血管生成素样4蛋白抑制剂，组合，以及其用途的制作方法

专利名称：血管生成素样4蛋白抑制剂，组合，以及其用途的制作方法
技术领域：
本发明总体涉及人疾病和病理状况诸如癌症的治疗。本发明涉及血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)抑制物以及ANGPTL4抑制物与其它治疗剂的组合，以及利用所述组合物进行疾病或病理状况的诊断和治疗的方法。
背景技术：
癌症是美国的首要死亡原因。已经采用各种类型的治疗来治疗癌症。例如，采用手术方法去除癌性或死亡组织。通过减小固体肿瘤起作用的放射治疗以及杀灭快速分裂细胞的化疗用作癌症治疗。
1971年，Folkman提出抗血管生成可能是有效的抗癌策略。Folkman，N.Engl.J.Med.285，1182-1186(1971)。血管生成是从已经存在的血管和/或循环的内皮干细胞形成新血管的发展过程(见例如，Ferrara & Alitalo，NatureMedicine 5(12)1359-1364(1999))。血管生成是以下过程组成的级联1)蛋白酶释放后局部位点的细胞外基质的降解，2)毛细血管内皮细胞的增殖，和3)毛细小血管向血管生成性刺激的迁移。Ferrara et al.Endocrine Rev.1318-32(1992)。
心血管的生长是胚胎和出生后发育的正常生理过程如胚胎形成，伤口愈合以及月经的先决条件。见例如Folkman and Klagsbrun Science 235442-447(1987)。心血管从预存在的毛细血管的这种增殖还在各种疾病的病理发展中起重要作用，包括但不限于，例如肿瘤，增殖性视网膜疾病，年龄相关的黄斑变性，银屑病，炎症，糖尿病和类风湿性关节炎(RA)。见例如，Ferrara，RecentProg.Horm.Res.5515-35(2000)，discussion 35-6。
由于血管生成的重要的生理和病理重要性，进行大量工作说明能调节该过程的因素。提示血管生成过程受到促-和抗-血管生成分子之间平衡的调节，并且在各种疾病具体是癌症中出现异常。见例如Carmeliet and Jain Nature407249-257(2000)。
例如，血管生成有赖于分泌的因子如血管内皮生长因子-A(VEGF，也已知为血管通透性因子(VPF))以及纤维母细胞生长因子(FGF)。见例如，Ferraraand Davis-Smyth Endocrine Rev.184-25(1997)；和，Ferrara J.Mol.Med.77527-543(1999)。除了作为血管生成和脉管形成中的生血管因子以外，VEGF作为多向性生长因子，在其它生理过程中显示多重生物作用，诸如内皮细胞存活，血管通透性和血管扩张，单核细胞趋化以及钙内流。Ferrara andDavis-Smyth(1997)，supra。此外，研究报道了VEGF对少数非内皮细胞类型的促有丝分裂效应，诸如视网膜色素内皮细胞，胰导管细胞和雪旺细胞。见例如，Guerrin et al.J.Cell Physiol.164385-394(1995)；Oberg-Welsh et al.Mol.Cell.Endocrinol.126125-132(1997)；和，Sondell et al.J.Neurosci.195731-5740(1999)。
VEGF属于包括胎盘生长因子(PlGF)，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D和VEGF-E的基因家族。这些配体结合并连接于内皮细胞上表达的酪氨酸激酶受体。例如，VEGF酪氨酸激酶受体家族包括Flt1(VEGF-R1)(VEGF，VEGF-B和PlGF)，Flk1/KDR(VEGF-R2)(其结合VEGF，VEGF-C，VEGF-D，和VEGF-E)，和Flt4(VEGF-R3)(其结合VEGF-C和VEGF-D)。见例如，Ferraraet al.，Nature Medicine 9(6)669-676(2003)；和Robinson & Stringer，Journal ofCell Science，114(5)853-65(2001)。
血管生成素是另一组血管内皮生长因子。见例如，Davis et al.，Cell，871161-1169(1996)；Suri et al.，Cell，871171-1180(1996)；Maisonpierre et al.Science 27755-60(1997)；和Valenzuela et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA961904-1909(1999)。血管生成素与VEGF的作用互补且协同，其中VEGF在血管发育中起作用而血管生成素可通过调节血管的重构、成熟以及稳定化起作用。见例如，Holash et al.，Oncogene 185356-5362(1999)。血管生成素1，血管生成素2，血管生成素3和血管生成素4结合酪氨酸激酶Tie2(也称为Tek)受体，其是见于内皮细胞上的受体。见例如，Ward & Dumont，Seminars inCell & Developmental Biology，1319-27(2002)。还有Tie1孤儿受体。
血管生成不仅有赖于生长因子，还受细胞粘附分子(CAM)的影响，其中包括整合素，它们结合细胞基质中存在的配体。见例如，Ferrara & Alitalo，Nature Medicine 5(12)1359-1364(1999)；和Carmeliet，Nature Medicine，6(3)389-395(2000)。整合素促进细胞粘附并迁移到见于细胞间隙以及基底膜的细胞外基质蛋白。细胞粘附蛋白的整合素家族由至少18α和8β亚基构成，所述亚基在至少22个αβ异源二聚体组合中表达。见例如，Byzova et al.，Mol.Cell.，6(4)851-860(2000)；和Hood and Cheresh，Nature Reviews，291-99(2002)。其中，至少6种(αVβ3，αVβ5，α5β1，α2β1，αvβ1和α1β1)组合见于血管生成(见例如，Hynes and Bader，Thromb.Haemost.，78(1)83-87(1997)；以及，Hynes et al.，Braz.J.Med.Biol.Res.，32(5)501-510(1999))。发现编码特异性粘附受体的各种基因的灭活或在动物模型中给药封闭型抗体对于内皮细胞的血管生成反应有影响。见例如，Elicieri and Cheresh，Mol.Med，4741-750(1998)。
这些分子已经成为癌症治疗的靶。例如，认识到VEGF是病理疾病中血管生成的主要调节物导致封闭VEGF活性的多种尝试。抑制性抗-VEGF受体抗体，可溶受体构建体，反义策略，针对VEGF的RNA适体以及低分子量VEGF受体酪氨酸激酶(RTK)抑制物均可用于干扰VEGF信号。见例如，Siemeister et al.Cancer Metastasis Rev.17241-248(1998)。抗-VEGF中和抗体已经显示可抑制裸小鼠中多种人肿瘤细胞系的生长(Kim et al.Nature362841-844(1993)；Warren et al.J.Clin.Invest.951789-1797(1995)；Borgstrm et al.Cancer Res.564032-4039(1996)；和Melnyk et al.Cancer Res.56921-924(1996))，并且也抑制缺血视网膜疾病中的眼内血管生成(Adamis etal.Arch.Ophthalmol.11466-71(1996))。事实上，人源化的抗-VEGF抗体，bevacizumab(AVASTIN，Genentech)已经得到US FDA的证实可作为转移性结肠直肠癌的一线治疗。见例如，Ferrara et al.，Nature Reviews DrugDiscovery，3391-400(2004)。
