用于治疗纤维化疾病或病症的组合物的制作方法

专利名称：用于治疗纤维化疾病或病症的组合物的制作方法
用于治疗纤维化疾病或病症的组合物相关申请的交叉引用本专利申请要求于2008年6月20日提交的美国临时申请No. 61/074，492的优先权权益，该临时申请的全文以引用方式并入本文中。
背景技术：
纤维化是由于长期受损伤而可能在多种不同组织中发生的复杂疾病。纤维化的特征通常在于成纤维细胞和成肌纤维细胞增殖的异常增加，以及胶原和其它细胞外基质 (ECM)成分的过量沉积。最终，这些变化可能破坏受影响器官的正常结构和功能，如在慢性间质性肝炎、肺间质纤维化(IPF)、系统性硬化病(硬皮病)中的皮肤和器官、移植排斥反应、充血性心力衰竭中的心脏以及许多其它疾病中所发生的那样。常规的治疗涉及使用皮质甾类药物和免疫抑制剂类药物，这些药物对于逆转或防止纤维化的发展效果很低，或者没有效果(Wynn，2007)。由于内在病理的复杂性，已经提出了各种治疗干预方案。已经提出减少胶原原纤维的合成、分泌或聚合可能对于减慢纤维发生是有效的。另一类解决方案是增强胶原酶的活性，以试图破坏过量的ECM，而其它方案已经提出中和或抵抗促进胶原合成的细胞因子的策略，如β转化生长因子(“TGF-β ”)。几种公认的抗纤维化剂已经在临床试验中进行测试，但是其并没有真正显示出推迟纤维化的效力。据认为，在导致纤维化的发生和发展的因素中，受伤部位的淋巴细胞和成纤维细胞/成肌纤维细胞的增多(Hinz等，2007)以及TGF-β的诱导(Wells 2000 ；Verrecchia 和Mauviel，2007)是关键的。因此，能够使成纤维细胞和成肌纤维细胞正常移动到受伤组织和/或调节TGF-β的功能的药物对于治疗纤维化是特别有用的。发明概述因此，在一个方面中，本发明提供了一种治疗患者内的纤维化疾病或病症的方法， 包括给该患者施用诺斯卡品和药用载体。在一些实施方案中，纤维化疾病或病症得到推迟； 在一些实施方案中，纤维化疾病或病症得到减轻。在另一方面中，本发明提供了治疗纤维化疾病的方法，包括施用以下药物组合物， 该药物组合物包含诺斯卡品(包括其变体)以及一种、两种、三种或更多种抗纤维化剂，所述抗纤维化剂包括(但是不限于)ACE抑制剂、抗炎剂、吡非尼酮(Pirfenidone)、格列卫 (Gleevec)和波生坦(Bosentan)。该药物组合物还可包含药用载体。这种治疗可使得纤维化疾病症状的发作得到推迟或者纤维化疾病症状的严重程度得到减轻。附图简述

图1示出在施用单独剂量的博莱霉素(1. 5U/kg，经口施用)2周后，新胶原的合成情况(标记羟基脯氨酸(OHP)百分比或“f”)。在施用博莱霉素同一天开始施用诺斯卡品 (ip)，并且持续2周。N = 4/组；数据以平均值+SD表示；*p < 0. 05 ；进行AN0VA，随后进行Durmett检验，以与博莱霉素/载剂进行比较。图2示出在施用单独剂量的博莱霉素(1. 5U/kg，经口施用)2周后，经氯胺_t分析测量，每个肺的OHP的绝对量。在施用博莱霉素同一天开始施用诺斯卡品，并且持续2周。 N = 4-5/组；数据以平均值+SD表示；*p < 0. 05 ；依次进行单因素ANOVA和Dunnett检验， 以与博莱霉素/载剂对照组或诺斯卡品治疗组(30mg/kg和100mg/kg)进行比较。图3示出在施用单独剂量的博莱霉素(1. 5U/kg，经口施用)2周后，每个肺的新合成的胶原的绝对量(以fx
的方式计算)。与载剂对照组或诺斯卡品治疗组相比，博莱霉素增加了肺内新合成的胶原的绝对量。N = 4-5/组；数据以平均值+SD表示；*p <0.05； 进行AN0VA，随后进行Durmett检验，以与博莱霉素/载剂对照进行比较。图4示出由施用单独剂量的博莱霉素(1.5U/kg;经口施用；和以上图1-3中使用相同的动物)2周后的小鼠的肺获得的α-平滑肌肌动蛋白(a-SM)阳性肺细胞的代表性载玻片和半定量分析。博莱霉素显著增加肺内存在的含有成肌纤维细胞的激活α-SMA的数量。诺斯卡品显著降低由博莱霉素激活的成肌纤维细胞的数量。