专利名称：Hla结合肽，以及编码所述hla结合肽的dna片段和重组载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及HLA结合肽，以及编码该HLA结合肽的DNA片段和重组载体。
背景技术：
对癌细胞具有特异性的癌症抗原呈递在癌细胞表面上时，当癌细胞被识别为自体外来物质，结果进行天然免疫反应，并且随后诱发特异性免疫反应时，是有机会因此引起消灭癌细胞的反应。
诱发特异性免疫反应时，体液中癌细胞衍生的片段等被中和抗体消灭，癌细胞本身被细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)所消灭。即，CTL特异性识别存在于癌细胞表面上HLA I类分子中的、由8-11个氨基酸组成的癌症抗原(CTL表位)，并通过破坏癌细胞消灭癌。因此，为了开发癌症的治疗用疫苗，鉴定这样的癌症特异性CTL表位是很关键的。
这种技术从专利公开1中已知。专利公开1陈述了由特异性氨基酸序列形成的寡肽具有与HLA结合的性质。
日本专利申请公开No.H8-151396(1996)发明内容但是，上述公开中记述的传统技术考虑到以下几点有改进的空间。
首先，尚不清楚上述公开的HLA结合肽是否与HLA分子有效结合，根据HLA-结合的性质，仍有改进的空间。
其次，已证明上述公开的HLA-结合肽具有与HLA-DQ4结合的性质。但是，尚不清楚其是否与常见于欧美人中的HLA-A2分子(HLA-A*0201基因等的产物)，以及常见于日本人中的HLA-A24分子(HLA-A*2402等的产物)相结合。
本发明在上述情况下完成，其目的是提供表现出与特异型HLA分子高亲和力结合的HLA-结合肽。
根据本发明，提供了与HLA-A型分子结合的HLA-结合肽，该HLA-结合肽含有至少一种类型的选自SEQ ID NOS1至60的氨基酸序列，并由不少于8个并且不超过11个氨基酸残基组成。
此外，根据本发明，提供了HLA-结合肽，包含至少一种类型的选自SEQ ID NOSI、2、3、4、5、6、7、10、14、29、30、31、33、38、39、40、43、44、49和51的氨基酸序列。
此外，根据本发明，提供了与HLA-A型分子结合的HLA-结合肽，该HLA-结合肽含有通过对包含在上述HLA-结合肽中的氨基酸序列的一或两个氨基酸残基进行缺失、置换或添加而形成的氨基酸序列，并由不少于8个且不超过11个氨基酸残基组成。
以这种方法，含有通过对具有与HLA-A型分子结合性质的特异性氨基酸序列进行一个或几个氨基酸残基进行缺失、置换或添加而形成的氨基酸序列的构建体，也能表现与上述HLA-结合肽相似的作用。
另外，根据本发明，提供了含有编码上述HLA-结合肽的DNA序列的DNA片段。
另外，根据本发明，提供了含有编码上述HLA-结合肽的DNA序列的重组载体。
另外，根据本发明，提供了在哺乳动物体内转变为上述HLA-结合肽的HLA-结合肽前体。
上文说明了本发明的构建体，但是这些构建体的任何组合作为本发明的实施方案也有效。此外，将本发明的表达方式转化为另一种类别(category)作为本发明的实施方案也有效。
根据本发明，由于其包括特异性氨基酸序列，可以得到与HLA-A型分子具有优异的结合性质的HLA-结合肽。
上述目的、其它目的、特征和优势根据下文说明的优选实施方案参考附图将变得更为显见。
说明用于实施方案中的主动学习实验设计的示意图。
实施发明的最佳方式实施本发明的方式在下文通过参考
。在所有的附图中，同样的构件用同样的参考数字和符号表示，从而不用重复解释。