然而，目前的癌症治疗方法不总是最优化的。通常，单一类型的治疗不能完全抑制病理疾病。例如，外科手术通常不能去除所有癌性生长物。其它癌症疗法，诸如化疗，有许多副作用，和/或治疗由于例如癌症对于药物或治疗产生抗性而变得无效。VEGF或VEGR受体或Tie2受体系统的抑制有时不能完全抑制肿瘤生长。见例如，Gerber et al.，Cancer Research，606253-6258(2000)；Ferrara et al.，Nature ReviewsDrug Discovery，3391-400(2004)；Millauer et al.，Nature 367，576-579(1994)；Kim et al.，Nature 362841-844(1993)；Millauer et al.，Cancer Res.561615-1620(1996)；Goldman etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 958795-8800(1998)；Asano et al.，CancerResearch，555296-5301(1995)；Warren et al.，J.Clin.Invest.，951789-1797(1995)；Fong et al.，Cancer Res.5999-106(1999)；Wedge et al.，Cancer Res.60970-975(2000)；Wood et al.Cancer Res.602178-2189(2000)；Siemeister etal.，Cancer Res.593185-3191(1999)；Lin et al.，J.Clin.Invest.103159-165(1999)；Lin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA958829-8834(1998)；and，Siemeister et al.，Cancer Res.59，3185-3191，(1999)。
因此，迫切需要新的且更为有效的调节癌症的疗法。本发明强调这些以及其它需要，其从以下公开中显而易见。

发明内容
本发明涉及血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)的抑制剂以及利用所述抑制剂治疗疾病和病理情况的方法，例如阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长，阻断或减慢复发性肿瘤生长等。本发明提供ANGPTL4抑制剂与抗癌药剂的组合，以及利用所述组合抑制肿瘤生长和/或涉及血管生成的疾病例如肿瘤形成(例如肿瘤生长)和非肿瘤形成疾病的方法。
ANGPTL4的调节物，例如ANGPTL4拮抗剂或激动剂也在本发明提供。本发明的ANGPTL4拮抗剂是抑制或降低ANGPTL4活性的分子。ANGPTL4抑制剂包括小分子量物质，多核苷酸，反义分子，RNA适体，针对ANGPTL4或其受体多肽的核酶，多肽，ANGPTL4的拮抗剂变体，分离的蛋白，重组蛋白，抗体，或其偶联物或融合蛋白，所述抑制剂可直接或间接抑制ANGPTL4活性。本发明的一些实施方案中，拮抗剂ANGPTL4抗体是通过与ANGPTL4蛋白的特异性亚序列或区域结合来抑制或降低ANGPTL4活性的抗体，所述特异性亚序列活区域例如人ANGPTL4的N末端，N末端螺旋区，C末端，C末端纤维蛋白原样区，或ANGPTL4(1-183)，ANGPTL4(23-183)，ANGPTL4(1到约162)，ANGPTL4(约162-406)，ANGPTL4(23-406)，或ANGPTL4(184-406)氨基酸亚序列，和/或鼠ANGPTL4的mANGPTL4(1-183)，mANGPTL4(23-183)，mANGPTL4(1到约165)，mANGPTL4(23到约165)，mANGPTL4(23-410)或mANGPTL4(184-410)氨基酸亚序列。其他序列还包括但不限于例如，hANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-406，60-406，80-406，100-406，120-406，140-406，和160-406，和例如mANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-410，60-410，80-410，100-410，120-410，140-410和160-410。本发明的一些实施方案中，ANGPTL4拮抗剂包括抗-αVβ5抗体，例如拮抗剂抗-αVβ5抗体。一些实施方案中，本发明的抗体是人源化抗体。本发明的一些实施方案中，ANGPTL4拮抗剂是SiRNA分子。一个实施方案中，SiRNA分子是ANGPTL4-SiRNA分子，该分子靶向编码ANGPTL4的核酸的DNA序列(例如，GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA)(SEQ ID NO3)。
提供了阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长的方法。在一些实施方案中，所述方法包括给药肿瘤或癌细胞有效量的血管生成素4样(ANGPTL4)拮抗剂。另一实施方案中，ANGPTL4拮抗剂是拮抗剂抗-αVβ5抗体。有效量阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长。抑制肿瘤细胞迁移的方法也在本发明提供。例如，这样的方法，包括将有效量的ANGPTL4拮抗剂给药肿瘤细胞，由此抑制它们的迁移。本发明一个实施方案中，ANGPTL4拮抗剂的给药抑制转移。
其它治疗剂，例如一或多种抗癌药剂，针对相同或不同抗原的多重抗体，一或多种抗血管生成药剂或抑制剂，疼痛药物等可与ANGPTL4拮抗剂联用和/或一起给药。其它治疗方法，例如手术方法，放射疗法等也可在本发明的方法中或与本发明的组合物一起联用和/或给药肿瘤和/或癌细胞。本发明还提供联用组合物，例如包括抗癌药剂(例如，抗血管生成药剂，等)，ANGPTL4拮抗剂，和载体(例如可药用载体)的组合物。
抗癌药剂包括但不限于，例如本领域抑制的抗癌药剂以及本文描述的那些。一些实施方案中，抗癌药剂包括一或多种抗血管生成药剂，例如VEGF拮抗剂和抑制物等。一个实施方案中，VEGF拮抗剂包括抗-VEGF抗体或其活性片段(例如人源化的A4.6.1，Avastin，等)。一些实施方案中，抗癌药剂包括一或多种化疗剂。
也提供了阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长的联用疗法。一些实施方案中，所述方法包括给药肿瘤或癌细胞有效量的抗癌药剂，以及给药肿瘤或癌细胞有效量的tANGPTL4拮抗剂。可选或此外，可给药包含有效量抗癌药剂(例如抗血管生成药剂等)和有效量ANGPTL4拮抗剂的联用组合物。联用的有效量阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长。
阻断或减慢复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法也在本发明提供。本发明一些实施方案中，受试者曾经或正在接受利用至少一种抗癌药剂进行的癌症疗法，并且给药受试者有效量的ANGPTL4拮抗剂。给药有效量的ANGPTL4拮抗剂阻断或减慢复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。一些实施方案中，受试者曾经或正在接受利用ANGPTL4拮抗剂进行的癌症疗法，并且给药受试者有效量的抗癌药剂(例如抗血管生成药剂)，给药有效量的抗癌药剂阻断或减慢复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。
通常，肿瘤或癌细胞在受试者内。一些实施方案中，受试者曾经或正在接受利用至少一种抗癌药剂进行的癌症疗法。通常，受试者是哺乳动物(例如人)。一些实施方案中，将本发明的药剂给药受试者。给药或方法步骤可以任何顺序进行。一个实施方案中，它们依次进行。另一实施方案中，它们同时进行。可选或此外，所述步骤作为依次和同时的组合，以任何顺序进行。
还提供了ANGPTL4调节物的试剂盒。一些实施方案中，试剂盒包含ANGPTL4拮抗剂，可药用载体，递送物或稀释剂和容器。一个实施方案中，试剂盒包含第一量的抗癌药剂(例如抗血管生成药剂等)，第二量的ANGPTL4拮抗剂以及可药用载体、递送物或稀释剂，和容器。另一实施方案中，试剂盒包含一定量的抗癌药剂(例如抗血管生成药剂等)，以及可药用载体、递送物或稀释剂，上述物质为第一单位剂量形式；一定量的ANGPTL4拮抗剂以及可药用载体、递送物或稀释剂，上述物质为第二单位剂量形式；和容器。它们的使用说明也包含在其中。
附图简述

图1显示人ANGPTL4的核酸序列(SEQ ID NO1)。
图2显示人ANGPTL4的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图3，图A显示纯化的重组鼠ANGPTL4(23-410)，其在存在(10mM)或缺失二硫苏糖醇(DTT)的条件下在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(4-20％)上分离。图3，图B显示野生型(泳道1)和变体hANGPTL4(泳道2)，其在SDS凝胶上分离并通过western印迹检出，其中变体hANGPTL4具有取代R162G和R164E。