N = 4-5/组；数据以平均值+SD表示；*ρ < 0. 05 ；进行AN0VA，随后进行Durmett检验，以与博莱霉素/载剂对照进行比较。图5示出施用单独剂量的博莱霉素(1. 5U，经口施用)2周后的新胶原的合成情况 (标记OHP百分比或“f”)。在施用博莱霉素同一天开始施用300mg/kg的诺斯卡品(经口施用)，并且持续2周。N = 10/组；数据以平均值+SD表示；*p < 0. 05 ；依次进行单因素 ANOVA和Durmett检验，以与博莱霉素/载剂进行比较。图6示出施用单独剂量的博莱霉素(1. 5U，经口施用)2周后的新胶原的合成情况 (标记OHP百分比或“f”)。在施用博莱霉素同一天开始通过饮食以产生大致300mg/kg的剂量的浓度施用诺斯卡品，并且持续2周。诺斯卡品倾向于降低新OH-P的百分比，但是其效果并无统计学意义。N = 5/组；数据以平均值+SD表示。图7示出在单独或与诺斯卡品组合施用(经口施用)ANIT之后肝内新胶原的合成情况(标记OHP百分比或“f”)。在剂量为30和100mg/kg的条件下，诺斯卡品显著降低ANIT诱导的OHP增加。N = 5/组；数据为平均值+SD ；*ρ < 0. 05 ；进行AN0VA，随后进行 Dunnett检验，以与ANIT/载剂多个对比组进行比较。图8示出在单独或与诺斯卡品组合施用(经口施用)ANIT之后肝内OHP的绝对量。 诺斯卡品显著降低ANIT诱导的OHP含量增加。N = 5/组；数据为平均值+SD ；*ρ < 0. 05 ； 进行AN0VA，随后进行Durmett检验，以与ANIT/载剂对照进行多个比较。图9示出与施用常规的食物相比，在单独或与诺斯卡品组合施用(经口施用)ANIT 之后肝内新合成胶原的绝对量(以fx
的方式计算)。在经口施用30和100mg/kg的条件下，诺斯卡品显著降低ANIT诱导的胶原合成增加。N= 5/组；数据为平均值+SD ;*p < 0. 05 ；进行AN0VA，随后进行Durmett检验，以与ANIT/载剂对照进行比较。图10示出在与图7、8和9相同的动物中，组织学测量的胶原含量(马森三色染色剂)的代表性载玻片和半定量分析。诺斯卡品显著降低ANIT诱导的胶原含量。数据为平均值+SD ；*ρ < 0. 05 ；进行AN0VA，随后进行Durmett检验，以与ANIT/载剂对照进行比较。图11示出诺斯卡品对ANIT诱导的肝内胶原合成增加的效果。诺斯卡品在饮食中以2g/kg的浓度施用，以产生大致300mg/kg的剂量，假设20g的小鼠每天食用3g的食物。 N = 5/组；数据为平均值+SD ；*ρ < 0. 05 ；进行AN0VA，随后进行Durmett检验，以与ANIT/ 载剂对照进行比较。
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图12示出诺斯卡品对ANIT诱导的肝内胶原合成增加的效果。诺斯卡品以300mg/ kg的剂量每天经口填胃一次；N = 5/组；数据以平均值+SD表示。图13示出诺斯卡品以及诺斯卡品类似物的结构。发明详述除非另外指明，否则本发明的实施采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、 细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术均属于本领域内的技能。这些技术在以下文献中具有充分阐释，所有这些文献中的所需技术均以引用的方式并入本文，所述文献例如为Molecular Cloning :A Laboratory Maniml，第二版(Sambrook 等，1989) Cold Spring Harbor Press ；OligonucleotideSynthesis(Μ. J. Gait 等，1984) ；Methods in Molecular Biology, Humana Press ；Cell Biology :A Laboratory Notebook (J. E.CeIMs, ed.,1998)Academic