专利名称：检测猪胸膜肺炎放线杆菌野毒感染的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测猪胸膜肺炎放线杆菌野毒感染的试剂盒，属于动物抗原抗体的检测试剂盒的研制，专用于胸膜肺炎放线杆菌(App)的检测、流行病学调查和免疫监测等。
背景技术：
猪传染性胸膜肺炎(porcine infection pleuropneumonia)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropeumoniae，App)引起的猪的一种高度传染性呼吸道疾病，以出血性、坏死性肺炎和慢性纤维素性胸膜肺炎为特征。该病已成为当今大型养猪场的三大呼吸道传染病之一，与其它呼吸道疾病相比，其危害性在于具有高发病率和死亡率，尤其在新引进猪群中多呈急性爆发，最急性的死亡率可达80-100％。
App的毒力因子很多，包括荚膜多糖(CPS)、脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、细菌毒素(Apx)、转铁蛋白(Tbp)、蛋白酶、渗透因子、菌毛等，其中Apx是App最重要的毒力因子，不同血清型的菌株可产生4种Apx即Apx I～IV，都具有溶细胞作用，是一种穿孔毒素，属于含重复子毒素(repeats-in-toxin，RTX)家族[1-4]。ApxIV是一种分子量为202kD的蛋白，App的12个血清型均能分泌这种毒素，但具有种属特异性，放线杆菌属中的其他菌株都不分泌这种毒素，ApxIV具有特异的抗原性，与App的其他RXT无交叉性，此外App仅在感染宿主时分泌ApxIV，而在体外培养时不表达该蛋白。
App有12种血清型之多，不同血清型之间缺乏足够的交叉保护性，加之该病原菌极易产生耐药性，因此疫苗免疫是预防本病最有效途径，但是在不同的国家和地区其流行的血清型可能不同，就是同一猪场也可能有多个血清型；目前国内外使用较多的是含有12种血清型中某几种血清型的全菌灭活疫苗，这样就会出现一些养猪场所用的App多价疫苗与其实际流行的血清型不相符合的情况，从而导致疫苗免疫低下或失败，给养猪场造成巨大的经济损失。
本发明基于“App仅在感染宿主时分泌ApxIV”这一特点，利用PCR技术从App血清1型的ApxIV基因中扩增出目的基因，构建了含目的基因的重组表达质粒pET-ApxIV，该质粒转化入宿主菌BL21(DE3)，体外表达蛋白经镍柱亲合层析纯化后作为抗原，建立间接ELISA检测方法，并优化ELISA的反应条件形成检测试剂盒，该试剂盒可检测App的野毒感染，指导养殖场选择合适的疫苗和药物进行防治。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种检测App野毒感染的试剂盒，通过构建一个在原核细胞中表达的高效重组表达质粒，利用重组表达质粒的表达产物为抗原，研制检测App野毒感染的试剂盒，专用于App的检测、流行病学调查和免疫监测。
技术方案本发明的具体实施方案如下一种检测App野毒感染的酶联免疫吸附试ELISA试剂盒，其组成成分如下细菌毒素ApxIV纯化表达蛋白包被好的酶标板、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体、柠檬酸、碳酸氢二钠、乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲系统加3，3’5，5’-四甲基苯(TMB)构成的显色系统、阳性血清、阴性血清和试剂盒说明书。
上述的ELISA试剂盒，其特征在于包被酶标板所用的抗原即细菌毒素ApxIV纯化表达蛋白是由基因工程菌株BL21(DE3)体外诱导表达后经镍柱纯化获得，该菌株含重组表达质粒pET32a-ApxIV，该重组表达质粒含有大肠杆菌复制子ori、启动子PT7、外源目的基因ApxIV基因的3’端1078bp和抗性筛选基因氨苄青霉素Amp基因，其表达式为-ori-PT7-ApxIV gene-Amp gene-；此外在其表达质粒pET32a-ApxIV的构建中，设计并合成的一对特异性引物为，上游引物P15’-gcaggatccaaatttaccgatgtg-3’，下游引物P25’-gtaaagcttcctcttcaagcgacaca-3’。
本发明的技术方案主要包括以下两个方面第一方面构建了表达载体pET32a-ApxIV。根据GenBank发表的App1型的ApxIV序列(序列号AF021919)，利用DNAStar软件分析，选取ApxIV基因3’端5434bp-6511bp(ApxIV C端抗原性较强的359个氨基酸)，自行设计一对特异性引物，引物两端分别加限制性酶切位点BamHI和HindII及保护性碱基(Takara公司合成)，下划线部分为酶切位点。