图4，图A，B，和C图示通过利用ANGPTL4表达构建体转导肿瘤细胞，以及通过ANGPTL4表达构建体(2)转导的COS细胞(C)的经调节的培养基(图C)，ANGPTL4刺激A673肿瘤细胞(图A和B)以及U87MG肿瘤细胞(图B)增殖。图B中，肿瘤细胞利用(1)AdLacZ表达构建体对照，(2)Ad-ANGPTL4表达构建体或(3)Ad-SiRNA ANGPTL4构建体转导。图C中，A673肿瘤细胞增殖通过来自Hepa(A)，HMVEC(B)或利用(1)LacZ表达构建体，(2)ANGPTL4表达构建体或(3)ANGPTL3表达构建体转导的COS细胞(C)的经调节的培养基进行。
图5图示了mANGPTL4涂覆于培养皿时促进A673增殖。
图6，图A和B图示了结合A673肿瘤细胞的ANGPTL4的各种形式(图A)以及各种条件下的情况(图B)。
图7，图A和B图示了利用含有ANGPTL4的培养基，生长7天(图A)或4天(图B)时，A673的增殖。图A中，(1)是AdLacZ表达构建体对照，(2)是Ad-hANGPTL4表达构建体，(3)是AdLacZ表达构建体和rmANGPTL4。图B中，(1)是没有添加，(2)是缓冲液对照，(3)mANGPTL4(2.5μg/ml)，(4)是hANGPTL4(2.5μg/ml)，(5)是hIgG-hANGPTL4(2.5μg/ml)，(6)hIgG-mANGPTL4(2.5μg/ml)。
图8，图A，B和C图示了ANGPTL4促进体内肿瘤生长(图A和图B)，以及逃离抗肿瘤治疗的趋势，例如利用抗-VEGF抗体(AVASTIN(Genentech，South San Francisco))，在肿瘤中利用腺病毒-Angptl4构建体肿瘤内给药(图C)。图A和C显示肿瘤植入后肿瘤体积(cm3)相对于天数的变化。图B显示植入20天后，异种移植的A673肿瘤的重量。
图9显示ANGPTL4诱导肿瘤细胞，A673和4T-1的细胞迁移，其中(1)没有添加血清，(2)10％胎牛血清(FCS)，(3)PDGF-BB，和(4)ANGPTL4。
图10，图A和B显示抗-hANGPTL4抗体抑制肿瘤细胞生长，例如图A(HeLa-S3和Caki细胞)以及图B(U87M G，293和A673 cells)，其中(1)抗-hANGPTL4抗体，(2)抗-down综合征(anti-down syndrome)关键区1蛋白(Dscr)抗体对照，和(3)没有添加物质，其中条状图下方的数目表示抗体浓度(μg/ml)。
图11显示293-1953(αVβ5)细胞粘附于ANGPTL4或玻连蛋白包被的板，其浓度在下方表示(μg/ml)，BSA用作对照。
图12显示抗-αVβ5和抗-hANGPTL4抗体消除ANGPTL4细胞粘附活性，其中(1)BSA，(2)玻连蛋白，(3)ANGPTL4。
图13，图A，B，C，D和E显示ANGPTL4与整合素αVβ5的结合。图A显示利用说明的量的蛋白(mANGPTL4，hANGPTL4-N末端，或hANGPTL4-C末端)结合αVβ5包被的板。图B显示抗-hANGPTL4抗体抑制蛋白(mANGPTL4，hANGPTL4-N末端，或hANGPTL4-C末端)与αVβ5包被的板的结合。消除ANGPTL4细胞粘附活性，其中(1)是BSA，(2)是玻连蛋白，(c)是m ANGPTL4。图C显示ANGPTL4与αVβ的结合，其中(1)包被在板上的hANGPTL4-C末端，(2)包被在板上并与抗hANGPTL4一起保温的hANGPTL4-C末端，(3)包被在板上并与抗-Dscr一起保温的hANGPTL4-C末端，(4)包被在板上的玻连蛋白，(5)包被在板上的BSA，所述情况为添加αVβ5之前的情况。
详细描述定义具体描述本发明之前，应理解本发明不限于具体的组合物或生物系统，其当然可变化。也应理解本文术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不用作限制。本发明的说明书和权利要求中，单数形式“一”，“一种”，“该”包括复数含义，除非另外明确说明。因此，例如“一种分子”可选包括两或多个所述分子的组合。除非另有定义，所有科学和技术术语应理解为与它们所述技术领域所用的常见含义相同。为了本发明的目的，在下文描述了以下术语。
术语“ANGPTL4或“Angptl4”指血管生成素-样4多肽或蛋白，以及其天然存在的等位基因形式、分泌的形式以及加工的形式。例如，人ANGPTL4是406氨基酸的蛋白，而小鼠ANGPTL4是410氨基酸的蛋白。术语“ANGPTL4”也指该多肽的片段(例如亚序列，截断的形式等)，包括例如N末端片段，螺旋区，C末端片段，纤维蛋白原样区，人血管生成素样4蛋白的氨基酸1-183，23-183，1到约162，23到约162，23-406，184-406，约162-406，或23-184，以及鼠血管生成素样4蛋白的氨基酸1-183，23-183，1到约165，23到约165，23-410，或184-410。其他片段包括但不限于，例如，hANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-406，60-406，80-406，100-406，120-406，140-406，和160-406，和例如，mANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-410，60-410，80-410，100-410，120-410，140-410和160-410。ANGPTL4的任何所述形式的参考也可在本申请中鉴定，例如，通过“ANGPTL4(23-406)，”“ANGPTL4(184-406)，”“ANGPTL4(23-183)，”“mANGPTL4(23-410)，”“mANGPTL4(184-410)，”等，其中m表示鼠序列。天然ANGPTL4片段的氨基酸位置根据在其天然ANGPTL4中的位置编号。例如，ANGPTL4片段中的氨基酸位置22(Ser)也是天然人ANGPTL4中的位置22(Ser)。例如参见图2。总体来看，天然ANGPTL4片段具有生物活性。
术语“ANGPTL4调节物”指可活化ANGPTL4或其表达的分子例如激动剂或者可抑制ANGPTL4的活性或其表达的分子例如拮抗剂(或抑制剂)。ANGPTL4激动剂包括抗体和活性片段。ANGPTL4拮抗剂指能中和、阻断、抑制、消除，降低或干扰ANGPTL4活性(例如细胞增殖或生长、迁移、粘附或代谢例如脂质)，调节或其表达包括其与ANGPTL4受体例如，αVβ5的结合的分子。ANGPTL4拮抗剂包括例如抗ANGPTL4抗体和其抗原结合片段，受体分子以及特异性结合ANGPTL4由此隔绝其与一或多个受体的结合的衍生物，抗-ANGPTL4受体抗体和ANGPTL4受体拮抗剂诸如受体的小分子抑制物。其他ANGPTL4拮抗剂也包括ANGPTL4的拮抗剂变体，反义分子(例如ANGPTL4-SiRNA)，RNA适体，以及针对ANGPTL4或其受体的核酶。一些实施方案中，拮抗剂ANGPTL4抗体是通过与ANGPTL4的特异性亚序列或区域结合而抑制或降低ANGPTL4活性的抗体，所述亚序列或区域例如N末端片段，螺旋区，C末端片段，纤维蛋白原样区，人血管生成素样4蛋白的氨基酸1-183，23-183，1到约162，23到约162，23-406，184-406，约162-406或23-184，鼠血管生成素样4蛋白的1-183，23-183，1到约165，23到约165，23-410，或184-410。其他亚序列还包括但不限于，例如，hANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-406，60-406，80-406，100-406，120-406，140-406，和160-406，例如，mANGPTL4的40-183，60-183，80-183，100-183，120-183，140-183，40-410，60-410，80-410，100-410，120-410，140-410和160-410。
术语“抗-ANGPTL4抗体”是以足够的亲和力和特异性结合ANGPTL4的抗体。本发明的一些实施方案中，本发明的抗-ANGPTL4抗体可用作靶向和干预与ANGPTL4活性有关的疾病和病症的治疗剂。通常，抗-ANGPTL4抗体不结合其他ANGPTL4同系物，例如，ANGPTL3。