Press ；Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed.,1987)； Introduction to Cell and Tissue Culture(J. P. Mather 禾口 P. E. Roberts,1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture :LaboratoryProcedures(A. Doyle, J. B. Griffiths 禾口 D. G. Newell, eds. ,1993-8)J. Wiley 禾口 Sons ;Methods in Enzymology(Academic Press 公司)；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir 禾口 C. C. Blackwel 1, eds. ) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J. M. Miller 禾口M. P. Calos,eds. ,1987) ；Current Protocols in MolecularBiology (F. M. Ausubel 等，eds. , 1987) :PCR :The Polymerase ChainReaction,(MuIMs等，eds.,1994) ；Current Protocols in Immunology(J. E. Coligan 等，eds. , 1991) ；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；以及 Mass isotopomer distribution analysisat eight years theoretical, analytic and experimental considerations,Hellerstein 禾口 Neese 著(Am J Physiol 276 (Endocrinol Metab. 39)E1146-E1162，1999)。此外，除非另外说明，否则通常根据制造商限定的规程进行采用市售可得的分析试剂盒和试剂的程序。最近的体外研究已经表明，微管(MT)动力学在纤维化发生中可能起到以前未认识到的作用。虽然MT并不是对于所有细胞的运动都是必需的，但是MT的适当功能似乎对于引导诸如成纤维细胞等大细胞的定向迁移是重要的。极低浓度的抑制MT动力学的化合物就显著降低大细胞能够迁移到受伤部位内的速率(Liao等，19%)。这可能是进入受损组织内的成纤维细胞/成肌纤维细胞增多的重要因素。此外，MT通过与Smad2、Smad3和Smad4 形成复合物，从而在TGF- β /Smad信号传导中提供负反馈环路，由此使rSmad与TGF- β受体隔离(Dong等，2000)。TGF-β信号传导级联反应及其在诱导纤维化中的重要性在许多出版物中有所综述(Wells 2000 ；Verrecchia 和 Mauviel，2007)。诺斯卡品是一种口服活性药物，其与微管蛋白结合，并且改变其构型，从而改变MT 的解离/再组装循环(即动力学)的速率( 等，1998)，而不影响微管蛋白的总聚合物质量或者导致较大的MT变形ahou等，2002)。最近报导，以前用作镇咳药(Empey等，1979) 的诺斯卡品为一种对正常组织具有较低毒性或抑制免疫应答的有效抗癌药(Ke等，2000 ； Zhou等，2003)。已经表明诺斯卡品有益于治疗中风，这可能是源于其能够阻断缓激肽活性的能力(Mahmoudian等，200 。诺斯卡品是得自鸦片的非麻醉类苯酞异喹啉生物碱。然而， 诺斯卡品不具有镇痛、镇静和呼吸抑制性能，并且不会诱导过度兴奋或依赖性。在临床试验中，诺斯卡品似乎被良好地耐受(Mahmoudian等，200；3)。此外，在本发明公开中，已经发现