实施方案1在本实施方案中，一种含有与HLA分子结合的氨基酸序列的肽，通过用主动学习实验方法(日本专利申请公开No.H11-316754(1999))得到的假设预测，-log Kd值是3或更高，由不少于8并且不超过11个氨基酸残基组成，用来作为HLA-结合肽的候选物。结合试验的结果证实这些肽实际上是HLA-结合肽。
结果，可以有效得到大量具有与HLA-A型分子结合的优异性质的HLA-结合肽，由于它们含有的氨基酸序列与HLA分子结合的-logKd值为3或更高。
具体而言，与本实施方案有关的HLA-结合肽是与HLA-A型分子结合的HLA-结合肽，含有至少一种类型选自将在下文中描述的SEQ ID NOS1至60的氨基酸序列，并由不少于8并不超过11个氨基酸残基组成。
在人HLA-A型中，大约50％的日本人具有HLA-A24型。很多欧美人如德国人具有HLA-A2型。
本文提到的所有这些序列是由包含在癌症抗原WT1的某个基因组蛋白中的9个氨基酸残基组成的序列。
SEQ ID NOS1至30的序列在下面的表1中给出表1HLA-A24-结合肽
SEQ ID NOS1至30的序列是由包含在癌症抗原WT1的某个基因组蛋白中的9个氨基酸残基组成。SEQ ID NOS1至30的序列是由上述方法预测具有与HLA-A24分子优异结合的序列。SEQ ID NOS1至30按照结合等级降低排列。即，SEQ ID NO1是据预测具有最佳结合的序列。预测的与HLA-A24分子的结合分值和每个序列的结合实验数据以-log Kd值的形式表达。
SEQ ID NOS31至60的序列在下面的表2中给出。
表2HLA-A2-结合肽
SEQ ID NOS31至60的序列是由包含在癌症抗原WT1的某个基因组蛋白中的9个氨基酸残基组成的序列。SEQ ID NOS31至60的序列是由上述方法预测具有与HLA-A24分子优良结合的序列。SEQ ID NOS31至60按照结合等级降低排列。即，SEQ ID NO31是据预测具有最佳结合的序列。预测的与HLA-A2分子结合的记分和每个序列的结合实验数据以-log Kd值的形式表示。
虽然详细资料在后文描述，但是很清楚在预测记分和结合实验数据之间有相关性。即，虽然有轻微误差，但是可以说上述方法预测的与HLA-A分子高度结合的肽在实验中发现与HLA-A分子有高水平结合。
由于没有传统技术通过利用所述实验设计方法发现HLA-结合肽，所以只有很少量的HLA-结合肽被实验证实具有HLA-结合特性。为此，甚至在通过传统方法随机合成9个氨基酸残基组成的肽，并进行实验以发现其是否与HLA分子结合时，仅仅有约1/100的概率发现一个-log Kd值超过6的结合。
根据本实施方案，由于采用了如上所述的利用实验设计方法发现HLA-结合肽的技术，发现了多达60个HLA-结合肽的序列。此外，当某些得到的HLA-结合肽的结合性得到实验检测时，证实了经受实验的所有序列都显示了与HLA的极好结合，等于或高于预测的水平。
这些序列中，含有至少一种类型选自SEQ ID NOS1、2、3、4、5、6、7、10、14、29、30、31、33、38、39、40、43、44、49和51的氨基酸序列的HLA-结合肽，被实验证实与人HLA-A型分子结合。因此可以肯定地说，它是在与人HLA-A型分子结合方面具有优良特性的HLA-结合肽。
本实施方案相关的与HLA-结合肽的HLA分子的结合的-log Kd值为3或更高，尤其优选5或更高，更优选5.4或更高。
在生化领域，已知结合能力，根据-log Kd值约为3是肽实际上是否与MHC结合的阈值水平。因此，如果与HLA分子的结合根据-log Kd值为3或更高，就可以说其为HLA-结合肽。
此外，如果与HLA分子的结合根据-log Kd值为5或更高，由于所得的肽在与HLA分子结合上具有优良的性质，其适合用于开发免疫疾病等的有效治疗药、预防药等。