P15’-gcaggatccaaatttaccgatgtg-3’ BamHIP25’ -gtaaagcttcctcttcaagcgacaca-3’ HindIII通过PCR获取ApxIV目的基因，将获取的目的基因克隆入pMD18-T载体并进行序列测定，将pMD18-T载体上的目的片段酶切后克隆入pET32a载体，构建重组表达质粒pET32a-ApxIV，将重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞，并用双酶切和PCR进行鉴定，鉴定阳性的质粒即为重组表达质粒pET32a-ApxIV。
第二方面通过重组表达质粒pET32a-ApxIV体外高效表达，表达蛋白经镍柱纯化后，测定蛋白浓度，，以纯化蛋白为抗原研制ELISA试剂盒，为了验证ApxIV-ELISA的检测效果，又建立了一个以App荚膜多糖(CPS)粗提物为抗原的CPS-ELISA与之对照。
有益效果 本发明的特点和优点如下本发明选取的目的基因较短，只有1078bp，表达载体pET32a-ApxIV构建容易；其次，pET32a-ApxIV的表达产物具有良好的抗原性；第三，基因工程菌株BL21(DE3)(pET32a-ApxIV)表达的蛋白表达量25％～30％；以可溶性形式存在于菌体内部，收集和纯化比较方便；第四，纯化的表达蛋白不需要进行蛋白复性就可用于ELISA试剂盒的研制。
事实证明，本发明细菌毒素ApxIV纯化表达蛋白具有良好的抗原性，能特异性地检测到人工发病猪血清中的抗ApxIV毒素抗体。ELISA试剂盒检测临床血清样品结果显示在从未使用过App灭活疫苗的猪场收集的血样，对照CPS-ELISA检测结果和本发明试剂盒的检测结果符合率达100％(表4)，说明本试剂盒在实际应用中具有良好的特异性和敏感性。表明本发明ELISA试剂盒在检测App野毒感染，在App的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有重要的应用价值，可以指导养殖场选择合适的疫苗和药物进行防治。
四
图1 pET32a-ApxIV重组质粒图谱表达式为-ori-PT7-ApxIV gene-Amp gene-，它含有大肠杆菌复制子ori、PT7是T7RNA聚合酶/启动子表达系统、外源目的基因为ApxIV3‘端部分基因，抗性筛选基因为氨苄青霉素Amp基因。
图2 目的片段的测序结果图3 pMD18-T载体克隆的酶切图谱泳道1为DL-15000Marker；泳道2为DL-2000Marker；泳道3～5为pMD18-T载体BamHI、HindIII双酶切。
图4 表达重组质粒pET32a-ApxIV的鉴定图谱泳道1为DL-15000Marker；泳道2为DL-2000Marker；泳道3为pET32a(+)/BamHI、HindIII双酶切；泳道4-5为pET32a-ApxIV/BamHI、HindIII双酶切。
图5 重组表达质粒pET32a-ApxIV体外表达的SDS-PAGE 图谱泳道1为低分子量标准蛋白质；泳道2为诱导的pET32a质粒；泳道3～11为重组表达质粒pET-ApxIV0，2，4，5，6，7，8，9，10小时诱导；泳道12为重组表达质粒pET-ApxIV诱导后超声波裂解上清；泳道13为重组表达质粒pET-ApxIV诱导后超声波裂解沉淀。
图6表达蛋白的免疫转印鉴定7测定多糖含量的标准OD值曲线图8人工感染猪体内抗体的动态变化图9灭活疫苗免疫猪体内抗体的动态变化五具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的描述1.引物设计根据GenBank发表的App1型(shope株购于农业部青岛动检所)的ApxIV序列(序列号AF021919)，利用应用DNAStar软件分析，选取ApxIV基因3’端5434bp-6511bp(ApxIV C端抗原性较强的359个氨基酸)，自行设计一对特异性引物，引物两端分别加限制性酶切位点BamHI和HindIII及保护性碱基，下划线部分为酶切位点。
P15’-gcaggatccaaatttaccgatgtg-3’BamHIP25’-gtaaagcttcctcttcaagcgacaca-3’ HindIII2.PCR获取ApxIV目的基因PCR反应条件94℃预热5min，94℃变性1min，60℃退火40sec，72℃延伸80sec，30个循环，最后一个循环后再延伸10分钟。PCR产物长度为1096bp，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，切下目的片段，用小量胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