5诺斯卡品能有效地治疗纤维化疾病或病症。因此，本发明公开提供用于治疗纤维化疾病或病症的制剂和方法。本发明涉及用于治疗各种纤维化疾病或病症的方法和组合物。在本文中，“治疗” 包括推迟症状的发作或严重程度、延缓死亡和减轻症状。在一个实施方案中，本发明提供治疗纤维化疾病或病症的方法，包括向需要治疗的患者施用含有诺斯卡品或其盐的药物组合物。“纤维化疾病”是指具有以下特征的疾病或病状与未患病的对照相比，在器官或组织中纤维结缔组织增多，如胶原或其它细胞外基质 (ECM)成分增多。“纤维化疾病”或病症包括(但是不限于)肝硬变、充血性心力衰竭、纤维化肺病、光老化、胰腺和肺的囊肿纤维化、注射纤维化(其可能作为肌内注射的并发症发生)、心内膜心肌纤维化、肺的特发性肺部纤维化、纵膈纤维化、骨髓纤维变性、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化(煤矿工人肺尘症的一种并发症)、神原型系统纤维化、硬皮病、肾脏纤维化、与器官移植物相关的纤维化、伤疤、烧痕等(还请参见美国专利7，449，171和美国专利申请序列No. 11/064，197中对于纤维性疾病或病症的讨论，其全文以引用的方式并入本文)。如下进一步所述，一个实施方案采用诺斯卡品作为治疗剂。诺斯卡品的结构如图 13所示。“诺斯卡品”包括诺斯卡品类似物和/或衍生物，如在美国专利No. 6，376，516中所述的那样，该专利的全文中与诺斯卡品类似物及其制备方法有关的具体内容以引用的方式并入本文。优选的诺斯卡品类似物如图13所示。在另一个实施方案中，根据本文所公开的方法，诺斯卡品与其它药剂(优选其它抗纤维化剂)组合使用。优选的药剂包括(但是不限于)血管紧缩素转化酶(ACE)抑制剂、抗炎剂、吡非尼酮、格列卫或波生坦。ACE抑制剂根据其分子结构可分为三组含巯基的药剂，如卡托普利(商品名 Capoten)和佐芬普利(Zofenopri 1)。其它药剂包括含二羧酸酯的药剂。这是最大的一组， 包括依那普利(Vasotec/悦宁定)、雷米普利(Altace/tritace/Ramace/Ramiwin)、奎那
禾Ij (Accupril)、口；|禾Ij (Coversyl/Aceon)、1 禾Ij (Lisodur/Lopril/Novatec/ I^rinivil/Zestril)、贝那普利(Lotensin)。最后，其它ACE抑制剂包括含有磷酸酯的药剂， 如福森普利(Monopril)。抗炎剂包括类固醇类或非类固醇类抗炎药物(NSAIDS)。优选的抗炎剂包括(但不限于)糖皮质激素、阿司匹林、布洛芬和萘普生。制剂在治疗纤维化疾病或病症的治疗应用中，将本发明的医药方法中所用的化合物以适合于实现治疗成效的剂量水平施用给诊断患有纤维化疾病或病症、或者处于发展为纤维性疾病或病症的风险中的患者。“治疗成效”是指化合物的施用随着时间而在患者内产生有益效果。可以由体外分析或动物模型确定适用于施用给人类的初始剂量。例如，可以将初始剂量调配为产生这样的血浆浓度，经体外分析测量，该血浆浓度包括所施用化合物的特定代谢活性剂的IC50。或者，用于人类的初始剂量可以基于确定在患有纤维性疾病或病症的动物模型(如博莱霉素诱导的肺纤维性小鼠模型)中有效的剂量。作为一个例子，本文所述药物组合物中的各成分的初始剂量可以在约0. 01mg/kg/天至约3000mg/kg/天、或约
60. lmg/kg/ 天至约 2000mg/kg/ 天、或约 lmg/kg/ 天至约 2000mg/kg/ 天或约 10mg/kg/ 天至约2000mg/kg/天、或约100mg/kg/天至约2000mg/kg/天的范围内，或者也可以使用约 1000mg/kg/天至约2000mg/kg/天的剂量。然而，剂量可以根据患者的要求、待治疗病症的严重程度和所用化合物的变化而改变。还通过随着在特定的患者内施用特定的化合物而伴随的各种副作用的产生、性质和程度来确定剂量的水平。确定特定情况的合适剂量在执业医生的技能范围内。通常，以少于化合物的最优剂量的较小剂量开始治疗。随后，以小的增量增加剂量，直到达到该情况下的最优效果。