另外，如果与HLA分子的结合根据-log Kd值为5.4或更高，所得的肽在与HLA分子结合上具有优良的性质，其适合用于开发免疫疾病等的更为有效的治疗药、预防药等。
此外，可以将与本实施方案有关的HLA-结合肽设置成由不少于8个且不超过11个氨基酸残基组成。
以这种方式，如果肽由不少于8个并且不超过11个氨基酸残基组成，其在与HLA分子的结合上具有优良的性质。此外，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异性识别对癌细胞特异的癌症抗原(CTL表位)，并通过只破坏癌细胞消灭癌细胞，所述癌症抗原由8-11个氨基酸组成、存在于癌细胞表面上的HLA I类分子中。这对于制备所述由8-11个氨基酸组成的、对癌细胞等特异的CTL表位，以便制备治疗或预防癌症等的疫苗是很重要的。
例如，上述HLA-结合肽可以是单独由氨基酸残基组成的肽，但是并不特别受此限制。例如，只要本发明的效果不受损，它可以是任选用糖链或脂肪酸基团修饰的HLA-结合肽前体。所述前体经过在活哺乳动物体内如人类消化器官中被消化酶等消化，改变成为HLA-结合肽，进而表现出与上述HLA-结合肽所显示的相似的作用。
此外，上述HLA-结合肽可以是与人HLA-A24分子结合的肽。
根据这样的组成，由于所得的肽与常见于亚洲人如日本人的HLA-A24分子结合，其可以用于开发对亚洲人如日本人特别有效的治疗药、预防药等。
另外，上述HLA-结合肽可以是与人HLA-A2分子结合的肽。
根据这样的组成，由于所得的肽与常见于欧美人的HLA-A2分子结合，其可以用于开发对欧美人特别有效的治疗药、预防药等。
含在上述HLA-结合肽的氨基酸序列可以是来自癌症抗原WT1蛋白的氨基酸序列，但是并不特别受此限制。例如，其可以是来自HIV蛋白的氨基酸序列，或来自雪松花粉蛋白等的氨基酸序列。而且，它可以含有来自具有其他致病性或致敏性的蛋白的氨基酸序列。
实施方案2根据本实施方案，提供了与HLA-A型分子结合，含有通过对包含在上述HLA-结合肽中的氨基酸序列的一个或两个氨基酸残基进行缺失、置换或添加而形成的氨基酸序列，并由不少于8个并且不多于11个氨基酸残基组成的HLA-结合肽。
如在后文所描述，即使组成中包括了通过对与HLA-A型分子结合的特定氨基酸序列的一个或数个氨基酸残基进行缺失、置换或添加而形成的氨基酸序列，仍表现出与上述实施方案1有关的HLA-结合肽相似的作用。
即，可以预测，即使氨基酸序列是通过对显示在SEQ ID NOS1至50中、具有与HLA-A24分子的优良结合性的氨基酸序列的一个或两个氨基酸残基进行缺失、置换或添加而形成，仍将以相似的方式表现出优良的HLA-结合性。
从另一个观点来看，可以预测，即使氨基酸序列是通过对上述方法预测的、具有与HLA-A24分子优良结合性的氨基酸序列的一个或数个氨基酸残基进行缺失、置换或添加而形成，仍将以相似的方式表现出优良的HLA-结合性。被置换的氨基酸残基优选彼此具有相似性质的氨基酸残基，如二者均为疏水氨基酸残基。
此外，实施方案1和实施方案2中描述的HLA-结合肽可以利用本领域技术人员已知的方法生产。例如，它们可以通过固相法或液相法人工合成。或者，这些HLA-结合肽可以通过编码这些HLA-结合肽的DNA片段或重组载体对其进行表达而生产。这样得到的这些HLA-结合肽可以通过本领域技术人员已知的方法鉴定。例如，可能通过使用Edman降解法、质谱法等鉴定。
实施方案3根据本实施方案，提供了含有编码上述HLA-结合肽的DNA序列的DNA片段。由于本实施方案有关的DNA片段含有特异性DNA序列，其可以表达上述HLA-结合肽。
当上述HLA-结合肽通过使用本实施方案有关的DNA片段表达时，可以通过将该DNA片段掺入细胞进行表达，或者可以通过使用市售人工蛋白表达盒进行表达。
