包含白介素-11类似物的生物聚合物缀合物的制作方法

专利名称：包含白介素-11类似物的生物聚合物缀合物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物治疗领域。具体而言，本发明涉及包含人白介素-11类似物或 突变体(mIL-11)的生物聚合物缀合物，其中与成熟的重组人IL-Il (rhIL-11)相比，所述 mIL-11显示了增强的稳定性，而且所述生物聚合物缀合物基本保持与mIL-11相同水平的 活性。
背景技术：
血液毒性(表现为中性粒细胞减少和血小板减少)是与癌症化疗相关的有害副作 用，经常限制施用给患者的抗肿瘤药物剂量。已经显示白介素Il(IL-Il)(与多种造血和非 造血细胞类型相互作用的基质细胞源性细胞因子)的体内施用提高血小板计数并具有有 利的血小板生成作用。IL-Il在干细胞分化为巨核细胞、巨核细胞的增殖和成熟以及血小板 的生成中起重要作用。重组人IL-Il (rhIL-11)在与癌症化疗相关之副作用的治疗中有潜在应用。当施 用给动物时，在正常和免疫抑制两种动物中，rhIL-11均增多巨核细胞生成并提高血小板计 数。Wyeth-Ayerst已在出售名为NEUMEGA (通用名奥普瑞白介素(oprelvekin)) 的rhIL-11产品，已批准其在严重血小板减少症风险高的非骨髓恶性肿瘤成年患者 进行骨髓抑制性化疗后，用于预防严重的血小板减少症并降低对血小板输注的需要。 NEUMEGA 以冻干粉末的形式在含5mg IL-Il的一次性管中提供。在ImL的USP标 准注射用灭菌水中重构粉末，以生成含5mg/mL IL-Il的溶液，以50 μ g/kg/天的剂量施用。 与]VEUMEGA .相关的最常见副作用包括房性心律失常、晕厥、呼吸困难、充血性心力 衰竭和肺水肿。尽管已经显示体内施用rhIL-11对预防正在接受癌症化疗之患者的血小板计数 降低具有已证明的药理学作用，但是所需的施用频率(通常是每天一次持续两周或更长时 间)高于理想频率。而且，尽管如IL-Il的细胞因子是有吸引力的治疗剂，但是它们的应用 经常由于它们经尿排泄、肝摄取和/或酶降解的快速清除而受限制。似乎肾和肝对rhIL-11 从动物体内循环中快速清除起主要作用。该快速清除可能是由于rhIL-11的低分子量(约 19kDa)和其高度阳离子化的特性。由于肾小球毛细血管壁对大分子的选择渗透性主要基于 分子大小，用水溶性聚合物对rhIL-11进行化学修饰可以限制肾小球对该蛋白的过滤。作为应对循环时间短的方法，已经对用生物聚合物(如聚乙二醇(PEG)分子)修 饰重组蛋白进行了研究。已经显示PEG聚合物与蛋白的缀合(PEG化)通过增加蛋白的流 体动力学半径而使其免于快速的肾清除，从而提高了生物利用度，而且缀合也提高了溶解 度。此外，由于PEG聚合物的庞大，PEG缀合蛋白显示出蛋白降解的降低以及免疫识别的 降低，这给予 PEG 化蛋白很多优势(Veronese FM 和 Pasut G. , DrugDiscovery Today 10: 1451-8(2005)).另一方面，PEG缀合蛋白对蛋白水解酶或抗体之敏感性的抑制能力也会妨 碍该蛋白与其受体结合的能力。因此PEG缀合蛋白与受体的结合亲和性会降低，特别是当 缀合位点涉及受体结合位点或与其紧密相邻时。
为了应对将rhIL-11存留在循环中的需要，研究者已经调查了用水溶性聚合物 聚乙二醇(PEG)化学修饰rhIL-11的可行性。参见Takagi等，Journal of Controlled Release 119 :271-278 (2007)。然而，如上所述，用PEG对rhIL-11进行化学修饰存在很多 缺点。由于所附PEG的庞大和空间位阻，PEG-rhIL-11缀合物可能不能与IL-Il受体结合或 与其最低程度地结合。而且，rhIL-11分子的生物活性可能降低。事实上，Takagi等证明， 尽管与未缀合rhIL-11相比，PEG-rhIL-11缀合物可在血浆中存留更长时间，并因此对血小 板计数的增加产生可测量的作用，但由于与PEG的缀合，PEG化-rhIL-11所保留的生物活 性降低。Takagi 等，Journal ofControlled Release 119 :271-278(2007) 因此为了获得 目标效果，需要施用更大量的PEG-rhIL-11缀合物。本发明应对了对IL-Il分子的需要，其当施用给患者时，不止在血浆中存留更长 时间，还保持生物活性，因此提高了其在治疗和预防与癌症化疗相关的血小板减少症及其 它血液毒性中的作用。发明简述本发明提供了 IL-Il类似物和生物相容性聚合物的缀合物。与rhIL-11相比，本发 明的IL-Il类似物(mIL-11)对酸解显示出增强的抗性，并且显示出增强的稳定性。而且， 本发明的缀合物具有以下特征与对应的未缀合mIL-11相比具有更长的血清半衰期，并且 因如下事实表现突出，即该缀合物未显示活性缺失。在一个实施方案中，本发明涉及包含mIL-11和生物相容性聚合物的缀合物，其 中，除了五个或更少氨基酸替换以外，所述mIL-11的氨基酸序列包含SEQ ID N0:2，然而前 提是与SEQ ID NO :2第1位对应的氨基酸残基为丙氨酸，并且与SEQ ID NO :2第125位对 应的氨基酸残基为天冬酰胺；其中与未缀合的参照mIL-11的细胞增殖活性水平相比，所述 缀合物的体外细胞增殖活性水平降低了至多5%，其中在缀合mIL-11和未缀合参照mIL-11 中所述mIL-11的氨基酸序列相同；并且其中通过以下来测定所述细胞增殖活性使所述缀 合物或未缀合参照mIL-11与因表达IL-Il受体α链和糖蛋白130(gpl30)而对IL-Il有 反应的细胞接触，在体外培养所述细胞，并测定由此所致的细胞增殖。在另一实施方案中，本发明涉及包含突变人IL-ll(mlL-ll)和生物相容性聚合物 的缀合物；其中所述mIL-11的氨基酸序列包含与SEQ IDNO 2所示氨基酸序列具有至少 95%同一性的氨基酸序列，然而前提是与SEQ ID NO :2第1位对应的氨基酸残基为丙氨酸， 并且与SEQ ID NO :2第125位对应的氨基酸残基为天冬酰胺；其中与未缀合的参照mIL-11 的细胞增殖活性水平相比，所述缀合物在细胞增殖测定中的体外细胞增殖活性水平降低了 至多5%，其中在缀合mIL-11和未缀合参照mIL-11中所述mIL-11的氨基酸序列相同；并 且其中通过以下来测定所述细胞增殖活性使所述缀合物或未缀合参照mIL-11与因表达 IL-Il受体α链和糖蛋白130(gpl30)而对IL-Il有反应的细胞接触，在体外培养所述细 胞，并测定由此所致的细胞增殖。在进一步的实施方案中，所述生物相容性聚合物选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、 聚氧乙烯、聚三亚甲基二醇、聚乳酸、聚丙烯酸、聚氨基酸、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚 (L-赖氨酸)、聚烯烃氧化物、多糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和聚丙烯酰胺。在一 些具体的实施方案中，所述生物相容性聚合物为PEG。在一些其它实施方案中，PEG为线性 或支链的。在另一些实施方案中，所述PEG的分子量为约2kDa至约lOOkDa、约IOkDa至约60kDa、约 2kDa 至约 50kDa、或约 5kDa 至约 20kDa。在一些具体的实施方案中，所述生物聚合物缀合物的mIL-11包含SEQ ID NO :2所 示氨基酸序列。在另一些实施方案中，除第31位缬氨酸被丙氨酸替换、并且第155位天冬 氨酸被天冬酰胺替换以外，所述生物聚合物缀合物的mIL-11包含SEQ ID NO :1所示氨基酸 序列。本发明还涉及包含本发明生物聚合物缀合物和可药用载体的药物组合物。本发明还涉及在哺乳动物中治疗、改善或预防对IL-Il有反应之疾病或病症(如 血小板减少症)的方法，其包括向所述动物施用本发明的生物聚合物缀合物或组合物。本 发明还涉及在哺乳动物中增加血小板计数的方法，其包括施用本发明的生物聚合物缀合物 或组合物。在一些具体的实施方案中，所述哺乳动物是人。附图简述当与附图结合时，可从以下本发明的描述中明确本发明的以上和其它目的和特 点，所述附图分别显示

图1是纯化的单PEG化IL-Il突变蛋白(通过胺特异性PEG化方法) (PEG-mIL-11-SC，泳道1)和纯化的IL-Il突变蛋白(泳道2)的SDS-PAGE凝胶图。图2是示意与重组人IL-Il (rhIL-11)相比，mIL-11的结构(A)和功能(B)测定 结果的曲线图。图3是在50°C、pH3. 5溶液中保持0、1、2、3和4天的受胁迫rhIL-11和mIL-11的 反相HPLC色谱图。图4是表示rhIL-11和mIL_ll酸水解位点的图，水解位点用斜线表示。图5是显示IL-Il突变蛋白上PEG化位点的可能胺基的图示。N端伯胺以深灰显 示，而赖氨酸(63、120、196位)的ε-胺基以浅灰显示。标号基于野生型人IL-Il (NCBI ΑΑΑ59132. 1)。图6是实施例3中显示的纯化PEG-mIL-11-SC的体积排阻HPLC色谱图。图7是实施例4中显示的纯化PEG-mIL-11-AD的SDS-PAGE凝胶图和体积排阻HPLC 色谱图。图 8 是示意与未缀合 mIL-11 相比，PEG 化 mIL-11 (PEG-mIL-11-AD 或 PEG-mIL-11-SC)体外增殖活性结果的曲线图(N = 3)。误差线表示数据的标准偏差。图9是显示与未缀合mIL_ll(单剂量400yg/kg)处理组相比，单次皮下施用 PEG-mIL-11-SC (400 μ g/kg) (A)和 PEG-mIL-11-AD (400 μ g/kg) (B)后大鼠(N = 5)血小板 计数水平的曲线图。误差线表示数据的标准偏差。图10是显示与每日皮下施用未缀合mIL-11 GOO μ g/kg/天，持续7天)相比，单 次皮下施用 PEG-mIL-11-SC(400 μ g/kg) (A)和 PEG-mIL-11-AD (400 μ g/kg) (B)后大鼠(N =5)血小板计数水平的曲线图。误差线表示数据的标准偏差。图11为示意与单次剂量的未缀合mIL-11 (400 μ g/kg)相比，单次皮下注射 PEG-mIL-11-SC(400 μ g/kg) (A) ^ PEG-mIL-11-AD (400 μ g/kg)后大鼠(N = 4-6)中 IL-Il 体内浓度水平的曲线图。发明详述本发明涉及IL-Il类似物和生物相容性聚合物的缀合物及其在治疗、改善或预防对IL-Il反应的疾病或病症(包括与癌症化疗相关的血小板减少症或中性粒细胞减少)中 的用途。本发明的缀合IL-Il类似物(mIL-11)多肽与人IL-Il或重组人IL-Il (rhIL_ll) 相比，在血清中存留更长的时间，并基本保持与未缀合mIL-11相同的生物活性。