为了方便起见，如果需要的话，可以将每天的总剂量在日内分份施用。药物组合物中的活性化合物的浓度取决于该药物的吸收、分布、失活和分泌速率以及本领域内的技术人员已知的其它因素。还应当注意，剂量值也会随着待减轻病症的严重程度而改变。还应当理解，对于任何特定的对象，应当根据个体需要以及施用组合物或者监管组合物的施用的个人的专业判断，随着时间而调整具体的剂量方案，并且本文所述的浓度范围仅是示例性的，并且无意于限制所要求保护的组合物的范围或实施。可以同时施用各活性成分，或者也可以将其分为多个以不同的时间间隔施用的小剂量。适用于经口施用的制剂可以包括(a)液体溶液，如悬浮在稀释剂(如水、盐水或 PEG400)中的有效量的化合物；(b)胶囊、袋剂或片剂，其分别含有液体、固体、颗粒或凝胶形式的预定量的活性成分；(c)在合适的液体中的悬浮液和(d)合适的乳液。片剂形式可包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶态二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂中的一种或多种，着色剂，填料，粘结剂，稀释剂，缓冲剂，润湿剂，防腐剂，调味剂，染料、崩解剂和药学相容的载体。锭剂形式可包括处于调味剂(例如蔗糖)中的活性成分，以及含有处于惰性基质(如明胶和甘油)中的活性成分，或者除了活性成分外，还含有本领域已知的载体的蔗糖和阿拉伯胶乳、凝胶等。口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可被包封在明胶胶囊中或者压缩成片剂。为了进行经口治疗施用，活性化合物可与赋形剂组合，并且以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。可以包含药学相容的粘结剂和/或辅助材料作为组合物的一部分。活性化合物或其可药用的盐可以作为酏剂、悬浮液、糖浆、包药干糊片、口香糖等的成分施用。糖浆除了含有活性化合物之外，还含有作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂与调味剂。活性化合物或其可药用的盐还可以与不损害所需作用的其它活性材料混合，或者与补充所需作用的材料混合。如本文所用，术语可药用的盐是指保持上述化合物的所需生物活性并且表现出最低或没有不期望的毒性效应的盐。所述盐的例子包括(但不限于)与无机酸(例如盐酸、 氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等)形成的酸加成盐和与有机酸形成的盐，所述有机酸例如为乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、双羟萘酸、褐藻酸、聚谷氨酸、 萘磺酸、萘二磺酸和半乳糖醛酸。所述化合物还可以作为本领域内已知的可药用的季盐施用，所述季盐具体包括由式-NR+Z-表示的季铵盐，其中R为氢、烷基或苄基，并且Z为平衡离子，其包括氯离子、溴离子、碘离子、-0-烷基、甲苯磺酸根、甲基磺酸根、磺酸根、磷酸根或羧酸根(如苯甲酸根、琥珀酸根、乙酸根、乙醇酸根、马来酸根、苹果酸根、柠檬酸根、酒石酸根、抗坏血酸根、苯甲酸根、肉桂酸根、扁桃酸根、苯氧酸根和二苯乙酸根)。
可以将所选的化合物单独或者与其它合适的成分组合制成气溶胶制剂(即，可以将它们“喷成雾状”)，以通过吸入施用。可以将气溶胶制剂置于加压的可用抛射剂中，所述抛射剂例如为二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。经直肠施用的合适制剂包括(例如)栓剂，其由封装的核酸与栓剂基质构成。合适的栓剂基质包括天然或合成的三甘油酯或石蜡烃。此外，还可以使用明胶直肠胶囊，其由所选的化合物组合与基质的组合构成，所述基质包括(例如)液体三甘油酯、聚乙二醇和石蜡烃。