另外，持续的表达可以通过将上述DNA片段掺入例如人类细胞进行。因此，HLA-结合肽可以制成在细胞内持久存在，方法是通过将编码HLA-结合肽的DNA片段掺入细胞，而不是将HLA-结合肽本身掺入细胞。当HLA-结合肽用作疫苗时，所述持续表达的能力在提高疫苗有效性方面是有利的。
此外，本实施方案有关的DNA片段可以通过本领域技术人员已知的方法生产。例如，可以依靠市售DNA合成仪等人工合成。或者，可以通过使用限制型酶等从HCV基因组切割片段。或者，可以通过用引物进行PCR法从HCV基因组扩增。这样得到的DNA片段可以用本领域技术人员已知的方法鉴定。例如，可以通过市售DNA测序仪鉴定。
实施方案4根据本实施方案，提供了含有编码上述HLA-结合肽的DNA序列的重组载体。由于本实施方案有关的重组载体含有特异性的DNA序列，可以表达上述HLA-结合肽。
当上述HLA-结合肽通过使用本实施方案有关的重组载体表达时，可以通过将该重组载体掺入细胞进行表达，或者可以通过使用市售人工蛋白表达盒进行表达。
此外，持续的表达可以通过将上述重组载体掺入例如人类细胞进行。因此，HLA-结合肽可以通过将编码HLA-结合肽的重组载体掺入细胞，而不是将HLA-结合肽本身掺入细胞制成在细胞内持久存在。当HLA-结合肽用作疫苗时，所述持续表达的能力在提高疫苗有效性方面是有利的。
另外，在上述重组载体中，HLA-结合肽的表达量，可以通过使用在参与转录和表达的调节区中的某个序列，如编码上述HLA-结合肽的DNA序列的上游启动子区，进行高精确度的控制。而且，重组载体在细胞中的拷贝数，可以使用参与复制的调节区的某个序列，如重组载体的复制起始点(origin)区进行高精确度的控制。
此外，上述重组载体可以自由地包含除编码上述HLA-结合肽的DNA序列以外的序列。例如，可以包含标记基因如耐药基因。
另外，本实施方案有关的重组载体可以用本领域技术人员已知的方法生产。例如，可以通过在某个限制型酶切位点，裂解市售载体如pBR322或pUC19的多克隆位点，将上述DNA片段插入该位点，并进行连接获得。此外，这样得到的重组载体可以利用本领域技术人员已知的方法鉴定。例如，其可以通过琼脂糖凝胶电泳证实被预先的限制酶裂解的DNA片段的长度是否符合市售载体如pBR322或pUC19的限制性图谱，此外，它可以通过DNA测序仪等鉴定上述DNA序列是否包含在从多克隆位点上切下来的DNA序列中。
以上说明了本发明的组成，但是这些组成的任何组合，作为本发明的实施方案也有效。此外，将本发明的表达转化为另一个类型，作为本发明的实施方案也是有效的。
例如，在上述实施方案中，HLA-结合肽含有来自癌症抗原WT1的某个基因组蛋白(SEQ ID NO61)的氨基酸序列，但是不同于WT1的病原体如HIV病毒的HLA-结合肽也可使用，并且含有来自蛋白质如雪松花粉过敏原等的氨基酸序列的HLA-结合肽也可使用。
这样，如果含有上述方法预测的具有优良HLA-结合性质的氨基序列，可以预期，当用实验进行证实时，其将以相似的方式表现出优良的HLA-结合性质。因此，这些HLA-结合肽能主要适用于治疗或预防感染性疾病(流感，SARS，HIV，HCV等)，并也能用于癌症免疫疗法、过敏性疾病(花粉过敏(干草热(hay fever))，风湿、遗传性过敏症、哮喘等)、自身免疫疾病等。
(实施例1)参考实施例在下面进一步说明本发明，但是本发明并不限于此。
具体而言，本实施例中预测、实验和评价过程基于主动学习实验设计进行，并且大体上重复了下列步骤。这里采用的主动学习实验设计的示意图示于图1中。
(1)进行一次后文描述的低阶学习算法(lower-order learningalgorithm)的试验。即，从累积的数据中随机抽样产生多个假设，至于随机表达的候选查询点(肽)，选择表现出预测值最大分布的点作为进行实验的查询点。
