胰岛淀粉样多肽家族肽及其制备和使用方法

专利名称：胰岛淀粉样多肽家族肽及其制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及新型化合物及其制备和使用方法。这些化合物可用于治疗或预防代谢失调、血管疾病、肾病和或胃肠疾病之类的病症。代表性病症可为其中食物摄取或热量摄取的减少有价值的病症，例如肥胖、II型糖尿病、进食障碍、代谢综合症和胰岛素抵抗综合症。
背景技术：
迄今为止，为理解胰岛淀粉样多肽、降钙素和降钙素基因相关肽(CGRP)的结构和功能，已对其进行了许多工作。表1提供了CGRP、降钙素和胰岛淀粉样多肽的一些生物学效应的概述，此概述公开于Wimalawansa，S.J.(1997)Critical Reviews in Neurobiology，11；167-239。
表1


业已报道，胰岛淀粉样多肽调节胃排空，抑制胰高血糖素分泌和食物摄取，因此调节循环中的葡萄糖生成速率。其似乎补充胰岛素作用，胰岛素调节循环中的葡萄糖清除速率及外周组织对葡萄糖的吸收。这些作用得到在啮齿动物和人中的实验结果的支持，实验结果表明胰岛淀粉样多肽以至少三种独立机制补充胰岛素在餐后葡萄糖控制中的作用，所有这些机制都影响葡萄糖生成速率。首先，胰岛淀粉样多肽抑制餐后胰高血糖素分泌。和健康成人相比，1型糖尿病患者不具有循环胰岛淀粉样多肽，2型糖尿病患者餐后胰岛淀粉样多肽浓度降低。而且，输注结合循环胰岛淀粉样多肽的胰岛淀粉样多肽特异性单克隆抗体又导致胰高血糖素浓度比对照有极大提升。这两个结果都指出了内源胰岛淀粉样多肽在餐后胰高血糖素分泌调节中的生理作用。其次，胰岛淀粉样多肽减慢胃肠动力和胃排空。最后，下丘脑内注射大鼠胰岛淀粉样多肽显示出降低大鼠取食，改变下丘脑中的神经递质代谢。在某些研究中，在下丘脑内注射大鼠胰岛淀粉样多肽和大鼠CGRP后，食物摄取显著降低达8小时。在人体实验中，胰岛淀粉样多肽类似物普兰林肽已表现出减少体重或体重的增加。胰岛淀粉样多肽可能有益于治疗代谢病症，例如糖尿病和肥胖。胰岛淀粉样多肽还可用于治疗疼痛、骨疾病、胃炎，用于调节脂质(特别是甘油三酯)，或用于影响机体组成，例如脂肪优先减少而节约瘦组织。
激素降钙素(CT)因其在诱导的血钙过多作用下分泌及其快速的降低血钙作用而得名。其在以前已命名为C细胞的甲状腺神经内分泌细胞中产生，并由该细胞分泌。研究得最多的CT(1-32)作用是其对破骨细胞的作用。CT的体外作用包括皱褶缘快速消失和溶酶体酶释放下降。最后，CT对破骨细胞功能的抑制导致骨吸收下降。但是，甲状腺切除术情况下的血清CT慢性减少和髓质性甲状腺癌中存在的血清CT增加，看起来均与血清钙或骨质的变化无关。因此，最有可能的是，CT(1-32)的主要功能是在紧急情况下对抗急性血钙过多和/或在“钙应激”期(例如生长期、妊娠期和哺乳期)保护骨骼。(综述于Becker，JCEM，89(4)1512-1525(2004)和Sexton，Current MedicinalChemistry 61067-1093(1999))。与此相一致的是近期由同时去除了降钙素和CGRP-I肽的降钙素基因敲除小鼠获得的数据，数据揭示小鼠具有正常水平的基础钙相关值，但血钙反应增加(Kurihara H等，Hypertens Res.2003年2月；26 SupplS105-8)。
CT对血浆钙水平有作用，抑制破骨细胞功能，广泛用于治疗骨质疏松。从治疗上讲，鲑鱼CT似乎增加骨密度，降低骨折率，且副作用最小。在过去的25年中，CT还已成功地用于治疗骨Paget病，骨Paget病是一种慢性骨骼疾病，可导致一个或多个骨骼区域中的骨变大或变形。CT还由于其对在骨质疏松过程中体验的骨痛的镇痛作用而被广泛使用，尽管还不清楚了解这种作用的机制。
降钙素基因相关肽(CGRP)是一种其受体广泛分布于体内(包括神经系统和心血管系统)的神经肽。这种肽似乎调节感觉神经传递，是迄今为止发现的最有效的内源性血管舒张肽之一。已报道的CGRP生物学效应包括调节炎症中P物质、调节神经肌肉接头的烟碱性性受体活性、刺激胰酶分泌、减少胃酸分泌、外周血管舒张、心跳加速、神经调节、钙代谢调节、成骨刺激、胰岛素分泌、体温增加和食物摄取降低。(Wimalawansa，Amylin，calcitonin gene-related peptide，calcitonin and ADMa peptide superfamily.Crit Rev Neurobiol.1997；11(2-3)167-239)。CGRP的一个重要作用是利用其有效的血管舒张作用控制通向各个器官的血流，以静脉给予CGRP后平均动脉压下降为证。血管舒张作用还得到纯合CGRP敲除小鼠新近分析的支持，该分析表明周围交感活性增加引起外周血管阻力提高和高血压(Kurihara H等，Targeted disruption of ADM and alpha CGRP genesreveals their distinct biological roles.Hypertens Res.2003年2月；26SupplS105-8)。因此，除了其它作用以外，CGRP似乎还激发血管舒张作用、降血压作用和增加心率。
对充血性心力衰竭患者较长时间输注CGRP已表现出对血液动力学功能的持续有益作用，而没有副作用，提示CGRP可用于心力衰竭。CGRP应用的其它适应症包括肾衰竭、急性和慢性冠状动脉缺血、治疗心率失常、其它外周血管疾病，例如Raynaud现象、蛛网膜下腔出血、高血压和肺动脉高压。还潜在地可治疗妊娠和早产的先兆子痫毒血症。(Wimalawansa，1997)。近期的治疗应用包括使用CGRP拮抗剂治疗偏头痛。
存在可单独或组合地用于治疗或预防各种病症、具有许多有益特性的各种肽。创建具有多种作用的新且有用的肽应当是有用的，其中所述多种作用赋予现有肽不具有的改良特征。例如，在食物摄取实验中，已表明胰岛淀粉样多肽在30分钟内快速起作用，但其作用在60分钟后逐渐停止。相反，已表明鲑鱼降钙素具有延迟作用，峰值水平在240分钟时仍保持。可模拟胰岛淀粉样多肽和/或降钙素的作用且具有类似于胰岛淀粉样多肽的快速发作活性以及降钙素的持续活性的该新型化合物，可增加任一种单独化合物的能力和功效。而且，胰岛淀粉样多肽、降钙素和/或CGRP的某些物理化学特征组合成单一形态，可利于在功能障碍性代谢循环中的不同位置进行干扰。这些新型化合物将优良治疗剂的所需活性或特性组合，可产生具有至少一种所需特征(例如较高功效、较高能力、较高生物利用度、副作用较少、易于生产、稳定性和/或溶解性)的化合物。
本文提及的所有文件都通过引用结合到本申请中，如同本文完全阐述一样。
发明概述本发明至少部分地涉及新型胰岛淀粉样多肽家族肽或化合物。在一般方面，这些新型化合物(也称为本发明化合物)具有胰岛淀粉样多肽或降钙素及其类似物的至少环区；至少一部分降钙素或其类似物α螺旋区的α螺旋区，或具有部分胰岛淀粉样多肽α螺旋区和降钙素α螺旋区的α螺旋区，或其各自的类似物；以及胰岛淀粉样多肽或降钙素或其类似物的C端尾，前提条件是降钙素或降钙素类似物的C端尾不是脯氨酸(Pro)、羟脯氨酸(Hyp)、高丝氨酸(Hse)或Hse衍生物。
本文使用的“类似物”指其序列来源于基础参比肽(例如胰岛淀粉样多肽和降钙素)序列的肽，包括参比氨基酸序列的插入、置换、延伸和/或缺失，优选与基础肽具有至少50％或55％的氨基酸序列同一性，更优选与基础肽具有至少70％、80％、90％或95％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，这样的类似物可包含保守或非保守氨基酸置换(包括非天然氨基酸以及L和D形式)。类似物包括具有激动剂活性的化合物和具有拮抗剂活性的化合物。如本文定义的类似物还包括衍生物。
“衍生物”被定义为如上所述的参比肽或类似物，其一个或多个氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基或末端羧基具有化学修饰。化学修饰包括但不限于加入化学部分、创建新键和去除化学部分。氨基酸侧基修饰包括但不限于赖氨酸ε-氨基酰化；精氨酸、组氨酸或赖氨酸N-烷基化；谷氨酸或天冬氨酸羧基烷基化；以及谷氨酰胺或天冬酰胺脱酰胺化。末端氨基修饰包括但不限于脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰。末端氨基修饰包括但不限于脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰，例如烷基酰基、分支烷基酰基、烷基芳基-酰基。末端羧基修饰包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺、芳基酰胺、烷基芳基酰胺和低级烷基酯修饰。低级烷基是C1-C4烷基。而且，可利用一般合成化学技术人员已知的保护基保护一个或多个侧基或末端基团。氨基酸的α-碳可一甲基化或二甲基化。
在某些实施方案中，新型化合物具有胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物环区、降钙素或降钙素类似物α螺旋区的至少一部分和胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物C端尾。在其它实施方案中，新型化合物具有降钙素或降钙素类似物环区、降钙素或降钙素类似物α螺旋区的至少一部分和胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物C端尾。在另外的实施方案中，新型化合物具有胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物环区、胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物α螺旋区的至少一部分和降钙素或降钙素类似物α螺旋区的至少一部分，以及胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物C端尾。在其它实施方案中，新型化合物具有降钙素或降钙素类似物环区、胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物α螺旋区的至少一部分和降钙素或降钙素类似物α螺旋区的至少一部分，以及胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物C端尾。在另外的实施方案中，新型化合物具有胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物环区、降钙素或降钙素类似物α螺旋区的一部分或者胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物α螺旋区的至少一部分和降钙素或降钙素类似物α螺旋区的至少一部分，以及降钙素或降钙素类似物C端尾。
在某些实施方案中，新型化合物的环区可在胰岛淀粉样多肽或降钙素环及其类似物中进一步包含不超过1、2、3或4个修饰，包括置换、插入或缺失。进一步设想新型化合物可在含N-加帽区的环的N端部分具有另外的修饰，其可具有疏水或亲水特征，例如乙酰基、异己酰基、3，6，-二氧基辛酸或1-氨基-4，7，10-三氧杂-13-十三烷胺琥珀酰胺酸(succinimic acid)。修饰可进一步包含1、2、3或更多个另外的氨基酸。这是一个允许多个修饰的区域，修饰太多以至于无法述及，但本领域技术人员基于本申请中进一步例举的修饰会理解这一点。
一般地讲，就氨基酸序列而言，术语“修饰”包括单独或组合的置换、插入、延长、缺失和衍化。本发明的新型化合物可包含一个或多个“非必需氨基酸”残基的修饰。在本发明背景下，“非必需”氨基酸残基为在新型氨基酸序列中可改变(即缺失或置换)而不消除或基本不降低类似物多肽的激动剂活性的残基。
置换包括保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链或物理化学特征(例如静电、氢键键合、等构、疏水特征)的氨基酸残基取代的置换。氨基酸可为天然或非天然氨基酸。具有相似侧链的氨基酸残基类别是本领域已知的。这些类别包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。置换还可包括非保守改变。
本发明的化合物还可通过化学改变(例如酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化和环化)进一步衍化。这样的化学改变可通过化学或生物化学方法以及通过体内方法或其任意组合获得。本发明化合物的衍生物还可包括缀合一个或多个聚合物或小分子取代基。一类聚合物缀合是将聚乙二醇(“PEG”)聚合物、聚氨基酸(例如聚组氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸等)和/或各种长度的脂肪酸链连接或附着至AFP-6类似物的N端或C端或氨基酸残基侧链。小分子取代基包括短烷基和受限烷基(constrained alkyl)(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)和芳基。另外，碱性残基如R或K可被高R和高K、瓜氨酸或鸟氨酸取代，以改善肽的代谢稳定性。本发明化合物还包括酸以及酰胺形式的肽。
在某些实施方案中，新型化合物的α螺旋区包含降钙素或降钙素类似物α螺旋区的至少4个连续氨基酸。在其它实施方案中，α螺旋区包含降钙素或降钙素类似物α螺旋区的至少5、6、7或8个连续氨基酸。在其它实施方案中，α螺旋区包含降钙素或降钙素类似物α螺旋区的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或更多个连续氨基酸。在某些实施方案中，当连续氨基酸的数目小于8时，设想α螺旋区进一步包含胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物α螺旋区的至少4、5、6、7、9、10、11或更多个连续氨基酸。在某些实施方案中，设想在新型化合物的α螺旋区中可存在较少的降钙素或降钙素类似物氨基酸、较多的胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物氨基酸。构成α螺旋区的氨基酸数可为约10至23个氨基酸。因此，α螺旋区可为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸长。而且，所述氨基酸应当提供约3至约6个α螺旋转角。还设想新型化合物的α螺旋区可在降钙素和/或胰岛淀粉样多肽α螺旋区及其类似物的α螺旋区中进一步包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8或10个修饰，包括置换、插入或缺失。
在某些实施方案中，新型化合物的C端尾包含胰岛淀粉样多肽或降钙素及其类似物的至少6、5或4个氨基酸。在某些实施方案中，新型化合物的C端尾包含至少一部分具有β转角的C端尾。在某些实施方案中，通过Gly-Ser氨基酸组合引入β转角。因此，新型化合物可具有这样的C端尾，即其包含具有Gly-Ser或以Gly-Ser开始的胰岛淀粉样多肽或降钙素C端尾的一部分(及其类似物)。
在某些实施方案中，新型化合物的C端尾可在胰岛淀粉样多肽或降钙素环及其类似物中进一步包含不超过1、2或3个修饰，包括置换、插入或缺失。进一步设想新型化合物可在C端尾的C端部分具有另外的修饰，其可包括L-辛基甘氨酸、4ABU(4-氨基丁酸)、9Anc(9-氨基壬酸)、3，6-二氧基辛酸或1-氨基-4，7，10-三氧杂-13-十三烷胺琥珀酰胺酸。修饰可进一步包含1、2、3或更多个另外的氨基酸。本领域技术人员根据本发明进一步例举的修饰应理解该区域中的设想修饰类型。
在一个方面，环区被定义为存在于N-末端的含至少5-8个氨基酸的区域，其中第一个氨基酸和最后一个氨基酸能够产生键，例如胰岛淀粉样多肽2-7位的残基或降钙素1-7位的残基及其各自类似物中的其对应区域。在另一方面，α螺旋区被定义为胰岛淀粉样多肽或降钙素中邻接环区和C端尾、在结构上形成α螺旋的内部部分，例如胰岛淀粉样多肽8-23位的残基或降钙素8-27位的残基及其各自类似物中的其对应区域。在再一方面，C端尾被定义为α螺旋之后的区域，例如胰岛淀粉样多肽33-37位的残基或更长的残基，例如27-37位的残基，或降钙素27或28至32位的残基。本发明化合物既包含所公开化合物的酰胺形式，也包括其酸形式。
本文定义的胰岛淀粉样多肽和降钙素包括所有的天然变体和种变体。胰岛淀粉样多肽和降钙素的实例包括但不限于人胰岛淀粉样多肽(hAmylin)KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEQID NO1)大鼠胰岛淀粉样多肽(rAmylin)KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY (SEQID NO2)鲑鱼降钙素(sCT)CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP(SEQ ID NO3)人降钙素(hCT)CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ IDNO4)。
所谓“氨基酸”和“氨基酸残基”指天然氨基酸、非天然氨基酸和修饰的氨基酸。除非相反地规定，否则一般性或以名称具体指出的任何氨基酸都包括D和L立体异构体，如果其结构允许这样的立体异构体形式的话。天然氨基酸包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然氨基酸包括但不限于高赖氨酸、高精氨酸、高丝氨酸、氮杂环丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2，4-二氨基异丁酸、锁链素、2，2′-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、2-吡啶酸和硫代脯氨酸。其它的非天然氨基酸包括在其N端氨基或其侧链基团上可逆或不可逆地被化学封闭或被化学修饰的修饰氨基酸残基，例如其中侧链官能团被化学修饰为另一种官能团的N-甲基化D和L氨基酸或残基。例如，修饰的氨基酸包括甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸砜；天冬氨酸的一种修饰氨基酸-天冬氨酸-(β-甲酯)；甘氨酸的一种修饰氨基酸-N-乙基甘氨酸；或丙氨酸的一种修饰氨基酸-丙氨酸甲酰胺。可加入的其它残基描述于Sandberg等，J.Med.Chem.412481-91，1998。
在一般方面，本发明的化合物包含至少环区、α螺旋区和C端尾。环区包含含式X-Xaa1序列-Y的氨基序列，其中X和Y能够产生键，并为独立选择的具有下述侧链的残基所述侧链彼此化学键合从而形成分子内连接，例如二硫键；酰胺键；可形成环状内酰胺的烷基酸和烷基胺；烷基醛或烷基卤和烷基胺，其可缩合和被还原，从而形成烷基胺或亚胺键；或所述侧链可连接从而形成烷基、烯基、炔基、醚或硫醚键。烷基链可包括具有约1至约6个碳原子的低级烷基。在某些实施方案中，分子内连接可为二硫键、酰胺键、亚胺键、胺键、烷基键和烯基键。在某些实施方案中，X和Y独立地选自Ser、Asp、Glu、Lys、Om或Cys。在某些实施方案中，X和Y是Cys和Cys。在其它实施方案中，X和Y是Ser和Ser。在另外的实施方案中，X和Y是Asp和Lys或者Lys和Asp。