3.将获取的目的基因克隆入pMD18-T载体并进行序列测定将回收PCR产物4.5μl，与pMD18-T 0.5μl和Solution I 5.0μl，混匀后，4℃连接过夜，用于转化DH5α感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用BamHI、HindIII双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条约1100bp的条带出现(图3)。将双酶切鉴定阳性的细菌寄出，由大连宝生物公司进行序列测定，结果此序列与GenBank上公布的序列相比较，核苷酸同源性为100％(图2)，获得pMD18-T载体质粒。
4.重组表达质粒pET32a-ApxIV的构建和鉴定将已测序鉴定的载体质粒pMD18-T和pET32a(+)，用BamHI、HindIII双酶切，电泳后，回收目的片段和pET32a(+)，然后用T4 DNA连接酶进行连接反应，转化BL21感受态细胞，用氨苄青霉素板筛选，挑取细菌培养，提取质粒进行酶切鉴定，可见目的条带(图4)，将阳性重组质粒命名为pET32a-ApxIV。
5.重组表达质粒pET32a-ApxIV的表达和免疫转印将阳性重组菌菌液以2％的比例接种与LB(Amp+)液体培养基中，37℃、180转/分钟振荡培养2小时后加入终浓度为1mmol/mlIPTG进行诱导表达，分别收集0h、2h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h的菌液。样品用10％SDS-PAGE鉴定，表达产物诱导2小时时即可产生分子量约60kD的目的条带，7～8小时达最高峰(图5)。取8小时的培养物超声波处理，12,000r/min、4℃离心5min分离上清和沉淀，用10％SDS-PAGE鉴定，表达蛋白以可溶形式存在于菌体内部(图5)。并进行转印，然后以兔抗App1血清为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗作免疫转印鉴定，最后用DAB显色试剂盒显色，在醋酸纤维素膜上可见目的条带(图6)。
6.细菌毒素ApxIV表达蛋白经镍柱纯化后，测定蛋白浓度参照Novagen公司His·bindpurification kit的说明书，细菌毒素ApxIV表达蛋白经镍柱纯化后，测定该蛋白浓度为0.5mg/ml。
7.App荚膜多糖的提取及浓度的测定7.1 荚膜多糖(CPS)的制备(三氯乙酸-丙酮法)App3(S1421株)、App5(K17株)、App7(WF83株)(购于农业部青岛动检所)各200ml的过夜培养物10,000g离心后收集菌体，用等体积的灭菌去离子水重悬，分别加50ml的三氯乙酸(100％)混匀，4℃、10,000g离心30min，取上清加等体积的丙酮混匀，4℃过夜后10,000g离心30min，用丙酮洗涤沉淀3次，在用5％的醋酸钠溶解沉淀，溶解物用1/3体积的氯仿正丁醇(4∶1)抽提两次，10,000g离心30min每次取水相，水相中加等体积的丙酮摇匀4℃过夜，10,000g离心30min，沉淀用无水乙醇洗涤3次，室温待乙醇晾干后用10ml灭菌去离子水溶解，-20℃保存备用。
7.2苯酚-浓硫酸法进行CPS的定量测定取5mg的葡萄糖溶解于100ml的灭菌双蒸水配制成50μg/ml的葡萄糖标准液，吸取该标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，分别加灭菌双蒸水补至2.0ml。分别加入6％苯酚(临用前用80％苯酚溶液配制)1.0ml及浓硫酸5.0ml，静置10min，摇匀，室温放置20min后于490nm测定吸光值(OD)。以糖浓度为横坐标、OD值为纵坐标，绘制标准曲线(表1和图7)。
表1标准液中糖的含量和与其对应的OD值糖含量(μg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90OD值0 0.036 0.076 0.124 0.154 0.202 0.245 0.302 0.327 0.386分别取待测样品原液、10倍稀释液和100倍稀释液1ml，加灭菌双蒸水补至2.0ml，另取一管加灭菌双蒸水2.0ml。分别加入6％苯酚(临用前用80％苯酚溶液配制)1.0ml及浓硫酸5.0ml，静置10min，摇匀，室温放置20min后于490nm测定吸光值(OD)，双蒸水对照管用于(OD)值测定时仪器的校零。待测样品管的OD值可在标准曲线上求得相应的CP含量，测得提取的App3、5b、7的CPS含量分别为2.4、2.2、3.2mg/ml。