(2)所选的查询点的肽以合成和提纯的方法制备，后文加以描述，实际结合能力以将在后文描述的实验测定，并添加到累积的数据中。
在本实施例中，作为低阶学习算法，运用了隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model)的监督学习算法，用223种类型的肽作为初始资料开始，每个实验预测和选择20-30类型的肽；上述步骤重复四次，总共得到341个数据点。
更具体说，在本实施例的主动学习方法中，每个实验设计并合成了20-30种类型的含有氨基酸序列的肽，其中设置(arrange)了20类型的氨基酸中9类。测定其与HLA分子的结合强度(结合力)。得到结合力(在摩尔浓度中的Kd值)为实验结果。当结合力高时，该肽被选择作为能用作疫苗材料的HLA-结合肽的候选物。
这样得到的结果输入配有采用隐马尔可夫模型作为数学算法的学习机的学习系统中，并创建规则。学习机从不同结果取样，准备规则。学习机表达的规则有不同的组成。这样得到的规则和实验数据根据需要保存作为累积数据。
从超过5000亿(＝209)的肽序列中，用规则选择后续实验的候选物，重复上述过程。在此阶段，不同的规则用于实验候选物，实验结果的预测有分歧的候选物接受实验。这样，由于实验结果的预测有分歧的候选物接受随后实验，就提高了预测的最终精确度。
这样，多个学习机进行选样，其中选择会给出不同预测的样本作为实验候选物，能够得到有效信息，并得到高精确度的假设(规则)。如后文实施例所述，重复上述过程四次，给出了极好的结果。重复七次或更多次给出了更好的结果。
根据这样的主动学习方法，可以减少对9个氨基酸残基组成的肽的结合实验的重复次数，否则不得不对HLA-结合肽的所有候选物的5000亿或更多组合进行实验。在主动学习方法中，通过实验形成规则，对用规则预测的数十个序列候选物重复进行实验。因此，可以削减实验次数，并且大幅减少起始筛选的时间和成本。
此外，通过用主动学习方法得到的规则预测的肽与HLA结合的命中率(hit rate)可达到70-80％，而其它已知技术如锚法(anchormethod)的命中率则低达约30％。
<肽的合成和提纯>
以Merrifield固相法用Fmoc氨基酸手工合成肽。在脱保护后，用C18柱进行反相HPLC提纯，纯度为95％或更高。肽的鉴定和其纯度的确定用MALDI-TOF质谱(Voyager DE RP，PerSeptive)进行。肽的定量分析以Micro BCA分析(Pierce Corp.)用BSA作为标准蛋白进行。
<肽与HLA-A24分子的结合实验>
肽与HLA-A*2402基因产物的HLA-A24分子的结合力，用表达HLA-A24分子的C1R-A24细胞测定(细胞由在Ehime大学MasakiYasukawa助教的许可下供应Kumamoto大学的Masafumi Takiguchi教授制备)。
C1R-A24细胞首先暴露在pH 3.3的酸性条件下30秒，从而解离并脱去通常与HLA I类分子结合的轻链β2m，以及原来与HLA-A*2402分子结合的内源肽。中和后，在C1R-A24细胞中加入纯化的β2m，将所得的产物加入肽的系列稀释液中，在冰上孵育4小时。用荧光标记的单克隆抗体17A12进行染色，所述抗体能识别三个组成部分的结合体(MHC-pep)，即HLA-A*2402分子、肽和β2m，它们在孵育期间再结合。
随后，每个C1R-A24细胞的MHC-pep计数(与上述荧光抗体的荧光强度成比例)用FACScan荧光激活细胞分类器(BectonDickinson Biosciences)进行定量测定。HLA-A24分子和肽之间的结合解离常数Kd值从每个细胞的平均荧光强度通过已发表的方法(Udakaet al.，Immunogenetics，51，816-828，2000)计算。