Xaa1序列包含X和Y之间的3、4、5或6个氨基酸的氨基酸序列。在某些实施方案中，Xaa1序列包含紧邻着Y具有一个或多个取代或未取代含羟基残基的区域的氨基酸序列。例如，含羟基残基区可具有Y邻近的3个氨基酸中的至少2个，其或者为Ser，或者为Thr。Xaa1序列中的其它氨基酸可为任意氨基酸。在某些实施方案中，Xaa1序列为3个氨基酸。在其它实施方案中，Xaa1序列为4个氨基酸。在另外的实施方案中，Xaa1序列为5个氨基酸。在其它实施方案中，Xaa1序列为6个氨基酸。因此，Xaa1可表示为Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7(SEQ ID NO5)。在某些实施方案中，Xaa2、Xaa3和/或Xaa4可不存在。在某些实施方案中，Xaa5、Xaa6和Xaa7包含含羟基的残基区。因此，3个氨基酸中的至少两个可为Ser、hSer、Thr、别Thr、d-Thr或其它的其非天然类似物。Xaa2可为任意氨基酸或不存在，Xaa3可为任意氨基酸或不存在，Xaa4可为任意氨基酸或不存在；如果Xaa6为Ser或Thr且Xaa7是Ser或Thr，则Xaa5可为任意氨基酸；如果Xaa5为Ser或Thr且Xaa7是Ser或Thr，则Xaa6可为任意氨基酸；如果Xaa5为Ser或Tbr且Xaa6是Ser或Thr，则Xaa7可为任意氨基酸。因此，在某些实施方案中，Xaa1可表示为Xaa2不存在、Xaa3是Ala、Gly、Ser、Asp或不存在，Xaa4是Asn、Ala、Asp、Gly或不存在；Xaa5是Ala、Leu、Thr或Ser；Xaa6是Ala、Ser或Thr；以及Xaa7是Ala、Ser、Val、Hse、(S)-2-氨基-3-羟基-甲基丁酸(Ahb)、(2S，3R)-2-氨基-3羟基-甲基戊酸(Ahp)、D-Thr、Thr或其衍生物。在其它实施方案中，Xaa1可表示为Xaa2不存在，Xaa3是Ser、Gly或不存在，Xaa4是Asn或Asp，Xaa5是Ala、Ser、Thr或Leu，Xaa6是Ala、Thr或Ser，而Xaa7是Ser、D-Thr、别Thr或Thr。在某些实施方案中，环区包含其中Xaa3为Ala、其中Xaa3为Ser或其中Xaa3为Gly的上述Xaa1表达式。或者或另外，环区包含其中Xaa4为Ala、其中Xaa4为Asn、其中Xaa4为Asp或其中Xaa4为Gly的上述Xaa1表达式。或者或另外，环区包含其中Xaa5为Ala、其中Xaa5为Thr或其中Xaa5为Leu的上述Xaa1表达式。或者或另外，环区包含其中Xaa6为Ser或其中Xaa6为Ala的上述Xaa1表达式。或者或另外，环区包含其中Xaa7为Thr或其中Xaa7为D-Thr的上述Xaa1表达式。进一步设想在环区中构造不超过1、2或3个修饰，例如置换、插入、缺失和/或衍化。
应注意的是，在整个申请中，可替代的选择都以马库什组记载，例如，每个氨基酸位都含1个以上的可能氨基酸。具体地说，设想马库什组中的每个成员都应被单独考虑，由此构成本发明的另一个实施方案，不能把马库什组当作单一单位。
本发明环区的实例包括但不限于C-N-T-A-T-C(SEQ ID NO6)、C-A-T-A-T-C(SEQ ID NO7)、C-D-T-A-T-C(SEQ ID NO8)、C-G-T-A-T-C(SEQ ID NO9)、C-N-A-A-T-C(SEQ ID NO10)、C-N-T-S-T-C(SEQ ID NO11)、C-N-T-A-dThr-C(SEQ ID NO12)、C-N-T-A-T(OPO3H2)-C(SEQ ID NO13)、C-N-T-A-S-C(SEQ ID NO14)、C-N-T-A-A-C(SEQ ID NO15)、C-N-T-A-V-C(SEQ ID NO16)、C-N-T-A-Hse-C(SEQ ID NO17)、C-N-T-A-Ahb-C(SEQ ID NO18)、C-N-T-A-Ahp-C(SEQ ID NO19)、C-S-N-L-S-T-C(SEQ ID NO20)、C-G-N-L-S-T-C(SEQ ID NO21)、C-A-N-L-S-T-C(SEQ ID NO22)、C-S-A-L-S-T-C(SEQ ID NO23)、C-S-N-A-S-T-C(SEQ ID NO24)、C-S-N-L-A-T-C(SEQ ID NO25)和C-S-N-L-S-A-C(SEQ ID NO26)。如先前所指出的，进一步设想在环区中构造不超过1、2或3个修饰，例如置换、插入、缺失和/或衍化。
新型化合物的环区可在N-末端进一步含有修饰或另外的氨基酸。这样的修饰包括添加化合物，例如Lys、Ala、Phe、Ile、Ser、辛基甘氨酸、异己酰基(Isocap)、Fmoc-3，6-二氧基辛酸、Fmoc-1-氨基-4，7，10-三氧杂-13-十三烷胺琥珀酰胺酸、乙酰基和/或用于溶解性、传递、信号转导的基团。代表性的修饰环包括向Xaa1序列添加Lys或向Xaa1序列添加Ile。例如，修饰的环区可为K-C-N-T-A-T-C(SEQID NO27)。在某些实施方案中，在环区N-末端酸添加和/或修饰可改变环区。例如，本发明的环区可如下修饰环(2，7)1-7 hAmylin、环(2Asp7Lys)1-7 hAmylin、N-异己酰基1-7 hAmylin、N-3，6二氧杂辛酰基1-7 hAmylin、L-辛基甘氨酸1-7 hAmylin、其中Agy是烯丙基甘氨酸的乙酰基(2Agy，7Agy)1-7 hAmylin、乙酰基(1Ala)1-7 hAmylin、(1Thr3Asp)1-7 hAmylin、异己酰基(7Ala)5-7 sCT、乙酰基(2Agy，7Agy)1-7 sCT和环(1，7)(1Asp 7Lys)1-7 sCT。因此，以异己酰基(7Ala)5-7 sCT为例，本发明的某些实施方案在本发明环区的N端区域包含修饰，使得Xaa2-Xaa5不存在。
在整个申请中，所述氨基酸序列可称作邻近参比肽的a位至b位的氨基酸。在本申请中，参比肽是胰岛淀粉样多肽和降钙素，其序列示于SEQ ID NO1-4。例如，在先前的段落中，1-7 hAmylin指包含人胰岛淀粉样多肽1位至7位的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。对参比肽的修饰可如下表述邻接修饰的修饰位。例如，(2Asp 7Lys)1-7hAmylin表示人胰岛淀粉样多肽1-7位的氨基酸序列，在2位具有由Cys变为Asp的修饰，在7位具有由Cys变为Lys的修饰。
新型化合物的α螺旋区可为约8-23个氨基酸长。在某些实施方案中，α螺旋区是双亲性的。在某些实施方案中，α螺旋区含约3-6个螺旋转角。在某些实施方案中，α螺旋区含3、4、5或6个螺旋转角。在其它实施方案中，α螺旋区是与约3、4、5或6个螺旋转角等同的刚性结构。理想螺旋的实例是LLQQLQKLLQKLKQY(SEQ IDNO28)。在某些实施方案中，α螺旋是双亲性结构。因此，可选择能提供该型结构的所需氨基酸特征。
业已发现，在新型化合物的α螺旋区中需要降钙素α螺旋区、胰岛淀粉样多肽和降钙素α螺旋区的组合或其部分和/或某些CGRP元件。如同环区的情况一样，设想α螺旋区可来自任何胰岛淀粉样多肽或降钙素及其类似物。因此，在某些实施方案中，α螺旋区是降钙素或降钙素类似物α螺旋区的至少一部分。在其它实施方案中，α螺旋区是降钙素或降钙素类似物α螺旋区的至少一部分和胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物α螺旋区的至少一部分。在另外的实施方案中，新型化合物的α螺旋区包含CGRP的元件。进一步设想新型化合物可具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个进一步的修饰，例如置换、插入、缺失和/或衍化。
在某些实施方案中，本发明的α螺旋区可包含sCT的8位至sCT的18、19、20、21、22、23、24、25、26或27位的氨基酸。而且，α螺旋区可包含相同或不同物种的降钙素或降钙素类似物α螺旋区的不止1个部分，例如8-21 sCT 19-27 sCT；8-21 sCT 18-27 sCT；或8-16 hCT 17-27 sCT；或(11Arg)8-16 hCT(18Arg)17-27 sCT。或者或另外，上述8-18 sCT至8-27 sCT的α螺旋可进一步包含(10Aib)、(11Arg)、(11Orn)、(11hArg)、(11Cit)、(11hLys)、(11Lys(for))、(17Aib)、(18Arg)、(18Orn)、(18hArg)、(18Cit)、(18hLys)、(18Lys(for))、(18Lys(PEG5000))、(22Leu)、(24Pro)中的一个或多个置换或其任意组合。
在一个实施方案中，本发明的α螺旋区可表示为(α螺旋区I型)R1-VL Xaa10 Xaa11 LSQ Xaa15 L Xaa17 Xaa18 LQT Xaa22 P Xaa24TNT-R1(SEQ ID NO29)，其中Xaa10为Gly或Aib；Xaa11为Lys、Arg、Orn、hArg、Cit、hLys或Lys(for)；Xaa15为Glu或Phe；
Xaa17为His或Aib；Xaa18为Lys、Arg、Orn、hArg、Cit、hLys、Lys(for)、Lys(PEG5000)；Xaa22为Try或Leu；Xaa24为Arg或Pro；或R1不存在或包含1-4个附加氨基酸。
此外，应当记住的是，马库什组中的每个成员或其组合，都是本发明的另一个实施方案，不能被理解为单一单位。作为实例，有一个用于说明的速记法，本发明的实施方案包括α螺旋区I型式，其中Xaa18可为Lys、Arg、Orn、hArg、Cit、hLys或Lys(for)，每个变体都是本发明的单独实施方案。因此，α螺旋区I型式具有一个实施方案，其中Xaa18是Lys。有另一个实施方案，其中Xaa18是Arg等等。进一步设想α螺旋区可包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰，例如置换、插入、缺失和/或衍化。因此，α螺旋区I型化合物可进一步在C末端具有缺失。在某些实施方案中，R1的氨基酸能够形成α螺旋转角。
本发明α螺旋区I型的实例包括但不限于8-18 sCT、8-21 sCT、8-24sCT、8-27 sCT、(11Arg)8-18 sCT、(18Arg)8-18 sCT、(11Arg 18Arg)8-18sCT、(11Orn 18Orn)8-18 sCT、(11Arg 18Cit)8-18 sCT、(11hArg 18hArg)8-18 sCT、(11Arg 18Orn)8-18 sCT、(11Cit 18Arg)8-18 sCT、(11Cit18Cit)8-18 sCT、(11hLys 18hLys)8-18 sCT、(10Aib 11Arg 17Aib 18Arg)8-18 sCT、(11Lys(for)18Lys(for))8-18 sCT、(10Aib 11Lys(for)17Aib18Lys(for))8-18 sCT、(11Arg 18Lys(PEG 5000))8-18 sCT、(11Arg)8-21 sCT、(18Arg)8-21 sCT、(11Arg 18Arg)8-21 sCT、(11Orn 18Orn)8-21sCT、(11Arg 18Cit)8-21 sCT、(11hArg 18hArg)8-21 sCT、(11Arg 18Orn)8-21 sCT、(11Cit 18Arg)8-21 sCT、(11Cit 18Cit)8-21 sCT、(11hLys18hLys)8-21 sCT、(10Aib 11Arg 17Aib 18Arg)8-21 sCT、(11Lys(for)18Lys(for))8-21 sCT、(10Aib 11Lys(for)17Aib 18Lys(for))8-21 sCT、(11Arg 18Lys(PEG 5000))8-21 sCT、(11Arg)8-24 sCT、(18Arg)8-24sCT、(11Arg 18Arg)8-24 sCT、(11Arg 18Arg 22Leu)8-24 sCT、(11Arg18Arg 24Pro)8-24 sCT、(11Orn 18Orn)8-24 sCT、(11Arg 18Cit)8-24sCT、(11hArg 18hArg)8-24 sCT、(11Arg 18Orn)8-24 sCT、(11Cit 18Arg)8-24 sCT、(11Cit 18Cit)8-24 sCT、(11hLys 18hLys)8-24 sCT、(10Aib11Arg 17Aib 18Arg)8-24 sCT、(11Lys(for)18Lys(for))8-24 sCT、(10Aib11Lys(for)17Aib 18Lys(for))8-24 sCT、(11Arg 18Lys(PEG 5000))8-24sCT、(11Arg)8-27 sCT、(18Arg)8-27 sCT、(11Arg 18Arg)8-27 sCT、(11Arg 18Arg 22Leu)8-27 sCT、(11Arg 18Arg 24Pro)8-27 sCT、(11Orn18Orn)8-27 sCT、(11Arg 18Cit)8-27 sCT、(11hArg 18hArg)8-27 sCT、(11Arg 18Orn)8-27 sCT、(11Cit 18Arg)8-27 sCT、(11Cit 18Cit)8-27sCT、(11hLys 18hLys)8-27 sCT、(10Aib 11Arg 17Aib 18Arg)8-27sCT、(11Lys(for)18Lys(for))8-27 sCT、(10Aib 11Lys(for)17Aib18Lys(for))8-27 sCT、(11Arg 18Lys(PEG 5000))8-27 sCT、(11Arg18Arg)8-21 sCT-19-27 sCT和(11Arg 18Arg)8-21 sCT-(18Leu)18-27sCT。
在某些实施方案中，本发明的α螺旋区可包含胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物α螺旋区的一部分和降钙素或降钙素类似物α螺旋区的一部分。本发明的α螺旋区可包含hAmylin的8位至hAmylin的11、12、13、14、15、16、17、18或19位的氨基酸和sCT的13、14、15、16、17、18和19位的氨基酸至sCT的18、19、20、21、22、23、24、25、26或27位的氨基酸。或者或另外，上述胰岛淀粉样多肽和降钙素的α螺旋区可进一步包含(8Val)、(9Leu)、(9Met)、(10Gly)、(10His)、(12Thr)、(13Thr)、(13Asn)、(13Phe)、(13Tyr)、(14Arg)、(14Ala)、(14Asp)、(14Glu)、(14Gln)、(14Thr)、(14Gly)、(15Leu)、(15Ser)、(15Glu)、(15Ala)、(15Tyr)、(16Asp)、(17Ser)、(17Phe)、(18Arg)、(17Aib)、(18Arg)、(18Orn)、(18hArg)、(18Cit)、(18hLys)、(18Lys(for))、(18Lys(PEG5000))、(19Phe)、(20His)、(21Asn)、(22Met)、(22Val)、(22Phe)、(22Leu)、(24Pro)中的一个或多个置换或其任意组合。在某些实施方案中，本发明α螺旋区中的氨基酸数目为至少10个氨基酸。在其它实施方案中，本发明α螺旋区中的氨基酸数目为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23。在其它实施方案中，本发明α螺旋区中的氨基酸数目为24或更多。
在一个实施方案中，本发明的α螺旋区可表示为(α螺旋区II型)R1-Xaa8 Xaa9 Xaa10 R Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 P Xaa24 TNT-R1(SEQ ID NO30)，其中Xaa8为Ala或Val；Xaa9为Thr、Met或Leu；Xaa10为Gln、Gly、His；Xaa12为Leu或Thr；Xaa13为Ala、Thr、Asn、Phe、Tyr、Ser或Thr；Xaa14为Asn、Arg、Ala、Asp、Glu、Gln、Thr或Gly；Xaa15为Phe、Leu、Ser、Glu、Ala、Asp或Tyr；Xaa16为Leu或Asp；Xaa17为Val、His、Ser、Phe或Aib；Xaa18为His、Arg、Lys、Orn、hArg、Cit、hLys、Lys(for)或Lys(PEG5000)；Xaa19为Leu、Ser或Phe；Xaa20为Gln或His；Xaa21为Thr或Asn；Xaa22为Tyr、Val、Phe、Leu或Met；Xaa24为Arg或Pro；以及R1为不存在或包含1-4个附加氨基酸。
此外，应当记住的是，马库什组中的每个成员或其组合，都是本发明的另一个实施方案，不能被理解为单一单位。进一步设想α螺旋区可包含本文描述化合物中的不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰，例如置换、插入、缺失和/或衍化。例如，在某些实施方案中，α螺旋区II型化合物可在C末端具有缺失，导致27、26、25、24或22位缺失。但是，在其它实施方案中，缺失并不去除19、20、21或22位的氨基酸。
II型α螺旋区的实例包括但不限于(8Val 9Leu 10Gly)11-15hAmylin 16-27 sCT、(8Val 9Leu 10GLy)11-15 hAmylin(18Arg)16-27sCT、8-12 hAmylin(18Arg)13-27 sCT、8-18 hAmylin 19-23 sCT、8-18HAmylin 19-27 sCT、(15Glu 18Arg)8-18 hAmylin 19-24 sCT、(14Arg15Ser)8-18 hAmylin 19-22 sCT、(13Ala 14Ala 15Ala)8-18 hAmylin19-27 sCT、(13Ala 14Asp 15Ala)8-18 hAmylin 19-22 sCT、(13Ala 14Asp)8-18 hAmylin 19-23 sCT、(13Ala 14Asp)8-18 hAmylin 19-27 sCT、(13Ala 14Ala)8-18 hAmylin 19-22 sCT、(13Ala 14Glu)8-18 hAmylin19-22 sCT、(13Thr 14Asp 15Tyr)8-18 hAmylin 19-22 sCT、(13Ala 14Gln)8-18 hAmylin 19-22 sCT、(13Asn 14GLu 15Tyr)8-18 hAmylin 19-27sCT、(13Phe 14Asp)8-18 hAmylin 19-27 sCT、(13Ala 14Asp)8-18hAmylin(15Glu 18Arg)8-18 hAmylin 19-24 sCT、(19Phe 22Phe)19-27sCT、(13Ala 14Asp)8-18 hAmylin(19Phe 20His 22Phe)19-27 sCT、(13Ala 14Asp)8-18 hAmylin(19Phe 22Phe)19-27 sCT、(9Thr 10His)8-18 hAmylin 19-22 sCT、(9Thr 10His 14Gly 15Leu 17Ser 18Arg)8-19hAmylin 20-23 sCT、8-18 hAmylin(21Asn 22Phe 23Val)19-23 sCT、8-18 hAmylin(22Met)19-27 sCT、8-18 hAmylin(22Val)19-27 sCT、(9Met 12Thr 13Tyr 14Thr 15Glu 16Asp 17Phe)8-17 hAmylin(18Arg)18-20 sCT。在其它实施方案中，新型化合物包括上述代表性化合物的变体，其具有在对应于sCT的22、23、24、25、26或27位的位置终止的α螺旋。换句话说，还具体描述了化合物8-18 hAmylin 19-24sCT，因为该化合物仅仅是截短至24位的上述8-18 hAmylin 19-27sCT。作为另一个实例，还具体描述了化合物(13Ala 14Asp 15Ala)8-18hAmylin 19-23，因为以上表述适用于(13Ala 14Asp 15Ala)8-18hAmylin 19-22。
