTAGGTGAGGAAAACTTCAAGGCTTTGGTCT-TGATCGCTTTCGCTCAATACTTGCAACAATGTCCATTCGAAGATCAC-3’(SEQ ID NO5)
VC058 5’-GTGATCTTCGAATGGACATTGTTGCAAGTATTGAGCGAAAGCGA-TCAAGACCAAAGCCTTGAAGTTTTCCTCACCTAGGT-3’(SEQ ID NO6)将人IL-11cDNA样品从100ng.mL-1至10pg.mL-1系列稀释(10倍增量)。设计PCR引物CF59(SEQ ID No7)及CF60(SEQ ID No12)，使得将IL-11cDNA作为N末端清蛋白融合蛋白克隆到用BglII及ClaI线性化的pDB2541中，同时由IL-11编码区删除编码N末端脯氨酸的密码子。每一种引物的DNA序列如下CF59HSA/MFα-1BalII融合前导序列 IL-115’-CGATAGATCTTTGGATAAGAGAGGGCCACCACCTGGCCCCC-CTCGAGTTTCCCC-3’CF60ClaI清蛋白 IL-115’-GGCCATCGATGAGCGACTTCGGACTTGTGAGCGTCCAGCCGAGT-CTTCAGCAGCAGCAGTCCCCTC-3’混合物原液制备如下2mM MgCl2PCR缓冲液，10μM PCR dNTP，0.2μM CF59，0.2μM CF60，2U FastStart Taq.DNA聚合酶。将1μl IL-11cDNA(10pg、100pg、1ng、10ng、100ng)添加到49ul反应混合液中。总反应体积为50μl。Perkin-Elmer Thermal Cycler 9600编程如下95℃变性4分钟[保持]，然后[循环]95℃变性30秒，45℃退火30秒，72℃延伸60秒，20个循环，然后[保持]72℃600秒，然后[保持]4℃。通过凝胶电泳分析PCR扩增产物，观察到预期大小(0.59kb)的一条带。使用Gene Clean III试剂盒(BI0101公司)从1％(w/v)琼脂糖TAE凝胶分离0.59kb DNA片段。
用限制性内切核酸酶BglII/ClaI完全消化PCR DNA片段，将0.58kb片段连接到6.15kb pDB2541BglII/ClaI载体DNA片段中，产生质粒pDB2567。
合适的酵母载体序列由“非整合”质粒pSAC35提供，该质粒公开于EP-A-286424中并描述于Sleep，D.等人，1991，Bio/Technology9，183-187中。从pDB2567分离3.52kb NotI N末端(des-pro)IL-11-清蛋白表达盒，纯化，并连接到用小牛小肠磷酸酶处理过的NotI消化的pSAC35中，产生与LEU2选择性标记方向相同含有NotI表达盒的质粒pDB2569及与LEU2选择标记方向相反含有NotI表达盒的质粒pDB2570。
设计PCR引物CF61及CF62，使得将IL-11cDNA作为C末端清蛋白融合蛋白克隆到用Bsu36I线性化并用HindIII部分消化的pDB2243中，同时在IL-11开放读码框3′末端添加两个“TAA”翻译终止密码子。在专利申请书WO 00/44772中描述的、含有酵母PRB1启动子和酵母ADH1终止子的质粒pDB2243提供了合适的转录启动子和转录终止子序列。CF61(SEQ IDNo13)及CF62(SEQ ID No14)引物的DNA序列如下CF61Bsu36I清蛋白IL-115’-CCGGCCTTAGGCTTACCTGGGCCACCACCTGGCCCCCCTCG-AGTTTCCCC-3’CF62HindIII IL-115’-GGCCAAGCTTATTACAGCCGAGTCTTCAGCAGCAGCAGTCCCCTC-3’终止 终止混合物原液制备如下2mM MgCl2PCR缓冲液，10μM PCR dNTP，0.2μM CF62，0.2μM CF60，2U FastStart Taq.DNA聚合酶。将1μl IL-11 cDNA(10pg、100pg、1ng、10ng、100ng)添加到49μl反应混合液中。总反应体积为50μl。Perkin-Elmer Thermal Cycler 9600编程如下95℃变性4分钟[保持]，然后[循环]95℃变性30秒，45℃退火30秒，72℃延伸60秒，20个循环，然后[保持]72℃600秒，然后[保持]4℃。通过凝胶电泳分析PCR扩增产物，观察到预期大小(0.55kb)的一条带。使用Gene Clean III试剂盒(BI0101公司)从1％(w/v)琼脂糖TAE凝胶分离0.55kb DNA片段。
用限制性内切核酸酶Bsu36I/HindIII完全消化PCR DNA片段，将0.55kb片段连接到6.19kb pDB2243 Bsu36I，HindIII部分消化的载体DNA片段连接以制备质粒pDB2568。
合适的酵母载体序列由“非整合”质粒pSAC35提供，该质粒公开于EP-A-286424中并描述于Sleep，D.等人，1991，Bio/Technology9，183-187中。从pDB2568分离3.53kb NotI C末端清蛋白-IL-11表达盒，纯化，并连接到用小牛小肠磷酸酶处理过的NotI消化的pSAC35中，产生与LEU2选择性标记方向相同含有NotI表达盒的质粒pDB2571及与LEU2选择标记方向相反含有NotI表达盒的质粒pDB2572。如Sleep，D.等人，2001，Yeast18，403-421所述，将WO 95/23857、WO95/33833及WO 94/04687中公开的酵母菌株转化成亮氨酸原养型。将转化子点种到缓冲极限培养基(BMM，见Kerry-Williams，S.M.等人，1998，Yeast14，161-169)上，并于30℃培育至充分生长以备进一步分析。
N末端IL-11-清蛋白融合蛋白开放读码框的DNA序列形成SEQ ID No15。
N末端IL-11-清蛋白融合蛋白的氨基酸序列见序列SEQ ID No16。
成熟N末端IL-11-清蛋白融合蛋白的氨基酸序列见序列SEQ ID No17。
GPPPGPPRVSPDPRAELDSTVLLTRSLLADTRQLAAQLRDKFPADGDHNLDSLPTLAMSAGALGALQLPGVLTRLRADLLSYLRHVQWLRRAGGSSLKTLEPELGTLQARLDRLLRRLQLLMSRLALPQPPPDPPAPPLAPPSSAWGGIRAAHAILGGLHLTLDWAVRGLLLLKTRLDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLC末端清蛋白-IL-11融合蛋白开放读码框的DNA序列形成SEQ ID No18。