<肽与HLA-A2分子的结合实验>
肽与HLA-A*0201基因产物的HLA-A2分子的结合能力用表达HLA-A*0201的JY细胞株进行测定。
JY细胞首先暴露在pH 3.8的酸性条件下30秒，从而解离并脱去与HLA-A*0201分子非共价结合的轻链β2m和内源肽。中和后，进行再结合实验。
上述JY细胞和纯化的β2m加至要测定结合力的肽的梯级稀释液中，在冰上孵育4小时。在该点再结合的HLA-A*0201分子用结合型特异性荧光标记的单克隆抗体BB7.2染色。
随后，每个细胞的荧光量用流式细胞仪测定，并通过已发表的方法计算在摩尔浓度中的解离常数Kd值(Udaka et al.，Immunogenetics，51，816-828，2000)。
<结果评价>
得到了示于上文中表1和2中的预测结果和实验结果。
表1中SEQ ID NOS1-30的序列是由包含在GENEBANK登记的某个WT1蛋白的全长序列中的9个氨基酸残基组成的序列。此外，SEQ ID NOS1-30的序列如实施方案1所述的实验设计方法得到的假设所预测，是与HLA-A24分子有优异结合的序列。SEQ ID NOS1-30以结合力降序排列。即，SEQ ID NO1是预测的具有最佳结合力的序列。WT1的确定的基因组蛋白的全长氨基酸序列显示在SEQID NO61中。
表1显示了用上述预测程序、预测分数和相应的结合实验数据得到的预测结果中，分数优异的30个氨基酸序列。所有的结合实验数据，通过上述的合成方法，以人工合成WT1肽序列获得。
此外，表2中的SEQ ID NOS31-60的序列是包含在GENEBANK登记的WT1的某个蛋白全长序列中的9个氨基酸残基组成的序列。此外，SEQ ID NOS31-60的序列如实施方案1所述的实验设计方法得到的假设所预测，是与HLA-A2分子有优异结合的序列。SEQ ID NOS31-60以结合力降序排列。即，SEQ ID NO31是预测具有最佳结合力的序列。
WT1的某个蛋白的全长序列显示在SEQ ID NO61中。(MGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL)。
表2显示了用上述预测程序、预测分数和相应的结合实验数据得到的预测结果中，分数优异的30个氨基酸序列。所有的结合实验数据，通过上述的合成方法，以人工合成的WT1肽序列获得。
可以预测，由一个或两个氨基酸残基彼此置换形成的任何肽序列，将显示出与HLA-分子优异的结合。总之，即使氨基酸序列通过显示在SEQ ID NOS1-60、与HLA-A分子有优异结合性的氨基酸序列的一个或几个氨基酸残基的缺失、置换或添加而形成，可以预测会同样显示优异的HLA-结合性质。
从另一个观点来看，即使氨基酸序列是通过如实施方案1所述的实验设计方法获得的假设所预测的、具有与HLA-A分子优异结合力的氨基酸序列的一个或几个氨基酸残基的缺失、置换或添加而形成，可以类似地说显示了优异的HLA-结合性质。置换的氨基酸残基优选彼此性质相似的氨基酸残基，如两个疏水氨基酸残基。
发明人之一的Udaka等人已报告，即使通过置换肽序列中的一个或两个氨基酸残基而形成的肽序列，也将类似地显示与抗原递呈分子的优异结合性质。
1.″Decrypting the structure of MHC-I restricted CTL epitopeswith complex peptide libraries.″Keiko Udaka，Karl-Heinz Wiesmuller，Stefan Kienle，Gunter Jung and Peter Walden.J.Exp.Med.181，2097-2108(1995).