术语″VEGF″和“VEGF-A”可互换使用，意指165个氨基酸的血管内皮细胞因子和相关的121-，145-，183-，189-，和206-氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如Leung et al.Science，2461306(1989)，Houck et al.Mol.Endocrin.，51806(1991)，和Robinson & Stringer，Journal of Cell Science，144(5)853-865(2001)所述，以及其天然存在的等位基因和加工的形式。术语“VEGF”也指多肽的片段，例如包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸8-109的片段。任何所述形式的VEGF在本发明中可称为例如“VEGF(8-109)，”“VEGF(1-109)”或“VEGF165”。“片段”天然VEGF的氨基酸位置根据天然VEGF序列中所示的进行编号。例如，片段活性VEGF的氨基酸位置17(蛋氨酸)也是天然VEGF中的位置17(蛋氨酸)。片段活性VEGF与天然VEGF相比对KDR和/或Flt-1具有结合亲和力。
“抗-VEGF抗体”是以足够的亲和力和特异性结合VEGF的抗体。本发明的抗-VEGF抗体可用作靶向并干扰与VEGF活性有关的疾病或病症的治疗剂。抗-VEGF抗体通常不结合其它VEGF同系物诸如VEGF-B或VEGF-C，也不结合其它生长因子诸如PlGF，PDGF或bFGF。见例如，U.S.Patents6,582,959，6,703,020；WO98/45332；WO 96/30046；WO94/10202；EP0666868B1；美国专利申请20030206899，20030190317，20030203409，和20050112126；Popkov et al.，Journal of Immunological Methods 288149-164(2004)；以及Attorney Docket number P2072R1。抗-VEGF抗体“Bevacizumab(BV)”也已知为“rhuMAb VEGF”或“AvastinTM”，其为重组人源化抗-VEGF单克隆抗体，根据Presta et al.Cancer Res.574593-4599(1997)产生。其包括突变的人IgG1框架区以及阻断人VEGF与其受体的结合的小鼠抗-hVEGF单克隆抗体A4.6.1的抗原结合互补决定区。Bevacizumab大约9.3％的氨基酸序列包括大部分框架区，源自人IgG1，大约7％的序列源自鼠抗体A4.6.1。Bevacizumab的分子量为大约149,000并且是糖基化的。Bevacizumab以及其它人源化的抗-VEGF抗体在2005-2-26提交的美国专利6,884,879中进一步描述。
“VEGF拮抗剂”指能中和、封闭、抑制、消除、减小或干扰VEGF活性包括其与一或多种VEGF受体的结合的分子。VEGF拮抗剂包括抗-VEGF抗体和其抗原结合片段，受体分子以及特异性集合阿VEGF由此锁定与一或多种受体的结合的衍生物，抗-VEGF受体抗体以及VEGF受体拮抗剂诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制物，以及融合蛋白，例如VEGF-Trap(Regeneron)，VEGF121-gelonin(Peregine)。VEGF拮抗剂还包括VEGF的拮抗剂变体，针对VEGF的反义分子，RNA适体，以及针对VEGF或VEGF受体的核酶。
“天然序列”多肽包括具有与源自自然的多肽相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。所述天然序列多肽可分离自自然或可通过重组或合成手段产生。术语“天然序列”多肽具体包括该多肽的天然存在的截短或分泌的形式(例如细胞外区序列)，天然存在的变体形式(例如可选拼接的形式)，以及天然存在的等位基因变体。
“多肽链”是其中每个结构域都通过肽键(与共价作用或二硫键不同)与其他结构域相连的多肽。
多肽“变体”指与相应的天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物活性多肽或其片段。所述变体包括例如，在所述多肽的N和/或C末端添加或缺失了一个或多个氨基酸残基(天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸)的多肽。通常，变体与天然序列多肽或其片段具有至少约80％氨基酸序列同一性，或至少约90％氨基酸序列同一性，或至少约95％或更高的氨基酸序列同一性。变体也包括天然序列的多肽片段(例如亚序列，截短等)，通常具有生物活性。
本文的“氨基酸序列相同性百分数(％)”定义为对位排列该序列且按需要导入间隔以达到最大序列相同性百分数后与所选序列中氨基酸残基相同的候选序列氨基酸残基的百分数，且任何保守取代都不作为该序列相同性的一部分。以测定氨基酸序列相同性百分数为目的的序列对比可按本领域技术内的各种方法完成，例如，使用公众可得到的计算机软件，例如BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可确定用于测量序列对比的合适参数，包括在所比较的序列全长上达到最大对位排列所需的任何算法。然而，为达到本文目的，氨基酸序列相同性值％可通过使用序列比较计算机程序ALIGN-2按下文所述获得，其中图4A-Q提供了ALIGN-2程序的全部源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创作且图4A-Q所示的源代码在美国版权局，华盛顿区，20559以用户文件存档，以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序通过Genentech，Inc.，South San Francisco，California可公开得到或者可从图4A-Q提供的源代码编译。编译ALIGN-2程序应基于UNIX操作系统平台，优选数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不改变。
为达到本文目的，给定氨基酸序列A与，和，或者对给定氨基酸序列B的氨基酸序列相同性％(任选可表述为具有或者包含与，和，或者对给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列相同性％的给定氨基酸序列A)计算如下100乘以分数X/Y其中X是通过序列对比程序ALIGN-2在A和B经该程序进行序列对比中评分为相同性匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中氨基酸残基的总数。可预料到如果氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等时，A与B的氨基酸序列相同性％不等于B与A的氨基酸序列相同性％。
术语“ANGPTL4变体”在本文中用于指上述变体和/或在天然ANGPTL4序列中包括一或多个氨基酸突变的ANGPTL4。可选，所述一或多个氨基酸突变包括一或多个氨基酸取代。本发明所用的ANGPTL4及其变体可通过本领域已知的多种方法制备。ANGPTL4的氨基酸序列变体可通过在ANGPTL4DNA中进行突变来制备。所述变体中包括，例如，在ANGPTL4的氨基酸序列中残基的缺失、插入或取代，例如保藏号为ATCC 209284的核酸编码的人氨基酸序列，或如图2所示。可进行缺失、插入和取代的任何组合以获得具有所需活性的最终构建体。编码所述变体内的突变必需不能位于读码框内并优选不产生可产生二级mRNA结构的互补区。EP 75,444A。
ANGPTL4变体可选通过在编码天然ANGPTL4的DNA中进行定点诱变或噬菌体展示技术来制备，由此产生编码所述变体的DNA，并由此在重组细胞培养物中表达该DNA。
预先确定导入氨基酸序列变异的位点后，所述突变本身无需预确定。例如，为优化突变在给定位点的表现，可在靶密码子或区域进行随机诱变并筛选表达的ANGPTL4变体以获得所需活性的优选组合。在序列已知的DNA中的预先确定位点产生取代突变的技术是已知的，诸如例如定点诱变。本文所述的ANGPTL4变体的制备可通过噬菌体展示技术实现，诸如PCT WO00/63380公开中描述的那些。
选出所述克隆以后，可去除突变的蛋白区域并置于适宜载体中以产生蛋白，通常可采用可用于转化适宜宿主的表达载体类型。
氨基酸序列缺失通常约1-30个残基，优选1-10个残基，优选1-5或更少个残基，通常是连续的。