以下显示了人IL-Il和重组人IL-Il的氨基酸序列。人IL-Il的氨基酸序列如 下Met-Asn-Cys-Val-Cys-Arg-Leu-Val-Leu-Val-Val-Leu-Ser-Leu-Trp-Pro-Asp-T hr-Ala-Val-Ala-Pro-Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Al a-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu -Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-T hr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-HiS-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Al a-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-LyS-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu -Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asp-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Trp-Gly-Gly-IIe-A rg-Ala-Ala-His-Ala-IIe-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gl y-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu (SEQ ID NO :1)。重组人IL-Il的氨基酸序列如下所示Gly-Pro-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-A sp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gl n-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu -Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-S er-Ser-Leu-LyS-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Le u-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asp -Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Trp-Gly-Gly-IIe-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-L eu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu(SEQ ID NO :3)mIL_ll 多肽mIL-11 多肽(SEQ ID NO :2)是人 IL_11(SEQ ID NO :1)的类似物，通过缺失 SEQ ID NO :1所示IL-Il多肽的N端前30个氨基酸，而后将所得第1位缬氨酸(Val)替换为丙 氨酸(Ala)，并将所得第125位天冬氨酸(Asp)替换为天冬酰胺(Asn)而生成。以下列出了 mIL-11的氨基酸序列Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-S er-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-As p-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly -Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-G Iu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-M et-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-P ro-Pro-Ser-Ser-Ala-Trp-Gly-Gly-IIe-Arg-Ala-Ala-His-Ala-IIe-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu(SEQ ID NO 2)之前在中国专利No. 11677中已经描述了所述mIL-11多肽，所述专利内容通过引 用并入本文。术语“mIL-11”可与“IL-11类似物”、“mIL_ll多肽”或“IL-11突变蛋白”互相替 换使用，并且如本文所用，其指包含SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽。本发明涵盖包含以下氨基酸序列或者由其组成的多肽，所述氨基酸序列与例如 SEQ ID NO :2所示多肽序列和/或SEQ ID NO :2的多肽片段有至少约95%、96%、97%、98% 或99%的同一性，前提是SEQ ID NO :2的任何多肽和/或片段包含的氨基酸序列中对应于 SEQ ID NO :2第1位的氨基酸保持为丙氨酸，并且对应于SEQ ID NO 2第125位的氨基酸 保持为天冬酰胺。具有与本发明查询氨基酸序列至少有例如95% “同一性”之氨基酸序列的多肽， 其意思是指，所述目标多肽的氨基酸序列除以下外与查询序列相一致，只是所述目标多肽 在对应SEQ ID NO :2第1位的氨基酸处保持为丙氨酸，并且在对应SEQ ID NO 2第125位 的氨基酸处保持为天冬酰胺，并且所述目标多肽序列可在所述查询氨基酸序列每100个氨 基酸中包括多达5个氨基酸变化。换句话说，为了获得具有与查询氨基酸序列至少有95% 同一性的氨基酸序列的多肽，除了对应SEQ ID NO :2第1和125位的氨基酸，可以将目标序 列中多达5%的氨基酸残基进行插入、缺失或替换为另外的氨基酸。对参照序列的这些改变 可以发生在参照氨基酸序列的氨基或羧基端或者在这些末端之间的任何位置，可以单个散 布在参照序列的残基中，也可以在参照序列中的一个或更多连续基团中。对于实际应用，可以采用已知的计算机程序(如采用BLASTP算法的BLAST 2. 0 (Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 :403-410,1990 ；Altschul 等，Nucleic Acids Res. 25 3389-3402,1997 ；Altschul, J. Mol. Biol. 219 :555-565,1991))常规地确定任何特定多肽 是否与SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。如在 本领域已知的，两个多肽之间的“相似性”通过将多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸替换与 第二个多肽的序列相比较来确定。本文将对于这些序列的同一性或同源性定义为，比对序 列并在必要时引入缺口来达到最高同源百分比后，在候选序列中与已知肽相同的氨基酸残 基的百分比，但不考虑将任何保守性替换当作序列同一性的一部分。不应将所述肽序列的 N-末端、C-末端或内部的延伸、缺失或插入理解为影响同源性。本发明还涵盖包含以下氨基酸序列或由其组成的多肽，所述氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示、或为具有5个或更少(包括5、4、3、2、1或0)个氨基酸替换、添加和/或缺失的 氨基酸序列，条件是该多肽在对应SEQID NO :2第1位的氨基酸处保持为丙氨酸，并且在对 应SEQ ID NO 2第125位的氨基酸处保持为天冬酰胺。应用于mIL-11多肽时，术语“其衍生物”或“其变体”是指由以下氨基酸序列组成 的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO 2所示氨基酸序列有至少95%、96%、97%、98%或 99%的同一性，或者所述多肽与SEQID NO :2相比具有5个或更少(包括5、4、3、2、1或0) 氨基酸替换、添加和/或缺失，条件是该多肽在对应SEQ ID NO :2第1位的氨基酸处保持为 丙甘氨酸，并且在对应SEQ ID NO :2第125位的氨基酸处保持为天冬酰胺，其中该多肽基本 保持mIL-11的所有生物活性。只要该多肽基本保持mIL-11的所有生物活性，添加或替换包括采用非天然氨基酸，并且可以在内部、或在N-端和/或C-端以任何数目发生。mIL-11的变体或衍生物可以是(i) 一种变体或衍生物，其中一个或更多个氨基酸 残基被替换为保守或非保守氨基酸残基取代(优选为保守氨基酸残基)，并且该替换氨基 酸残基可以是或不是由遗传密码编码的，或(ii)其中一个或更多个氨基酸残基包括取代 基团的变体或衍生物，或(iii) 一种变体或衍生物，其中成熟多肽与另一化合物融合，比如 提高该多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)，或(iv) —种变体或衍生物，其中为了纯化该 多肽而在成熟多肽上融合附加氨基酸，或(ν) —种变体或衍生物，其中该多肽的片段是可 溶性的，即不与膜结合，但仍结合所述膜结合受体的配体。根据本文的教导，这些变体或衍 生物被认为在本领域技术人员的范围内。所述多肽的“变体”可以是保守变体或等位基因变体。如本文所用，保守变体是指 在序列中具有的改变不会对蛋白的生物功能产生不利影响的氨基酸序列。当改变的序列 阻止或破坏与该蛋白相关的生物功能时，则称替换、插入或缺失对该蛋白产生不利影响。例 如，可以改变蛋白的总体电荷、结构或疏水-亲水特性而对生物活性无不利影响。因此，可 以改变氨基酸序列(例如使肽更疏水或亲水)而对该蛋白的生物活性无不利影响。“保守氨基酸替换”是将氨基酸残基用具有相似电荷之侧链的氨基酸残基替换的 氨基酸替换。在本领域中已经定义了具有相似电荷之侧链的氨基酸残基家族。这些家族包 括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、 不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、 非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨 酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨 酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。