在某些实施方案中，本发明的C端尾包含hAmylin的27、28、29、30、31、32或33位至36或37位的氨基酸。在其它实施方案中，C端尾包含sCT的27或28位至32位的氨基酸；但是，当环区来自降钙素或降钙素类似物、α螺旋区来自降钙素或降钙素类似物时，C端尾的最后一位不是Pro、Hyp、高丝氨酸(Hse)或Hse衍生物。或者或另外，上述胰岛淀粉样多肽和降钙素α螺旋区可进一步包含(27Tyr)hAmylin、(29Arg)hAmylin、(32Val)hAmylin、(32Thr)hAmylin、(34Glu)hAmylin、(35Lys)hAmylin、(36Phe)hAmylin、(36Ala)hAmylin、(37Phe)hAmylin、(30Asn)sCT、(32Tyr)sCT中的一个或多个取代或其任意组合。
在一个实施方案中，本发明的C端尾可表示为Xaa28 Xaa29Xaa30 Xaa31 Xaa32 Xaa33 G Xaa35 Xaa36 Xaa37 Xaa38 (SEQ IDNO31)，其中Xaa28为Lys、Tyr或不存在；Xaa29为Ser、Pro或不存在；Xaa30为Ser、Pro、Arg或不存在；Xaa31为Thr或不存在；Xaa32为Asn或不存在；Xaa33为Val、Thr或不存在；Xaa35为Ser、Glu；Xaa36为Asn、Lys或Gly；Xaa37为Thr、Phe或Ala；Xaa38为Tyr、Phe、Pro或不存在；前提条件是当环区来自降钙素或降钙素类似物、α螺旋区来自降钙素或降钙素类似物时，C端尾的最后一位不是Pro、Hyp、高丝氨酸(Hse)或Hse衍生物。
此外，应当记住的是，马库什组中的每个成员或其组合，都是本发明的另一个实施方案，不能被理解为单一单位。进一步设想C端尾可包含先前段落所述化合物中的不超过1、2或3个修饰，例如置换、插入、缺失和/或衍化。
本发明C端尾的实例包括但不限于27-37 rAmylin、(27Tyr 29Arg32Thr)27-37 rAmylin、(29Arg 32Thr)28-37 rAmylin、30-37 hAmylin、(32Thr)30-37 hAmylin、(35Lys 36Ala 37Phe)30-37 hAmylin、30-36hAmylin、(32Val)30-36 hAmylin、(34Glu 36Phe)30＝36 hAmylin、31-37 hAmyin、31-36 hAmylin、33-36 hAmylin、33-7 hAmylin、28-32 sCT、(30Asn 32Tyr)28-32 sCT和27-32 sCT。在其它实施方案中，C端尾包含氨基酸序列KSNFVPTN(SEQ ID NO32)或SNFVPTNV(SEQ IDNO33)。
可如先前段落所述，进一步设想对本发明的C端尾构造不超过1、2或3个修饰，例如置换、插入、缺失和/或衍化。新型化合物的C端尾可在C末端进一步包含修饰或附加氨基酸。这样的修饰包括添加化合物，例如Lys(一直到4个Lys)、L-辛基甘氨酸、4ABU(4-氨基丁酸)、9Anc(9-氨基壬酸)和/或用于溶解性、稳定性或传递的基团。实例包括33-37 hAmylin L-辛基甘氨酸、33-37 hAmylin 4ABU和33-37 hAmylin 9Anc。
在一般方面，本发明的化合物包含(a)本发明的任一种环区；(b)本发明的任一种α螺旋区；和(c)本发明的任一种C端尾，前提条件是当环区来自降钙素或降钙素类似物、α螺旋区来自降钙素或降钙素类似物时，C端尾的最后一位不是Pro、Hyp、高丝氨酸(Hse)或Hse衍生物。
在另一个一般方面，本发明的化合物包含(a)包含Xaa1或在N-末端具有修饰的Xaa1的环区；(b)包含I型或II型α螺旋区的α螺旋区；(c)由SEQ ID NO31表示的C端尾，前提条件是当环区来自降钙素或降钙素类似物、α螺旋区来自降钙素或降钙素类似物时，C端尾的最后一位不是Pro、Hyp、高丝氨酸(Hse)或Hse衍生物。C末端可包含进一步的修饰。
在再一方面，本发明的化合物包含式I的氨基酸序列Xaa1 XXaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Y Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32(SEQ IDNO34)，其中Xaa1为A、C、hC、D、E、F、I、L、K、hK、R、hR、S、Hse(高丝氨酸)、T、G、Q、N、M、Y、W、P、Hyp(羟脯氨酸)、H、V或不存在；Xaa3为A、D、E、N、Q、G、V、R、K、hK、hR、H、I、L、M或不存在；Xaa4为A、I、L、S、Hse、T、V、M或不存在；Xaa5为A、S、T、Hse、Y、V、I、L或M；Xaa6为T、A、S、Hse、Y、V、I、L或M；Xaa8为A、V、I、L、F或M；Xaa9为L、T、S、Hse、V、I或M；Xaa10为G、H、Q、K、R、N、hK或hR；Xaa11为K、R、Q、N、hK、hR或H；Xaa12为L、I、V、F、M、W或Y；Xaa13为A、F、Y、N、Q、S、Hse或T；Xaa14为A、D、E、G、N、K、Q、R、H、hR或hK；Xaa15为A、D、E、F、L、S、Y、I、V或M；Xaa16为L、F、M、V、Y或I；Xaa17为H、Q、N、S、Hse、T或V；Xaa18为K、hK、R、hR、H、u(Cit)或n(Orn)；Xaa19为F、L、S、Hse、V、I、T或不存在；Xaa20为H、R、K、hR、hK、N、Q或不存在；
Xaa21为T、S、Hse、V、I、L、Q、N或不存在；Xaa22为F、L、M、V、Y或I；Xaa23为P或Hyp；Xaa24为P、Hyp、R、K、hR、hK或H；Xaa25为T、S、Hse、V、I、L、F或Y；Xaa26为N、Q、D或E；Xaa27为T、V、S、F、I或L；Xaa28为G或A；Xaa29为S、Hse、T、V、I、L或Y；Xaa30为E、G、K、N、D、R、hR、hK、H或Q；Xaa31为A、T、S、Hse、V、I、L、F或Y；和Xaa32为F、P、Y、Hse、S、T或Hyp；其中X和Y能够产生键，并为独立选择的具有下述侧链的残基所述侧链彼此化学键合从而形成分子内连接，例如二硫键；酰胺键；可形成环状内酰胺的烷基酸和烷基胺；烷基醛或烷基卤和烷基胺，其可缩合和被还原，从而形成烷基胺或亚胺键；或所述侧链可连接从而形成烷基、烯基、炔基、醚或硫醚键。烷基链可包括具有约1至约6个碳原子的低级烷基。在某些实施方案中，分子内连接可为二硫键、酰胺键、亚胺键、胺键、烷基键和烯键。在某些实施方案中，X和Y独立地选自Ser、Asp、Glu、Lys、Orn或Cys。在某些实施方案中，X和Y是Cys和Cys。在其它实施方案中，X和Y是Ser和Ser。在另外的实施方案中，X和Y是Asp和Lys或Lys和Asp。
在再一方面，本发明的化合物包含式II的氨基酸序列Xaa1 Xaa2Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32(SEQ IDNO35)，其中Xaa1为A、C、D、F、I、K、S、T或不存在；Xaa2为C、D、S或不存在；
Xaa3为A、D、N或不存在；Xaa4为A、L、T或不存在；Xaa5为A或S；Xaa6为T、A、S或V；Xaa7为C、K或A；Xaa8为A、V、L或M；Xaa9为L或T；Xaa10为G、H或Q；Xaa11为K、R、Q或hArg；Xaa12为L、W或Y；Xaa13为A、F、N、Q、S或T；Xaa14为A、D、E、G、N、K、Q或R；Xaa15为A、D、E、F、L、S或Y；Xaa16为L或F；Xaa17为H、Q、S或V；Xaa18为K、R、hArg、u(Cit)或n(Orn)；Xaa19为F、L、S或不存在；Xaa20为H、Q或不存在；Xaa21为T、N或不存在；Xaa22为F、L、M、V或Y；Xaa23为P；Xaa24为P或R；Xaa25为T；Xaa26为N；Xaa27为T或V；Xaa28为G；Xaa29为S；Xaa30为E、G、K或N；
Xaa31为A或T；和Xaa32为F、P或Y。
在再一方面，本发明的化合物包含式III的氨基酸序列Xaa1 Xaa2Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32(SEQ IDNO36)，其中Xaa1为A、C、F、I、K、S或不存在；Xaa2为C、D或S；Xaa3为A、D或N；Xaa4为A、L或T；Xaa5为A或S；Xaa6为T；Xaa7为C或K；Xaa8为A或V；Xaa9为L或T；Xaa10为G、H或Q；Xaa11为K、R或hArg；Xaa12为L；Xaa13为A、F、N、S或T；Xaa14为A、D、E、G、N、Q或R；Xaa15为A、E、F、L、S或Y；Xaa16为L；Xaa17为H、S或V；Xaa18为K、R、hArg、u(Cit)或n(Orn)；Xaa19为F、L或S；Xaa20为H或Q；Xaa21为T或N；Xaa22为F、L、M、V或Y；
Xaa23为P；Xaa24为P或R；Xaa25为T；Xaa26为N；Xaa27为T或V；Xaa28为G；Xaa29为S；Xaa30为E、G、K或N；Xaa31为A或T；和Xaa32为F、P或Y。
在一般方面，式I、II或III的序列进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个置换、插入、延伸和/或衍化修饰。在某些实施方案中，式I、II或III的序列包含在22位和23位氨基酸之间插入的Val。在其它实施方案中，式I、II或III的序列包含在22位和23位之间插入的Gln。在另外的实施方案中，式I、II或III的序列包含在22位和23位之间的Gln-Thr-Tyr(SEQ ID NO37)序列。在其它实施方案中，式I、II或III的序列包含在22位和23位之间的Leu-Gln-Thr-Tyr(SEQ ID NO38)序列。在另一个一般方面，式I、II或III的修饰可处于N-末端。在某些实施方案中，式I、II或III的N端部分具有添加的辛基甘氨酸。在其它实施方案中，式I、II或III的N端部分具有添加的异己酰基。
在再一方面，本发明的化合物包含式IV的氨基酸序列Xaa1 Xaa2Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32(SEQ IDNO39)，其中Xaa1为A、C、D、F、K、T或不存在；Xaa2为A、C、D、S或不存在；Xaa3为A、D、N或不存在；
Xaa4为A、L、T或不存在；Xaa5为A或S；Xaa6为A、S、T或V；Xaa7为A、C或K；Xaa8为A、L、M或V；Xaa9为L或T；Xaa10为G、H或Q；Xaa11为K、Q或R；Xaa12为L、W或Y；Xaa13为A、N、Q、S或T；Xaa14为A、D、E、G、K、N、Q或R；Xaa15为A、D、E、F、L、S或Y；Xaa16为F或L；Xaa17为H、Q、S或V；Xaa18为K或R；Xaa19为F、L、S或不存在；Xaa20为H、K、Q或不存在；Xaa21为Q、T或不存在；Xaa22为F、L或Y；Xaa23为P；Xaa24为P或R；Xaa25为T；Xaa26为N；Xaa27为T或V；Xaa28为G；Xaa29为S；Xaa30为E、K或N；Xaa31为A或T；
Xaa32为F、Y或不存在；在一般方面，式IV的序列进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个置换、插入、延伸和/或衍化修饰。在某些实施方案中，式I、II、III或IV的序列包含在24位的缺失。
在再一方面，本发明的化合物包含氨基酸序列，其含有(a)包含Xaa1的环区；(b)α螺旋环I型；和(c)C端尾；其中X1包含氨基酸序列X Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Y(SEQ ID NO5)，其中，Xaa2为任意氨基酸或不存在；Xaa3为Ala、Gly、Ser、Asp或不存在；Xaa4为Asn、Ala、Asp、Gly或不存在；Xaa5为Ala、Leu、Thr或Ser；Xaa6为Ala、Ser或Thr；和Xaa7为Ala、Ser、Val、Hse、(S)-2-氨基-3-羟基-甲基丁酸(Ahb)、(2S，3R)-2-氨基-3羟基-甲基戊酸(Ahp)、D-Thr、Thr或其衍生物；X和Y是能够产生键的氨基酸，为独立选择的具有下述侧链的残基所述侧链彼此化学键合从而形成分子内连接，例如二硫键；酰胺键；可形成环状内酰胺的烷基酸和烷基胺；烷基醛或烷基卤和烷基胺，其可缩合和被还原，从而形成烷基胺或亚胺键；或所述侧链可连接从而形成烷基、烯基、炔基、醚或硫醚键；α螺旋区I型包含序列R1-V L Xaa10 Xaa11 L S Q Xaa15 L Xaa17Xaa18 L Q T Xaa22 P Xaa24 T N T-R1(SEQ ID NO29)，其中Xaa10为Gly或Alb；Xaa11为Lys、Arg、Orn、hArg、Cit、hLys或Lys(for)；Xaa15为Glu或Phe；Xaa17为His或Aib；
Xaa18为Lys、Arg、Orn、hArg、Cit、hLys、Lys(for)、Lys(PEG5000)；Xaa22为Try或Leu；Xaa24为Arg或Pro；或R1不存在或包含1-4个附加氨基酸；和C端尾包含序列Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32 Xaa33 G Xaa35Xaa36 Xaa37 Xaa38(SEQ ID NO31)，其中Xaa28为Lys、Tyr或不存在；Xaa29为Ser、Pro或不存在；Xaa30为Ser、Pro、Arg或不存在；Xaa31为Thr或不存在；Xaa32为Asn或不存在；Xaa33为Val、Thr或不存在；Xaa35为Ser、Glu；Xaa36为Asn、Lys或Gly；Xaa37为Thr、Phe或Ala；Xaa38为Tyr Phe、Pro或不存在；前提条件是当环区来自降钙素或降钙素类似物、α螺旋区来自降钙素或降钙素类似物时，C端尾的最后一位不是Pro、Hyp、高丝氨酸(Hse)或Hse衍生物。
在再一方面，本发明的化合物包含氨基酸序列，其含有(a)包含Xaa1的环区；(b)α螺旋环II型；和(c)C端尾；其中环区Xaa1包含氨基酸序列X Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6Xaa7 Y，其中Xaa2为任意氨基酸或不存在；Xaa3为Ala、Gly、Ser、Asp或不存在；
Xaa4为Asn、Ala、Asp、Gly或不存在；Xaa5为Ala、Leu、Thr或Ser；Xaa6为Ala、Ser或Thr；和Xaa7为Ala、Ser、Val、Hse、(S)-2-氨基-3-羟基-甲基丁酸(Ahb)、(2S，3R)-2-氨基-3羟基-甲基戊酸(Ahp)、D-Thr、Thr或其衍生物；X和Y是能够产生键的氨基酸，为独立选择的具有下述侧链的残基所述侧链彼此化学键合从而形成分子内连接，例如二硫键；酰胺键；可形成环状内酰胺的烷基酸和烷基胺；烷基醛或烷基卤和烷基胺，其可缩合和被还原，从而形成烷基胺或亚胺键；或所述侧链可连接从而形成烷基、烯基、炔基、醚或硫醚键；α螺旋区II型包含序列R1-Xaa8 Xaa9 Xaa10 R Xaa12 Xaa13Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 P Xaa24TNT-R1(SEQ ID NO30)，其中Xaa8为Ala或Val；Xaa9为Thr、Met或Leu；Xaa10为Gln、Gly、His；Xaa12为Leu或Thr；Xaa13为Ala、Thr、Asn、Phe、Tyr、Ser或Thr；Xaa14为Asn、Arg、Ala、Asp、Glu、Gln、Thr或Gly；Xaa15为Phe、Leu、Ser、Glu、Ala、Asp或Tyr；Xaa16为Leu或Asp；Xaa17为Val、His、Ser、Phe或Alb；Xaa18为His、Arg、Lys、Orn、hArg、Cit、hLys、Lys(for)或Lys(PEG5000)；Xaa19为Leu、Ser或Phe；Xaa20为Gln或His；Xaa21为Thr或Asn；Xaa22为Tyr、Val、Phe、Leu或Met；
Xaa24为Arg或Pro；和R1不存在或包含1-4个附加氨基酸；和C端尾包含序列Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32 Xaa33 G Xaa35Xaa36 Xaa37 Xaa38(SEQ ID NO31)，其中Xaa28为Lys、Tyr或不存在；Xaa29为Ser、Pro或不存在；Xaa30为Ser、Pro、Arg或不存在；Xaa31为Thr或不存在；Xaa32为Asn或不存在；Xaa33为Val、Thr或不存在；Xaa35为Ser、Glu；Xaa36为Asn、Lys或Gly；Xaa37为Thr、Phe或Ala；Xaa38为Tyr Phe、Pro或不存在。
在再一方面，本发明的化合物包括SEQ ID NO40KCNTATCVLGKLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO41KCNTATCVLGRLSQELHRLQTLPRTNTGSNTYSEQ ID NO42KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPPTNTGSNTYSEQ ID NO43KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSNTYSEQ ID NO44KCNTATCVLGRLSQELHRLQTLPPTNVGSNTYSEQ ID NO45KCNTATCVLGRLANFLHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO46ACNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO47KCNAATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO48KCNTAACVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO49CANLSTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO50异己酰基-STAVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO51CSNASTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO52CSNLATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO53CSNLSACVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO54KCNTATCVLGRLSQELHKLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO55KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSGTPSEQ ID NO56CSALSTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO57Ac-(Agy)SNLST(Agy)VLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO58Ac-K(Agy)NTAT(Agy)VLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO59异己酰基-STAVL(Aib)RLSQELRLQTYPRTNTGSGTPSEQ ID NO60异己酰基-STAVLG[K(For)]LSQELH[K(For)]LQTYPRTNTGSGTP