C末端清蛋白-IL-11融合蛋白的氨基酸序列见序列SEQ ID No19。
成熟C末端清蛋白-IL-11融合蛋白的氨基酸序列见序列SEQ ID No20。
实施例2纯化C末端IL-11纯化
C末端IL-11融合蛋白含有高水平的修剪(即非全长)物质。使用WO00/44772中描述的标准rHA SP-FF条件进行纯化，但采用反相模式(negativemode)，由此融合蛋白位于流出液中。将流出液调至pH8及2.5mS.cm-1，并上样到用15mM四硼酸钾平衡的标准rHA DE-FF上。这是在反相模式下操作的。将DE-FF流动液的电导率提高至15mS.cm-1，并通过标准rHA DBA层析纯化物质，额外用溶于平衡缓冲液的50mM辛酸盐进行洗脱。然后浓缩物质，并用300mM甘氨酸，10mM磷酸盐pH7渗滤。
N末端IL-11纯化(A型)N末端IL-11含有一些修剪物质。使用WO 00/44772中描述的标准rHASP-FF条件进行纯化。大部分位于流出液中，但结合的足够用含有200mMNaCl的标准洗脱缓冲液洗脱是必要的。然后将洗脱液调至pH8及2.5mS.cm-1，并使用用15mM四硼酸钾平衡的标准rHADE-FF进行纯化。用标准rHA洗脱缓冲液对DE-EF进行洗脱。然后，将纯化的物质浓缩，并用300mM甘氨酸，10mM磷酸盐pH7渗滤。
N末端IL-11纯化(B型)N末端IL-11含有一些修剪物质。根据标准rHA SP-FF条件使用S-Sepharose-FF柱分离该物质。游离rHA保留在柱上。然后，将流出液中的融合蛋白吸附到清蛋白特异的单克隆抗体Sepharose上。用高盐洗柱，并于pH2.5洗脱。将洗脱液调至中性pH，浓缩，并用300mM甘氨酸，10mM磷酸盐pH7渗滤。
纯化后的蛋白质鉴定表1IL-11清蛋白融合蛋白的鉴定

12％梯度SDS非还原性凝胶及Western印迹显示于图11。
实施例3兔单次静脉内或皮下施药后的清蛋白融合IL-11与重组人 IL-11的药物动力学对比每组三只雄兔及三只雌兔于第0天通过单次静脉内或皮下注射接受Neumega_IL-11(100μg/kg)或C末端清蛋白融合IL-11(440μg/kg)。在基线、静脉内施用各测试物质后5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时(1天)、48小时(2天)、72小时(3天)、5天、7天、9天、11天及14天以及在基线、皮下注射后30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时(1天)、48小时(2天)、72小时(3天)、5天、7天、9天、11天及14天采集血液样品，用于测定各抗原水平。Neumega_IL-11及C末端清蛋白融合IL-11的剂量是在等摩尔的基础上计算的。
IL-11血浆水平的测量人IL-11血浆水平是通过Quantikine_人IL-11免疫测定法(R&DSystems，产品目录编号D1100)测量的。该测定法采用定量三明治酶免疫测定技术。将IL-11特异的鼠单克隆抗体包被到微量滴定板上。用移液器将标准品和样品加到孔中，任何存在的IL-11被固定化抗体所结合。洗去未结合物质后，将IL-11特异的酶联多克隆抗体加到孔中。在洗去任何未结合抗体-酶试剂后，将底物溶液加到孔中，显色程度与起始步骤中结合的IL-11数量成正比。终止显色，并测量颜色强度。
融合蛋白与未融合蛋白在兔中的血浆半衰期比较在每一个时间点的IL-11浓度的平均值及标准偏差显示于图1(静脉内处理组)及图2(皮下处理组)。
在静脉内处理的动物中，在Neumega_IL-11组注射后1天和清蛋白融合IL-11组注射后9天可发现高于100pg/ml的水平。
在皮下处理的动物中，Neumega_IL-11组的水平在注射后6小时左右达到其峰值，并在略短于2天的时间里维持在高于100pg/ml的水平(图2)。清蛋白融合IL-11组在注射后24小时达到其峰值，并在恰好7天之内维持在高于100pg/ml的水平。
药物动力学结果见表2(静脉内处理组)和表3(皮下处理组)。
表2静脉内施药后的药物动力学结果

表3皮下施药后的药物动力学结果

*分散因子＝exp[标准偏差(log-变换值)]兔皮下施药与静脉内施药的比较静脉内应用后C末端清蛋白融合IL-11显示的平均清除半衰期比Neumega_IL-11长8倍(表4)。曲线下面积大35倍。皮下注射后，C末端清蛋白融合IL-11的平均清除半衰期比Neumega_IL-11长4倍(表4)。曲线下面积大14倍。
表4不同物质间生物利用度的比较

皮下较静脉内的Neumega_生物利用度比值为78％(表5)，而对于C末端清蛋白融合蛋白计算值是31％。
表5应用路径间生物利用度的比较

实施例4大鼠静脉内或皮下施药后的清蛋白融合IL-11与重组人 IL-11的药物动力学比较每组3只大鼠于第0天通过单次静脉内或皮下注射接受Neumega_IL-11(100μg/kg)或N末端清蛋白融合IL-11(A型)(440μg/kg)。在如下时间点采集血液样品，用于测定各抗原水平注射前、注射后2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、8小时、24小时、48小时、72小时(3天)、5天、7天。Neumega_IL-11及N末端清蛋白融合IL-11的剂量是在等摩尔的基础上计算的。
研究设计IL-11血浆水平的测量第1组和第3组的血浆水平(Neumega_IL-11)是如上文实施例3所述通过Quantikine_人IL-11免疫测定法(R&D Systems，产品目录编号D1100)的抗人IL-11 ELISA测量的。第2组和第4组的血浆水平(IL-11-AFP)是通过抗人清蛋白ELISA测量的。此测定法的标准品为IL-11-AFP。
融合蛋白和未融合蛋白在大鼠中的血浆半衰期比较在静脉内处理的动物中(图3)，在Neumega_组注射后的6至12小时及在清蛋白融合IL-11组注射后的3天发现高于0.1ng/ml的水平。在皮下处理的动物中(图4)，Neumega_IL-11组的水平在注射后1小时内达到其峰值，并在约9个小时的时间里维持在高于0.1ng/ml的水平。清蛋白融合IL-11组的水平在注射后2至8小时之间达到其峰值，并在至少44个小时的时间里维持在高于0.1ng/ml的水平。
静脉内处理组的药物动力学结果显示于表6，皮下处理组的药物动力学结果显示于表7。
表6静脉内施药后的药物动力学结果