或者，可沿全部或部分编码序列随机引入突变(如通过饱 和诱变)，并且可以筛选所得突变体的生物活性以鉴定保有活性(例如，IL-Il活性)的突 变体。“等位基因变体”意思是指，占据生物染色体上给定基因座的基因的替代形式。 Genes II，Lewin, B.，ed.，John Wiley & Sons, New York(1985)。可以采用本领域已知的 诱变技术生成非天然变体。尽管与以上列举的那些相比等位基因变体具有稍有不同的氨基 酸序列，其仍具有与mIL-11蛋白相关的相同或相似的生物功能。本领域技术人员已知的用于在编码本发明分子的核苷酸序列中引入突变的标准 技术包括，例如定点突变和PCR介导的诱变，其可导致在多篇文献中描述的氨基酸替换， 如 Sambrook, Fritsch & Maniatis, MolecularCloning :A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y,1989. ；DNA Cloning :APractical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover 编，1985) ；Ausubel 等 (编)，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc. ,1994 ；Sidhu 等，Methods Enzymol 328 :333-363,2000)以及 Kunkel 等，Methods Enzymol 204:1991。因此，本发明的蛋白质和肽包括含有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的分子或其变 体或衍生物。所涵盖的变体还包括那些含有衍生物的变体，其中已将所述蛋白通过取代、化 学、酶学或其他恰当方式用天然氨基酸以外的结构(例如，可检测结构如酶或放射性同位 素)进行了共价修饰。采用已知的蛋白质工程和重组DNA技术方法，可以生成变体以提高或改变mIL-11多肽的特性。例如，可从mIL-11多肽缺失一个或更多个氨基酸以便于生物聚合物在特定位 置(例如位于该多肽N-端附近的Lys残基)的共价结合，而基本上不丧失生物功能。因此，本发明还包括显示基本生物活性的mIL-11多肽。这些变体包括根据本领域 已知的一般规律选择的缺失、插入、颠换、重复和替换，以使其对活性产生很小影响。如以下进一步描述的，本领域技术人员完全了解具有更小可能或不可能显著影响 蛋白质功能的氨基酸替换(例如，用一个脂肪族氨基酸替换另一个脂肪族氨基酸)。本发明的“衍生物”可通过取代、化学、酶学或其他恰当方式用天然氨基酸以外的 结构(例如，可检测结构如酶或放射性同位素)进行共价修饰。衍生物的实例包括融合蛋 白。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选是重组多肽。对人IL-Il的结构和功能已经进行了彻底的研究，而且本领域技术人员已知在 IL-Il序列中对基本保留该蛋白所有生物活性很关键、并且在任何mIL-11变体或衍生物中 优选不改变或只保守性改变的氨基酸。可以将其他对生物活性不重要的氨基酸缺失和/ 或更自由地替换。已知对生物活性重要的氨基酸的实例包括但不限于Lys41、Met58、Lys98, Lys174、Thr175、Arg176 禾口 Leu177 (Czupryn 等，J. Biol. Chem. 270 :978(1995)) ；Pro13、Glu16, LeU17、LeU22、Arg25、LeU28、Thr31、Arg32、LeU34、Arg39、Arg15°、Ala152、HiS153、Ile155、Gly158、LeU159、 Thr162、Leu163、Asp164、Trp165、Arg168和Leu17ci(Czupryn等，Ann. NY Acad. Sci. 762 :152(1995))； Leu63、lie149、Arg168 和 Leu172 (Tacken 等，Eur. J. Biochem. 265 :645 (1999))，其中氨基酸编号 对应rhIL-11多肽的氨基酸编号。本领域技术人员可用常规的突变技术(如以上引用的文 献中描述的那些)制备mIL-11的衍生物，并鉴定基本保有mIL-11多肽全部生物活性的衍 生物。如本文中针对mIL-11、未缀合mIL-11或裸(naiive )mIL-ll所用，术语“基本相 同的生物活性”或“基本的生物活性”或“相似的生物活性”或“基本不显示活性丧失”，是指 mIL-11任何一种或更多种生物活性(例如，mIL-11的刺激血小板生成的能力或其他已知生 物活性(如对酸解的抗性))的至少95%、96%、97%、98%或99%。mIL-11的生物活性还 包括其诱导细胞增殖的能力，这可在采用表达gpl30和IL-Il受体α链的Ba/F3细胞的体 外细胞增殖测定中测量，该方法类似于Lebeau B等描述的方法(Lebeau B等，FEBS Letters 407 :141-147(1997))。采用这样的细胞增殖测定，当用于修饰术语“mIL-11多肽的生物活 性”时，术语“基本上所有”或“相似”或“相同”对应于按照所述测定测量的活性水平，其中 与所述mIL-11多肽的细胞增殖活性水平相比，其水平降低至多5%。如上所述，可以通过测量一种或更多种生物活性水平来测定包含mIL-11的缀合 物的生物活性水平。可以通过将本发明的缀合物与未缀合的参照mIL-11作比较来进行这 种测定。如本文所用，术语“参照”意思是指用作比较点并可用作对照的对象或物品。对应 本发明，“参照” mIL-11是具有与待测缀合物内mIL-11相同序列的未缀合mIL-11，将其进 行测定以确定缀合物的生物聚合物对其所附的mIL-11之生物活性有何种作用。因此，包含 mIL-11或其变体或衍生物的缀合物的生物活性可以与对应的未缀合“参照” mIL-11比较， 以确定与在未缀合形式中的mIL-11相比，在缀合形式中的mIL-11是否具有基本相同的生 物活性。例如，当采用所述的体外细胞增殖测定测量时，与未缀合的mIL-11多肽的细胞增殖活性水平相比，具有mIL-11多肽基本所有生物活性的生物聚合物缀合物的活性水平不 超过5%、4(%、3(%、2(%或1(%。当比较例如含有mIL-11、其变体、片段或衍生物的具体生物 聚合物聚合物的生物活性时，所述缀合物的mIL-11和与其相比较的未缀合mIL-11具有相 同的序列。还可以通过在本领域已知的另外的体外和体内常规测定方法来确定mIL-11的 活性(例如，巨核细胞增殖测定，血小板血液水平的刺激)。在本发明的一些实施方案中，在本发明的方法中采用分离的或纯化的mIL-11、或 其变体、片段或衍生物。其“分离的”或“纯化的”蛋白基本不含产生mIL-11蛋白或其变体、 片段或衍生物的细胞或组织来源的细胞材料或其它污染蛋白质，或者当化学合成时基本不 含化学前体或其他化学物。语句“基本不含细胞材料”包括所述mIL-11蛋白、或其变体、片 段或衍生物的制备物，其中该蛋白质与其重组生产细胞的细胞组分相分离。在一个实施方 案中，语句“基本不含细胞材料”包括所述mIL-11蛋白、或其变体、片段或衍生物的制备物， 其具有少于约30% (干重)的非mIL-11蛋白质(本文中也称为“污染蛋白质”)，例如，少 于约20%、少于约10%，或少于约5%的非mIL-11蛋白质。当重组生产mIL-11蛋白质或其 变体、片段或衍生物时，优选地基本不含培养基，即培养基代表少于约20% (例如，少于约 10%或少于约5% )的所述蛋白质制备物体积。语句“基本不含化学前体或其他化学物”包括所述mIL-11蛋白质或其变体、片段 或衍生物的制备物，其中所述蛋白质与参与该蛋白质合成的化学前体或其他化学物相分 离。在一个实施方案中，语句“基本不含化学前体或其他化学物”包括所述mIL-11蛋白质 或其变体、片段或衍生物的制备物，其中具有少于约30% (干重)的化学前体或非mL-11化 学物，例如，少于约20%，少于约10%或少于约5%的化学前体或非mIL-11化学物。可以通过本领域已知的任何方法生产mIL-11多肽或其变体、片段或衍生物，例 如，重组表达或化学合成。优选地，重组表达mIL-11多肽或其变体、片段或衍生物，例如， 在细菌、酵母或哺乳动物细胞培养物中。重组表达涉及制备含有编码mIL-11多肽或其变 体、片段或衍生物的多核苷酸的载体，将载体递送入宿主细胞，在表达mIL-11多肽或其变 体、片段或衍生物的条件下培养该宿主细胞，并分离mIL-11多肽或其变体、片段或衍生物。 在 Sambrook 等，Molecular Cloning，第 3 片反，Cold SpringHarbor Laboratory, 2001 以及 Ausubel 等，Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley & Sons, New York 第 3版，0000)(均通过引用并入本文)中描述了制备重组载体并用其转化宿主细胞、在宿主 细胞中复制该载体并表达生物活性的外源多肽和蛋白质的方法和材料。所述mIL-11多肽或其变体、片段或衍生物的氨基酸序列信息可以用于创建编码 mIL-11多肽或其变体、片段或衍生物的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列可以化学合成或 衍生自编码野生型或重组IL-Il的基因或cDNA。编码mIL-11的多核苷酸序列的可获得性 使通过本领域公知且常规采用的技术大规模表达所编码的多肽成为可能。生物相容性聚合物和生物相容性聚合物缀合物本发明的生物相容性聚合物或生物聚合物包括但不限于一种或更多种聚亚烷基 二醇(包括但不限于一种或更多种聚(乙二醇)、一种或更多种单甲氧基聚(乙二醇) 以及一种或更多种单羟基聚(乙二醇))、一种或更多种聚烯烃氧化物(polyalkylene oxide)、一种或更多种聚环氧乙烷、一种或更多种聚烯醇(例如聚乙烯醇)、一种或更多 种聚羧酸类、一种或更多种聚(乙烯基吡硌烷酮)、一种或更多种聚(氧乙烯氧亚甲基)(poly(oxyethyleneoxymethylene))、一种或更多种聚(氨基酸)、一种或更多种聚丙烯酰 吗啉、一种或更多种酰胺与一种或更多种氧化烯烃的一种或更多种共聚物、一种或更多种 葡聚糖和一种或更多种透明质酸。具体而言，本发明的生物聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧乙烯、聚三亚 甲基二醇、聚乳酸、聚丙烯酸、聚氨基酸、聚乙烯醇、聚氨酯、聚膦腈、聚(L-赖氨酸)、聚烯烃 氧化物、多糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇或聚丙烯酰胺。