氨基酸序列缺失包括一个残基到基本上长度不受限制的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。序列内插入(即天然ANGPTL4序列内的插入)可从约1-10个残基，可选1-5，或可选1-3个残基。末端插入的实例包括单个序列与N末端的融合，而无论该单个序列是与宿主细胞异源还是同源，所述融合促进自重组宿主的分泌。
其他ANGPTL4变体是天然ANGPTL4中的至少一个氨基酸序列被去除并在其位置插入不同的残基的那些。本发明的一个实施方案中，ANGPTL4变体包括ANGPTL4的162和/或164的取代或mANGPTL4的169的取代。所述取代可根据表1中所示的那些进行。ANGPTL4变体也可包括本文描述的非天然氨基酸。
氨基酸可根据它们侧链性质的相似性分组(在A.L.Lehninger，inBiochemistry，second ed.，pp.73-75，Worth Publishers，New York(1975)中)(1)非极性Ala(A)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Pro(P)，Phe(F)，Trp(W)，Met(M)(2)不带电的极性Gly(G)，Ser(S)，Thr(T)，Cys(C)，Tyr(Y)，Asn(N)，Gln(Q)(3)酸性Asp(D)，Glu(E)(4)碱性Lys(K)，Arg(R)，His(H)可选，天然存在的残基可根据共有的侧链特性分成几组(1)疏水型正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性亲水型cys，ser，thr；(3)酸性asp，glu；
(4)碱性asn，gln，his，lys，arg；(5)影响链方向的残基gly，pro；和(6)芳香基trp，tyr，phe。
表1

“天然存在的氨基酸残基”(即遗传密码编码的氨基酸残基)可选自下组丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；蛋氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。“非天然存在的氨基酸残基”除了上面列出的天然存在的氨基酸残基的残基，其能共价结合于多肽链内的相邻氨基酸残基。非天然存在的氨基酸残基的实例包括例如正亮氨酸，鸟氨酸，正缬氨酸，同型丝氨酸和其他氨基酸残基同系物，诸如Ellman et al.Meth.Enzym.202301-336(1991) & US专利申请公开20030108885和20030082575中描述的那些。简而言之，这些方法涉及利用非天然存在的氨基酸残基活化阻遏物tRNA然后进行RNA的体外或体内转录和翻译。见例如，US专利申请公开20030108885和20030082575；Noren etal.Science 244182(1989)；和Ellman et al.，supra。
“分离的”多肽是指从其天然环境成份中鉴定和分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染成份是可能干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，且可能包括酶，激素，和其它蛋白型或非蛋白型溶质。在一些的实施方案中，该多肽可纯化成(1)按劳里(Lowry)方法测定的多肽重量超过95％，且最优选重量超过99％，(2)其纯化程度足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列，或(3)在还原型或非还原型条件下进行SDS-PAGE并使用考马斯蓝或者，优选银染测定具有同质性。该分离的多肽包括在重组细胞内的原位多肽，因为该多肽天然环境中的至少一种成份不存在。然而，一般来说，分离的多肽由至少一个纯化步骤制备。
这里的术语“抗体”用其最广泛的意义，尤其包含完整的单克隆抗体，多克隆抗体，由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及能显示所需生物学活性的任何抗体片段。
除非另有说明，术语“多价抗体”在整个说明书中指包含三个和多个抗原结合位点的抗体。多价抗体通常经改造具有三个或多个抗原结合位点并通常不是天然序列IgM或IgA抗体。
“抗体片段”包括完整抗体的仅仅一部分，通常包括完整抗体的抗原结合位点并由此保持了结合抗原的能力。本发明定义包括的抗体片段的实例包括(i)Fab片段，其具有VL，CL，VH和CH1区；(ii)Fab’片段，其为在CH1区的C末端具有一或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1区；(iv)Fd’片段，其具有VH和CH1区并在CH1区的C末端具有一或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体单个臂的VL和VH区；(vi)dAb片段(Ward et al.，Nature 341，544-546(1989))，其含有VH区；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab′)2片段，包括两个通过铰链区二硫桥连接的两个Fab’片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)(Bird et al.，Science242423-426(1988)；and Huston et al.，PNAS(USA)855879-5883(1988))；(x)“二价抗体”，其具有两个抗原结合位点，包括连接于位于相同多肽链中的轻链可变区(VL)的重链可变区(VH)(见例如，EP 404,097；WO 93/11161；andHollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993))；(xi)“线性抗体”，其包括一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，它们与互补轻链多肽在一起形成了一对抗原结合区(Zapata et al.Protein Eng.8(10)1057 1062(1995)；美国专利5,641,870)。
本文中术语“单克隆抗体”指从实质上均一的抗体群获得的抗体，即包含该群体的单个抗体除了可能自然发生的很少量突变以外都相同。单克隆抗体均以高度特异性直接针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的传统(多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆抗体直接针对抗原上的单个决定簇。单克隆抗体除了具有特异性，其优势还在于，它们是通过杂交瘤培养而合成的，无其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆的”指抗体获自实质上均一的抗体群的特征，不应理解为需要由任何具体方法产生抗体。例如根据本发明使用的单克隆抗体可以用由Kohler等，自然，256495(1975)首次描述的杂交瘤方法来制备，或用重组DNA法(如美国专利4,816,567)来制备。“单克隆抗体”还可以是用Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物学杂志，222581-597(1991)所述技术从噬菌体抗体库中分离得到。
本文中单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中所述嵌合抗体中重链和/或轻链的一部分等同于或同源于来自特定物种的抗体或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列，链的其余部分等同于或同源于来自其它物种的抗体或属于另一抗体类或亚类的抗体的相应序列，只要它们展示所需生物学活性(见美国专利4,816,567；Morrison等，美国国家科学院学报，816851-6855(1984))。本文的目标嵌合抗体包括“灵长源化(primatized)”抗体，其包含源于非人灵长类可变区的抗原结合序列(如Old World Monkey，如狒狒，猕猴(rhesus)或恒河猴(cynomolgus monkey))和人的恒定区序列(美国专利5,693,780)。