SEQ ID NO61 异己酰基-STAVL(Aib)[K(For)]LSQEL(Aib)[K(For)]LQTYPRTNT GSNTYSEQ ID NO62 异己酰基-STAVL(Aib)[K(For)]LSQEL(Aib)[K(For)]LQTYPRTNV GSNTYSEQ ID NO63 KCNTATCLLQQLQKLLQKLKQYPRTNTGSNTYSEQ ID NO64 KCNTASCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO65 KCNTAVCVLGRLSQELHRLQTYPRTnTGSNTYSEQ ID NO66 KCNTATCVLGRLSQELHRYPRTNTGSNTYSEQ ID NO67 KCNTATCVLGK(For)LSQELHK(For)LQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO68 KCNTA(d-Thr)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO69 KCNTA(dAh)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO70 AC-ACNTATCVLGRLSQELHK(PEG5000)LQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO71 KCNTATCVLGRLSQELHRLQTLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO72 KCNTATCVLGRLSQELHRLQTLLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO73 KCNTATCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO74 KCNTSTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO75 KCNTATCATQRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO76 KCNTATCATQRLSQELHRLQTYPRTNVGSNTYSEQ ID NO77 KCNTSTCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSNTYSEQ ID NO78 KCNTA(Hse)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO79 KCNTA(Ahb)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO80 KCNTA(Ahp)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO81 KCNTAT(OPO3H2)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO82 KCNTATCVLG(Orn)LSQELH(Orn)LQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO83 KCNTATCVLG(Cit)LSQELH(Cit)LQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO84 KCNTATCVLG(高K)LSQELH(高K)LQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO85 L-辛基甘氨酸KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO86 N-[3，6]-二氧杂辛酰基-CNTATCVLGRLSQELHRLQTVPRTNTGSNTYSEQ ID NO87 KCNTATCMLGRYTQDFHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO88 DSNLSTKVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO89 KDNTATKVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO90 CNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO91 KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY(9Anc)SEQ ID NO92 KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY(L-辛基甘氨酸)SEQ ID NO93 N-异己酰基-KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO94 KCNTATCVLG(高R)LSQELH(高R)LQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO95 FCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO96 KCNTATCVLGRLSQELH(Cit)LQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO97 KCNTATCVLGRLSQELH(Orn)LQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO98 ICNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO99 1-辛基甘氨酸-CNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO100异己酰基-CNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO101KCNTATCVLG(Cit)LSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO102KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY(4ABU)SEQ ID NO103异己酰基-KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY(4ABU)SEQ ID NO104KCNTSTCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSEAFSEQ ID NO105KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPTNVGSEAFSEQ ID NO106KCNTATCVLGRLSRSLHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO107KCNTATCVTHRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
SEQ ID NO108KCNTATCVLGRLADFLHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO109CNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTSEQ ID NO110KCNTATCVLGRLSQELHRLQNFVPRTNTGSNTYSEQ ID NO111KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSETFSEQ ID NO112ACDTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO113KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSKAPSEQ ID NO114KCDTATCVTHRLAGLLSRSQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO115KCNTATCVLGRLADALHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO116KCNTATCVLGRLAAFLHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO117SCNTATCVLGRLADFLHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO118KCNTATCVLGRLSQELHRLQTMPRTNTGSNTYSEQ ID NO119KCNTATCVLGRLSQELHRLQTVPRTNTGSNTYSEQ ID NO120KCNTATCVLGRLNEYLHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO121SCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO122KCNTATCVLGRLTEFLHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO123KCNTATCVLGRLAEFLHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO124KCNTATCVLGRLTDYLHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO125KCNTATCVLGRLAQFLHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO126KCNTATCVLGRLADFLHRFQTFPRTNTGSNTYSEQ ID NO127KCNTATCVLGRLADFLHRFHTFPRTNTGSNTYSEQ ID NO128KCNTATCVLGRLADFLHRFQTFPRTNTGSGTPSEQ ID NO129CNTATCVLGRLADFLHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO130KCDTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO131KCNTATCVLGRLFDFLHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO132KCNTATCVLGRLAAALHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO133TCDTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO134CSNLSTCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSNTYSEQ ID NO135KCNTATCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSNTYSEQ ID NO136CSNLSTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTYSEQ ID NO137KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY在再一方面，本发明的化合物包括SEQ ID NO40-137的生物活性片段。生物活性片段可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸的缺失。在某些实施方案中，SEQ IDNO40-137的氨基酸序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个修饰，例如置换、插入、缺失和/或衍化。在其它实施方案中，SEQ ID NO40-137的氨基酸序列具有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰，例如置换、插入、缺失和或衍化。在本发明的再一方面，本发明的化合物包括与SEQ ID NO40-137中的任一个具有至少75、80、85、90、95或97％氨基酸序列同一性的那些化合物。同一性百分率通过用Vector NTI(Invitrogen；Carlsbad CA)中的AlignX模件分析来测定。意将所述的每个同一性百分率或提到的生物活性片段或修饰应用于每个单独的SEQ ID NO。例如，所述的每个实施方案、片段、修饰或同一性百分率都适用于SEQ ID NO40、41、42、43、44等，或任一组SEQ ID NO。而且，本发明的化合物包括实施例3中描述的化合物1-127。
在另一个一般方面，本发明的化合物可起本文公开的降钙素、胰岛淀粉样多肽和/或CGRP的至少一种生物作用的激动剂的作用，或结合胰岛淀粉样多肽、降钙素或CGRP受体中的至少一种。
在再一个一般方面，本发明的化合物可用于减少食物摄取、降低食欲、诱生饱感、降低营养物利用度、引起体重下降、影响机体组成、改变机体含能量或能量消耗、改善脂质谱(包括降低LDL胆固醇和甘油三酯水平和/或改变HDL胆固醇水平)、减慢胃肠动力、延迟胃排空、缓解餐后血糖漂移、防止或抑制胰高血糖素分泌和降低血压。
因此，在某些实施方案中，本发明的方法用于治疗或预防通过降低营养物利用度可减轻的病症或障碍，包括给予所述受试者治疗或预防有效量的本发明化合物。这样的病症和障碍包括但不限于进食障碍、胰岛素抵抗、肥胖、异常餐后高血糖、任何类型的糖尿病(包括I型、II型和妊娠期糖尿病)、代谢综合症、倾倒综合症、高血压、血脂异常、心血管疾病、高脂血症、睡眠呼吸暂停、癌症、肺动脉高压、胆囊炎和骨关节炎。
心血管病症或疾病的非限制性实例是高血压、心肌缺血和心肌再灌注。本发明的化合物还可用于治疗或预防与肥胖相关的其它病症，包括中风、癌症(例如子宫内膜癌、乳癌、前列腺癌和结肠癌)、胆囊疾病、睡眠呼吸暂停、生育力下降和骨关节炎，(参见Lyznicki等，Am.Fam.Phys.632185，2001)。在其它实施方案中，本发明的化合物可用于因审美原因而改变机体组成，以增强个体的身体能力或产生较瘦的肉源。
在另一个一般方面，本发明的化合物可用于抑制ghrelin分泌。因此，本发明的化合物可利用此机制治疗或预防ghrelin相关疾病，例如Prader-Willi综合症、所有类型的糖尿病及其并发症、肥胖、饮食过多、高脂血症或其它与营养过度相关的疾病。
在另一个一般方面，现在一般公认，胰岛淀粉样多肽和胰岛淀粉样多肽激动剂，包括本发明的化合物，可用于治疗或预防Barrett食管、胃食管反流病(GERD)及其相关疾病。这样的病症可包括但不限于胃灼热、与胃/肠内容物反流入口或肺相伴的胃灼热、吞咽困难、咳嗽、间歇性喘鸣和声带炎症(与GERD相关的疾病)、食管侵蚀、食管溃疡、食管狭窄、Barrett组织变形(以不正常上皮替代正常食管上皮)、Barrett腺癌和肺吸入。胰岛淀粉样多肽和胰岛淀粉样多肽激动剂，包括本发明化合物，具有抗分泌特性，例如抑制胃酸、抑制胆汁酸和抑制胰酶。而且，业已发现胰岛淀粉样多肽具有胃保护作用。因此，胰岛淀粉样多肽、胰岛淀粉样多肽激动剂和本发明化合物的这些特性可使其在如本文所述的Barrett食管和/或GERD及相关或伴随病症的治疗和预防中特别有用。
在另一个一般方面，本发明化合物可进一步用于治疗或预防胰腺炎、胰腺癌和胃炎。而且，本发明化合物可用于在经受了内窥镜下逆行性胆胰管造影(ERCP)的患者中治疗和预防胰腺炎。还已发现胰岛淀粉样多肽和胰岛淀粉样多肽激动剂(包括本发明化合物)在与促生长素抑制素组合时可具有令人惊奇的优良治疗作用。因此，在某些实施方案中，治疗或预防胰腺炎的方法包括给予受试者胰岛淀粉样多肽和胰岛淀粉样多肽激动剂(包括本发明化合物)，并给予受试者促生长素抑制素和促生长素抑制素激动剂。在其它实施方案中，治疗或预防胰腺炎的方法包括给予本发明化合物和给予促生长素抑制素和促生长素抑制素激动剂。
在另一个一般方面，本发明化合物还可用于降低骨吸收、降低血浆钙和诱发镇痛作用。因此，本发明化合物可用于治疗骨疾病，例如骨质减少和骨质疏松。在另外的实施方案中，本发明的化合物可用于治疗疼痛和疼痛性神经病。
在又一个一般方面，本发明的化合物可用作联合治疗的一部分。在某些实施方案中，本发明的化合物可与其它市售可得的膳食辅助剂或其它抗肥胖剂联用，作为实例，抗肥胖剂例如为PYY和PYY激动剂、GLP-1和GLP-1激动剂、DPPIV抑制剂、CCK和CCK激动剂、毒蜥外泌肽和毒蜥外泌肽激动剂，以及瘦蛋白和瘦蛋白激动剂。在其它实施方案中，本发明的化合物可与其它镇痛剂、免疫抑制剂或其它抗炎药联用。
在再一个一般方面，描述了含本发明化合物的新型药用组合物及其使用方法。在某些实施方案中，药用组合物可包含至少0.01％-5％w/v。在某些实施方案中，组合物的pH可为约3.0至约6.0。在某些实施方案中，缓冲液可为乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐。在某些实施方案中，组合物进一步包含碳水化合物或多元醇张力剂(tonicifier)。在某些实施方案中，组合物进一步包含防腐剂，其选自间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸酯和苯酚。在另外的实施方案中，以约0.05mg/kg至约2mg/kg的剂量给予所述化合物。例如，日剂量可为每天1μg至约5mg。在某些实施方案中，代表性的递药方式可为注射、输注、吸收(粘膜)和吸入。给药途径可为肌内、静脉内、皮下、经皮、经粘膜、口服、鼻内或通过肺吸入给药。