本发明的生物聚合物可以包括本领域已知的聚合物的任何直链或支链、单功能活 化形式。例如，包括分子量(排除活化基团的质量)范围在约IkDa至约IOOkDa的那些。 适合的分子量范围包括但不限于约^iDa至约IOOkDa ；约^iDa至约20kDa ；约^Da至约 20kDa ；约 5kDa 至约 30kDa ；约 IOkDa 至约 20kDa ；约 IOkDa 至约 60kDa ；约 18kDa 至约 60kDa ； 约12kDa至约30kDa ；约5kDa ；约IOkDa ；约20kDa或约30kDa。在为直链PEG的情况下，约 lOkDa、约20kDa或约30kDa的分子量分别对应于约230、约450或约680个环氧乙烷单体单 元的聚合度(η)。如本文所用，“PEG”包括环氧乙烷的所有聚合物，无论其为直链或具有支链或具有 多臂，也无论其末端加帽或具有羟基末端。“PEG”包括在本领域已知为聚(乙二醇)、甲氧 基聚(乙二醇)或mPEG或聚(乙二醇)_单甲基醚、烷氧基聚(乙二醇)、聚(氧化乙烯) 或ΡΕΟ、α -甲基-Ω -羟基-聚(氧-1，2-乙二基)和聚环氧乙烷，以及在本领域用作环氧 乙烷聚合物的其他名称。如本文所用，"PEG化”是指将PEG共价偶联到生物活性靶标分子(尤其是受体结 合蛋白质)的任何过程。由此产生的辍合物称为被“PEG化”。可采用一种或更多种化学修 饰方法实现PEG化，所述方法包括胺特异性PEG化、N端定向PEG化和/或位点特异性修饰。如本文所用，术语“辍合物”是指生物聚合物(例如PEG)与靶标分子(例如 rhIL-11或mIL-11)共价连接的产物。术语“辍合”是指形成如上所述辍合物。可以在本发 明中采用本领域技术人员通常采用的将生物聚合物辍合到靶标分子的任何方法。当采用胺特异性辍合法时，所述rhIL-11分子总共包含4个生物聚合物(如PEG) 共价结合的可能位点。这四个可能位点包括三个赖氨酸残基(Lys41Iysi38和Lys174)和N-末 端。参照rhIL-11的三维预测结构，这些伯胺基团位于rhIL-11的外表面。rhIL-11的Lys41、 Lysi38 和 Lys174 分别对应 mIL_ll(SEQ ID NO 2)的 Lys33、Lys9ci 和 Lys166。在典型的生物聚合物辍合物(如PEG辍合物)的制备中，将待辍合到PEG的目的分 子(例如rhIL-11或mIL-11)与摩尔过量的PEG —起在缓冲体系中孵育。用所要求的反应时 间、温度以及PEG修饰剂/IL-Il分子摩尔比例来实施该反应。本领域已知用于PEG化反应 条件的信息，这些信息可在如 Zalipsky 等，Biotechnol. Appl. Biochem. 15 :100-114(1992) 以及Kinstler等，Pharm. Res. 13 =996-1002(1996)中获得。在实施该辍合反应中，Takagi等 发现难以维持rhIL-11分子的生物活性。参见Takagi等，Journal of Controlled Release 119 :271-278(2007)。载体和宿主细胞本文的载体用于扩增编码mIL-11或其变体或衍生物的DNA或RNA，和/或用于表 达编码mIL-11或其变体或衍生物的DNA。如本文所用，术语“载体”是指能够转运连接其上 的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型为“质粒”，其是指额外DNA片段可连接于其中的环状双链DNA环。载体的另一种类型为病毒载体，其中额外DNA片段可被连接入病毒基因 组。一些载体能够在其被引入的宿主细胞中自主复制(如，具有细菌复制起点的细菌载体 以及附加体型哺乳动物载体)。其他载体(比如非附加体型哺乳动物载体)在引入宿主细 胞后被整合进宿主细胞的基因组，因此与宿主细胞基因组一起复制。此外，一些载体能够介 导其有效连接的基因的表达。这些载体在本文中被称为“表达载体”。一般地，在重组DNA 技术中所用的表达载体经常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因 为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意于包括其他形式的可实现同等功能的表达载 体，如病毒载体(如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。原核动物中蛋白质的表达最常在大肠杆菌中进行，用含有组成型或诱导型启动子 的载体指导融合或非融合蛋白的表达。融合载体在其编码的蛋白质上添加一定数目的氨 基酸，通常添加在重组蛋白质的氨基末端。这些融合蛋白质通常服务于三个目的(1)增 加重组蛋白质的表达；( 增加重组蛋白质的可溶性；以及C3)通过在亲和纯化中作为配 体来帮助重组蛋白质的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分和重组蛋白的接合处 引入蛋白水解切割位点，以在纯化该融合蛋白质后能够将重组蛋白质和融合部分分离。这 些酶和它们的同源识别序列包括因子)(a、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括在 目标重组蛋白质上分别融合谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A的 pGEX(Amersham ；Smith φ, Gene 67 :31-40(1988))>pMAL(New England Biolabs,Beverly, Mass.)禾口 pRIT5(Pharmacia, Piscataway, N. J.)。适合的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc (Amrarm等，Gene 69 301-315(1988))禾口 pETl Id(Studier 等，GENE EXPRESS10NTECHN0L0GY :METH0DS IN ENZYM0L0GY 185，Academic Press, San Diego, Calif. (1990)60-89)。在大肠杆菌中最大 化重组蛋白质表达的一种策略是将该蛋白质在无蛋白水解切割该重组蛋白能力的宿主细 菌中表达。参见 Gottesman，GENE EXPRESSION TECHNOLOGY :METH0DS IN ENZYM0L0GY 185， Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128。另一种策略是改变待插入表达载体 的核酸的核酸序列，以使每个氨基酸的单个密码子为大肠杆菌优选使用的(Wada等，Nuc. Acids Res. 20 :2111-2118 (1992))。可以通过标准的DNA合成技术进行本发明核酸序列的 这些改变。在另一个实施方案中，所述表达载体为酵母表达载体。在酵母(S. cerevisae)中用 于表达的载体的实例包括 pY^^ecl (Baldari 等，EMBO J. 6 =229-234 (1987)),pMFa (Kurjan 等，Cell 30 :933-943 (1982))、pJRY88(Schultz 等，Gene 54:113-123 (1987))、 pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)以 及 picZ (Invitrogen Corporation)。或者，可以采用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达mIL-11或其变体或衍生物。 可获得的用于在培养昆虫细胞(例如SF9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc 系歹Ij (Smith 等，Mol. Cell. Biol. 3 :2156-2165(1983))和 pVL 系歹lj (Lucklow 等，Virology 170 :31-39(1989))。在另一个实施方案中，本发明的核酸采用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表 达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，Nature329 :840(1987))和 pMT2PC(Kaufman 等，EMBO J. 6 :187-195(1987))。当在哺乳动物细胞中使用时，表达载体的调控功能通常由病毒调控元件提供。例如，通常采用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猴病 毒40。对于适用于原核和真核细胞两者的其他适合的表达系统，参见例如Sambrook等， MOLECULAR CLONING A LABORATORYMANUAL.第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989 的第 16 禾口 17 章。优选的表达载体为可复制的DNA构建体，其中编码mIL-11或其变体或衍生物的 DNA序列与适合的调控序列有效连接，所述调控序列能够实现mIL-11或其变体或衍生物在 适合宿主中的表达。当DNA区域彼此功能性相关时，它们有效地连接。例如，如果启动子控 制编码序列的转录，则该启动子与编码序列有效地连接。本领域技术人员应该理解，表达载 体的设计可以基于这些因素，即待转化宿主细胞的选择，所需蛋白质的表达水平等。本发明 的表达载体可以被引入宿主细胞，以产生本文所述的核酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋 白或肽。优选的载体优选地包含被宿主生物识别的启动子。本发明的启动子序列可以是原 核、真核或病毒的。适合的原核序列的实例包括大肠杆菌的trp、tac、trc、recA、热休克和 IacZ启动子。另外的启动子包括但不限于噬菌体的T7启动子、λ噬菌体的冊和PL启动 子、巨细胞病毒的立即早期启动子和劳斯肉瘤病毒启动子。此外，适合的表达载体可以包括恰当的标记物，其能筛选转化的宿主细胞。采用多 种本领域专家熟知以及描述于Sambrook等(同上)中的技术的任何一种进行所选宿主的转化。复制起点的提供还可以通过将载体构建成包含外源起点，或可以通过宿主细胞染 色体复制机制。如果该载体被整合入宿主细胞染色体，后者应该能够充分提供复制的起始。可以按照传统技术将编码mIL-11或其变体或衍生物的核苷酸序列与载体DNA重 组，所述技术包括连接平末端或粘末端，限制性内切酶消化以提供适合的末端，恰当地补齐 粘末端，用碱性磷酸酶处理以避免不必要的连接，用恰当的连接酶进行连接。