适合于肠胃外施用(例如，通过关节内(在关节内)、静脉内、肌内、皮内、腹膜内和皮下途径施用)的制剂包括水性和非水性的等渗灭菌注射溶液，该溶液可包含抗氧化剂、 缓冲剂、抑菌剂和使得该制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性的灭菌悬浮液，其可以含有悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在本发明的实践中，可以通过(例如)静脉输注、经口施用、局部施用、腹膜内施用、膀胱内施用或胸内施用来施用所述组合物。肠胃外施用、经口施用、皮下施用和肌内施用是优选的施用方法。合适的溶液制剂的具体例子可以包含约0. l-100mg/ml的化合物和约1000mg/ml在水中的丙二醇。合适的溶液制剂的另一个具体例子可包含约0. 1或约0. 2至约100mg/ml的化合物和约800_1000mg/ ml在水中的聚乙二醇400 (PEG 400)。合适的悬浮液制剂的具体例子可包含约0. 2-30mg/ml的化合物和一种或多种选自由以下物质组成的组中的赋形剂在水中的约200mg/ml的乙醇、约1000mg/ml的植物油 (例如，玉米油)、约600-1000mg/ml的果汁(例如，葡萄汁)、约400_800mg/ml的牛奶、约 0. lmg/ml羧甲基纤维素(或微晶纤维素)、约0. 5mg/ml苄醇(或苄醇和苯扎氯铵的组合) 和约40-50mM的pH值为7的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，或者可以使用5%的葡萄糖代替缓冲液)。合适的脂质体悬浮液制剂的具体例子可以包含在水中的约0. 5-30mg/ml的化合物、约100-200mg/ml的卵磷脂(或其它磷脂或磷脂混合物)、和可任选的约5mg/ml的胆固醇。对于皮下施用化合物，以下脂质体悬浮液制剂提供良好的效果，所述制剂包含在水中的 5mg/ml的化合物以及100mg/ml的卵磷脂，和在水中的5mg/ml的化合物以及100mg/ml的卵磷脂和5mg/ml的胆固醇。化合物的制剂可以提供在单位剂量或多剂量密封容器(如安瓿和小瓶)内。注射溶液和悬浮液可以由上述的灭菌粉末、颗粒和片剂制备。药物制剂优选为单位剂型。在一些形式中，制剂被细分为含有适量的化合物的单位剂量。单位剂型可以为包装制剂，该包装含有单独量的制剂，如包装片、胶囊和处于小瓶或安瓿内的粉末。此外，单位剂型可以为胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者其可以为合适数量的包装形式的任意这些剂型。如果需要的话，组合物还可以含有以下更详细地讨论的其它相容性治疗剂。在一个实施方案中，活性化合物与防止该化合物从体内快速消除的载体一起制备，如控释制剂，其包括植入剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容的聚合物，如乙烯-醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备上述制剂的方法对于本领域内的技术人员而言是显而易见的。材料还可以商购自Alza公司(CA)和Gilford Pharmaceuticals公司(Baltimore，Md.)。脂质体悬浮剂还可以是可药用的载体。可以根
8据本领域内已知的方法制备这些制剂，例如美国专利No. 4，522，811(其全文以引用的方法并入本文中)所述的方法。例如，可以通过以下方法制备脂质体制剂将合适的脂质(如硬质酰磷脂酰乙醇胺、硬质酰卵磷脂、花生酰卵磷脂和胆固醇)溶解在无机溶剂中，然后将其蒸发，从而在容器的表面留下干燥脂质的薄膜。然后可以将活性化合物或其单磷酸酯、二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液加入到容器内。然后用手旋动容器，以使脂质材料脱离容器的侧面，并且分散脂质团聚体，从而形成脂质悬浮液。