还设想将编码本文描述氨基酸序列的核苷酸、含所述核苷酸的载体、用于扩增核苷酸和/或表达核苷酸所编码多肽的宿主细胞、针对新型化合物的抗体及其在受试者中筛选或检测/诊断如本文所述病症的用途作为本发明的一部分。
参照以下的优选实施方案和详述可更清楚地理解本发明的这些方面和其它方面。
附图简述

图1表明了在整夜禁食的小鼠中食物消耗对本发明代表性化合物剂量的剂量依赖性下降(食物摄取实验)。
图2A图示了在增肥(膳食诱导性肥胖或DIO)大鼠中于2周周期内持续外周输注溶媒或本发明代表性化合物的热量摄取降低。
图2B图示了在对应时间周期内体重的下降。
图3说明了本发明代表性化合物对机体组成的作用。
图4A说明了本发明代表性化合物对胃排空的作用。
图4B说明了本发明代表性化合物的低血钙作用。
图5说明了本发明代表性化合物对甘油三酯的作用。
图6A-6B说明了随时间变化的本发明代表性化合物对甘油三酯的作用。
图7A-7E说明了随时间变化的本发明代表性化合物对甘油三酯的剂量作用。
图8A说明了胰岛淀粉样多肽对ghrelin的作用。
图8B-8C说明了胰岛淀粉样多肽对ghrelin的作用。
图9A说明了本发明代表性化合物对胰腺功能标记物的作用。
图9B说明了本发明代表性化合物对胰腺功能标记物的作用。
图10A说明了胰岛淀粉样多肽对胃酸分泌的作用。
图10B说明了胰岛淀粉样多肽对胃酸分泌的剂量反应作用。
图11A说明了胰岛淀粉样多肽的胃保护作用。
图11B说明了胰岛淀粉样多肽的胃保护作用。
图11C描绘了胰岛淀粉样多肽的剂量反应曲线。
发明详述本发明涉及新型胰岛淀粉样多肽家族化合物或激动剂(也称为新型化合物和本发明化合物)。这些新型化合物可用于治疗或预防代谢疾病、血管疾病、肾病和/或胃肠疾病之类的病症。先前章节提供了化合物的结构。新型化合物可进一步被描述为具有所需特征，例如在代谢疾病和障碍以及以上提及的那些疾病的治疗和/或预防中具有和胰岛淀粉样多肽、降钙素和/或CGRP相比相当或更高的活性。在其它实施方案中，和胰岛淀粉样多肽、降钙素或CGRP相比，本发明的化合物可不具有相当或更高的活性，但可具有增加的稳定性和溶解性、较少的副作用、组合的生物活性、较快的活性发作、较长的活性时程和/或易于生产、配制或使用。
所谓胰岛淀粉样多肽活性指化合物表现出类似于胰岛淀粉样多肽的生理特征，例如本说明书中描述的那些生理特征，例如减少食物摄取。本发明化合物可与胰岛淀粉样多肽受体或者胰岛淀粉样多肽自身可与之相互作用而激发生物反应(例如减少食物摄取)的其它一种或多种受体结合或以其它方式直接或间接相互作用。
所谓降钙素活性指化合物表现出类似于降钙素的生理特征，例如本说明书中描述的那些生理特征，例如抑制破骨细胞功能。本发明化合物可与CT受体或者降钙素自身可与之相互作用而激发生物反应(例如抑制成骨细胞功能)的其它一种或多种受体结合或以其它方式直接或间接相互作用。
所谓CGRP活性指化合物表现出类似于CGRP的生理特征，例如本说明书中描述的那些生理特征，例如激发血管舒张作用。本发明的化合物可与CGRP受体或者CGRP自身可与之相互作用而激发生物反应(例如激发血管舒张作用)的其它一种或多种受体结合或以其它方式直接或间接相互作用。
本发明化合物还可以包括本文所述较大肽的保有活性的生物活性片段。因此，本发明化合物具有的所需活性的实例包括(1)在食物摄取、胃排空、胰腺分泌、血压、心率或体重减轻实验中具有类似于胰岛淀粉样多肽、降钙素或CGRP的活性，和/或(2)在受体结合实验中结合胰岛淀粉样多肽、降钙素或CGRP。某些代表性实验提供于实施例1。
本发明化合物可进一步具有特定的结合模式。例如，业已报道，借助于与两种密切相关的II型G蛋白偶联受体(GPCR)-降钙素受体(CTR)和降钙素受体样受体(CRLR)结合，介导胰岛淀粉样多肽、降钙素和CGRP的生物学效应。克隆和功能研究表明，CGRP和胰岛淀粉样多肽与CTR或CRLR和受体活性修饰蛋白(RAMP)不同组合的相互作用。许多细胞表达多种RAMP。一般认为，RAMP和CTR或CRLR的共表达是产生降钙素、CGRP和胰岛淀粉样多肽功能受体所必需的。RAMP家族包含3个成员(RAMP-1、-2和-3)，其享有的序列同一性低于30％，但具有共同的拓扑组构。CRLR和RAMP1共表达导致形成CGRP受体，CRLR和RAMP3共表达也导致形成CGRP受体。hCTR2和RAMP1共表达导致形成胰岛淀粉样多肽和CGRP受体。hCTR2和RAMP3共表达导致形成胰岛淀粉样多肽受体。
因此，用于本发明方法的本发明化合物可表现出与胰岛淀粉样多肽家族中的胰岛淀粉样多肽、CGRP和降钙素受体的亲和性。本发明化合物可显示出结合胰岛淀粉样多肽受体的显著亲和性，以及结合其它受体(例如降钙素和CGRP受体)的能力。本发明化合物可以高于20nM、10nM、5nM、1nM的亲和性结合胰岛淀粉样多肽受体，更优选以高于0.10nM的亲和性结合胰岛淀粉样多肽受体。另外，本发明化合物还可以相似的亲和性结合降钙素和CGRP受体，但与CGRP受体的亲和性较低。在其它实施方案中，本发明化合物可以高于20nM、10nM或1nM的亲和性结合降钙素受体。在另外的实施方案中，本发明化合物可以高于约1μM、700nM或500nM的亲和性结合CGRP受体。本发明化合物还可结合所有三种受体至不同的程度。因此，设想本发明化合物可具有对本文所述激素的各个受体具有特定亲和性的结合谱。
就减少食物摄取和本文(例如表1)描述的一种其它活性而言，本发明化合物，包括式I、II、III、IV的那些化合物；SEQ ID NO40-137的生物活性片段；与SEQ ID NO40-137的任一个具有至少75％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％或97％氨基酸序列同一性的那些化合物及其生物活性片段，可保有胰岛淀粉样多肽、降钙素、CGRP或具有SEQ ID NO40-137序列的化合物或实施例3中的化合物1-137的至少约25％的生物活性，优选约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的生物活性。在另一个实施方案中，本发明化合物具有改良的生物活性。优选地，就减少食物摄取和本文(例如表1)描述的一种其它活性而言，新型化合物具有胰岛淀粉样多肽、降钙素、CGRP或具有SEQ ID NO40-137序列的化合物或实施例3中的化合物1-137的生物活性的至少约110％、125％、130％、140％、150％、200％或更高。例如，所需的本发明化合物是在本文描述的一种实验(食物摄取、体重减轻实验、胃排空、甘油三酯、胰腺炎、ghrelin或钙)中所具有的活性高于胰岛淀粉样多肽、降钙素或CGRP在相同实验中的活性的化合物。
仅作为示例，所需的本发明化合物可表现出减少累积食物摄取的能力，其与溶媒给予相比，其减小超过5％，优选超过15％，更优选超过25％，再更优选超过35％或40％，最优选超过50％。
在再一个一般方面，本发明化合物可用于减少食物摄取、降低食欲、诱生饱感、降低营养物利用度、引起体重下降、影响机体组成、改变机体含能量或能量消耗、改善脂质谱(包括降低LDL胆固醇和甘油三酯水平和/或改变HDL胆固醇水平)、减慢胃肠动力、延迟胃排空、缓解餐后血糖漂移、防止或抑制胰高血糖素分泌和降低血压。至少在实施例3、4、5、6和7中描述了关于对食物摄取、体重减轻、胃排空、甘油三酯和机体组成作用的代表性实验。
因此，在某些实施方案中，本发明方法用于治疗或预防通过降低营养物利用度可减轻的病症或障碍，包括给予所述受试者治疗或预防有效量的本发明化合物。这样的病症和障碍包括但不限于进食障碍、胰岛素抵抗、肥胖、异常餐后高血糖、任何类型的糖尿病(包括I型、II型和妊娠期糖尿病)、代谢综合症、倾倒综合症、高血压、血脂异常、心血管疾病、高脂血症、睡眠呼吸暂停、癌症、肺动脉高压、胆囊炎和骨关节炎。
心血管病症或疾病的非限制性实例是高血压、心肌缺血和心肌再灌注。本发明化合物还可用于治疗或预防与肥胖相关的其它病症，包括中风、癌症(例如子宫内膜癌、乳癌、前列腺癌和结肠癌)、胆囊疾病、睡眠呼吸暂停、生育力降低和骨关节炎，(参见Lyznicki等，Am.Fam.Phys.632185，2001)。在其它实施方案中，本发明化合物可用于因审美原因而改变机体组成，以增强个体的身体能力或产生较瘦的肉源。
在另一个一般方面，本发明化合物可用于抑制ghrelin分泌。因此，本发明化合物可利用此机制治疗或预防ghrelin相关疾病，例如Prader-Willi综合症、所有类型的糖尿病及其并发症、肥胖、摄食过量、高脂血症或其它与营养过度相关的疾病。对ghrelin作用的代表性实验描述于实施例8。
在另一个一般方面，现在一般公认，胰岛淀粉样多肽和胰岛淀粉样多肽激动剂，包括本发明化合物，可用于治疗或预防Barrett食管、胃食管反流病(GERD)及其相关疾病。这样的病症可包括但不限于胃灼热、与胃/肠内容物反流入口或肺相伴的胃灼热、吞咽困难、咳嗽、间歇性喘鸣和声带炎症(与GERD相关的疾病)、食管侵蚀、食管溃疡、食管狭窄、Barrett组织变形(以不正常上皮替代正常食管上皮)、Barrett腺癌和肺吸入。胰岛淀粉样多肽和胰岛淀粉样多肽激动剂，包括本发明化合物，具有抗分泌特性，例如抑制胃酸、抑制胆汁酸和抑制胰酶。因此，胰岛淀粉样多肽、胰岛淀粉样多肽激动剂和本发明化合物的这些特性可使其在如本文所述的Barrett食管和/或GERD及相关或伴随病症的治疗和预防中特别有用。显示对胃酸分泌的作用和胃保护作用的代表性实验描述于实施例10和11。
在另一个一般方面，本发明化合物可进一步用于治疗或预防胰腺炎、胰腺癌和胃炎。而且，本发明化合物可用于在经受内窥镜下逆行性胆胰管造影(ERCP)的患者中治疗和预防胰腺炎。还已发现胰岛淀粉样多肽和胰岛淀粉样多肽激动剂(包括本发明化合物)在与促生长素抑制素组合时可具有令人惊奇的优良治疗作用。因此，在某些实施方案中，治疗或预防胰腺炎的方法包括给予受试者胰岛淀粉样多肽和胰岛淀粉样多肽激动剂(包括本发明化合物)，并给予受试者促生长素抑制素和促生长素抑制素激动剂。在其它实施方案中，治疗或预防胰腺炎的方法包括给予本发明化合物和给予促生长素抑制素和促生长素抑制素激动剂。显示对胰腺功能的作用的代表性实验描述于实施例9。
在另一个一般方面，本发明的化合物还可用于降低骨吸收、降低血浆钙和诱发镇痛作用。因此，本发明化合物可用于治疗骨疾病，例如骨质减少和骨质疏松。在另外的实施方案中，本发明化合物可用于治疗疼痛和疼痛性神经病。显示对钙水平作用的代表性实验提供于实施例6。
在本发明方法中，所述多肽可单独地或与一种或多种对降低营养物利用度具有长效或短效作用的其它化合物和组合物(包括但不限于含胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物激动剂、鲑鱼降钙素、缩胆囊素(CCK)或CCK激动剂、瘦蛋白(OB蛋白)或瘦蛋白激动剂、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物激动剂、GLP-1或GLP-1类似物激动剂、DPPIV抑制剂、PYY或PYY类似物、AFP-6(垂体中间叶激素)或AFP-6激动剂、Urocortin或Urocortin激动剂或者肾上腺髓质素或肾上腺髓质素激动剂的其它化合物和组合物)一起给予。合适的胰岛淀粉样多肽激动剂包括例如[25，28，29 Pro-]人胰岛淀粉样多肽(也称为“普兰林肽”，述于美国专利第5,686,511和5,998,367号)。使用的CCK优选为CCK八肽(CCK-8)。瘦蛋白论述于例如(Pelleymounter，Cullen等，Science 269540-543(1995)；Halaas，Gajiwala等，Science 269543-6(1995)；Campfield，Smith等，Science 269546-549(1995))。合适的毒蜥外泌肽包括毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4，毒蜥外泌肽激动剂化合物包括例如描述于PCT公开说明书WO 99/07404、WO99/25727和WO 99/25728的那些化合物。合适的PYY多肽和类似物包括描述于美国申请第[代理人申请案编号18528.662和18528.663]的那些化合物。
尽管“肥胖”一般定义为身体质量指数超过30，但对本说明书来说，需要或希望减轻体重的任一受试者，包括身体质量指数低于30的那些受试者，都包括在“肥胖”范围内。
本发明化合物的制备可使用本领域已知的标准重组技术或化学肽合成技术(例如使用自动化或半自动化肽合成仪)，或这二者，制备本文描述的本发明化合物。同样，可使用标准化学、生物化学或体内方法，生产本发明多肽的衍生物。
可按照常规技术，在溶液中或固相支持体上合成本发明化合物。各种自动化合成仪可商购获得，并可按照已知的方法使用。参见例如Stewart和Young，Solid Phase Peptide Synthesis，第2版，PierceChemical Co.(1984)；Tam等，J.Am.Chem.Soc.1056442(1983)；Merrifield，Science 232341-7(1986)；以及Barany和Merrifield，ThePeptides，Gross和Meienhofer编辑，Academic Press，New York，1-284(1979)。可用使用NMP/HOBt(选项1)系统的自动化肽合成仪(例如430A型，Applied Biosystems Inc.，Foster City，California)和包含加帽的tBoc或Fmoc化学法(参见关于ABI 430A肽合成仪的AppliedBiosystems用户指引，1.3B版，1988年7月1日，第6节，49-70页，Applied Biosystems，Inc.，Foster City，California)进行固相肽合成。还可使用Advanced ChemTech合成仪(MPS 350型，Louisville，Kentucky)组装肽。可使用例如Waters Delta Prep 3000系统和C4、C8或C18制备柱(10μ，2.2×25cm；Vydac，Hesperia，California)，通过RP-HPLC(制备型和分析型)纯化肽。可容易地合成活性蛋白，然后用设计用于鉴别反应性肽的筛选实验对活性蛋白进行筛选。
除了经典的按步合成以外，已开发了汇集性(convergent)固相肽合成(也称为杂种法或片段缩合法)，用于制备复杂和困难的肽和小蛋白。按照该方法，或者在固相支持体上，或者在溶液中，将覆盖整个肽序列并在固相上制备的适当受保护的肽片段缩合成目标肽。新树脂和树脂处理的可利用性已开启了通过固相技术快速合成完全受保护的肽节段的可能性。该方法对生产大分子特别有吸引力，因为其组合了固相和液相法二者的优势。生产周期比液相方法短，产量和纯度通常更高。另外，放大试验更容易一些，避免了许多在长肽固相合成中经常遇到的聚集问题。
在另一个实施方案中，合成策略使用汇集片段缩合。汇集片段缩合是一种与标准固相或标准液相合成相比更优越的生产高质量大肽的方法。使用这样的方法可平行合成片段，缩减合成时间且确保质量。随着肽变得越长，副反应和不完全合成的风险就越高。业已确认，本发明的肽序列可具有理想定位的甘氨酸和脯氨酸，其促成了片段化法，因为这两种氨基酸在片段偶合过程中不能外消旋，并显示出非常有效的缩合率。除了直接固相合成存在较大放大生产问题并因此可能不适于大规模合成的事实以外，片段化法更加可控，提供了纯化中间体的机会。二硫键仅位于第一个片段中，并因此可在片段阶段用完全受保护的前体形成。因为该方法在策略和规模方面存在很多优势，所以将缩短合成时间，因为所有的片段都可同时合成。这是一个最大限度降低风险和降低成本的完美方法。为显示能允许该策略执行的理想片段的骨架结构，描述了以下的片段片段1Boc-X(Boc)-X-X(Trt)-X(tBu)-X-X(tBu)-X-X-X-Gly-OH环状(环化应发生在片段偶合之前)片段2Fmoc-K(Pbf)-X-X(tBu)-X(Trt)-X(OtBu)-X-X(Trt)-X(Pbf)-X-X(Trt)-X(tBu)-X(tBu)-Pro-OH片段3Fmoc-X(Pbf)-X(tBu)-X(Trt)-X(tBu)-X-X(tBu)-X(Trt)-Thr(tBu)-OH片段4H-Tyr(tBu)-NH2根据这些讲述，本领域技术人员能够理解哪些本发明化合物用于此合成应当是理想的。不断发展的技术使仅具有3个片段成为可能，即第4个片段不需要独立于第3个片段产生。
另一方面，可通过本领域众所周知的重组技术生产本发明化合物。参见例如Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor(1989)。通过重组技术产生的这些多肽可由多核苷酸表达。这些多核苷酸序列可掺入有利于mRNA在微生物宿主中转录和翻译的密码子。按照本领域众所周知的方法，可容易地构建如此生产的序列。参见例如WO 83/04053。以上多核苷酸还可任选地编码N端甲硫氨酰残基。可利用本领域已知的方法制备用于本发明的非肽类化合物。例如，可使用本领域已知的方法制备含磷酸的氨基酸和含这些氨基酸的肽。参见例如Bartlett和Landen，BioorgChem.14356-77(1986)。
可利用各种各样的表达载体/宿主系统，以包含和表达新型化合物编码序列。这些系统包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)转染或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(例如COS-7)、WI 38、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562知293细胞。下文描述了用于蛋白重组表达的代表性方案。
因此，本发明提供的多核苷酸序列可用于产生新且有用的病毒和质粒DNA载体、新且有用的转化和转染原核和真核宿主细胞(包括在培养物中生长的细菌、酵母和哺乳动物细胞)以及新且有用的能够表达本发明多肽的此宿主细胞的培养生长方法。编码本文的新型化合物的多核苷酸序列还可用于基因治疗。
本发明还提供新型化合物的重组DNA生产方法。提供由含新型化合物编码核酸的宿主细胞生产多肽的方法，其包括(a)在有利于表达此DNA分子的条件下培养含该此多肽编码多核苷酸的所述宿主细胞；和(b)获得所述新型化合物。
宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，包括细菌、哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴细胞、幼仓鼠肾细胞、癌细胞或其它细胞)、酵母细胞和昆虫细胞。
用于表达重组蛋白的哺乳动物宿主系统对本领域技术人员来说也是众所周知的。可根据加工已表达蛋白或产生某些用于提供蛋白活性的翻译后修饰的特定能力，选择宿主细胞株。这样的多肽修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割“前原”形式蛋白的翻译后加工对正确的插入、折叠和/或功能可能也很重要。不同的宿主细胞，例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等，对这样的翻译后活性具有特化细胞机器和特征机制，可对宿主细胞进行选择，以确保所导入的外源蛋白的正确修饰和加工。