Sambrook等 (同上)公开了该操作的技术，并且其在本领域公知。在如Okayama等，Mol. Cell. Biol. 3 280(1983)，Cosman 等，Mol. Immunol. 23 :935(1986), Cosman 等，Nature312 :768(1984), EP-A-0367566以及WO 91/18982 (均通过全文引入并入本文)中公开了构建哺乳动物表达 载体的方法。根据本发明的另一个方面，提供宿主细胞(包括原核和真核细胞)，其包含编码 mIL-11或其变体或衍生物的多核苷酸，并能够表达所编码的mIL-11或其变体或衍生物多 肽。可以将本发明的多核苷酸作为环状质粒的一部分，或作为含有分离的蛋白质编码区域 的线性DNA或病毒载体来引入宿主细胞。已经广为人知并且在本领域常规进行的将DNA 引入宿主细胞的方法包括转化、转染、电穿孔、核注射或与载体如脂质体、胶团、鬼影细胞 (ghost cell)和原生质体相融合。本发明的表达系统包括细菌、酵母、真菌、植物、昆虫、无 脊椎动物、脊椎动物和哺乳动物细胞系统。本发明的宿主细胞可用于mIL-11或其变体或衍生物多肽的大规模生产方法中， 其中将细胞在适合的培养基中培养，并且通过本领域已知的纯化方法，将所需的多肽产物 从细胞或从细胞生长的培养基中分离，所述纯化方法如常规的色谱法，包括免疫亲和色谱、 受体亲和色谱、疏水作用色谱、凝集素亲和色谱、体积排阻色谱、阳离子或阴离子交换色谱、 高效液相色谱(HPLC)、反相HPLC等。还有其他的纯化方法，包括那些其中所需蛋白质作为 融合蛋白质被表达和纯化的方法，所述融合蛋白质具有被特异性结合配对物或试剂识别的特异性标签、标记或鳌合基。可以将所述经纯化的蛋白质进行切割以产生所需的蛋白质，或 者可以保留完整的融合蛋白质形式。由于切割过程，融合组分的切割可能产生具有额外氨 基酸残基的所需蛋白质形式。表达本发明多肽的适合的宿主细胞包括但不限于原核细胞、酵母和真核细胞。如 果采用原核表达载体，则适合的宿主细胞应为能够表达所克隆序列的任何原核细胞。适 合的原核细胞包括但不限于埃希氏菌属(Escherichia)、杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属 (Salmonella)、假单孢菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)以及葡萄球菌属 (Staphylococcus)的细菌。如果采用真核表达载体，则适合的宿主细胞应为能够表达所克隆序列的任何真核 细胞。优选地，真核细胞为高等真核生物的细胞。适合的真核细胞包括但不限于非人哺乳 动物组织培养细胞和人组织培养细胞。优选的宿主细胞包括但不限于昆虫细胞、HeLa细 胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(COS细胞)、人293细胞和鼠3T3成纤 维细胞。这些细胞在细胞培养中的增殖已经是常规方法(参见Tissue Culture,Academic Press, Kruse和Patterson编，(1973)，其通过全文引入并入本文)。此外，可以用酵母宿主作为宿主细胞。优选的酵母细胞包括但不限于酵母属 (Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和克鲁维酵母属(Kluveromyces)。优选的酵母宿 主为酿酒酵母(S. cerevisiae)和毕赤酵母(P. pastoris)。优选的酵母载体可以包含2T酵 母质粒的复制起点序列，自主复制序列(ARS)，启动子区域，多聚腺苷酸化序列，转录终止序 列和选择标记基因。本文也包括在酵母和大肠杆菌中均复制的穿梭载体。此外，昆虫细胞也可以被用作宿主细胞。在一个优选的实施方案中，采用杆状病毒 表达系统表达本发明的多肽(参见，Luckow 等，Bio/Technology，6 :47 (1988)，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS :A LABORATORY MANUAL, O' Rielly 等编，W. H. Freeman andCompany, New York, 1992以及美国专利No. 4，879，236，均通过全文引用并入本文)。此外，可以采用 如MAXBACTM完全杆状病毒表达系统(Invitrogen)在昆虫细胞中进行生产。在Goeddel， GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY :METH0DS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego, Calif. (1990)中进一步讨论了适合的宿主细胞。此外，可以在体外转录或翻译重组表达载 体，例如采用T7启动子调控序列和T7聚合酶。可以采用本发明的宿主细胞(如培养的原核或真核宿主细胞)来生产(即表达) mIL-11多肽或其变体或衍生物。在一个实施方案中，该方法包括在适合的培养基中培养 本发明宿主细胞(其中已引入编码mIL-11或其变体或衍生物的重组表达载体)，以产生 mIL-11或其变体或衍生物蛋白质。在另一个实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细 胞中分离所述mIL-11或其变体或衍生物。当mIL-11或其变体或衍生物多肽主要在细胞内被发现的情况下，可以采用本领 域普通技术人员已知的任何标准技术从宿主细胞中提取细胞内材料(包括革兰氏阴性细 菌的包涵体)。这些方法应涵盖(示例而非限制)通过弗氏压碎器、勻浆和/或超声随后离 心的方法裂解宿主细胞以释放周质/细胞质内含物。如果mIL-11多肽或其变体或衍生物在细胞溶胶中已经形成了包涵体，该包涵体 可能经常结合到内和/或外细胞膜上。离心后，主要在沉淀物质中发现这些包涵体。然后该 沉淀材料可以采用以下方法处理以释放、破裂或溶解该包涵体，所述方法为在极端PH下处理，或在还原剂(如碱性PH时的二硫苏糖醇或酸性pH下的三羧乙基膦)的存在下用一种 或更多种离液剂(如洗涤剂、胍、胍衍生物、尿素或尿素衍生物)处理。溶解后，可以采用凝 胶电泳或免疫沉淀等对mIL-11多肽或其变体或衍生物进行分析。本领域普通技术人员知 晓分离mIL-11多肽或其变体或衍生物的多种方法，例如，可以采用以下所述和在Marston 等，Meth. Enzymol. 182 :264-275 (1990)(其通过全文引入并入本文)中的标准方法进行分离。如果分离的mIL-11多肽或其变体或衍生物在进行分离过程后无生物活性，可以 采用多种方法“重折叠”或将该多肽转化为其三级结构并生成二硫键来重获生物活性。本领 域普通技术人员已知的方法包括对溶解多肽的PH值进行调整，通常调整为高于7，并在特 定浓度的离液剂存在下。离液剂的选择与用于溶解包涵体的选择非常类似，但是通常浓度 更低，并且不一定使用与用于溶解时相同的离液剂。可能需要采用还原剂或特定比例的还 原剂加其氧化形式，以形成特定的氧化还原电位，从而在形成蛋白质的半胱氨酸桥时发生 二硫键洗牌(shuffling)。一些常用的氧化还原对包括半胱氨酸/胱氨、谷胱甘肽(GSH)/ 二硫化GSH、氯化铜、二硫苏糖醇(DTT) / 二噻烷DTT、2-巯基乙醇(bME) / 二硫_b (ME)。为 了提高重折叠的效率，可能需要采用助溶剂，如甘油、各种分子量的聚乙二醇以及精氨酸。治疗方法本发明涵盖治疗、改善或预防对IL-Il有反应的疾病或病症的方法。可对施用 IL-Il有反应的疾病或病症的实例包括但不限于血小板减少症(如骨由髓抑制化疗诱导 的)、免疫介导的病症(如细胞毒性T细胞和补体介导的细胞毒性、移植物抗宿主病)、粘膜 炎(例如，口腔粘膜炎、肠胃粘膜炎、鼻粘膜炎、直肠炎)、炎性肠病(例如，克罗恩氏病、溃 疡性结肠炎、未定型结肠炎、感染性结肠炎)、炎性皮肤疾病(例如，牛皮癣、特应性皮炎、接 触过敏)、败血症、牙龈炎、牙周炎、炎性眼部疾病(如，结膜炎、视网膜炎、葡萄膜炎)、胃肠 动力障碍(如胃食管反流病、喂养不耐受、手术后麻痹性肠梗阻)、胰腺炎、坏死性小肠结肠 炎、口腔溃疡、咽炎、食管炎、消化性溃疡、AIDS、类风湿性关节炎、骨关节炎、脊柱关节病、抗 生素诱导的腹泻、多发性硬化、糖尿病、骨质疏松、再灌注损伤、哮喘、鼻炎、惊厥前期、血管 性血友病(Von Willebrand disease)、甲型血友病、非霍奇金淋巴瘤以及造血祖细胞或干 细胞缺陷。本文所用的术语“治疗有效量”是指足以使疾病的一种或更多症状改善、或防止疾 病的进展或导致疾病消退的治疗剂的量。例如，对于血小板减少症的治疗，治疗有效量优选 地指将血小板的血液水平提高至少5 %，优选地至少10 %、至少15 %、至少20 %、至少25 %、 至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至 少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少100 %的治疗剂的量。本文所用术语“防止”、“阻止”和“预防”是指减少动物中病理细胞的出现或没有 所需细胞(例如血小板)的减少。该防止可以是完全的，例如，在个体中完全没有所需细胞 的减少。该防止也可以是部分的，即与没有本发明之作用的情况相比，个体中所需细胞的降 低更小。可以在疾病或病症发生后施用含有mIL-11或其变体、片段或衍生物的生物相容 性聚合物辍合物。在另一个实施方案中，在可能发生疾病或病症的情况下，可以在疾病或病 症发生之前施用含有mIL-11或其变体、片段或衍生物的生物相容性聚合物辍合物，以预防或降低疾病或病症的严重性。例如，可以对正在接受已知会引起血小板减少症的化疗治疗 的患者施用mIL-11或其变体、片段或衍生物的PEG辍合形式。可以将含有mIL-11或其变体、片段或衍生物的生物相容性聚合物辍合物与一种 或更多种已知能有效治疗、改善或预防疾病或病症的其他治疗剂或治疗联合施用。其他治 疗剂或治疗的实例包括但不限于其他生长因子(例如，白介素、干扰素、集落刺激因子、肿 瘤坏死因子、促红细胞生成素)、免疫抑制剂、抗炎剂、抗癌药、抗体和放射治疗。可以以单个 组合物或作为分离的组合物施用含有mIL-11或其变体、片段或衍生物的生物相容性聚合 物辍合物和一种或更多种治疗剂。在一些实施方案中，在以下一种或更多种条件下对动物 施用含有mIL-11或其变体、片段或衍生物的生物相容性聚合物辍合物以及一种或更多种 治疗剂以不同的频率、以不同的持续时间、以不同的浓度、通过不同的给药方式等。在一些 实施方案中，在施用治疗剂之前施用含有mIL-11或其变体、片段或衍生物的生物相容性聚 合物辍合物，例如，在施用所述治疗剂之前0. 5、1、2、3、4、5、10、12或18小时，1、2、3、4、5或 6天，1、2、3或4周。