*分散因子＝exp[标准偏差(log-变换值)]**在10分钟时测量，PSR 04/02研究中最早的注射后测量值。
表7皮下施药后的药物动力学结果

*分散因子＝exp[标准偏差(log-变换值)]在PSR 01/03研究中测量的最大IL-11浓度显示于表8。
表8注射后1小时内获得的最大值

大鼠皮下施药与静脉内施药的比较表9显示了关于相对生物利用度的方差分析。两种产品之间关于清除半衰期、AUC及Cmax的差异是显著的。

表10显示了关于绝对生物利用度的方差分析。对于Neumega_IL-11，两种应用路径之间关于清除半衰期及AUC没有统计学显著差异。Cmax的差异是高度显著的。对于清蛋白融合IL-11，两种应用路径之间关于清除半衰期的差异是不显著的。AUC及Cmax的差异是高度显著的。
表10应用路径之间生物利用度的比较

a来自PSR 01/03研究的静脉内路径的Cmax值是在注射后2分钟测量的。
在大鼠中，静脉内应用后N末端清蛋白融合IL-11显示的平均清除半衰期比Neumega_长17倍。曲线下面积大318倍。皮下注射后，N末端清蛋白融合IL-11的平均清除半衰期比Neumega_IL-11长6倍。曲线下面积大40倍。
实施例5IL-11融合蛋白在首次实验大鼠中对血小板生成的刺激根据如下方案用Neumega_IL-11、C末端或N末端融合IL-11(B型)或安慰剂处理首次实验CD大鼠(每组10只)。
表11处理方案

在基线、第5天、第7天、第9天、第13天和第16天采集血液样品，并测量血液学参数(PLT、WBC、RBC、HCT、HGB)及体重。融合蛋白的剂量是在与Neumega_IL-11比较等摩尔的基础上计算的，并根据SDS-PAGE结果以因数(factor)1.5校正。
结果所有组在第7天获得最大血小板计数(图5)。N末端融合蛋白每天施药获得1528×103/μl(第6组)的最高平均水平，每3天施药(第4组)则为1304×103/μl。C末端融合蛋白还显示出服药间隔相关的影响，每天施药的最大平均水平为1238×103/μl，而每3天施药则为977×103/μl。Neumega_IL-11达到1032×103/μl的峰值，而对照组动物维持在864×103/μl。
所有组的红细胞参数(RBC、HGB、HCT)保持不变。白细胞计数显示出轻度原始增加之后有不一致的波动。这可能是由于频繁注射及采集血样引起的轻伤造成的。所有动物在观察期间显示出体重轻度增加。
总之，在5天、7天及9天，每天施用的N末端及C末端两种融合蛋白以及间隔3天施用的N末端融合蛋白明显优于对照及Neumega_IL-11。然而，N末端融合蛋白似乎达到比C末端融合蛋白更高的水平。
尽管持续治疗至第9天但在第7天之后可发生血小板计数减少，这是由于产生了针对异源人蛋白质的中和性抗体。
实施例6IL-11融合蛋白在大鼠中对化学疗法诱导的血小板减少症的治疗每组10只雌性CD大鼠于第0天以35mg/kg静脉内接受碳铂。根据如下方案于第5天开始用Neumega_IL-11、C末端或N末端融合IL-11(B型)或安慰剂处理大鼠。
表12处理方案

在基线、第5天、第7天、第9天、第13天及第16天采集血液样品，并测量血液学参数(PLT、WBC、RBC、HCT、HGB)及体重。融合蛋白的剂量是在与Neumega_IL-11比较等摩尔的基础上计算的，并根据SDS-PAGE结果以因数1.5校正。
结果所有组在第5天和第9天之间观察到血小板最低点(nadir)(表13)。之后，血小板水平在第16天恢复至高于基线。平均血小板水平显示于下表。
表13平均血小板水平(×103/μl)

对于每天注射Neumega_IL-11、C末端及N端融合蛋白的情况，在第5天即处理的第一天观察到血小板最低点(图6)。之后，在每天接受N末端融合蛋白的组中，血小板水平稳定且显著增加，而每天施用C末端融合蛋白与Neumega_IL-11相比诱导血小板水平增加。
为第5天血小板水平调整的协方差分析显示出在第9天、第13天及第16天每天注射N末端融合蛋白的血小板计数显著高于对照，以及在第13天显著优于Neumega_IL-11。同样的分析在第7天、第13天、第16天显示出总体处理结果，p≤0.004。
就血小板水平低于500×103/μl的持续时间而言，N末端融合蛋白再次显示出最佳效果，即每天注射时的平均5.87天或每3天注射的平均6.27天，与之相比，Neumega_IL-11为平均8.08天，对照为平均6.03天。C末端融合蛋白在该方面显示出较小功效，即每天施药的持续时间为7.16天而每3天施药为6.69天。
所有组的红细胞参数(RBC、HGB、HCT)在研究期间显示出轻度降低，这可反映了由频繁采集血样引起的失血。白细胞计数显示出轻度增加，这可能是由于频繁注射及采集血样引起的轻伤造成的。然而，这种效果在每天接受N末端融合IL-11的动物中尤其显著，因此在该组中对WBC水平的处理相关影响不能排除。所有动物在观察期间显示出体重正常、轻度增加。
总之，在IL-11的N末端清蛋白融合蛋白中可观察到最显著的结果，而C末端融合蛋白表现得与Neumega_IL-11可比。即使最低点的绝对水平不受显著影响，N末端融合蛋白能够缩短水平低于500×103/μl的持续时间，导致与Neumega_IL-11相比更为显著的恢复。
实施例7IL-11融合蛋白在小鼠炎性肠病(IBD)模型中的应用在此模型中，在小鼠中通过口服施用溶于自来水的3％硫酸右旋糖酐二钠盐(DSS)诱导结肠炎。每组10只小鼠按如下处理组进行分配。
表14处理方案

在诱导前及第3天、第6天、和第9天评估体重、直肠出血/腹泻及粪便中的潜隐血。第10天终止实验，对动物进行尸检，测量结肠长度，并保留大肠样品用于组织学评估。
结果接受安慰剂、柳氮磺吡啶或Neumega_IL-11的动物在结肠炎发病后体重减轻，而用N末端或C末端融合蛋白处理的动物体重反而增加(图7)。这是事先未曾预料到的惊人结果。
评估腹泻及直肠出血的目测观察评分也显示出与安慰剂、柳氮磺吡啶或Neumega_IL-11相比，融合蛋白具有惊人、显著、有益的结果(图8)。结肠长度(图9)及组织学评分(图10)也具有同样的结果。
总之，这些数据显示间隔3天给予的这两种清蛋白融合蛋白能够显著改善小鼠中DSS诱导的结肠炎的症状，甚至优于Neumega_IL-11或目前的标准治疗药柳氮磺吡啶。