或者，可使用酵母系统生产本发明的新型化合物。通过PCR扩增新型化合物编码DNA的编码区。使用一种含α交配型因子基因的核苷酸1-20的引物和与该基因的核苷酸255-235互补的另一种引物，在PCR反应中由酵母基因组DNA扩增编码酵母前-原-α前导序列的DNA(Kurjan和Herskowitz，Cell，30933-43(1982))。将前-原-α前导编码序列和新型化合物编码序列片段连接入含酵母乙醇脱氢酶(ADH2)启动子的质粒中，使得该启动子引导由融合至成熟新型化合物的前-原-α因子组成的融合蛋白的表达。如Rose和Broach，Meth.Enz.185234-79，Goeddel编辑，Academic Press，Inc.，San Diego，California(1990)所讲述，载体进一步包含克隆位点下游的ADH2转录终止子、酵母“2-μ”复制起点、酵母leu-2d基因、酵母REP1和REP2基因、大肠杆菌β-内酰胺酶基因和大肠杆菌复制起点。β-内酰胺酶和leu-2d基因分别供在细菌和酵母中进行选择。leu-2d基因还有利于增加质粒在酵母中的拷贝数，以诱导较高水平的表达。REP1和REP2基因编码参与调节质粒拷贝数的蛋白。
使用已知方法，例如乙酸锂处理(Steams等，Meth.Enz.185280-97(1990))，将在前段中描述的DNA构建物转化入酵母细胞中。当生长培养基中的葡萄糖耗尽时诱导ADH2启动子(Price等，Gene 55287(1987))。前-原-α序列影响细胞分泌融合蛋白。与此相伴的是酵母KEX2蛋白从本发明成熟化合物切割前-原序列(Bitter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 815330-4(1984))。
还可以使用可商购的表达系统，例如毕赤酵母(Pichia)表达系统(Invitrogen，San Diego，California)，按照生产商的说明，在酵母中重组表达本发明化合物。此系统也依靠前-原-α序列引导分泌，但插入片段的转录在甲醇诱导时由醇氧化酶(AOX1)驱动。通过例如用于由细菌和哺乳动物细胞上清液纯化新型化合物的方法，由酵母生长培养基纯化所分泌的新型化合物。
或者，可将编码新型化合物的DNA克隆入杆状病毒表达载体pVL1393(PharMingen，San Diego，California)中。然后按照生产商的指引(PharMingen)，使用含此新型化合物的载体感染无sF9蛋白培养基中的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞，并生产重组蛋白。使用肝素-Sepharose柱(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)和串接的分子筛柱(Amicon，Beverly，Massachusetts)由培养基中纯化和浓缩蛋白，并重悬浮在PBS中。SDS-PAGE分析显示单一条带，确证蛋白大小，用Proton 2090肽测序仪进行Edman测序确认其N端序列。
例如，可将所需新型化合物的编码DNA序列克隆入含所需启动子和任选的前导序列的质粒中(参见例如Better等，Science 2401041-3(1988))。该构建物的序列可通过自动化测序确认。然后使用采用CaCl2温育和细菌热激处理的标准方法将质粒转化入大肠杆菌菌株MC1061中(Sambrook等，出处同上)。转化的细菌在补加羧苄青霉素的LB培养基中培养，通过在合适的培养基中生长诱导表达蛋白生产。如果存在前导序列，则前导序列将影响成熟新型化合物的分泌，并在分泌过程中被切除。利用下文描述的方法由细菌培养基中纯化分泌的重组蛋白。
或者，本发明的多肽可在昆虫系统中表达。用于蛋白表达的昆虫系统是本领域技术人员周知的。在一个这样的系统中，使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)作为在草地贪夜蛾细胞或粉夜蛾属(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因的载体。将新型化合物编码序列克隆入病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)中，并处于多角体蛋白启动子控制之下。新型化合物的成功插入将使多角体蛋白基因失活，产生没有外壳蛋白包被的重组病毒。然后使用重组病毒感染其中表达多肽的草地贪夜蛾细胞或粉夜蛾属幼虫(Smith等，J.Virol.46584(1983)；Engelhard等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913224-7(1994))。
在另一个实施例中，可通过PCR扩增编码新型化合物的DNA序列，并将其克隆入合适的载体中，例如pGEX-3X(Pharmacia，Piscataway，New Jersey)。pGEX载体设计用于生产融合蛋白，其包含由载体编码的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和由插入到载体克隆位点中的DNA片段编码的蛋白。可产生含例如合适的切割位点的PCR引物。然后可由融合蛋白的GST部分切割重组融合蛋白。将pGEX-3X/PYY类似物多肽构建物转化入大肠杆菌XL-1 Blue细胞(Stratagene，La Jolla，California)中，分离单个转化子，并在LB培养基(补加羧苄青霉素)中于37℃培养至600nm波长的光密度为0.4，接着在0.5mM异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri)存在下再温育4小时。纯化单个转化子的质粒DNA，并使用自动化测序仪部分测序，以确认存在正确方向的目的基因插入片段。
预期在细菌中可作为不溶性内含体生产的融合蛋白可如下纯化。通过离心收集细胞；用0.15M NaCl、10mM Tris(pH8)、1mMEDTA清洗；并用0.1mg/mL溶菌酶(Sigma Chemical Co.)于室温处理15分钟。超声处理澄清裂解物，通过以12,000×g离心10分钟沉淀细胞碎片。将含融合蛋白的沉淀重悬浮在50mM Tris(pH8)和10mM EDTA中，铺在50％甘油上，并以6000×g离心30分钟。沉淀重悬浮在无Mg++和Ca++的标准磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。通过在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中分级分离重悬浮沉淀进一步纯化融合蛋白(Sambrook等，出处同上)。凝胶浸泡在0.4M KCl中，以显现蛋白，切下蛋白，并在没有SDS的凝胶电泳缓冲液中电洗脱。如果GST/新型化合物融合蛋白在细菌中作为可溶性蛋白生产，则其可使用GST纯化模块(GST Purification Module)(Pharmacia Biotech)纯化。
融合蛋白可进行消化，以切开GST和成熟新型蛋白。消化反应物(20-40μg融合蛋白、20-30单位人凝血酶(4000U/mg(Sigma)的0.5mL PBS溶液)于室温温育16-48小时，并上变性SDS-PAGE凝胶，以分级分离反应产物。将凝胶浸泡在0.4M KCl中，以显现蛋白条带。使用自动化测序仪(Applied Biosystems 473A型，Foster City，California)，通过部分氨基酸序列分析，可确认对应于新型化合物预期分子量的蛋白条带的身份。
在特别优选的新型化合物重组表达方法中，可通过磷酸钙法，用在pCMV载体(5′CMV启动子，3′HGH聚腺苷酸序列)和pSV2neo(含neo抗性基因)中含新型化合物DNA的质粒共转染293细胞。优选地，载体应当在转染前用ScaI线性化。同样，可使用替代性构建物，其使用掺有neo基因的相似pCMV载体。通过在含0.5mg/mL G418(新霉素样抗生素)的生长培养基中有限稀释10-14天，由单细胞克隆选择出稳定细胞系。通过ELISA或蛋白质印迹，对细胞系进行新型化合物表达筛选，并扩增高表达细胞系，以用于大规模生长。
优选将转化细胞用于长期、高产的蛋白生产，因此需要稳定表达。一旦应用含选择标记以及所需表达盒的载体转化这样的细胞，就让细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将其转换至选择培养基。选择标记用于赋予选择抗性，其存在使得成功表达所导入序列的细胞可生长和回收。可使用适于该细胞的组织培养技术增殖稳定转化细胞的抗性群(Resistant clumps)。
可使用许多选择系统回收已转化用于重组蛋白生产的细胞。这样的选择系统包括但不限于分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。另外，抗代谢物抗性可用作dhfr、gpt、neo、also和hygro的选择基础，dhfr赋予对氨甲喋呤的抗性；gpt赋予对霉酚酸的抗性；neo赋予对氨基糖苷G418的抗性；also赋予对氯磺隆的抗性；而hygro赋予对潮霉素的抗性。其它可使用的选择基因包括trpB或hisD，trpB允许细胞利用吲哚代替色氨酸，hisD允许细胞利用组氨醇代替组氨酸。产生用于鉴别转化子的目测指示的标记包括花色素苷、β-葡糖醛酸酶及其底物GUS和荧光素酶及其底物荧光素。
可使用自动化肽合成和重组技术二者的组合生产本发明的多种新型化合物。例如，本发明的化合物可包含在PEG化之前的修饰组合，包括缺失、置换和插入。这样的化合物可分阶段生产。在第一阶段，可通过如所述的重组技术生产含缺失、置换、插入及其任意组合的修饰的中间体形式的新型化合物。接着，在如下所述的可选纯化步骤后，通过用合适的PEG化试剂(例如得自Nectar TransformingTherapeutics，San Carlos，California)通过化学修饰PEG化中间体多肽，以产生所需化合物。本领域技术人员会认识到，上述步骤可推广应用于含修饰组合的新型化合物，所述修饰选自缺失、置换、插入、衍化以及本领域众所周知和本发明设想的其它修饰手段。
可能需要纯化本发明生产的新型化合物。肽纯化技术是本领域技术人员众所周知的。这些技术包括在一个水平上将细胞环境粗分离为多肽和非多肽级分。在将所述多肽和其它蛋白分离后，可使用层析和电泳技术进一步纯化目的多肽，以达到部分或完全纯化(或纯化至均一)。特别适合于纯肽制备的分析型方法是离子交换层析、排阻层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦。特别有效的肽纯化法是反相HPLC，接着通过液相色谱/质谱法(LC/MS)和基质辅助激光解吸离子化(MALDI)质谱法表征纯化产物。通过确定氨基酸分析获得对纯度的额外证实。
本发明的某些方面涉及所编码蛋白或肽的纯化，在具体的实施方案中，涉及所编码蛋白或肽的基本纯化。适用于肽纯化的各种技术是本领域技术人员周知的。这些技术包括例如用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀；热变性，接着离心；层析步骤，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、反相层析、羟磷灰石层析和亲和层析；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些技术和其它技术的组合。如本领域一般所知晓的，人们相信可改变进行各种纯化步骤的顺序，或某些步骤可省略，仍可形成适于制备基本纯化的蛋白或肽的方法。纯化多肽的方法可见于美国专利第5,849,883号。这些文件描述了分离和纯化G-CSF组合物的特定代表性方法，这些方法可用于分离和纯化本发明的新型化合物。在已知本发明公开内容的情况下，本领域技术人员显然会意识到可使用众多纯化技术由给定来源纯化多肽。另外，设想可使用阴离子交换和免疫亲和层析的组合生产本发明的纯化化合物。
因此，短语“分离的多肽或肽”指基本上无细胞物质或蛋白来源细胞或组织源的其它杂质蛋白的多肽或肽，或在化学合成时基本上无化学前体或其它化学物质的多肽或肽。表述“基本上无细胞物质”包括其中所述蛋白与分离或重组产生其的细胞的细胞组分分离的蛋白制品。因此，基本无细胞物质的蛋白包括异源蛋白(在本文也称为“杂质蛋白”)低于约30％、20％、10％或5％(干重)的蛋白制品。当蛋白、肽及其片段重组产生时，优选地其还基本无培养基，即培养基占蛋白制品体积的不足约20％、10％或5％。当蛋白通过化学合成产生时，优选地其基本无化学前体或其它化学物质，即其与参与蛋白合成的化学前体或其它化学物质分离。因此，这样的蛋白制品的化学前体或目的多肽以外的化合物低于约30％、20％、10％、5％(干重)。在优选的实施方案中，纯化或分离的制品没有一般生产蛋白的相同动物的任何杂质蛋白，这可通过例如在非人细胞中重组表达的人蛋白来完成。
某些优选的合成方法描述于共同受让的专利中请第454,533号(1999年12月6日提交)，其全文在此引入作为参考。
对于所有适应症，可以单剂量或分剂量或受控持续释放的约1μg/天至约5mg/天的剂量，或以每剂约0.01μg/kg至约500μg/kg，更优选约0.05μg/kg至约250μg/kg，最优选低于约50μg/kg，外周给予新型化合物。剂量可一天给予1、2、3或4次。当然，在这些范围中的剂量随每种类似物或衍生物的效力而变化，剂量可由本领域技术人员确定。
在本发明方法中，所述多肽可单独地或与一种或多种对降低营养物利用度具有长效或短效作用的其它化合物和组合物(包括但不限于含胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物激动剂、鲑鱼降钙素或鲑鱼降钙素激动剂、缩胆囊素(CCK)或CCK激动剂、瘦蛋白(OB蛋白)或瘦蛋白激动剂、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽类似物激动剂、GLP-1或GLP-1类似物激动剂或者PYY或PYY类似物或PYY相关多肽的其它化合物和组合物)一起给予。合适的胰岛淀粉样多肽激动剂包括例如[25，28，29 Pro-]人胰岛淀粉样多肽(也称为“普兰林肽”，述于美国专利第5,686,511和5,998,367号)。使用的CCK优选为CCK八肽(CCK-8)。瘦蛋白论述于例如(Pelleymounter，Cullen等，Science 269540-543(1995)；Halaas，Gajiwala等，Science 269543-6(1995)；Campfield，Smith等，Science 269546-549(1995))。合适的毒蜥外泌肽包括毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽-4，毒蜥外泌肽激动剂化合物包括例如描述于PCT公开WO 99/07404、WO 99/25727和WO 99/25728的那些化合物。合适的PYY多肽和类似物包括描述于美国申请第[代理人申请案编号18528.740和18528.723]的那些化合物。
药用组合物本发明还涉及药用组合物，其包含治疗或预防有效量的至少一种本发明化合物或其药学可接受的盐，连同药学可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅助剂和/或用于传递新型化合物的载体。这样的组合物可包括各种缓冲内容物(例如乙酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、TRIS)、pH和离子强度的稀释剂；添加剂，例如表面活性剂和增溶剂(例如山梨糖醇酐一油酸酯、卵磷脂、Pluronics、Tween 20和Tween 80、Polysorbate 20和Polysorbate 80、丙二醇、乙醇、PEG-40、十二烷基硫酸钠)、抗氧化剂(例如一硫代甘油、抗坏血酸、乙酰基半胱氨酸、亚硫酸盐(亚硫酸氢盐和偏亚硫酸氢盐))、防腐剂(例如苯酚、间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸(甲、丙、丁)酯、苯扎氯铵、三氯叔丁醇、硫柳汞、苯汞盐(乙酸盐、硼酸盐、硝酸盐))和张力剂/膨松剂(甘油、氯化钠、甘露醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖)；将材料掺入到特定聚合化合物制品中，例如聚乳酸、聚乙醇酸等；或与脂质体结合。这样的组合物将影响本发明化合物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见例如Remington′sPharmaceutical Sciences 1435-712，第18版，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1990)。
一般来说，鉴于本发明化合物的药理学特性，可以和胰岛淀粉样多肽相同的方式使用本发明化合物。一个优选用途是外周给予此新型化合物，用于治疗或预防代谢疾病和障碍。具体地说，本发明化合物具有作为降低营养物利用度、减少食物摄取和影响体重下降的物质的活性。
本发明的化合物可配制用于外周给予，包括配制用于注射、口服给药、鼻内给予、肺部给予、局部给予或本领域技术人员认可的其它给药类型。制剂的实例可见于美国专利6,410,511号和专利申请第10/159,779号，其全文在此引入作为参考。更具体地说，可通过任何普通途径给予本发明的药用组合物，只要经过该途径可到达靶组织。在一个优选实施方案中，可通过任何常规外周方法，例如通过静脉内、皮内、肌内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼球后、肺内(例如末端释放)；通过口服、舌下、鼻、肛门、阴道或经皮传递，或通过在特定部位手术移植，将药用组合物导入到受试者中。治疗可由一段时间内的单剂量或多剂量组成。还设想了可控持续释放本发明组合物。微球体技术的实例可见于美国专利第6,458,387号和美国专利第5,578,708号，其全文在此引入作为参考。
制品可为液体，或可为固体，例如用于重建的冻干固体。本发明的水性组合物包含有效量的新型化合物，其溶解或分散在药学可接受的载体或水性介质中。短语“药学或药理学可接受的”指在给予动物或人时不产生不良反应、变态反应或其它不适当反应的分子实体和组合物。本文使用的“药学可接受的载体”包括任意溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和物质用于药学活性物质的用途在本领域众所周知。除非任何常规的介质或物质与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗组合物。还可将补充活性成分加入到组合物中。在某些情况下，在单个组合物或溶液中提供本发明化合物和另一种减少食物摄取、降低血浆葡萄糖或改变血浆脂质的物质(例如胰岛淀粉样多肽、胰岛淀粉样多肽激动剂类似物、CCK或CCK激动剂、瘦蛋白或瘦蛋白激动剂、毒蜥外泌肽或毒蜥外泌肽激动剂类似物或者PYY或PYY类似物)以便一起给药是很方便的。在其它情况下，将另外的物质与新型化合物分开给予可能更有利。