在一些实施方案中，在施用治疗剂之后施用含有mIL-11或其变体、片 段或衍生物的生物相容性聚合物辍合物，例如，在施用所述治疗剂之后0. 5、1、2、3、4、5、10、 12或18小时，1、2、3、4、5或6天，1、2、3或4周之后。在一些实施方案中，含有mIL-11或其 变体、片段或衍生物的生物相容性聚合物辍合物与治疗剂同时但以不同方案施用，例如，含 有mIL-11或其变体、片段或衍生物的生物相容性聚合物辍合物每天施用、一周两次或一周 一次施用，而治疗剂或抗癌剂的施用为一周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次。组合物本发明范围内的组合物包括下述所有组合物，即组合物中以足够达到预定目的的 量包含本发明之含有mIL-11或其变体、片段或衍生物的生物相容性聚合物辍合物。尽管个 体需要不同，但是每个组分有效量的最佳范围的确定在本领域现有技术范围内。通常地，可 以以约1至约5000 μ g/kg体重的剂量对动物(例如人)施用含有mIL-11或其变体、片段 或衍生物的生物相容性聚合物辍合物。在另一些实施方案中，该剂量为约2至约IOOOyg/ kg、约5至约500 μ g/kg或约5至约250 μ g/kg(以无化学修饰、单独蛋白质的质量计算)。在一些实施方案中，包含具有mIL-11或其变体、片段或衍生物之生物相容性聚合 物辍合物的组合物为单位剂量形式，如一次性容器、可直接注射溶液、药片/丸、胶囊或局 部用组合物。在一个实施方案中，该单位剂量形式包含小于约500mg的该含有mIL-11或其 变体、片段或衍生物的生物相容性聚合物辍合物，例如约0. Img至约500mg、约0. 2mg至约 IOOmg 或约 0. 5mg 至约 50mg。除了以分离的多肽施用含有mIL-11或其变体、片段或衍生物的生物相容性聚合 物辍合物，本发明的多肽还可以作为含有适合的药用可接受载体的药物制剂的一部分来施 用，所述载体包括赋形剂和辅剂，其便于将多肽加工为可以药用的制剂。优选地，该制剂含 有约0.01%至99% (优选约0.25%至75% )的活性多肽，以及赋形剂。在一个实施方案中，药物组合物含有使具有mIL-11或其变体、片段或衍生物的生 物相容性聚合物辍合物稳定化的赋形剂，以防止贮存中降解。在一个实施方案中，该药物组 合物为干燥形式(如冷冻干燥)，以保持经生物相容性聚合物辍合的多肽的稳定性。在要 施用给动物之前，将该干燥组合物溶解在适合的液体中，例如水或盐水。在另一个实施方案 中，该药物组合物为液体形式。具有mIL-11或其变体、片段或衍生物的生物相容性聚合物辍合物的合适药物组合物的实例包括含有具有mIL-11或其变体、片段或衍生物之生物相 容性聚合物辍合物、甘氨酸和冷冻保护剂、并任选地包含聚山梨醇酯、甲硫氨酸和缓冲剂的 组合物(参见美国专利No. 6，270，757和No. 7，033，992)。可以将本发明的药物组合物施用给任何可以获得本发明化合物的有利效果的动 物。这些动物中最主要的是哺乳动物，如人，尽管本发明不意图受限于此。其他动物包括兽 医学动物(牛、羊、猪、马、狗、猫等)。在一个实施方案中，该动物是人或猴。可以通过任何能够达到预定目的的方式施用该药物组合物。例如，施用可以是经 肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、透皮、口腔颊粘膜、鞘内、颅内、鼻内或局部用药。作 为替代、或者同时，可以通过口服途径施用。优选的施用途径取决于需治疗、改善或预防的 疾病或病症。例如，为了刺激血小板生成，优选的施用途径是皮下。对于治疗、改善或预防 胃肠道炎性病症，优选的施用途径是局部给药。施用的剂量取决于受体的年龄、健康状况和 体重、同时进行治疗的种类(如果有)、治疗频率以及素期望效果的性质。本发明的药物制剂以其本身显示的方法制造，例如，通过常规的混合、颗粒化、制 备糖衣、溶解或冷冻干燥方法。因此，可以通过将活性化合物与固体赋形剂组合，任选地，如 果需要或必要，在加入合适的辅剂后研磨所得混合物并加工颗粒混合物以获得药片或糖衣 剂核心，从而获得口服用药物组合物。具体而言，合适的赋形剂是填充剂如糖类(如乳糖或蔗糖)、甘露醇或山梨醇、纤 维素制剂和/或磷酸钙(例如磷酸三钙或磷酸氢钙)，以及粘合剂如淀粉糊(如采用玉米淀 粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉)、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲 基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如需要，可以加入崩解剂，比如上述淀粉还有羧甲基淀 粉、交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐如海藻酸钠。重要的是，辅剂是流动控制剂 和润滑剂，例如硅石、滑石、硬脂酸或其盐(如硬脂酸镁或硬脂酸钙)、和/或聚乙二醇。糖 衣剂核心与适合的包被一起提供，如果需要，所述包被对胃液有抗性。为此，可以采用糖溶 液，其任选地包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及 适合的有机溶剂或溶剂混合物。为了生产对胃液有抗性的包衣，采用了适合的纤维素制剂 (如邻苯二甲酸醋酸纤维素或羟丙基甲基-邻苯二甲酸纤维素)的溶液。可以在片剂或糖 衣剂包衣中加入染料或色素，例如用于鉴别或用于表征活性化合物剂量组合。其他可口服使用的药物制剂包括明胶制成的推入-配合胶囊，以及由明胶和增塑 剂入甘油或山梨醇制成的软密封胶囊。推入-配合胶囊可以包含颗粒形式的活性化合物， 其可以与以下物质混合填充剂如乳糖，粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁，以 及任选地，稳定剂。在软胶囊中，活性化合物优选地溶解或分散在适合的液体中，所述液体 如脂肪油或液体石蜡。此外，可以加入稳定剂。本发明还涉及试剂盒，包括药盒。所述试剂盒可以包含具有mIL-11或其变体、片 段或衍生物的生物聚合物辍合物，以及适合的对照，如阳性和/或阴性对照。在一些实施方 案中，所述试剂盒可以包含具有mIL-11或其变体、片段或衍生物之生物相容性聚合物辍合 物的药物组合物。所述试剂盒优选地包含额外的组分，例如，如使用说明、固体支持物、帮助 定量的试剂等。可以在适合的容器中包装所述化合物或试剂。实施例实施例1 人白介素-11突变蛋白A.制备人IL-Il突变蛋白人白介素11突变蛋白(mIL-11)是重新设计以耐受化学和蛋白水解压力的人白 介素-Il(IL-Il)。缺失了人 IL-Il (NCBI AAA59132. 1 SEQ IDN0. 1)的 N-端区域(1-30 位残基)，并且将新的N-端(对应人IL-Il第31位缬氨酸)以及所得第125位天冬氨酸 (对应人IL-Il第155位)分别突变成丙氨酸和天冬酰胺。在以上SEQ ID NO :2中显示 了 mIL-11的氨基酸序列。该mIL-11用pGEX4T表达载体表达为谷胱甘肽-S-转移酶融合 蛋白(GST-mIL-11)。详细的制备过程与在WO 2006/126102 A2中所述的类似。简单讲，通 过定位突变产生编码mIL-11的cDNA，并将其引入pGEX4T-kan表达载体(其中用卡那霉素 抗性基因替换PGEX4T的氨苄青霉素抗性基因)中以产生GST-mIL-11。将所得的表达载体 pGEX4T-GST-mIL-ll转化入大肠杆菌KRX(Promega，Madison, WI，USA)。用单个转化物接种 添加了卡那霉素(10yg/ml)的LB培养基，并在30°C下培养直到生长到合适水平(0D·= 0.5)。然后，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) (0. 4mM)以诱导蛋白质表达，并 将细胞在30°C下培养3-4小时。通过SDS-PAGE确定GST-mIL-11的表达。通过离心收集细胞并将其悬浮在含有2mM EDTAWpH 7.550mM磷酸钠中，并用超声或在4°C下高压勻浆进行裂解。除非另外指明，以 下步骤在4°C下进行。通过离心去除裂解细胞的碎屑，并将上清液进行GST-亲和色谱分析 (GEHealthcare, Pittsburgh, PA, USA)。用 pH 7. 5，50mM 磷酸钠清洗柱子，而后用含有 IOmM 还原谷胱甘肽的PH 7.5，50mM的磷酸钠洗脱。收集洗脱的GST-mL-11级分并在20°C下孵育 以供凝血酶蛋白水解。每毫克GST-mIL-11加入0. 75U凝血酶，而后在20°C下孵育1. 5小 时并温和搅拌。用吸光系数通过紫外分光术分析该蛋白质浓度。通过快速冷却到1_4°C终 止蛋白质水解。而后将反应溶液进行阳离子交换层析(SP sepharose fastflow树脂，GE Healthcare，Pittsburgh，PA，USA)。用pH 7. 5，50mM磷酸钠彻底清洗柱子。在这些条件下， 谷胱甘肽-S-转移酶和谷胱甘肽被洗脱进流动相，经切割的mIL-11保持结合。通过50mM磷 酸钠中0至40mMNaCl的线形梯度收集该mIL-11级分，随后加入苯甲脒柱(GE Healthcare, Pittsburgh,PA,USA)以去除任何残留的凝血酶。收集流过的级分加入kphadex 75柱(GE Healthcare,Pittsburgh,PA,USA)从而将缓冲液更换为含有0. 聚山梨醇酯20和5%山 梨醇的pH 5. 0，50mM的醋酸钠。收集mIL-11级分并在_80°C贮存备用(图1，泳道2)。B.人IL-Il突变蛋白的表征为了调查突变对IL-Il的作用，分别通过圆二色谱分析(⑶)和细胞增殖测定来进 行二级结构测定和生物活性测定。认为人白介素-11采取的是四螺旋束折叠(Czupryn等， JBC 270 :978-985(1995)) ο 用 JASCOJ-810 模型(Tokyo, Japan)记录 mIL-11 的远紫外 CD 谱，方法类似于Czupryn等所报道的但稍有改动。该⑶谱的记录以0. Icm步长在25士 1°C 下的IOmM Tris-HCl (pH8. 0)中进行。该样本的浓度为0. 5mg/ml。为了对照，也分析了重 组人 IL-Il ((rhIL-11，Wyeth，NJ，USA，SEQ ID No. 3)。mIL-11 的 CD 谱显示了典型的 α 螺 旋信号，并与rhIL-11类似(图2Α)。而且，当采用表达IL-Il报告基因的Ba/F3细胞测量 mIL-11的细胞增殖活性时(详细过程参见实施例5)，mIL-ll的生物活性曲线与rhIL_ll类 似(图2B)。这些结果证实对IL-Il引入的突变不影响其结合其受体的能力，并且不影响该分子的整体结构。在实施例5中说明了详细的细胞系信息和测定方案。