“人源化”形式的非人(如鼠)抗体是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在多数情况下，人源化抗体是下述人免疫球蛋白(受者(recipient)抗体)，其中受者的高变区残基被非人物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类(供者(donor)抗体)的具有所需特异性、亲和力和容量(capacity)的高变区的残基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。而且人源化抗体可包含未在受者抗体或供者抗体中发现的残基。这些修饰旨在进一步改进抗体的功能。一般情况下，人源化抗体基本上包含至少一个、通常两个完整可变区，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗体任选还包含免疫球蛋白、通常为人免疫球蛋白的恒定区(Fc)的至少一部分。详见Jones等，自然321522-525(1986)；Riechmann等，自然332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
“人抗体”是一种这样的抗体，其氨基酸序列对应于由人产生的和/或已使用如本文所公开的用于制备人抗体的任何方法制备的抗体的氨基酸序列。此人抗体的定义具体地排除了含有非人抗原-结合残基的人源化的抗体。可使用本技术领域已知的各种方法产生人抗体。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等，Nature Biotechnology，14309-314(1996)；Sheets等，PNAS(USA)，956157-6162(1998))；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991))。人抗体也可通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物来制备，例如，内源的免疫球蛋白基因已被部分地或全部失活的小鼠。一旦激发，观察到人抗体产生，这在各个方面十分类似于在人中所见的情况，包括基因重排、组装和抗体库(antibody repertoire)。此方法在，例如，美国专利Nos.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，和在Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992)；Lonberg等，Nature，368856-859(1994)；Morrison，Nature，368812-813(1994)；Fishwild等，NatureBiotechnology，14845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology，14826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.，1365-93(1995)中描述。可选，人抗体可通过产生针对靶抗原的抗体的人B-淋巴细胞的无限增殖(immortalization)来制备(所述B淋巴细胞可从个体回收或可在体外被免疫)。参见，例如，Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)；和US Pat No.5,750,373。
术语“可变的”是指不同抗体的可变区特定部分序列差异很大，且这些部分在每种抗体与其特定抗原的结合和特异性中有用。然而在抗体整个可变区中可变性的分布并不均等。它集中在轻链和重链可变区的三个被称为高变区的节段中。可变区的更高度保守部分被称为框架区(FR)。天然轻链和重链的可变区分别包含四个FR，它们大多采用β片层构象，通过三个高变区相连，这些高变区形成环状，有时形成β片层结构的一部分。每条链的高变区通过FR紧密连接，并与其他链的高变区共同形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，具有免疫学意义的蛋白的序列，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定区不直接参与抗体对抗原的结合，但显示多种效应功能，如使抗体参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。
本文中术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区含有“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变区的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，重链可变区的残基31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，具有免疫学意义的蛋白的序列，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))，和/或“高变环”的残基(例如轻链可变区的残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，重链可变区的残基26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，分子生物学杂志196901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基是除本文所定义的高变区残基以外的可变区残基。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分为不同的类型。有5种主要的免疫球蛋白类型IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，其中的一些可进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，和IgA2。相应于免疫球蛋白不同类型的重链恒定区分别称为α，δ，ε，γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。
来自任一脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，根据其恒定区的氨基酸序列，可称为κ(6)和λ(8)这两个明显不同的类型之一。
术语“Fc区”用于定义可通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体产生的免疫球蛋白重链C末端区。Fc区可为天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的范围可变，人IgG重链Fc区通常定义为从大约位置Cys22或大约位置Pro2306的氨基酸残基到Fc区的羧基末端。免疫球蛋白的Fc区通常包括两个恒定结构域，CH2结构域和CH3结构域，并可选包括CH4结构域。
“Fc区链”在本文意指Fc区的两个多肽链之一。
人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“Cg2″结构域)通常从大约位置231的氨基酸残基延伸到大约位置340的氨基酸残基。CH2结构域的独特之处在于其与其他结构域并不紧密配对。两个N连接的分支碳水化合物链位于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。推测该碳水化合物提供结构域-结构域之间配对的取代基并有助于稳定CH2结构域。Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985)。CH2结构域在本文可为天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。
“CH3结构域”包括Fc区中C末端残基到CH2结构域的片段(即从IgG大约位置341的氨基酸残基到大约位置447的氨基酸残基)。本文的CH3结构域天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如在一条链中具有导入的“突起(protroberance)”以及位于另一条链中的相应的导入的”空腔”的CH3，见美国专利5,821,333，包含在此作为参考)。所述变体CH3结构域可用于如本文所述制备多特异性(例如双特异性)抗体。
“铰链区”通常被定义为人IgG1中从Glu216到Pro230的区域(Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985))。其它IgG同种型的铰链区可与IgG1的序列对比排列，即对齐在相同位置形成重链之链间二硫键的第一个和最后一个半胱氨酸残基。本发明的铰链区可为天然序列铰链区或变体铰链区。变体铰链区的两个多肽链通常保持每个多肽链至少一个半胱氨酸残基，使得变体铰链区的两条多肽链可形成这两条链间的二硫键。本发明优选的铰链区是天然序列人铰链区，例如天然序列人IgG1铰链区。