8 CPS-ELISA和细菌毒素ApxIV表达纯化蛋白ELISA试剂盒的研制8.1 ELISA试剂盒的组成成分和最佳反应条件1)抗原最佳包被浓度表达产物0.625μg/ml的浓度，100μl/孔包被，4℃包被过夜；包被液为0.05M PH9.6的碳酸盐缓冲液(Na2CO31.95g，NaHCO32.93g，去离子水1000ml)；提取的荚膜多糖以3μg/ml的浓度，100μl/孔包被；2)洗涤液PBST/Tween-20(NaCL 8g，Na2HPO412H2O 3.6g，KCL0.2g，KH2PO40.2g，Tween-20 0.5ml，去离子水1000ml)3)最佳封闭液10％的小牛血清(PBST/Tween-20)4)血清稀释液0.01M的PBS(NaCL 8g，Na2HPO412H2O 3.6g，KCL0.2g，KH2PO40.2g，去离子水1000ml)，PH7.25)血清的最佳稀释浓度100倍稀释6)血清与抗原的结合时间90分钟7)酶标二抗的最佳稀释浓度和反应时间20000倍稀释，50分钟8)显色系统柠檬酸、碳酸氢二钠、乙二胺四乙酸(EDTA)为缓冲系统加TMB和过氧化氢尿素配制成显色底物，配方A液(磷酸氢二钠36.82g，柠檬酸10.21g，过氧化氢尿素0.6g，去离子水1000ml)，B液(10.5g，EDTA0.146g，TMB0.25g，去离子水1000ml)。
9)终止液2MH2SO48.2 ELISA的操作程序1)4℃包被过夜，取出后用洗涤液PBST/Tween-20洗涤3次，每次5分钟。
2)加入100倍稀释好的血清样品，100μl/孔，每次设阳性、阴性和空白对照，37℃孵育90分钟，取出洗涤3次，每次5分钟。
3)加酶标记的二抗，100μl/孔，37℃孵育50分钟，取出洗涤3次，每次5分钟。
4)加底物100μl/孔，37℃孵育10分钟，2M的硫酸终止反应，50μl/孔，酶标仪测吸光值(波长450nm)。
8.3判定标准的确定分别取猪传染性胸膜肺炎正向间接血凝诊断试剂盒检测阳性、阴性血清100份和40份进行ELISA，并计算它们的OD450平均值和标准差(Standard deviation，SD)，以阳性和阴性血清的OD450平均值+3SD的比值大于或等于2.1作为ELISA的判定标准。
8.4保存期试验按照上述ELISA确定的条件，抗原包被、封闭后，分别在4℃和-20℃保存，于不同时间取出进行ELISA试验，包被ELISA板的保存期在4℃可保存6个月，而在-20℃可保存15个月。
9.本发明ELISA试剂盒的使用说明书1)加入100倍稀释好的血清样品，100μl/孔，每次设阳性、阴性和空白对照，37℃孵育90分钟，取出洗涤3次，每次5分钟。
2)加酶标记的二抗，100μl/孔，37℃孵育50分钟，取出洗涤3次，每次5分钟。
3)加底物100μl/孔，37℃孵育10分钟，2M的硫酸终止反应，50μl/孔，酶标仪测吸光值(波长450nm)。
4)试剂盒所附的阳性血清的OD450与阴性对照血清的OD450的比值大于2.1时，若待检样品的OD450与阴性对照血清的OD450的比值大于或等于2.1则可判为阳性。
10.ELISA试剂盒的应用10.1 ELISA试剂盒检测人工感染猪血清样品App1、3、5b和7活菌分别鼻腔接种3头35日龄小猪(总共12头，实验前用兰州兽医研究所的间接血凝试剂盒检测阴性)，15d后再次鼻腔接种；分别采集接种前、第一次接种后15d、第二次接种后15d和25d血清，结果显示App阴性的30日龄猪经鼻腔接种后15天可两种ELISA均可以检测到相应的抗体，再次接种后15天OD值下降，再过10天，OD值上升超过一次接种后15天的值(表2和图8)，表明App活菌在猪体内能分泌ApxIV毒素，说明细菌毒素ApxIV纯化表达蛋白具有良好的抗原性，能特异性地检测到人工发病猪血清中的抗ApxIV毒素抗体。
表2人工感染猪血清样品的平均OD值接种前 一次接种后15天 二次接种后15天 二次接种后25天CPS0.2056670.77580.6825 0.813889ApxIV 0.1628330.67350.6102 0.75588910.2ELISA试剂盒检测App四价灭活苗免疫猪血清样品App1、3、5b和7四价灭活苗免疫12头30日龄猪(实验前用兰州兽医研究所的间接血凝试剂盒检测阴性)，分别收集免疫前、免疫后10d、20d、30d、60d、90d血清；在免疫后90d分别以App1、3、5b和7活菌鼻腔攻毒两次，其间间隔15d，并收集两次攻毒后15d的血清，检测结果表明CPS-ELISA可以检测到30日龄猪免疫后相应抗体的动态变化，而ApxIV-ELISA检测不到相应的抗ApxIV抗体即使是活菌攻毒后(见表3和图9)。本试验验证了“App仅在感染宿主时分泌ApxIV毒素，而在体外培养时不表达ApxIV毒素蛋白”这一论断，同时也表明本发明所研制的试剂盒可以检测App野毒感染，可以指导养殖场选择合适的疫苗和药物进行防治，本试剂盒在App的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有重要的应用价值。