实施例2 酸性条件下mIL-11的稳定性测定如实施例1中所述，将mIL-11设计为在化学压力下比IL-Il更加稳定。为了比较 mIL-11和IL-Il的稳定性，进行了强制降解试验。简单而言，在50°C下pH 3.5的2福柠檬 酸溶液中将实施例1中制备的mIL-11和购自Wyeth (NJ，USA)的rhIL-11孵育0_4天。在 某时间点(0、1、2、3和4天)收集经处理样本，并立刻冰冻以停止反应直到进行分析。用 SDS-PAGE 和反相 HPLC (RP-HPLC，C4，5X4. 6mm, Vydac, Deerf ield, IL, USA)分析降解的产物。 收集RP-HPLC(图幻的每个峰，并通过Edman测序和质谱分析进行确定。在处理的M小时内，约60%的rhIL-11被降解，根据SDS-PAGE (数据未显示)和 RP-HPLC (图3)的结果，产生了 3个级分。这些结果类似于之前在Kenley和Warne，Pharma. Res. 11 :72-76(1994)中的报道。在4天的酸性条件下，根据RP-HPLC，只观察到3%的完整 rhIL-11。该结果也与之前所述(Kenley和Warne)相同。通常的酸水解位点是脯氨酸(P) 和天冬氨酸⑶之间的肽键，其在rhIL-11中出现了 2次，在mIL-11中出现了 1次(斜线 表示，图4)。然而，在mIL-11中，在处理过程中大部分mIL-11 ( 85%)保持完整(图3)。 所观察到的mIL-11降解位点在脯氨酸3和天冬氨酸4之间。不像rhIL_ll，IM和155位之 间的肽键(图4)被保护而免受蛋白水解，这可能是由于在SEQ ID NO :2第124-125位(对 应于SEQ ID NO :1的P1M-D155)由天冬氨酸突变为天冬酰胺。这些结果表明与rhIL-11 相比，mIL-11在酸性条件下明显地更加稳定。mIL-11的该特点对PEG化有利，因为在一些 情况下，PEG化的条件非常严苛。实施例3 单PEG化IL-Il突变蛋白的制备采用胺特异性PEG化A.单 PEG 化 IL-Il 突变蛋白的制备PEG_mIL-Il-SC在IL-Il突变蛋白上具有4个暴露于表面的胺基(N-端的一个伯胺和3个赖氨酸 残基的ε胺，图5)。按照以下所述进行胺特异性PEG化。首先，将实施例1中所示的纯化mIL-11进行相对于pH7. 4磷酸盐缓冲液(PBS)的 透析以去除所有不需要的胺基基团。然后将经透析的mIL-11溶液用超滤膜(VivaSpin2， IOK MWCO, Vivascience, Germany)浓缩至 lmg/ml。用 ^Onm 吸光度(Pace 等，Prot. Sci. 4 2411(1995))或 Lowery 法(Lowry 等，J. Biol. Chem. 193 :265(1951))确定 mIL-11 的浓度。 将透析的mIL-11溶液与5倍摩尔数过量的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC， IDB,Korea)在室温Q0_25°C )下反应1 2小时，并温和搅拌。所测试的PEG聚合物的长 度为5kDa、20kDa或30kDa。无论所连接PEG聚合物长度为何，均应用相同的反应和纯化方 案。而后用 IOK 膜(Vivaspin2,30K MWCO, Vivascience, Germany)相对于 pH 5.0，50mM 醋 酸钠来透析过滤反应溶液以去除未反应的PEG聚合物。然后将保留物(retenant)加到阳离子交换层析(SP_s印harose，GEHealthcare, Pittsburgh, PA, USA)中，并用pH 5. 0的50mM醋酸钠平衡。用相同缓冲液从0至400mM的线 性盐梯度洗脱该柱，以分离二PEG化、单PEG化(PEG-mIL-11-SC)和非PEG化的mIL-11。然后 将获得的单PEG化mIL-11级分用kphadex 25柱脱盐到配制缓冲液中(含有0. 1 % Tween 20、5%山梨醇的50mM醋酸钠，pH 5. 0)。用280nm吸光度和Lowry确定PEG-mlL-Il-SC的 浓度。将终浓度调整为lmg/ml并在-80°C贮存备用。B.表征
用SDS-PAGE0-12 % NuPAGE Novex bis-tris 丙烯酰胺凝胶，hvitrogen， Carlsbad, CA, USA)和体积排阻 HPLC (Bio-Si 1 SEC 250，Bio-Rad, Richmond, CA, USA)分 析纯化的单PEG化mlL-11 (称为PEG-mlL-11-SC)。在SDS-PAGE凝胶上观察到用20kDa mPEG-SC被PEG化的mIL-11的50kDa清晰条带(图1，泳道1)，这说明在纯化后获得的大 部分mIL-11是单PEG化的。检测到了少于5%的75kDa带(代表二 PEG化mIL-11)和少 于的未反应mIL-11(ISkDa)。通过体积排阻高效波相层析(HPLC)分析，检测到了稍高 含量的二 PEG化mIL-ll(8%，保留时间 14分钟)，而未反应mIL-11的含量相同(图6)。 无论检测的纯化批次为何，单PEG化mIL-11 (PEG-mIL-11-SC)的总纯度均高于90%。实施例4 单PEG化mIL-11突变蛋白制备采用N-端特异性PEG化A.用N端特异件PEG化法制备单PEG化mIL-11突变蛋白(PEG-mlL-ll-AD)为了将PEG聚合物选择性引入蛋白质的N端，将4倍摩尔过量的20kDa甲氧基 PEG 丙醛(Nektar Therapeutics, San Carlos, CA, US)与纯化的 mIL-11 突变蛋白在 pH 5.0，50mM柠檬酸钠中混合。然后加入氰基硼氢化钠(终浓度5mM)作为还原剂。在室温 (20-25°C )下孵育该反应混合物M小时，并温和搅拌。通过立即的纯化步骤或在-20°C贮 存来终止反应。连接到mIL-llN-端的单个PEG聚合物(PEG-mIL-11-AD)的纯化方法与在 实施例3中所述的方法相同。B.表征分析方法与实施例3中的那些相同。如在实施例3中的情况，也检测到了迁移到 75、50和18kDa处的三个条带，代表二 PEG化、单PEG化和裸露(未缀合)的mIL-11。只检 测到少于的二 PEG化mIL-ll(75kDa)和少于1 %的未反应mIL-11 (18kDa)(图7A)。采 用体积排阻HPLC分析，单PEG化mIL-11 (保留时间 15分钟)的总纯度为92%，其余是8% 的二 PEG化mIL-11 (保留时间 14分钟)以及少于1 %的未反应或未缀合mIL-11 (图7B)。实施例5 =PEG化mIL-11的体外生物活性A.构建表达人IL-Il受体的Ba/F3细胞(BallG)通过采用表达gpl30和IL-Il受体α链的Ba/F3细胞的体外细胞增殖测定来确定 PEGKmIL-Il的生物活性，方法与Lebeau等所述的类似(Lebeau等，FEBS Letters 407 141-147(1997))。简单而言，通过用两个逆转录病毒受体MIN-IL-IIR和MIH_gpl30 (分别表达IL_11 受体 α 链(NCBI NM 004512. 3) ^P gp 130 (NCBI NM602184))转导 Ba/F3 细胞制备稳定表达 IL-Il 受体、gpl30 和 IL-Il 受体 α 链(IL-IlR)的 Ba/F3 细胞系(DSMZ，Germany)。通过 将IL-IlR基因插入pMIN载体制备逆转录病毒质粒pMIN-IL-llR(Yu等，GeneTherapy 10 706-71K2003))。通过用潮霉素抗性基因取代pMIN的新霉素抗性基因并随后插入gpl30基 因来制备pMIN-gpl30。为了产生逆转录病毒载体MIN-IL-11R，如Yu等，Gene Therapy 10: 706-711(2003)所示，将 pMIN_IL_llR 与 pVM_GP 和 pVM_AE (分别表达 gag-pol 和双嗜性包 膜)一起转染入HEK293T细胞。除pMIH-gpl30被转染而不是pMIN-IL-llR被转染外，用与 MIN-IL-IlR相同的过程产生逆转录病毒载体MIH-gpl30。在含有10%胎牛血清的DMEM培 养基中培养该转化细胞2天。在培养后，通过将培养上清液通过0. 45 μ m滤器过滤来制备 无细胞病毒。为了产生表达IL-Il受体α链的Ba/F3细胞，用逆转录病毒载体MIN-IL-IIR 转导Ba/F3细胞，并在ang/ml G418存在下筛选。通过采用FITC-抗-IL_llR(ThermoScientific, Rockford，IL, USA)的流式细胞术分析来确定IL-Il受体α链的表达。而后 用逆转录病毒载体MIH-gpl30转导稳定表达IL-IlR的细胞，并在ang/ml G418和0. 5mg/ml 潮霉素的存在下进行筛选。通过采用FITC-抗-IL-IlR和PE-抗_hgpl30 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)的流式细胞术分析分别确定IL-IlR和gpl30的表达。通过在ang/ml G418和0. 5mg/ml潮霉素存在下的有限稀释来获得表达IL-IlR和gpl30两者的单克隆。通 过采用以下引物对的RT-PCR来确定该细胞中IL-Il受体α链和gp130 mRNA的产生。
对IL-Il受体α链