“功能Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种“效应功能”。示例性“效应功能”包括Clq结合；补体依赖性细胞毒(CDC)；Fc受体结合；抗体-依赖型细胞介导的细胞毒(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)等。所述效应功能通常需要Fc区以便与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合并可利用本领域已知用于评估所述抗体效应功能的各种实验来评估。
“天然序列Fc区”包括与天然Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
“变体Fc区”包括由于至少一种氨基酸修饰而与天然序列Fc区不同的氨基酸序列。优选，变体Fc区与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中具有至少一个氨基酸取代，例如从约1-10个氨基酸取代，优选约1-5个氨基酸取代。本文的变体Fc区通常与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有例如至少约80％的序列同一性，或至少约90％的序列同一性，或至少约95％或更高的序列同一性。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”和“ADCC”指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒细胞(如自然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞，和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞即NK细胞仅表达FcγR III，而单核细胞表达FcγR I，FcγR II和FcγR III。Raveth和Kinet在免疫学年鉴9457-92(1991)，464页的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。为评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC试验，如美国专利5,500,362号或5,821,337号中所述。这类试验中有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。任选或另外，目的分子的ADCC活性可在体内评估，例如在Clynes等PNAS(USA)95652-656(1998)公开的动物模型中。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应物的功能的白细胞。优选所述细胞表达至少FcγR III并执行ADCC效应物的功能。例如可介导ADCC的人白细胞包括人外周血单个核细胞(PBMC)，自然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒T细胞和中性粒细胞；其中优选PBMC和NK细胞。效应细胞可分离自其天然来源，例如如本文所述分离自血液和PBMC。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。而且，优选的FcR是与IgG抗体结合的受体(γ受体)，其包括FcγR I，FcγR II和FcγR III亚型，以及这些受体的等位基因变体和可替换的剪接形式。FcγR II受体包括FcγR IIA(“活化型受体”)和FcγR IIB(“抑制型受体”)，二者的氨基酸序列相似，主要区别在其胞浆结构域。活化型受体FcγR IIA在其胞浆结构域包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受体FcγR IIB在其胞浆结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(见Daeron，免疫学年鉴15203-234(1997))。在Ravetch和Kinet，免疫学年鉴9457-92(1991)；Capel等，免疫方法(免疫学方法)425-34(1994)；和de Haas等，实验室及临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)126330-41(1995)中对FcR进行了综述。其它FcR，包括将来被确定的，均被包含在术语“FcR”中。该术语也包括新生期的受体，FcRn，其负责将母体的IgG转运至胎儿(Guyer等，免疫学杂志117587(1976)和Kim等，免疫学杂志24249(1994))。
“补体依赖性细胞毒作用”或“CDC”是指在补体存在时分子裂解标靶的能力。补体活化途径由补体系统第一个成分(C1q)结合至一个与同源抗原形成化合物的分子(如抗体)来启动。为评价补体活化，可如Gazzano-Santoro等，免疫学方法杂志202163(1996)所述进行CDC试验。
“亲和性-成熟的”抗体是在其一个或多个CDR中具有一或多种变化的抗体，所述变化导致所述抗体与对应的不具有那些变化的亲代抗体相比，前者对于抗原的亲和性改进。优选的亲和性-成熟的抗体将具有纳摩尔的或甚至皮摩尔的靶抗原亲和性。通过本技术领域已知的方法产生亲和性-成熟的抗体。Marks等，Bio/Technology，10779-783(1992)描述了通过VH和VL域重排的亲和性成熟(affinity maturation)。CDR和/或框架残基的随机突变由Barbas等，Proc.Nat.Acad.Sci，USA，913809-3813(1994)；Schier等，Gene，169147-155(1995)；Yelton等，J.Immunol.，1551994-2004(1995)；Jackson等，J.Immunol.，154(7)3310-3319(1995)；和Hawkins等，J.Mol.Biol.，226889-896(1992)描述。
本发明中“柔性接头”指包含通过肽键相连并由此提供的两个或多个氨基酸残基的肽，这为所连接的两个肽(诸如两个Fd区)提供了更多的旋转自由度。所述旋转自由度允许该柔性接头连接的两个或多个抗原结合位点更有效地接近靶抗原。适宜的柔性接头肽序列包括gly-ser，gly-ser-gly-ser，ala-ser，和gly-gly-gly-ser。
“二聚化结构域”通过将至少两个氨基酸残基(通常为半胱氨酸残基)或至少两个肽或多肽(其可具有相同或不同的氨基酸序列)相连而形成。所述肽或多肽可通过共价和/或非共价结合相互作用。本发明二聚化结构域的实例包括Fc区；铰链区；CH3结构域；CH4结构域；CH1-CL对；具有改造的“把手(knob)和/或突起(protruberance)的“界面”，如美国专利5,821,333所描述的那样，该文献包含在本文作为参考；亮氨酸拉链(例如jun/fos亮氨酸拉链，见Kostelney et al.，J.Immunol.，1481547-1553(1992)；或酵母GCN4亮氨酸拉链)；异亮氨酸拉链；受体二聚体对(例如，白介素-8受体(IL-8R)；以及整合素异源二聚体诸如LFA-1和GPIIIb/IIIa)，或其二聚化区；二聚体配体多肽(例如神经生长因子(NGF)，神经生长蛋白(neurotrophin)-3(NT-3)，白介素-8(IL-8)，血管内皮生长因子(VEGF)，VEGF-C，VEGF-D，PDGF成员，以及脑源性神经生长因子(BDNF)；见Arakawa et al.J.Biol.Chem.269(45)27833-27839(1994)和Radziejewski et al.Biochem.32(48)1350(1993))，或其二聚化区；能形成二硫键的半胱氨酸残基对；肽或多肽对，每个都包含至少一个半胱氨酸残基(例如大约1，2或3到约10个半胱氨酸残基)使得肽或多肽之间可形成二硫键(此后称为“合成铰链)；和抗体可变结构域。本发明最优选的二聚化结构域是Fc区或铰链区。