可将本发明化合物配制成与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的游离碱或药学可接受盐的水溶液以便给药。本文使用的短语“药学可接受的盐”指由药学可接受的(优选无毒的)酸和碱(包括无机或有机酸和碱)制备的盐，包括但不限于硫磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、乙酸盐、草酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖二酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对-甲苯磺酸盐和扑酸盐(即1，1′-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学可接受的盐包括与游离氨基形成的那些盐，例如但不限于来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸和酒石酸的那些盐。药学可接受的盐还包括与游离羧基形成的那些盐，例如但不限于来源于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸和普鲁卡因的那些盐。在一般的储存和使用条件下，这些制品包含防腐剂，以防止微生物生长。
在一个实施方案中，将本发明的药用组合物配制得适于胃肠外给予，例如通过注射或输注给予。优选地，新型化合物悬浮在水性载体中，例如在pH约3.0至约8.0的等渗缓冲溶液中，优选在pH约3.5至约7.4、3.5至6.0或3.5至约5.0的等渗缓冲溶液中。有用的缓冲剂包括乙酸钠/乙酸、乳酸钠/乳酸、抗坏血酸、柠檬酸钠-柠檬酸、碳酸氢钠/碳酸、琥珀酸钠/琥珀酸、组氨酸、苯甲酸钠/苯甲酸和磷酸钠以及三(羟甲基)氨基甲烷。可使用一种长效或“贮库型”缓释制剂，以在经皮注射或传递后的多个小时或多天内，将治疗有效量的制剂传递入血流中。
适于注射使用的药用组合物包括无菌水性溶液或分散液和用于即时配制无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。就一切情况而论，剂型应当是无菌的，流动性应达到可易于注射的程度。还需要本发明的PPF多肽在生产和储存条件下是稳定的，其必须防腐，以对抗微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可为溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如山梨醇、甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、二甲基乙酰胺、Cremorphor EL，其合适的混合物，以及油(例如豆油、芝麻油、蓖麻油、棉籽油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、玉米油)。例如通过使用包衣剂(例如卵磷脂)、在分散液情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可保持适当的流动性。可利用各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸(甲、丙、丁)酯、三氯叔丁醇、苯酚、苯汞盐(乙酸盐、硼酸盐、硝酸盐)、山梨酸、硫柳汞等，达到对微生物作用的预防。在许多情况下，优选包含等渗剂(例如糖、氯化钠)。通过在组合物中使用吸收延迟剂(例如一硬脂酸铝和明胶)，可实现注射组合物的吸收延长。代表性的药用组合物可为0.1-5％本发明化合物的水系统溶液，连同将最终组合物的pH缓冲至约3.0至约6.0的约0.02％至约0.5％(w/v)的乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐，以及约1.0-10％(w/v)的碳水化合物或多元醇张力剂；和任选的约0.005-1.0％(w/v)的防腐剂，其选自间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸酯和苯酚。
可通过加入在合适溶剂中的所需量的活性化合物，以及根据需要加入以上列举的各种其它成分，接着除菌过滤，制备无菌注射溶液。一般来说，通过将各种经灭菌的活性成分加入到无菌溶媒中，制备分散液，其中无菌溶媒含有基础分散介质和以上列举物质中的所需其它成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂，优选的制备方法是由其先前除菌过滤的溶液产生活性成分加任何其它所需成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥技术。
一般来说，根据年龄、体重以及受者的身体状况或者疾病或代谢病症或障碍的严重性来确定本发明新型化合物的治疗或预防有效量。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences 697-773。另参见Wang和Hanson，Parenteral Formulations of Proteins and PeptidesStability and Stabilizers，Journal of Parenteral Science and Technology，Technical Report No.10，Suppl 422S(1988)。通常，可使用约0.001μg/kg体重/天至约1000μg/kg体重/天的剂量，但正如熟练医师所认识到的，可使用多一些或少一些的剂量。给药可为每日一次或多次，或频率更低，可与本文描述的其它组合物结合给予。应当指出的是，本发明不限于本文提及的剂量。
可通过使用已确立的测定代谢疾病或障碍水平的实验连同相关的剂量-反应数据，确定合适的剂量。最终的给药方案由主治医师考虑改变药物作用的因素来确定，这些因素例如为药物的比活、损伤的严重性和患者的响应性、患者的年龄、身体状况、体重、性别和膳食、任何感染的严重性、给药时间和其它临床因素。随着研究的进行，将显露出关于特定疾病和病症的合适剂量水平和治疗时程的更多信息。
以单剂量或分剂量给予的有效剂量通常为约1-30μg至约5mg/天，优选约10-30μg至约2mg/天，更优选约5-100μg至约1mg/天，最优选约5μg至约500μg/天。剂量可为约0.01至约500μg/剂。设想本发明的化合物可一日给予1、2、3、4次或更多次。因此，代表性剂量可源于每日的给药总量和每日的给药次数。例如，代表型剂量可为约0.125μg/剂(每天4次，给予0.5μg)至约5mg/剂(每日给予一次5mg)。其它的剂量可为约0.01至约100μg/kg/剂。另外的代表性剂量可为20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200μg/剂。要给予的确切剂量可由本领域技术人员确定，其取决于具体化合物的效力，以及个体的年龄、体重和身体状况。给予应当在例如需要抑制营养物利用度、降低食物摄取、体重、血糖或血浆脂质的时候开始，例如，在病症最初有征兆的时候或在诊断出肥胖、糖尿病或胰岛素抵抗综合症后不久开始。可通过任何途径给予，例如注射(优选皮下或肌内注射)、口服、鼻、经皮等。用于某些途径(例如口服给予)的剂量可增加，例如增加约5-100倍，从而引起生物利用度降低。
在一个实施方案中，在要胃肠外给予药用制剂时，配制组合物，以便传递1μg/kg至100mg/kg体重/天的新型化合物剂量，优选10μg/kg至约50mg/kg体重/天的剂量。可周初始大剂量进行胃肠外给予，接着持续输注，以保持药物的治疗循环水平。本领域一般技术人员易于优化有效剂量和给药方案，这可根据良好医疗实践和个体患者的临床病症确定。
给药频率取决于药物的药代动力学参数和给药途径。本领域技术人员根据给药途径和所需剂量确定最佳的药物制剂。参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，出处同上，1435-1712页。这样的制剂可影响所给予药物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。根据给药途径，可按照体重、体表面积或器官大小计算合适的剂量。本领域一般技术人员无需不当过度实验，可以常规方式进行确定合适治疗剂量所必需的更精细计算，尤其是在依据本文公开的剂量信息和实验以及在动物或人体临床实验中观察到的药代动力学数据的情况下。
要认识到，本发明的药用组合物和治疗方法可用于人类医药和兽医领域。因此，要治疗的受试者可为哺乳动物，优选为人或其它动物。对于兽用目的，受试者包括例如家畜(包括母牛、绵羊、猪、马和山羊)、宠物(例如狗和猫)、珍奇(exotic)动物和/或动物园动物、实验室动物(包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠)；以及家禽，例如鸡、火鸡、鸭和鹅。
为帮助理解本发明，纳入以下的实施例。涉及本发明的实施例当然不应当被解释为对本发明的具体限制，现在已知或以后开发的本发明的属于本领域技术人员的能力范围的这些改变，被认为落入本文描述的和后文要求保护的本发明范围。
实施例实施例1降低热量摄取的多肽的合成可使用标准多肽合成方法合成以下多肽。这样的方法描述于下文和美国专利6,610,824和美国专利5,686,411以及专利申请序号第454,533号(1999年12月6日提交)，这些文献全文在此引入作为参考。
在4-(2′-4′-二甲氧基苯基)-Fmoc氨基甲基苯氧基乙酰胺正亮氨酸MBHA树脂(Novabiochem，0.55 mmole/g)上使用Fmoc-保护的氨基酸(Applied Biosystems，Inc.)组装多肽。一般来说，在整个合成中使用单偶联循环，并使用Fast Moc(HBTU活化)化学。但是，在某些位置偶联的效率可能比预期低，需要双偶联。使用哌啶对增长的肽链进行去保护(Fmoc基团去除)同样可能不总是有效的，需要双去保护。使用三乙基硅烷(0.2mL)、乙二硫醇(0.2mL)、苯甲醚(0.2mL)、水(0.2mL)和三氟乙酸(15mL)混合物，按照标准方法(Introduction to CleavageTechniques，Applied Biosystems，Inc.)，实现已完成肽的最终去保护。肽在乙醚/水(50mL)中沉淀并离心。沉淀在冰乙酸中重建，并冻干。冻干的肽溶解在水中。然后测定粗产物纯度。
在纯化和分析步骤中使用溶剂A(0.1％TFA的水溶液)和溶剂B(0.1％TFA的ACN溶液)。
将含各种多肽的溶液上制备型C-18柱并纯化(40分钟内，含10％-40％溶剂B的溶剂A溶液)。使用C-18分析型柱等度测定分离级分的纯度。合并纯分离级分以提供以上鉴别肽。对冻干肽进行分析型RP-HPLC(梯度为30分钟内含30％-60％溶剂B的溶剂A溶液)，以测定保留时间。
实施例2受体结合实验首先，多肽可在实验中用于测定与胰岛淀粉样多肽、降钙素和CGRP受体的结合能力。测定与胰岛淀粉样多肽受体、降钙素受体和CGRP受体的相互作用的结合实验描述于例如美国专利第5,264,372号，其全文在此引入作为参考。
更详细地讲，如下对本发明化合物与胰岛淀粉样多肽受体的结合进行评价。由Amersham Corporation(Arlington Heights，IU.)购买125I-大鼠胰岛淀粉样多肽(Bolton-Hunter标记在N端赖氨酸)。未标记的肽得自BACHEM Inc.(Torrance，Calif.)和Peninsula Laboratories(Belmont，Calif.)。
断头处死雄性Sprague-Dawley_大鼠(200-250g)。取出脑，并置于冷磷酸缓冲盐水(PBS)中。从腹面开始，制作由嘴至下丘脑的切口，侧面以嗅束为界，并由这些嗅束向中线以45°角延伸。此基底前脑组织包含伏隔核和周围区域，对其称重并在冰冷的20mM HEPES缓冲液(20mM HEPES酸，于23℃用NaOH将pH调节至7.4)中匀浆。通过以48,000×g离心15分钟，用新鲜缓冲液清洗膜3次。将最终的膜沉淀重悬浮在含0.2mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的20mM HEPES缓冲液中。
为检测125I-胰岛淀粉样多肽结合，将得自4mg原始湿重组织的膜与12-16pM125I-胰岛淀粉样多肽的20mM HEPES缓冲溶液(其含0.5mg/ml杆菌肽、0.5mg/ml牛血清白蛋白和0.2mM PMSF)温育。溶液于2℃温育60分钟。通过GF/B玻璃纤维滤器(Whatman Inc.，Clifton，N.J.)过滤来终止温育，该滤器预先在0.3％聚乙烯亚胺中浸泡4小时，以便减少放射性标记肽的非特异性结合。临过滤前用5ml冷PBS清洗滤器，在过滤后立即用15ml冷PBS清洗滤器。取下滤器，在γ-计数器中以77％的计数效率评测放射性。通过在10-12-10-6M未标记测试化合物存在下检测结合，产生竞争曲线，并通过使用4-参数逻辑斯谛方程的非线性回归(Inplot program；GraphPAD Software，San Diego)分析竞争曲线。
在该实验中，纯化的人胰岛淀粉样多肽以检测的约50pM的IC50结合其受体。本发明测试化合物的结果列于下表，表明每种化合物都具有显著的受体结合活性。
基本如对胰岛淀粉样多肽的描述评价本发明化合物与CGRP受体的结合，只是使用125I-hCGRP和由SK-N-MC细胞制备的膜，已知SK-N-MC细胞表达CGRP受体(Muff，R.等，Ann NY Acad.Sci.1992657，106-16)。如对胰岛淀粉样多肽的描述进行结合实验，只是使用13,500cpm125I-hCGRP/孔或21.7 pM/孔(Amersham)。
如本领域所知，可使用同样表达降钙素受体的CHO细胞或T47D细胞Muff R.等，Ann N YAcad Sci.1992，657106-16和KuestnerR.E.等，Mol Pharmacol.1 994，46246-55)研究与降钙素受体的结合。
表X.多肽的EC50值(nM)

nt代表未测试。
实施例3多肽对食物摄取的活性以12:12小时光暗周期，分组圈养雌性NIH/Swiss小鼠(8-14周龄)。水和标准丸状小鼠饲料可随意获取，注明处除外。动物在实验前1天约15:00时开始禁食。
在时间＝0分钟时，以200μl/小鼠的量给予所有动物腹膜内注射溶媒或多肽，并立即给予预称重量(10-15g)的标准饲料。于30、60、120和180分钟取出食物并称重，以确定食物消耗量。治疗对食物摄取的作用表示为相对于对照的变化百分率。
由图1可见，25-300nmol/kg剂量的化合物2在注射后30分钟剂量依赖性地降低食物摄取。下表描述了用25nmol/kg剂量外周给予(腹膜内注射)多肽的食物摄取降低。时间点30、60、120和180分钟的数据代表相对于溶媒的累积食物摄取的下降百分率。






nd＝未实施。
实施例4本发明化合物对体重减轻和热量摄取的活性使单独圈养的雄性Sprague-Dawley_大鼠(350g；12小时光/暗周期)维持高脂肪饲料(58％的千卡来自脂肪)4周。在增肥期结束时，在麻醉下肩胛间植入14天渗透泵(Durect Corp.)。大鼠接受泵持续传递的溶媒(50％DMSO)或2.9nmol/kg/天剂量的多肽。每周获取食物摄取和体重检测结果。图2A和2B显示了多肽化合物3、化合物4或化合物5在整个14天测试期中产生的热量摄取下降和体重增加下降。
下表提供了几种化合物在第1周和第2周的体重下降百分率。
表X给予本发明代表性化合物后的体重下降

*和对照相比，P＜0.05实施例5机体组成使单独圈养的雄性Sprague-Dawley_大鼠(420g；12小时光/暗周期)维持高脂肪饲料(58％的千卡来自脂肪)4周。在增肥期结束时，在麻醉下肩胛间植入14天渗透泵(Durect Corp.)。大鼠接受泵持续传递的溶媒(50％DMSO)或70nmol/kg/天剂量的化合物1。在第12天处死动物。立即冷冻尸体，并通过化学分析(Covance Laboratories，Madison，WI)测量机体组成(脂肪和蛋白)。图3表明，相比于对照，化合物1处理大鼠的脂肪含量占总机体质量的百分率下降。另外，化合物1增加瘦组织含量的百分率。
实施例6胃排空和离子钙通过测量血浆中管饲氚化葡萄糖的出现监测胃排空。受试者为有知觉的雄性Sprague Dawley_大鼠(7-9周龄，12:12小时光暗周期)，其可随意获取食物和水，直至实验开始。在给药前，撤走食物和水。在t＝-5分钟时，同时给予肽或溶媒(200μl盐水)。在t＝0分钟时，通过口咽管给予1ml含5μCi D-[3-3H]葡萄糖(Dupont，Wilmington，DE，USA)的无菌水溶液。在t＝20分钟时，对尾尖施用局部麻醉(Hurricaine_，20％苯佐卡因液体)。在t＝40分钟时，用解剖刀结扎尾尖，收集约250μl血至肝素化管中。然后使用Ciba/Corning 634Ca/pH分析仪(Ciba/Corning，Inc.，Medfield，MA)立即检测血浆的离子化钙。用移液管吸取10μl血浆样品至制备的闪烁小瓶(0.5ml水+2ml闪烁混合物(Ecolite scintillation cocktail ICN，Costa Mesa，CA))中，涡旋混合，并在β-计数器(1209 Rack-beta；LKB-Wallac，Gaithersburg，MD)中以1分钟/瓶计数。
在图4A中，点代表6只SD大鼠(喂饲，有知觉)的平均值±标准偏差。在t＝0时皮下注射所示剂量的肽。35分钟后收集血进行cpm分析。*所有点对盐水对照都为p＜0.001；ANOVA、Dunnett检验。根据非线性回归ED50＝2.3μg/kg。底部＝25cpm/10μl；顶部＝328cpm/10μl。血浆cpm的最大降低为-92％。拟合优度r2＝0.9992。
在图4B中，点代表6只SD大鼠(喂饲，有知觉)的平均值±标准偏差。在t＝0时皮下注射所示剂量的肽。35分钟后收集血进行cpm分析。*相对盐水对照P＜0.001；ANOVA、Dunnett检验。根据非线性回归ED50＝1.1μtg/kg。底部＝1.2mmol/L；顶部＝1.3mmo1/L。血浆iCa的最大降低为-14％。拟合优度r2＝0.9936。
实施例7甘油三酯在研究1中，喂饲育种退役的雌性Harlan Sprague-Dawley_大鼠(HSD；HarlanTeklad，Indianapolis，IN)高脂肪饲料(40％的卡路里来自脂肪；饲料编号TD95217，HarlanTeklad)达9周，然后开始研究，在整个研究周期中维持此饲料。在整个研究中，一组大鼠随意喂饲，以检验本发明的代表性化合物-化合物1处理(n＝10)相对于对照-未处理大鼠(n＝10)的代谢作用。为测定化合物1在设立食物限制(“定食”)中的代谢作用，每天给予第二组大鼠其研究前基线食物摄取的75％达10天，然后开始化合物1(n＝10)或溶媒(n＝10)处理(相对于限制前体重，体重下降约5％)。在此时，所有大鼠都接受在异氟烷麻醉下在肩胛间区域中皮下手术植入的Alzet_渗透泵(Durect，Cupertino，CA)。泵准备用于持续21天传递化合物1(101μg/kg/天)或溶媒(50％二甲氧基亚砜[DMSO]的水溶液)。食物受限的大鼠每天继续给予其基线食物摄取的75％。在21天处理后，通过心脏穿刺由异氟烷麻醉的吸收后大鼠(在上午禁食约2-4小时)将血样获取至肝素化注射器中，获得的血浆用于分析物分析。使用用于临床化学的标准自动化分析(LabCorp，Inc.，San Diego，CA)测定血浆甘油三酯。