SEQ ID NO 4 5' -CGACGCGTATGAGCAGCAGCTGCTCAGGG-3，(正向) SEQ ID NO 5 5' -GAAGATCTCTACAGGTTTGGAGCTCCTGG-3，(反向)对gpl30:SEQ ID NO 6 :5，-ACGCGTATGTTGACGTTGCAGACT-3，(正向)SEQ ID NO 7 5' -GGATCCTCACTGAGGCATGTAGCC-3，(反向)B.单PEG化mIL-11的体外牛物活件测定将以上实施例3和4中所述的采用胺特异性方法或N端特异性方法制备的单PEG 化mlL-11 (PEG-mIL-11-SC或PEG-mIL-11-AD)、以及实施例1中制备的未缀合mIL_l 1，通 过10倍系列稀释从lpg/ml稀释到1 μ g/ml并放置到96孔板上。将100微升BallG细胞 (3X104细胞/ml)加入稀释的样本中，并在96孔板中，在37°C，5% CO2中培养72小时。在 培养结束时，在37°C，5% CO2中用XTT试剂(细胞增殖试剂盒II，Roche, Indianapolis, IN, USA)处理细胞 4 小时。用微孔板阅读器(VERSA max, Molecular Devices, Sunnyvale, CA,USA)测量样本在492nm下的光密度。将每个样本在690nm的光密度减去以去除细胞的 散射信号。所有测定重复三次。单PEG化mlL-11的两种制备物(胺特异性PEG化mIL_ll (PEG-mIL-ll_SC)和N 端特异性PEG化mIL-11 (PEG-mIL-11-AD))与未缀合mIL-11相比显示了相似的细胞增殖活 性，这表明PEG的添加没有干扰IL-Il和IL-Il受体的相互作用(图8)。通过在y轴显示 吸光度、在χ轴显示样本浓度来为PEGKmIL-Il的剂量效应曲线作图。用对数方程拟合该 S形剂量效应曲线。实施例6 大鼠中PEG KmIL-Il突变蛋白的体内生物活性通过采用单次皮下注射对10周龄雌性Sprague-Dawley大鼠(SLC，Japan)施用 400 μ g/kg 的 PEG-mIL-ll-AD、PEG-mIL-ll-SC 或未缀合的 mlL-11 进行 PEG 化 mlL-11 的体 内测试。用盐水作为载体对照。每个组分配5只动物。在用药后不同时间点(0、3、6、8、10 和12天)从尾血管收集血液样本。采用自动血液分析仪(Abbott Lab, Abbott Park, IL, USA)根据制造商的建议测定血小板计数。如图9所示，PEG-mlL-ll-SC(A)或PEG-mlL-ll-AD (B)处理动物的血小板计数从第 3天增加，并在第6天达到最大值。在第6天，两种PEG化mIL-11蛋白质的血小板计数与 天然mIL-11相比显著提高(* ;P<0. 001),并且在第6和8天，两种PEG化mIL-11蛋白质 的血小板计数显著地高于那些载体对照组Ck ；P <0.05)。在所有时间点，未缀合mIL-11 和载体对照之间的血小板计数差异没有显著的统计学差异。这些结果证明，在大鼠中两种 PEGKmIL-Il蛋白的生物活性比未缀合mIL-11更高。通过在大鼠中比较单次施用PEG-mIL-11-SC或PEG-mlL-l I-AD与多次施用未缀合mIL-11来测试降低给药频率的能力。对重 250g、10周龄的雌性Sprague-Dawley大鼠(每 组 5 只大鼠)单次皮下注射 400 μ g/kgPEG 化 mIL-11 (PEG-mIL-11-SC 或 PEG-mlL-ll-AD)。 作为对照，每天注射施用400yg/kg未缀合mIL-11，持续7天。在用药后不同时间点(0、3、 6、8、10和12天)从尾血管收集血液样本。采用自动血液分析仪测定血小板计数。如在图10中所示，PEG-mlL-ll-SC(A)或PEG-mlL-ll-AD (B)处理动物的血小板计 数从第3天增加，并在第6天达到最大值，而用未缀合mIL-11处理的动物的血小板计数在 第8天达到最大值。两种PEG化mIL-11处理组的最大血小板计数水平与7次连续注射未 缀合mIL-11的类似。这些结果证明，在大鼠中PEGKmIL-Il的单次给药剂量能够有效替 代未缀合mIL-11的7天给药剂量，并可导致相同或提高的效用。实施例7 大鼠中PEG KmIL-Il突变蛋白的药代动力学为了确定PEG-mIL-11-SC和PEG-mlL-l I-AD在大鼠中的药代动力学，采用单次皮 下注射对 10 周龄雌性 Sprague-Dawley 大鼠(SLC，Japan)施用 400 μ g/kg 的 PEG-mlL-ll-SC 或PEG-mIL-11-AD。用盐水或400 μ g/kg的未缀合mIL-11作为对照。每组分配4至6只 大鼠。简单而言，在用药后不同时间点(0. 08、0. 5、1、2、3、6、12、24、48、72和96小时)从 尾血管收集血液样本。而后通过离心O，500g，10分钟)分离血浆样本，采用可购得的人 IL-Il ELISA试剂盒(R&D system, Minneapolis, MN, USA)按照制造商的建议测定血浆中 PEG-mIL-ll-SC、PEG-mIL-ll-AD 或裸 mlL-11 的水平。用 PEG-mIL-ll-SC、PEG-mIL-ll_AD 或 未缀合 mIL-11 作为标准蛋白质。用 5. 2 版 WinNonlin 软件(Pharsight Corp.，Cary, NC, USA)以无间隔方式分析药代动力学参数。如图11中所示，在施用后，PEG-mlL-ll-SC(A)或PEG-mlL-ll-AD(B)的血浆水平在 8小时达到最大值并保持到72小时。在施用后，未缀合mIL-11的血浆水平在1小时达到 最大值并保持到12小时。在以下表1中概括了 PEG-mIL-11-SC、PEG-mlL-Il-AD或未缀合 mIL-11的药代动力学参数。PEG-mIL-11-SC或-AD的半衰期与未缀合的mIL-11相比大约 是5倍长。PEG-mIL-11-AD或-SC的曲线下面积与采用相同剂量的未缀合mIL-11相比是大 约8倍或5倍高。该结果证明两种PEG KmIL-Il蛋白的特征为在大鼠中与未缀合mIL-11 相比具有增强的持久性。以下表1显示了大鼠中在单次皮下给药后PEG-mIL-11和mIL_ll的详细药代动力 学特性。表1:
权利要求
1.包含突变人IL-Il(mIL-11)和生物相容性聚合物的辍合物；其中，除五个或更少的氨基酸替换以外，所述mIL-11的氨基酸序列包含SEQ ID NO :2， 然而前提是对应SEQ ID NO :2第1位的氨基酸残基是丙氨酸并且对应SEQ ID NO 2第125 位的氨基酸残基是天冬酰胺；其中与未缀合参照mIL-11的细胞增殖活性水平相比，所述辍合物的体外细胞增殖活 性水平下降了至多5%，其中在所述辍合mIL-11中与未缀合参照mIL-11中所述mIL-11的 氨基酸序列相同；并且其中通过以下方式来测定所述细胞增殖活性使所述辍合物或所述未缀合参照 mIL-11与因表达IL-Il受体α链和糖蛋白130(gpl30)而对IL-Il有反应的细胞接触，体 外培养所述细胞，以及测量所得的细胞增殖。
2.权利要求1的辍合物，其中所述生物相容性聚合物选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二 醇、聚氧乙烯、聚三亚甲基二醇、聚乳酸、聚丙烯酸、聚氨基酸、聚乙烯醇、聚氨酯、聚膦腈、聚 (L-赖氨酸)、聚烯烃氧化物、多糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和聚丙烯酰胺。
3.权利要求1的辍合物，其中所述生物相容性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
4.权利要求3的辍合物，其中所述PEG是直链的或具有支链。
5.权利要求1的辍合物，其中所述mIL-11是单PEG化的。
6.权利要求3的辍合物，其中所述PEG的分子量为约2kDa至约lOOkDa。
7.权利要求6的辍合物，其中所述PEG的分子量为约IOkDa至约60kDa。
8.权利要求6的辍合物，其中所述PEG的分子量为约2kDa至约50kDa。
9.权利要求8的辍合物，其中所述PEG的分子量为约5kDa至约20kDa。
10.权利要求1的辍合物，其中所述mIL-11的氨基酸序列包含SEQIDNO :2。
11.权利要求1的辍合物，其中除第31位缬氨酸被替换为甘氨酸、以及第155位天冬氨 酸被替换为天冬酰胺以外，所述mIL-11的氨基酸序列包含SEQ ID NO :1。
12.权利要求1的辍合物，其中除第9位缬氨酸被替换为甘氨酸、以及第133位天冬氨 酸被替换为天冬酰胺以外，所述mIL-11的氨基酸序列包含SEQ ID NO :3。
13.包含突变人IL-Il(mIL-11)和生物相容性聚合物的辍合物；其中，所述mIL-11的氨基酸序列包含与SEQ ID NO :2所示氨基酸序列有至少95%同 一性的氨基酸序列，然而前提是对应SEQ ID NO :2第1位的氨基酸残基是丙氨酸并且对应 SEQ ID NO 2第125位的氨基酸残基是天冬酰胺；其中在细胞增殖测定中与未缀合参照mIL-11的细胞增殖活性水平相比，所述辍合物 的体外细胞增殖活性水平下降了至多5%，其中在所述辍合mIL-11中与未缀合参照mIL-11 中所述mIL-11的氨基酸序列相同；并且其中通过以下来测定所述细胞增殖活性使所述辍合物或所述未缀合参照mIL-11与 因表达IL-Il受体α链和糖蛋白130(gpl30)而对IL-Il有反应的细胞接触，体外培养所 述细胞，以及测量所得的细胞增殖。
14.权利要求13的辍合物，其中所述生物相容性聚合物选自聚乙二醇(PEG)、聚丙二 醇、聚氧乙烯、聚三亚甲基二醇、聚乳酸、聚丙烯酸、聚氨基酸、聚乙烯醇、聚氨酯、聚膦腈、聚 (L-赖氨酸)、聚烯烃氧化物、多糖、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和聚丙烯酰胺。
15.权利要求13的辍合物，其中所述生物相容性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
16.权利要求15的辍合物，其中所述PEG是直链的或具有支链。
17.权利要求13的辍合物，其中所述mIL-11是单PEG化的。
18.权利要求15的辍合物，其中所述PEG的分子量为约2kDa至约lOOkDa。
19.权利要求18的辍合物，其中所述PEG的分子量为约IOkDa至约60kDa。
20.权利要求18的辍合物，其中所述PEG的分子量为约2kDa至约50kDa。
21.权利要求20的辍合物，其中所述PEG的分子量为约5kDa至约20kDa。
22.权利要求13的辍合物，其中所述mIL-11的氨基酸序列包含SEQIDNO :2。
23.权利要求13的辍合物，其中除第31位缬氨酸被替换为甘氨酸、以及第155位天冬 氨酸被替换为天冬酰胺以外，所述mIL-11的氨基酸序列包含SEQ ID NO :1。
24.权利要求13的辍合物，其中除第9位缬氨酸被替换为甘氨酸、以及第133位天冬氨 酸被替换为天冬酰胺以外，所述mIL-11的氨基酸序列包含SEQ ID NO :3。
25.一种药物组合物，其包含权利要求1至M任一项的辍合物以及药用可接受载体。
26.权利要求1至M任一项之辍合物或权利要求25之组合物用于制造在有此需要的 患者中治疗血小板减少症的药物的用途。
27.权利要求沈的用途，其中所述患者是哺乳动物。
28.权利要求27的用途，其中所述哺乳动物是人。
29.权利要求1至M任一项之辍合物或权利要求25之组合物用于制造在有此需要的 患者中增加血小板计数的药物的用途。
30.权利要求四的用途，其中所述患者是哺乳动物。
31.权利要求30的用途，其中所述哺乳动物是人。
全文摘要
本发明提供了IL-11类似物(mIL-11)和生物相容性聚合物的生物聚合物缀合物。本发明的mIL-11与rhIL-11相比对酸解显示了增强的抗性，并显示了更强的稳定性。本发明缀合物的特征为与对应未缀合的mIL-11相比，具有更长的血清半衰期，并且基本未显示活性的丧失。
文档编号A61K38/20GK102131518SQ200980133683
公开日2011年7月20日 申请日期2009年8月21日 优先权日2008年8月25日
发明者朴明玉, 胡成炫, 郑允姬, 金明淑 申请人:百疗医株式会社, 百聚生物有限公司