实施例8保质期根据下述方法测定清蛋白融合IL-11产物的保质期。将总共25mg的清蛋白融合IL-11产物在玻璃小瓶中在无菌注射用水中配制成终体积5ml，甘氨酸、七水合磷酸氢二钠及磷酸二氢钠作为赋形剂。将个瓶产物于25℃培育1个月。如实施例1中所述在一个月结束时通过ESMS、N末端序列、非还原性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及western印迹分析样品的翻译后修饰。在上述任一项测试中，如果化合物在此贮存之后表现出比未融合IL-11化合物具有较少的变化，则认为保质期被延长了。
实施例9对人施药至少在癌症治疗的情况中，清蛋白融合IL-11产物可通过单次皮下注射每四天施用一次，剂量方案为每kg体重25-1000μg，优选每kg体重25-50μg。
参考本发明不限于所述具体实施方案的范围内，它们旨在作为本发明各个方面的单独示例，而且功能上等价的方法和成分属于本发明的范围内。实际上，除了本发明显示和描述的内容以外的本发明各种改变根据前述描述和附图来看对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些改变旨在落入所附权利要求的范围内。将上文引用的每一篇参考文献完整引入本发明作为参考。
序列表<110>达尔塔生物技术有限公司<120>白介素-11融合蛋白<130>DELF P29719EP<140>03027770.1<141>13/12/03<160>20<170>SeqWin99<210>1<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸接头VC053<400>1gatctttgga taagagagac gctcacaagt ccgaagtcgc tcaccggt 48<210>2<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸接头VC054<400>2ccttgaaccg gtgagcgact tcggacttgt gagcgtctct cttatccaaa50<210>3<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸接头VC055<400>3gatctttgga taagagagac gctcacaagt ccgaagtcgc tcatcgat 48<210>4<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸接头VC056<400>4ccttgaatcg atgagcgact tcggacttgt gagcgtctct cttatccaaa50<210>5<211>86<212>DNA
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<223>多肽接头SEQ ID 8<400>8Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>9<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>多肽接头SEQ ID 9<400>9Gly Gly Gly Ser1<210>10<211>17<212>PRT<213>Stanniocalcin信号肽序列<400>10Met Leu Gln Asn Ser Ala Val Leu Leu Leu Leu Val Ile Ser Ala Ser1 5 10 15A1a
<210>11<211>22<212>PRT<213>共有信号序列<400>11Met Pro Thr Trp Ala Trp Trp Leu Phe Leu Val Leu Leu Leu Ala Leu1 5 10 15Trp Ala Pro Ala Arg Gly20<210>12<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物CF60<400>12ggccatcgat gagcgacttc ggacttgtga gcgtccagcc gagtcttcag cagcagcagt 60cccctc 66<210>13<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物CF61<400>13ccggccttag gcttacctgg gccaccacct ggcccccctc gagtttcccc 50<210>14<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物CF62<400>14ggccaagctt attacagccg agtcttcagc agcagcagtc ccctc 45<210>15<211>2358<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>N-末端IL11-清蛋白融合体<400>15atgaagtggg ttttcatcgt ctccattttg ttcttgttct cctctgctta ctctagatct 60ttggataaga gagggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgggccgag 120ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca 180cagctgaggg acaaattccc agctgacggg gaccacaacc tggattccct gcccaccctg 240gccatgagtg cgggggcact gggagctcta cagctcccag gtgtgctgac aaggctgcga 300gcggacctac tgtcctacct gcggcacgtg cagtggctgc gccgggcagg tggctcttcc 360