因此，本文所述的组合物在治疗纤维化病症方面得到应用。受损组织的修复是存活所需的根本生物过程。然而，在重复或长期受损伤的情况下，修复过程可能变得异常，并且ECM蛋白可能积聚到病理水平。在本文所述的实验中，组织受损由不同药剂导致肺内的博莱霉素和肝内的ANIT。这些模型的共同点在于刺激物显著地使组织胶原的合成增加到超过在非治疗对照中获得的水平。这些效应反映在总胶原池以及在组织内合成的新胶原的绝对量的增加。在这两种模型中，诺斯卡品剂量依赖性地阻止新胶原合成的增加(包括分数增加和绝对增加)，以及阻止组织内存在的胶原的总量的增加。诺斯卡品在这些实验中具有2个所关注的主要药理活性。诺斯卡品是MT调节剂 (Ye等，1998)，以及缓激肽拮抗剂(Mahmoudian等，2001)。不受理论的束缚，这种活性的组合可能使得诺斯卡品成为用于治疗纤维化的特别关注的新药剂。在正常的创伤愈合过程中，受损的上皮细胞和/或内皮细胞释放介体，以激活成纤维细胞。当成纤维细胞迁移到创伤时，其转化为表达成肌纤维细胞的α -SMA，所述成肌纤维细胞在病理组织改造中具有关键的作用(参见Hinz等，2007)。当大细胞发生迁移时，MT 的动力学性能允许MT网络再改方位。不受理论的束缚，据认为，由于诺斯卡品降低MT的动力性能，因此其可减少诸如成纤维细胞等细胞移动到受伤部位。Liao(等人，19%)在体外发现，干扰MT动力学、而不是细胞内MT的实际水平的低浓度物质(如诺考达唑)降低成纤维细胞迁移到成纤维细胞培养物的受伤部位的速率。然而，以前在体内还没有证实MT调节剂(如诺斯卡品)的抗纤维化效果。MT在负调节TGF- β /Smad信号传导途径方面也可具有重要作用。Liu (等人，2005) 在体内发现，低浓度的MT干扰剂(紫杉醇)在患硬皮病的裸鼠模型中显著抑制TGF-β信号传导。紫杉醇显著降低Smad2和Smad3磷酸化，并且减少胶原在Sk移植物内的沉积 (Liu等，2005)。TGF-β Smad信号传导途径与纤维化的诱导具有因联(参见Wells，2000 ； Verrecchia和Mauviel，2007)。例如，TGF-β对成纤维细胞具有趋药性，并且诱导成纤维细胞合成ECM，同时还增加防止ECM的酶破坏的蛋白酶抑制剂的产生。TGF-β调节淋巴细胞功能，并且增加内皮细胞凋亡，同时抑制平滑肌细胞凋亡。在体外的低浓度下，所有MT干扰剂均破坏MT动力学，但是这些药剂在不同的结合部位对微管作用，这使得它们具有不同的效果(Jordan，20(^)。MT干扰剂分为两个大类抑制MT聚合的化合物，如秋水仙碱、诺考达唑和长春碱；以及促进MT聚合的化合物，如紫杉烷 (如紫杉醇)(Jordan，2002)。秋水仙碱(一种已经用于治疗通风的抗炎药物)结合微管蛋白，并且导致MT聚合中断。已经试验秋水仙碱在治疗IPF时作为皮质甾类药物和/或免疫抑制药物的替代物(Douglas等，1998)，并且发现其更安全，但是无效(S卩，不比常规的治疗剂更有效，其是无效的)。虽然诺斯卡品在化学上与秋水仙碱相似，但是其结合到微管蛋白上的不同位点( 等，1998)。在结合后，诺斯卡品诱导促进MT聚合和组装的微管蛋白的构型改变，而不是使聚合中断，并且可能以常规的方式作用，以减慢MT解离/再组装循环。已经采用多种MT干扰剂(如类毒素)作为抗癌治疗剂，因为其能限制细胞增殖。 然而，这些药剂的副作用特性使得它们不合适用于治疗纤维化。实际上，由于这些药剂的一些破坏MT网络导致配体独立性Smad核积聚，以及TGF-β -应答基因转录，并且增加TGF-β 诱导的Smad活性，所有这些作用都会在本质上更容易产生纤维化。紫杉醇治疗与一些患者内的硬皮病类综合症的发展有关(例如，De Angelis等，2003)。无论诺斯卡品是否会发挥促纤维化作用，其在患有纤维化疾病或病症的动物模型体内的抗纤维作用或中和作用是不可预料的。除了 MT调节效果之外，诺斯卡品还可用作非竞争性缓激肽拮抗剂(Mahmoudian 等，2001)，其是一种导致至少某种程度的咳嗽抑制剂活性的机制(Ebrahimi等，2003)。 缓激肽引起多种生物效果血压过低，支气管缩小，消化道和子宫收缩，气管、消化道和外分泌腺内的上皮细胞分泌、血管渗透、疼痛、结缔组织增生、细胞因子释放和二十酸形成(Meranka等，1989)。