表3灭活疫苗猪血清样品的平均OD值一次攻毒后 二次攻毒后免疫前0d 免疫后10d 20d 30d 60d 90d15d 15dCPS 0.22125 0.4495 0.6014 0.7018 0.6935 0.6001 0.8598330.800417ApxIV 0.161167 0.215830.2426 0.2478 0.23425 0.2193 0.2070830.20310.3 ELISA试剂盒检测临床血清样品分别收集南京六合、镇江、常州、常熟、苏州五地某猪场血清100、90、80、49和128份，其中后四地猪场猪群均存在严重呼吸道症状，病死猪解剖病变集中于肺部，未使用过App疫苗。结果显示在从未使用过App灭活疫苗的猪场收集的血样，CPS-ELISA检测结果和本发明试剂盒的检测结果符合率达100％(表4)，说明本试剂盒在实际应用中局有良好的特异性和敏感性。
表4两种ELISA检测临床血清样品CPS-ELISA ApxIV-ELISA检出数/总数检出率检出数/总数检出率六合3/1003 0/100 3镇江85/9094.485/90 94.4常州70/8087.570/80 87.5常熟46/4993.946/49 93.9苏州119/128 93 119/1289权利要求
1.一种检测胸膜肺炎放线杆菌App野毒感染的酶联免疫吸附试验ELISA试剂盒，其组成成分如下细菌毒素ApxIV纯化表达蛋白包被好的酶标板、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体、柠檬酸、碳酸氢二钠、乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲系统加3，3’5，5’-四甲基苯(TMB)构成的显色系统、阳性血清、阴性血清和试剂盒说明书。
2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于包被酶标板所用的抗原即ApxIV片段纯化表达蛋白是由基因工程菌株BL21体外诱导表达获得，该菌株含表达质粒pET32a-ApxIV，重组表达质粒pET32a-ApxIV含有大肠杆菌复制子ori、启动子PT7、外源目的基因ApxIV基因的3’端1078bp和抗性筛选基因氨苄青霉素Amp基因，其表达式为-ori-PT7-ApxIV gene-Amp gene-。
3.根据权利要求1或2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，其表达质粒pET32a-ApxIV的构建中，设计并合成的一对特异性引物为，上游引物P15’-gcaggatccaaatttaccgatgtg-3’，下游引物P25’-gtaaagcttcctcttcaagcgacaca-3’。
全文摘要
一种检测胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropeumoniae，App)野毒感染的试剂盒，其组成成分如下细菌毒素ApxIV纯化表达蛋白包被好的酶标板、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体、柠檬酸、碳酸氢二钠、EDTA缓冲系统加TMB构成的显色系统、阳性血清、阴性血清和试剂盒说明书。其特征是利用聚合酶链反应(PCR)从App血清1型的ApxIV基因中扩增出目的基因，构建了含目的基因的表达质粒pET32a－ApxIV，该质粒转化入宿主菌BL21(DE3)，体外表达蛋白经镍柱纯化后作为抗原，建立酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法并优化反应条件形成了检测试剂盒，该试剂盒在App的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有重要应用价值。
文档编号C07H19/00GK1645148SQ20051003821
公开日2005年7月27日 申请日期2005年1月24日 优先权日2005年1月24日
发明者何孔旺, 彭小华, 王芳, 邱索平, 张雪寒, 倪艳秀, 郭容利, 俞正玉, 陆承平 申请人:江苏省农业科学院