ctgaagaccc tggagcccga gctgggcacc ctgcaggccc gactggaccg gctgctgcgc 420cggctgcagc tcctgatgtc ccgcctggcc ctgccccagc cacccccgga cccgccggcg 480cccccgctgg cgcccccctc ctcagcctgg gggggcatca gggccgccca cgccatcctg 540ggggggctgc acctgacact tgactgggcc gtgaggggac tgctgctgct gaagactcgg 600ctggacgctc acaagtccga agtcgctcat cgattcaagg acctaggtga ggaaaacttc 660aaggctttgg tcttgatcgc tttcgctcaa tacttgcaac aatgtccatt cgaagatcac 720gtcaagttgg tcaacgaagt taccgaattc gctaagactt gtgttgctga cgaatctgct 780gaaaactgtg acaagtcctt gcacaccttg ttcggtgata agttgtgtac tgttgctacc 840ttgagagaaa cctacggtga aatggctgac tgttgtgcta agcaagaacc agaaagaaac 900gaatgtttct tgcaacacaa ggacgacaac ccaaacttgc caagattggt tagaccagaa 960gttgacgtca tgtgtactgc tttccacgac aacgaagaaa ccttcttgaa gaagtacttg 1020tacgaaattg ctagaagaca cccatacttc tacgctccag aattgttgtt cttcgctaag 1080agatacaagg ctgctttcac cgaatgttgt caagctgctg ataaggctgc ttgtttgttg 1140ccaaagttgg atgaattgag agacgaaggt aaggcttctt ccgctaagca aagattgaag 1200tgtgcttcct tgcaaaagtt cggtgaaaga gctttcaagg cttgggctgt cgctagattg 1260tctcaaagat tcccaaaggc tgaattcgct gaagtttcta agttggttac tgacttgact 1320aaggttcaca ctgaatgttg tcacggtgac ttgttggaat gtgctgatga cagagctgac 1380ttggctaagt acatctgtga aaaccaagac tctatctctt ccaagttgaa ggaatgttgt 1440gaaaagccat tgttggaaaa gtctcactgt attgctgaag ttgaaaacga tgaaatgcca 1500gctgacttgc catctttggc tgctgacttc gttgaatcta aggacgtttg taagaactac 1560gctgaagcta aggacgtctt cttgggtatg ttcttgtacg aatacgctag aagacaccca 1620gactactccg ttgtcttgtt gttgagattg gctaagacct acgaaactac cttggaaaag 1680tgttgtgctg ctgctgaccc acacgaatgt tacgctaagg ttttcgatga attcaagcca 1740ttggtcgaag aaccacaaaa cttgatcaag caaaactgtg aattgttcga acaattgggt 1800gaatacaagt tccaaaacgc tttgttggtt agatacacta agaaggtccc acaagtctcc 1860accccaactt tggttgaagt ctctagaaac ttgggtaagg tcggttctaa gtgttgtaag 1920cacccagaag ctaagagaat gccatgtgct gaagattact tgtccgtcgt tttgaaccaa 1980ttgtgtgttt tgcacgaaaa gaccccagtc tctgatagag tcaccaagtg ttgtactgaa 2040tctttggtta acagaagacc atgtttctct gctttggaag tcgacgaaac ttacgttcca 2100aaggaattca acgctgaaac tttcaccttc cacgctgata tctgtacctt gtccgaaaag 2160gaaagacaaa ttaagaagca aactgctttg gttgaattgg tcaagcacaa gccaaaggct 2220actaaggaac aattgaaggc tgtcatggat gatttcgctg ctttcgttga aaagtgttgt 2280aaggctgatg ataaggaaac ttgtttcgct gaagaaggta agaagttggt cgctgcttcc 2340caagctgctt tgggtttg2358<210>16<211>786<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>N-末端IL11-清蛋白融合体<400>16Met Lys Trp Val Phe Ile Val Ser Ile Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala1 5 10 15Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg20 25 30Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr35 40 45Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp50 55 60Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu65 70 75 80Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu85 90 95Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp
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<223>成熟的N-末端IL11-清蛋白融合体<400>17Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu1 5 10 15Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg20 25 30Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His35 40 45Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly50 55 60Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu65 70 75 80Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser85 90 95Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp100 105 110Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro115 120 125Gln Pro Pro Pro Asp Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser130 135 140Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His145 150 155 160Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg165 170 175Leu Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly180 185 190Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu195 200 205Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr210 215 220Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp225 230 235 240Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr245 250 255Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu
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<223>C-末端清蛋白-IL11融合体<400>18atgaagtggg taagctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggagc 60ttggataaaa gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttacaccaa gaaagtaccc 1320
caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620tctgagaagg agagacaaat caagaaacaa actgcacttg ttgagctcgt gaaacacaag 1680cccaaggcaa caaaagagca actgaaagct gttatggatg atttcgcagc ttttgtagag 1740aagtgctgca aggctgacga taaggagacc tgctttgccg aggagggtaa aaaacttgtt 1800gctgcaagtc aagctgcctt aggcttacct gggccaccac ctggcccccc tcgagtttcc 1860ccagaccctc gggccgagct ggacagcacc gtgctcctga cccgctctct cctggcggac 1920acgcggcagc tggctgcaca gctgagggac aaattcccag ctgacgggga ccacaacctg 1980gattccctgc ccaccctggc catgagtgcg ggggcactgg gagctctaca gctcccaggt 2040gtgctgacaa ggctgcgagc ggacctactg tcctacctgc ggcacgtgca gtggctgcgc 2100cgggcaggtg gctcttccct gaagaccctg gagcccgagc tgggcaccct gcaggcccga 2160ctggaccggc tgctgcgccg gctgcagctc ctgatgtccc gcctggccct gccccagcca 2220cccccggacc cgccggcgcc cccgctggcg cccccctcct cagcctgggg gggcatcagg 2280gccgcccacg ccatcctggg ggggctgcac ctgacacttg actgggccgt gaggggactg 2340ctgctgctga agactcggct g2361<210>19<211>787<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>C-末端清蛋白-IL11融合体<400>19Met Lys Trp Val Ser Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala1 5 10 15Tyr Ser Arg Ser Leu Asp Lys Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala20 25 30His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu35 40 45Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val50 55 60Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp65 70 75 80Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp85 90 95Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala100 105 110Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln115 120 125His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val130 135 140Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys145 150 155 160Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro165 170 175Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys180 185 190