缓激肽可能参与诱导纤维化，但是也存在相反的证据(例如， Sancho-Bru等，2007 ；Helske等，2007)。通过诱导成纤维细胞增生、肺原纤维细胞转化为成肌纤维细胞以及促进胶原产生，缓激肽可能参与支气管再改造，以及肺纤维化(Vancheri 等，2005)。缓激肽还增加胶原mRNA、血管平滑肌细胞内的TIMP和TGF- β的分泌(Douillet 等，2000)。使用缓激肽拮抗剂治疗能够阻止在心肌再改造的模型中缓激肽对纤维化发生产生作用(Koike等，2005)。因此，诺斯卡品在博莱霉素和ANIT模型中的某种程度的抗纤维化作用除了由于其MT调节活性之外，还可能是由于缓激肽拮抗剂活性产生的。总之，诺斯卡品似乎是一种新的抗纤维化药物，其具有治疗各种纤维化病症的潜能。诺斯卡品的抗纤维化活性可能归因于其作为MT调节剂和/或缓激肽拮抗剂的独特药理学特性。以下的非限定例子对本文公开的发明进一步进行阐释。 实施例例I 博莱霉素诱导的肺纤维化特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性和通常致命的疾病，其特征在于ECM过度沉积， 从而导致损害肺功能的广泛组织再改造。常规的治疗方法(如涉及免疫抑制剂的那些)对于控制或预防疾病发展是无效的。向啮齿动物气管内施用博莱霉素已经成为人类肺间质纤维变性症的标准试验模型。博莱霉素毒性主要发生在肺和皮肤内(参见Slei jfer，2001)，因为这些组织内缺乏失活酶(博莱霉素水解酶)。博莱霉素通过诱导自由基(然后其导致DNA破坏)，从而诱导细胞毒性。IPF的许多组织学改变都是由施用博莱霉素再生的(参见Grande等，1998)，所述改变为肺泡显著畸变、毛细管再改造和ECM的过度沉积(特别是胶原的过度沉积)。在博莱霉素模型以及IPF中，TGF-β是成纤维细胞增生和胶原合成增加的主要分子介体。通过GC/MS测量，施用博莱霉素诱导OHP的分数合成至少增加3倍。通过与博莱霉素-载剂对照相比、OHP合成的降低来确定对纤维化应答的抑制或逆转。方法Mll 研究开始时采用10周龄的C57BL/6雌性小鼠。在研究期限内自由提供食物和水。研究组被列于表1中。 表1 在博莱霉素诱导的纤维化中的试验组概况
权利要求
1.一种治疗患者内的纤维化疾病或病症的方法，包括给所述患者施用诺斯卡品和药用载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维化疾病或病症的发作得到推迟。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维化疾病或病症的严重程度得到减轻。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中在进行所述施用之后，细胞外基质蛋白的水平相对于所述施用之前的水平得到降低。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞外基质蛋白为胶原。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述诺斯卡品为诺斯卡品类似物。
7.一种治疗患者内的纤维化疾病或病症的方法，包括向所述患者施用微管调节剂和药用载体。
8.根据权利要求1、2、3、4、5、6或7所述的方法，其中所述的方法还包括施用选自由 ACE抑制剂、抗纤维化剂和抗炎剂组成的组中的药剂。
9.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用是通过经口施用、静脉内施用、皮下施用、皮内施用、局部施用、直肠栓剂施用、气雾化施用、关节内施用和肌内施用进行的。
全文摘要
本发明提供了一种治疗患者内的纤维化疾病或病症的方法，包括给所述患者施用诺斯卡品和药用载体。
文档编号A61K31/485GK102159211SQ200980133667
公开日2011年8月17日 申请日期2009年6月22日 优先权日2008年6月20日
发明者M·沃尔夫, S·特纳 申请人:金尼医疗公司