在研究2中，喂饲有肥胖倾向的HSD大鼠Levin品系(CharlesRiver，Wilmington，MA)的雄性大鼠高脂肪饲料(32％的卡路里来自脂肪；饲料编号12266B，Research Diets，Inc.，New Brunswick，NJ)达6周，然后开始研究，并在整个实验过程中维持此饲料。按照研究1放置含化合物1或DMSO溶媒的皮下渗透泵，从此时开始处理，并持续3周(21天)。比较化合物1处理大鼠(303μg/kg/天；n＝10)、溶媒处理对照(n＝10)和每日接受化合物1处理大鼠所吃食物量的匹配喂饲组(n＝10)之间的代谢参数。按照研究1进行血收集和血浆甘油三酯浓度分析，但在第1周和第2周时间点使用尾静脉收集。
按照研究2进行研究3，只是以不同剂量的化合物1处理动物8周(56天)。在处理的第28天，以新鲜渗透泵替换已使用泵。泵用于传递1、3、10或100μg/kg/天剂量的化合物1(n＝10/组)或DMSO溶媒(对照，n＝10)。另外的配对喂饲组(n＝10)接受溶媒，以及每日喂饲100μg/kg/天化合物1组所吃的食物量。通过尾静脉收集入肝素化管中，由有知觉喂饲大鼠收集血液并分析基线、2、4和6周时间点的血浆甘油三酯浓度；通过心脏穿刺由异氟烷麻醉的喂饲大鼠将血液收集到肝素化注射器中，使用标准甘油三酯实验(Cobas Mira Plus，Roche Diagnostics)分析第8周时间点的血浆甘油三酯浓度。
以单因子方差分析(ANOVA)继之以Dunnett多重比较检验(Prism V.4.01，GraphPad Software，San Diego，CA)评价研究中给定时间点处理之间平均血浆甘油三酯水平的差异。在统计学上，p＜0.05时认为差异是显著的。
如分别为研究1、2和3的图5-7E所示，在1-8周内用化合物1处理导致显著降低甘油三酯浓度。图5显示了在用化合物1经持续皮下(s.c.)输注处理21天后雌性育种退役大鼠中的血浆甘油三酯浓度。和随意喂饲的对照相比，给予化合物1的大鼠表现出显著降低的甘油三酯水平不管是在随意喂饲条件下给予化合物1，还是在食物限制条件下给予化合物1，都观测到该作用。和随意喂饲的溶媒处理对照相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
图6A-6C描述了在通过持续皮下输注化合物1处理的3周中，膳食诱导肥胖(DIO)雄性Levin大鼠中的血浆甘油三酯浓度。图代表由处理(A)1周、(B)2周和(C)3周时的血样所获得的值。和溶媒处理的对照相比，*p＜0.05，**p＜0.01。
图7A-7E显示了化合物1的剂量反应研究，其中和在2、4、6和8周时间点的溶媒对照相比，低至1μg/kg/天的剂量导致血浆甘油三酯浓度下降(分别为图7B、C、D和E)。和溶媒处理的对照相比，*p＜0.05，**p＜0.01。处理组以图例表示。
实施例8ghrelin实验该实施例提供了检测本发明化合物对ghrelin作用的代表性实验。
以12:12小时光暗周期于22.8±0.8℃圈养雄性Harlan SpragueDawley_(HSD)大鼠。全部实验都在光周期中进行。动物在实验前禁食约20小时。所有动物都可自由获取水，直至实验开始。用20％苯佐卡因(Hurricaine，Beutlich Pharmaceutical，Waukegan，IL)麻醉动物尾，由尾静脉收集血样。分别使用Linco RIA试剂盒GHRA-89HK和GHRA-88HK检测总ghrelin浓度和活性ghrelin浓度。
在研究1中，由局部麻醉的尾对HSD大鼠进行定期取血样，并检测ghrelin水平。在t＝0时，对大鼠(n＝6)皮下注射125μg/kg五肽胃泌素(Sigma)，以刺激胃酸分泌(在图1中PG＝0分钟)，20分钟后皮下(s.c.)注射10μg大鼠胰岛淀粉样多肽。分析血样的总ghrelin和活性(酰化)ghrelin(Linco)。如图8A所示，胰岛淀粉样多肽在1小时内降低活性ghrelin约50％。
进行研究2，以检验外源胰岛淀粉样多肽是否独立于五肽胃泌素刺激来抑制ghrelin分泌。在时间＝0分钟时给予禁食大鼠皮下注射盐水或30μg/kg大鼠胰岛淀粉样多肽，或皮下注射盐水或125μg/kg五肽胃泌素(Sigma，批号050K1525)。在时间为20分钟时通过皮下注射给予在100μl盐水中的30μg/kg剂量的大鼠胰岛淀粉样多肽(AC0128，批号AR2081-42A，Amylin Pharmaceuticals)或单独的盐水溶媒(分别为n＝5、5)。至少在0、10、20、30、60和90分钟的时间点收集血浆样品。图8B和8C均表明，和盐水对照相比，给予胰岛淀粉样多肽使总血浆ghrelin下降，图8B证实和对照相比，在单独的胰岛淀粉样多肽存在(即无五肽胃泌素)时血浆ghrelin下降。五肽胃泌素似乎增强胰岛淀粉样多肽的ghrelin降低作用。
实施例9胰腺功能在禁食、麻醉的HSD大鼠(重320-350g)中进行股动脉和股静脉套管插入术，并使其稳定90分钟。在t＝-30时，开始输注盐水(1ml/小时)或化合物1(1ml/小时)。在t＝0时，大鼠接受imp注射10μg/kg雨蛙肽。于t＝-30至t＝240的不同时间点收集血浆淀粉酶、脂酶样品。
如图9A和9B所示，用化合物1处理削弱了急性胰腺炎大鼠模型血液中胰酶活性的增加，这提示胰岛淀粉样多肽激动剂可能是预防和治疗胰腺炎的有前景侯选药物。
实施例10胰岛淀粉样多肽的胃酸分泌以12:12小时光暗周期于22.8±0.8℃圈养雄性Harlan SpragueDawley_大鼠。实验在光周期中进行。喂饲大鼠饲料(Teklad LM 485，Madison，WI)的大鼠在实验前禁食约20小时。它们可自由获取水，直至实验开始。
经手术使大鼠(9-14周龄，体重264-395g)装备供应商(Zivic Miller，目录号SCAO3.00)的双胃瘘管。在剖腹术过程中，在氟烷麻醉下，将环形双腔插头缝合入胃壁中。两个2.3mm内径硅橡胶(进和出)套管连接至插头并与胃腔相通，跟踪在皮下由腹壁至肩胛间区的这两个套管，其中这两个套管分别在腹壁和肩胛间区外露。用夹钳封闭剖腹术伤口，将大鼠放置于加热的恢复笼中1天，可自由获取水。此后，单独地图养大鼠，可自由获取水和大鼠饲料，直至在手术后约10-15天使大鼠经受过夜禁食，用于对有知觉大鼠进行的实验。
打开胃导管，并将其连接至柔性PE240管，用于注射和取样。为确保导管开放，注射2-3mL室温的盐水溶液，并立即由胃中抽出。重复此步骤，直至易于流动和流出物澄清。经一个导管通过注射5mL盐水和2mL空气，然后立即经另一个导管将其抽出，以10分钟间隔检测胃酸分泌。这样，由于不完全抽出小分泌体积而产生的误差可被最大限度地减小。使用pH计(Beckman model number PHI34Fullerton，CA)，用0.01N氢氧化钠将3mL的各个胃抽提物滴定至pH7.0。使用每次滴定所需要的碱量(已根据抽出总体积校正过)计算每个样品的酸摩尔数。
在收集基线样品并记录回收体积后，给予动物皮下注射125μg/kg五肽胃泌素(Peninsula Laboratories批号019945和034686)，并将10分钟胃取样再延续2小时。在五肽胃泌素注射后40分钟，于该时刻观察到胃酸分泌达到稳定平台，用盐水(n＝6)或0.01、0.1、1.0、10.0或100μg(分别为n＝3、3、4、5、5)剂量的大鼠胰岛淀粉样多肽(批号AR905-80，Amylin Pharmaceuticals Inc.，San Diego，CA)皮下注射大鼠。
如图10A所示，五肽胃泌素刺激胃酸分泌达4.6倍，由约13.8±2.2μmol/10分钟的基线速率至五肽胃泌素注射后40分钟的约63.4±3.3μmol/10分钟(总平均值；P＜0.0001)。在五肽胃泌素后40分钟注射胰岛淀粉样多肽剂量依赖性地抑制胃酸产生，0.1、1、10和100μg剂量起作周的半寿期分别为8.6、10.4、5.8和6.3分钟。在最高(100μg)剂量胰岛淀粉样多肽时，注射胰岛淀粉样多肽后1小时五肽胃泌素刺激的胃酸分泌降低93.4±2.6％(对于剂量0.1-100μg，P＜0.001)。此分泌速率仅为五肽胃泌素注射前的基线速率的32％(P＜0.01，t检验，Welch correction)。胰岛淀粉样多肽抑制五肽胃泌素刺激的胃酸分泌的剂量反应示于图10B。胰岛淀粉样多肽的胃酸抑制作用的ED50为0.05μg/大鼠±0.15对数单位(41pmol/kg)。
实施例11胰岛淀粉样多肽的胃保护作用在管饲1mL无水乙醇(乙醇-200标准脱水乙醇，USP，SpectrumQuality Products，Inc.Gardena，CA)前20分钟，用0.1mL盐水(n＝12)或用含0.001、0.01、0.1、0.3、1、3或10μg剂量大鼠胰岛淀粉样多肽的相同体积(分别为n＝5、5、5、9、9、5、6)皮下注射体重163-196g的禁食雄性大鼠。在管饲后30分钟，用5％氟烷麻醉每只大鼠，切除胃，沿着胃小弯打开，并外翻，以暴露粘膜。用盐水轻缓地淋洗外翻的胃，立即由10名实验处理盲观察者的每一人对粘膜损伤评级。评定尺度限制在0(未观察到损伤)和5(粘膜表面100％被充血、溃疡或腐肉形成所覆盖)之间，与其它人(例如Guidobono F.等，Br JPharmacol 120581-586(1997))使用的0-5记分系统相当。图11A显示了以乙醇诱导损伤的百分率表示的损伤记分结果。
为测定胰岛淀粉样多肽的胃保护作用是否可归因于胰岛淀粉样多肽特异性机制，在乙醇管饲前25分钟对4只大鼠静脉注射3.0mg选择性胰岛淀粉样多肽拮抗剂AC187(Amylin Pharmaceuticals，Inc.San Diego，CA)，在5分钟后(距管饲为t＝-20分钟)皮下注射0.3μg大鼠胰岛淀粉样多肽。切除胃，并如上所述在乙醇管饲后30分钟对损伤评级。结果提供于图11A中的倒数第二个条棒。最后的条棒显示了注射3.0mg AC187而未注射大鼠胰岛淀粉样多肽的结果。图11B显示了对结果更有选择性的考察。
图11C表明，在乙醇管饲前5分钟皮下注射给予的胰岛淀粉样多肽剂量依赖性地保护胃免受粘膜损伤(对于0.1μg和更高的剂量，P＜0.05)。0.3μg和更高剂量的胰岛淀粉样多肽将损伤记分达降低67％。在此实验系统中胰岛淀粉样多肽胃保护作用的ED50为0.036μg(31pmol/kg)±0.40对数单位。
为进一步研究胰岛淀粉样多肽的胃保护作用是否可在葡萄糖刺激的内源胰岛淀粉样多肽分泌的作用下发生，对比了先腹膜内给予葡萄糖(250mg/0.5mL D-葡萄糖；距管饲t＝-30分钟；n＝9)对乙醇诱发的胃炎的作用和在溶媒处理大鼠中观察到的损伤(n＝23)。切除胃，并如上所述在乙醇管饲后30分钟对损伤评级，取血检测血浆葡萄糖。另外检测共给予3mg静脉浓注AC 187的葡萄糖处理大鼠(n＝9)中的损伤反应。
预先给予D-葡萄糖，在t＝+30分钟后增加血浆葡萄糖至123mg/dL(相比之下，对照为76mg/dL)，先前已表明其在禁食SpragueDawley大鼠中增加内源性血浆胰岛淀粉样多肽浓度至4.8±0.6 pM，将胃损伤记分显著降低18.5±4.6％(P＜0.0005)。但是，预注射AC187对葡萄糖处理大鼠中的损伤记分没有作用。
在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都代表了本发明所属领域技术人员的技术水平。所有的出版物和专利申请都在此引入作为参考，其程度如同各个单独的出版物和专利申请被明确和个别指出在此引入作为参考。
尽管为了透彻理解的目的，已利用阐述和实施例相当详细地描述了上述发明，但显而易见的是，可在所附权利要求书的范围内实施某些改变和修饰。
权利要求
1.一种胰岛淀粉样多肽家族肽，其包含胰岛淀粉样多肽及类似物的环区；至少一部分降钙素或其类似物α螺旋区的α螺旋区以及降钙素或其类似物的α螺旋区。
2.权利要求1的肽，其中所述胰岛淀粉样多肽为人胰岛淀粉样多肽及其类似物。
3.权利要求1的肽，其中所述降钙素为鲑鱼降钙素。
4.权利要求2的肽，其中所述降钙素为鲑鱼降钙素。
5.权利要求1的肽，其包含式I的氨基酸序列Xaa1 X Xaa3 Xaa4Xaa5 Xaa6 Y Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32(SEQ ID NO34)，其中Xaa1为A、C、hC、D、E、F、I、L、K、hK、R、hR、S、Hse(高丝氨酸)、T、G、Q、N、M、Y、W、P、Hyp(羟脯氨酸)、H、V或不存在；Xaa3为A、D、E、N、Q、G、V、R、K、hK、hR、H、I、L、M或不存在；Xaa4为A、I、L、S、Hse、T、V、M或不存在；Xaa5为A、S、T、Hse、Y、V、I、L或M；Xaa6为T、A、S、Hse、Y、V、I、L或M；Xaa8为A、V、I、L、F或M；Xaa9为L、T、S、Hse、V、I或M；Xaa10为G、H、Q、K、R、N、hK或hR；Xaa11为K、R、Q、N、hK、hR或H；Xaa12为L、I、V、F、M、W或Y；Xaa13为A、F、Y、N、Q、S、Hse或T；Xaa14为A、D、E、G、N、K、Q、R、H、hR或hK；Xaa15为A、D、E、F、L、S、Y、I、V或M；Xaa16为L、F、M、V、Y或I；Xaa17为H、Q、N、S、Hse、T或V；Xaa18为K、hK、R、hR、H、u(Cit)或n(Orn)；Xaa19为F、L、S、Hse、V、I、T或不存在；Xaa20为H、R、K、hR、hK、N、Q或不存在；Xaa21为T、S、Hse、V、I、L、Q、N或不存在；Xaa22为F、L、M、V、Y或I；Xaa23为P或Hyp；Xaa24为P、Hyp、R、K、hR、hK或H；Xaa25为T、S、Hse、V、I、L、F或Y；Xaa26为N、Q、D或E；Xaa27为T、V、S、F、I或L；Xaa28为G或A；Xaa29为S、Hse、T、V、I、L或Y；Xaa30为E、G、K、N、D、R、hR、hK、H或Q；Xaa31为A、T、S、Hse、V、I、L、F或Y；和Xaa32为F、P、Y、Hse、S、T或Hyp；其中X和Y能够产生键，并为独立选择的具有下述侧链的残基所述侧链彼此化学键合从而形成分子内连接，例如二硫键；酰胺键；可形成环状内酰胺的烷基酸和烷基胺；烷基醛或烷基卤和烷基胺，其可缩合和被还原，从而形成烷基胺或亚胺键；或所述侧链可连接从而形成烷基、烯基、炔基、醚或硫醚键。
6.权利要求5的肽，其中X和Y形成二硫键、酰胺键、亚胺键、胺键、烷基键和烯基键的分子内连接。
7.权利要求5的肽，其进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个置换、插入、缺失、延长和/或衍化修饰。
8.权利要求1的肽，其包含式II的氨基酸序列Xaa1 Xaa2 Xaa3Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32(SEQ IDNO35)，其中Xaa1为A、C、D、F、I、K、S、T或不存在；Xaa2为C、D、S或不存在；Xaa3为A、D、N或不存在；Xaa4为A、L、T或不存在；Xaa5为A或S；Xaa6为T、A、S或V；Xaa7为C、K或A；Xaa8为A、V、L或M；Xaa9为L或T；Xaa10为G、H或Q；Xaa11为K、R、Q或hArg；Xaa12为L、W或Y；Xaa13为A、F、N、Q、S或T；Xaa14为A、D、E、G、N、K、Q或R；Xaa15为A、D、E、F、L、S或Y；Xaa16为L或F；Xaa17为H、Q、S或V；Xaa18为K、R、hArg、u(Cit)或n(Orn)；Xaa19为F、L、S或不存在；Xaa20为H、Q或不存在；Xaa21为T、N或不存在；Xaa22为F、L、M、V或Y；Xaa23为P；Xaa24为P或R；Xaa25为T；Xaa26为N；Xaa27为T或V；Xaa28为G；Xaa29为S；Xaa30为E、G、K或N；Xaa31为A或T；和Xaa32为F、P或Y。
9.权利要求8的肽，其进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个置换、插入、缺失、延长和/或衍化修饰。
10.权利要求1的肽，其包含式III的氨基酸序列Xaa1 Xaa2 Xaa3Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28 Xaa29 Xaa30 Xaa31 Xaa32(SEQ IDNO36)，其中Xaa1为A、C、F、I、K、S或不存在；Xaa2为C、D或S；Xaa3为A、D或N；Xaa4为A、L或T；Xaa5为A或S；Xaa6为T；Xaa7为C或K；Xaa8为A或V；Xaa9为L或T；Xaa10为G、H或Q；Xaa11为K、R或hArg；Xaa12为L；Xaa13为A、F、N、S或T；Xaa14为A、D、E、G、N、Q或R；Xaa15为A、E、F、L、S或Y；Xaa16为L；Xaa17为H、S或V；Xaa18为K、R、hArg、u(Cit)或n(Orn)；Xaa19为F、L或S；Xaa20为H或Q；Xaa21为T或N；Xaa22为F、L、M、V或Y；Xaa23为P；Xaa24为P或R；Xaa25为T；Xaa26为N；Xaa27为T或V；Xaa28为G；Xaa29为S；Xaa30为E、G、K或N；Xaa31为A或T；和Xaa32为F、P或Y。
11.权利要求11的肽，其进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个置换、插入、缺失、延长和/或衍化修饰。
12.一种胰岛淀粉样多肽家族肽，其包含SEQ ID NO40-137的序列。
13.权利要求12的肽，其中所述肽与SEQ ID NO40-137具有至少95％的序列同一性。
14.一种治疗进食障碍、胰岛素抵抗、肥胖、异常餐后高血糖；任何类型的糖尿病，包括I型、II型和妊娠期糖尿病；代谢综合症、倾倒综合症、高血压、血脂异常、心血管疾病、高脂血症、睡眠呼吸暂停、癌症、肺动脉高压、胆囊炎和骨关节炎的方法，其包括权利要求1所述肽。
15.一种治疗进食障碍、胰岛素抵抗、肥胖、异常餐后高血糖；任何类型的糖尿病，包括I型、II型和妊娠期糖尿病；代谢综合症、倾倒综合症、高血压、血脂异常、心血管疾病、高脂血症、睡眠呼吸暂停、癌症、肺动脉高压、胆囊炎和骨关节炎的方法，其包括权利要求5所述肽。
16.一种治疗进食障碍、胰岛素抵抗、肥胖、异常餐后高血糖；任何类型的糖尿病，包括I型、II型和妊娠期糖尿病；代谢综合症、倾倒综合症、高血压、血脂异常、心血管疾病、高脂血症、睡眠呼吸暂停、癌症、肺动脉高压、胆囊炎和骨关节炎的方法，其包括权利要求8所述肽。
17.一种治疗进食障碍、胰岛素抵抗、肥胖、异常餐后高血糖；任何类型的糖尿病，包括I型、II型和妊娠期糖尿病；代谢综合症、倾倒综合症、高血压、血脂异常、心血管疾病、高脂血症、睡眠呼吸暂停、癌症、肺动脉高压、胆囊炎和骨关节炎的方法，其包括权利要求12所述肽。
全文摘要
本发明涉及具有胰岛淀粉样多肽家族肽功能的新型化合物、相关核酸、表达构建物、宿主细胞和所述化合物的生产方法。本发明的化合物包括一种或多种氨基酸序列修饰。另外，公开了治疗和预防代谢疾病(例如肥胖、糖尿病和心血管风险增加)的方法和组合物。
文档编号C07K14/585GK1980954SQ200580012043
公开日2007年6月13日 申请日期2005年2月11日 优先权日2004年2月11日
发明者C·J·索亚雷斯, M·R·汉利, D·Y·路易斯, D·G·帕克斯, C·M·约德卡, K·S·普里克特, S·高希, C·M·麦克, Q·林 申请人:安米林药品公司