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<223>成熟的C-末端IL11-清蛋白融合体<400>20Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln20 25 30Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu35 40 45Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys50 55 60Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu65 70 75 80Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro85 90 95Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu100 105 110Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His115 120 125Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg130 135 140Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg145 150 155 160Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala165 170 175Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser180 185 190Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu195 200 205Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro210 215 220Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys225 230 235 240Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp245 250 255Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser260 265 270Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His275 280 285Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser290 295 300Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala305 310 315 320Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg325 330 335Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu355 360 365Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro370 375 380Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu385 390 395 400Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro405 410 415Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys420 425 430Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys435 440 445Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His450 455 460Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser465 470 475 480Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr485 490 495Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp500 505 510Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala515 520 525Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu530 535 540Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys545 550 555 560Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val565 570 575Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro580 585 590Pro Arg Val Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu595 600 605Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu610 615 620Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro625 630 635 640Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly645 650 655Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val660 665 670Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro675 680 685
Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu690 695 700Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro Pro Asp Pro705 710 715 720Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gly Gly Ile Arg725 730 735Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr Leu Asp Trp Ala740 745 750Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu755 760
权利要求
1.包含IL-11或其片段或变体和清蛋白或其片段或变体的清蛋白融合蛋白。
2.根据权利要求1的清蛋白融合蛋白，其中所述IL-11为人IL-11。
3.根据权利要求1或权利要求2的清蛋白融合蛋白，包含与IL-11融合的清蛋白。
4.根据前述权利要求任一项的清蛋白融合蛋白，其中所述IL-11为人IL-11。
5.根据权利要求1的清蛋白融合蛋白，其中与未融合状态的IL-11或其片段或变体的体内半衰期相比所述清蛋白具有延长IL-11或其片段或变体的体内半衰期的能力。
6.根据权利要求5的蛋白质，所述清蛋白融合的IL-11的半衰期较未连接清蛋白的IL-11的半衰期延长了至少5倍。
7.根据权利要求6的蛋白质，所述清蛋白融合的IL-11的半衰期较未连接清蛋白的IL-11的半衰期延长了至少10倍。
8.根据权利要求7的蛋白质，所述清蛋白融合的IL-11的半衰期较未连接清蛋白的IL-11的半衰期延长了至少50倍。
9.根据权利要求1的清蛋白融合蛋白，其中所述IL-11或其片段或变体融合至清蛋白的N末端或清蛋白片段或变体的N末端。
10.根据权利要求1的清蛋白融合蛋白，其中所述IL-11或其片段或变体融合至清蛋白的C末端或清蛋白片段或变体的C末端。
11.根据权利要求1的清蛋白融合蛋白，其中所述IL-11或其片段或变体融合至清蛋白的内部区域或清蛋白片段或变体的内部区域。
12.根据权利要求1的清蛋白融合蛋白，其中所述IL-11或其片段或变体经接头与清蛋白或其片段或变体分隔。
13.根据前述权利要求任一项的清蛋白融合蛋白，其中与清蛋白或其片段或变体融合的IL-11或其片段或变体的体外生物学活性比未融合状态的IL-11或其片段或变体的体外生物学活性大。
14.根据前述权利要求任一项的清蛋白融合蛋白，其中与清蛋白或其片段或变体融合的IL-11或其片段或变体的体内生物学活性比未融合状态的IL-11或其片段或变体的体内生物学活性大。
15.包含编码前述权利要求任一项的清蛋白融合蛋白的多核苷酸序列的核酸分子。
16.包含权利要求15的核酸分子的载体。
17.包含权利要求15的核酸分子的宿主细胞。
18.用于制备根据权利要求1-14任一项的清蛋白融合蛋白的方法，该方法包括(a)提供可在细胞或生物体中表达的包含编码清蛋白融合蛋白的核苷酸序列的核酸；(b)在细胞或生物体中表达核酸以形成清蛋白融合蛋白；并(c)纯化清蛋白融合蛋白。
19.根据权利要求18的方法，其中所述清蛋白融合蛋白在酵母中表达。
20.权利要求19的方法，其中所述酵母是糖基化缺陷型。
21.权利要求19的方法，其中所述酵母具有糖基化能力。
22.权利要求18的方法，其中所述清蛋白融合蛋白在细胞培养中的哺乳动物细胞中表达。
23.包含权利要求1-14任一项的清蛋白融合蛋白和载体的组合物。
24.包含有效量的权利要求1-14任一项的清蛋白融合蛋白和药学可接受载体或赋形剂的药物组合物。
25.用于将与用IL-11治疗哺乳动物相关的副作用降至最低的方法，所述治疗包括将清蛋白融合IL-11施用于所述哺乳动物。
26.根据权利要求25的方法，其中所述哺乳动物患有肠紊乱且副作用为体重减轻、直肠出血或腹泻。
27.增加患有引起体重减轻的肠疾病的哺乳动物体重的方法，所述方法包括将清蛋白融合IL-11施用于所述哺乳动物。
28.治疗患者的疾病或紊乱的方法，包括施用有效量的权利要求1-14任一项的清蛋白融合蛋白的步骤。
29.治疗患者的方法，包括施用有效量的权利要求1-14任一项的清蛋白融合蛋白的步骤。
30.延长IL-11或其片段或变体的体内半衰期的方法，包括将IL-11或其片段或变体与清蛋白或其片段或变体融合的步骤，与未融合状态的IL-11或其片段或变体的体内半衰期相比，所述清蛋白或其片段或变体足以延长IL-11或其片段或变体的体内半衰期。
31.延长IL-11在哺乳动物中的半衰期的方法，该方法包括将所述IL-11与清蛋白连接形成清蛋白融合IL-11，并将所述清蛋白融合IL-11施用于所述哺乳动物，由此所述清蛋白融合的IL-11的半衰期较未结合清蛋白的IL-11的半衰期相比延长了至少2倍。
32.用于预防或治疗哺乳动物的血小板减少症的方法，该方法包括将清蛋白融合IL-11施用于所述哺乳动物。
33.用于将与用IL-11治疗哺乳动物相关的副作用降至最低的方法，该方法包括将清蛋白融合IL-11施用于所述哺乳动物。
全文摘要
本发明涉及包含与清蛋白(包括但不限于清蛋白片段或变体)融合的、表现血小板生成或抗炎特性的白介素11(IL－11)(包括但不限于其片段及变体)的蛋白质。这些融合蛋白在本发明中统称为“本发明清蛋白融合蛋白”。这些融合蛋白表现出延长的保质期和/或药物动力学特性和/或延长的治疗活性。本发明包括治疗性清蛋白融合蛋白、组合物、药学组合物、制剂和试剂盒。本发明还包括编码本发明清蛋白融合蛋白的核酸分子，以及含有这些核酸的载体，经这些核酸和载体转化的宿主细胞，及使用这些核酸、载体和/或宿主细胞制备清蛋白融合蛋白的方法。本发明还涉及用于治疗或预防血小板减少症或炎性疾病的组合物和方法。
文档编号C07K14/765GK1938333SQ200480041355
公开日2007年3月28日 申请日期2004年12月3日 优先权日2003年12月3日
发明者M·克罗兹, G·迪克尼特, 汉斯-彼得·豪泽, T·韦默, 达雷尔·斯利普 申请人:达尔塔生物技术有限公司