2.″Tolerance to amino acid variations in peptides binding to theMHC class I protein H-2Kb.″Keiko Udaka，Karl-Heinz Wiesmuller，Stefan Kienle，Gunter Jung and Peter Walden.J.Biol.Chem.270，24130-24134(1995).
3.″Self MHC-restricted peptides recognized by all alloreactive Tlymphocyte clone.″Keiko Udaka，Karl-Heinz Wiesmuller，Stefan Kienle，Gunter Jung and Peter Walden.J.Immunol.157，670-678(1996).
因此，可以预测，即使本发明所述的癌症抗原WT1衍生的肽，甚或上述通过置换肽序列中一个或两个氨基酸残基形成的肽序列，将类似地显示与HLA-A分子的优异结合性。
本发明参考实施例进行上述说明。这些实施例仅作为实施例的示例，本领域的技术人员应当了解可能有多种修改的实施例，并且这样的修改的实施例包括在本发明的范围内。
序列表<110>日本电气株式会社(NEC Corporation)国立大学法人高知大学(Kochi University)<120>HLA结合肽，以及编码所述HLA结合肽的DNA片段和重组载体(HLA binding peptides，DNA fragment encoding the same and recombinant vector)<130>SCT071173-66<160>61<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe1 5
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<210>28<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>28His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile1 5<210>29<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>29Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu1 5<210>30<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>30Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val1 5<210>31<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>31Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val1 5
<210>32<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>32Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val1 5<210>33<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>33Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu1 5<210>34<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>34Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile1 5<210>35<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>35Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly1 5
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Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser245 250 255Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile275 280 285His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro290 295 300Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys325 330 335Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp355 360 365Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln370 375 380Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys405 410 415Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val420 425 430Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala435 440 445Leu
权利要求
1.一种与HLA-A型分子结合的HLA-结合肽，所述HLA-结合肽包括至少一种类型选自SEQ ID NOS1至60的氨基酸序列，并且不少于8个且不超过11个氨基酸残基。
2.权利要求1所述的HLA-结合肽，包括至少一种类型选自SEQID NOS1，2，3，4，5，6，7，10，14，29，30，31，33，38，39，40，43，44，49和51的氨基酸序列。
3.一种与HLA-A型分子结合的HLA-结合肽，所述HLA-结合肽包括通过对权利要求1或2所述的HLA-结合肽中包含的所述氨基酸序列的一个或两个氨基酸残基进行缺失、置换或添加而形成的氨基酸序列，并且不少于8个且不超过11个氨基酸残基。
4.权利要求1至3任一项所述的HLA-结合肽，其中所述HLA-结合肽与人HLA-A24分子结合。
5.权利要求1至3任一项所述的HLA-结合肽，其中所述HLA-结合肽与人HLA-A2分子结合。
6.包括编码权利要求1至5任一项所述的HLA-结合肽的DNA序列的DNA片段。
7.包括编码权利要求1至5任一项所述的HLA-结合肽的DNA序列的重组载体。
8.在哺乳动物体内改变为权利要求1至5任一项所述的HLA-结合肽的HLA-结合肽前体。
全文摘要
本发明提供了一种与HLA－A型分子结合的HLA－结合肽，所述HLA－结合肽包括至少一种类型选自SEQ ID NOS1至60的氨基酸序列，并且不少于8个且不超过11个氨基酸残基。由预测程序，利用图1所示的主动学习实验方法预测，所有的氨基酸序列都具有与人HLA－A24分子或人HLA－A2分子结合的性质。
文档编号C07K7/06GK101031648SQ20058003156
公开日2007年9月5日 申请日期2005年9月13日 优先权日2004年9月17日
发明者宫川知也, 宇高惠子 申请人:日本电气株式会社, 国立大学法人高知大学