抗体的“功能性抗原结合位点”是能靶向抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力不必要和该抗原结合位点所来源的亲本抗体一样强，但是结合抗原的能力必须能够利用已知用于评估抗体与抗原的结合的多种方法之一测定。此外，本发明的多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力无需在量上相同。对于本发明的多体抗体，功能性抗原结合位点的数量可利用超速离心分析来评估。根据该分析方法，靶抗原与多体抗体可以不同比例组合并且可推定不同的功能性结合位点数量来计算复合体的平均分子量。将这些理论数值与获得的实际试验数值相比较以评估功能性结合位点的数量。
具有规定抗体的“生物学特征”的抗体是具有这样的一或多种抗体生物学特征之一的抗体，所述特征使得其与其他结合于相同抗原的抗体相区分。
为了筛选结合目的抗体所结合的抗原上的表位的抗体，可进行常规的交叉阻断试验诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中所述。
“联用”一或多种其他治疗剂给药包括同时(同时发生的)和/或以任何顺序序贯给药。
用于治疗的“哺乳动物”指任何分类为哺乳动物的动物，包括人、家养动物和农场饲养动物，以及动物园的动物、运动用动物或宠物，诸如狗、马、猫、牛、羊、猪等。通常，所述哺乳动物是人。
“疾病”是任何将从利用本发明的分子的治疗受益的疾病。包括慢性和急性疾病或包括使得哺乳动物易患目的疾病的那些病理情形的疾病。本发明待治疗的疾病的非限制性实例包括任何形式的肿瘤，良性和恶性肿瘤；血管化的肿瘤；肥大；白血病和淋巴恶性疾病；神经元、胶质细胞、星形细胞，下丘脑和其他腺体、巨噬细胞、上皮细胞、基质以及blastocoelic疾病；和炎性、血管生成性和免疫性疾病，由于不适当、异常、过度和/或病理性血管化和/或血管通透性导致的血管疾病。
术语“有效量”或“治疗有效量”指有效治疗哺乳动物中的疾病或病症的药物的量。对于癌症，有效量的药物可减少癌细胞的数量；减小肿瘤体积；抑制(即在一定程度上减慢并通常停止)癌细胞对周围器官的浸润；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与所述疾病相关的一或多种症状。就药物可预防癌细胞生长或杀灭现存的癌细胞而言，其可为抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，体内效力可例如通过评估存活时间，疾病进展时间(TTP)，反应率(RR)，反应持续时间和/或生活重量来评估。
“治疗”是指治疗方法和预防措施。需要治疗者包括已经患疾病者，以及需要对疾病进行预防者。
与本发明ANGPTL4分子相关的术语“生物活性”或“生物活性的”指分子特异性结合并调节细胞反应的能力，所述细胞反应例如增殖，粘附，迁移，制止调节等。细胞反应也包括ANGPTL4受体例如αVβ5整合素受体介导的那些，包括但不限于粘附，迁移和/或增殖。本发明中，术语“调节”包括ANGPTL4受体例如αVβ5整合素受体的激动剂和拮抗剂。
“肥大”在本发明中意指与肿瘤形成无关的、独立于自然生长的器官或结构的体积增加。器官或组织的肥大是由于个体细胞的体积增加(真性肥大)和/或构成组织的细胞数量增加(增生)。
术语“癌”和“癌性的”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长失控为特点的病理状态。癌的实例包括但不限于癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病或淋巴样恶性疾病。所述癌症的更具体实例包括肾癌，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，非癌包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌以及肺的鳞状细胞癌，鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)，宫颈癌，卵巢癌，前列腺癌，肝癌，膀胱癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌包括胃肠癌，胰腺癌，头和颈癌，胶母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，星形细胞瘤，泡膜细胞瘤，卵巢男性细胞瘤，肝细胞瘤，血液恶性疾病包括非何杰金淋巴瘤(NHL)，多发性骨髓瘤和急性血液恶性疾病，子宫内膜或子宫癌，子宫内膜异位症，纤维肉瘤，绒毛膜癌，唾液腺癌，外阴癌，甲状腺癌，食管癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，鼻咽癌，喉癌，卡波奇肉瘤，黑素瘤，皮肤癌，雪旺细胞瘤，寡突细胞瘤，神经母细胞瘤，横纹肌肉瘤，成骨肉瘤，平滑肌肉瘤，尿道癌，甲状腺癌，Wilm瘤，以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡状非何杰金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中间级别/滤泡状NHL；中间级别弥散性NHL；高级别免疫母细胞NHL；高级小非凹陷的细胞(high grade small non-cleavedcell)NHL；bulky病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS-相关的淋巴瘤；和Waldenstrom′s巨球蛋白血症)；慢性淋巴母细胞白血病(CLL)；急性淋巴母细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，以及与瘢痣病相关的异常血管增殖，水肿(诸如与脑肿瘤西那嘎关的)，和Meigs′综合征。
术语“抗肿瘤形成组合物”指用于治疗癌症的组合物，包括至少一种活性治疗剂，例如“抗癌药剂”。治疗剂(抗癌剂)的实例包括但不限于，例如化疗剂，生长抑制剂，细胞毒药剂，用于放射治疗的药剂，抗血管生成药剂，凋亡药剂，抗微管蛋白剂，毒素，以及其它用于治疗癌症的药剂，，例如抗VEGF中和抗体，VEGF拮抗剂，抗-HER-2，抗-CD20，表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)，HER1/EGFR抑制剂，erlotinib，COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))，干扰素，细胞因子，结合ErbB2，ErbB3，ErbB4，或VEGF受体的一或多种的拮抗剂(例如中和抗体)，血小板来源的生长因子(PDGF)和/或干细胞因子(SCG)的受体酪氨酸激酶抑制剂(例如imatinib mesylate(GleevecNovartis))，TRAIL/Apo2，以及其它生物活性和有机化学药剂等。其组合也包含在本发明内。
本文术语″细胞毒药剂″指抑制或防止细胞功能和/或导致细胞破坏的物质。该术语意图包括放射活性同位素(例如，211At，131I，125I，90Y，186Re，188Re，153Sm，212Bi，32P和Lu的放射活性同位素)，化疗剂例如氨甲蝶呤，阿霉素，长春花碱(长春新碱，长春碱，依托泊苷)，多柔比星，美法仑，丝裂霉素C，苯丁酸氮芥，柔红霉素或其它嵌入剂，酶及其片段诸如核酸分解酶，抗生素，和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。
本文所用″生长抑制剂″，是指在体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物，其中所述细胞的生长有赖于活化。因此，生长抑制剂是显著降低S期细胞的百分比的药剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进程的试剂(在S期之外的环节)，譬如，诱导G1期停滞和M-期停滞的试剂。传统的M-期阻断剂包括长春花碱(长春新碱和长春碱)、紫杉烷(taxane)和拓扑酶II抑制剂如阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、依托泊苷和博莱霉素。那些使G1期停滞的试剂也涉及S-期停滞，例如，DNA烷化剂如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷。进一步的信息可在下列文献中找到The Molecular Basis ofCancer，Mendelsohn和Israel编辑，第一章，题目为″Cell cycle regulation，oncogens，and antineoplastic drugs″byMurakami等(WB SaundersPhiladelphia，1995)，特别是第13页。
“化疗制剂”是在癌的治疗中使用的化学化合物。化疗制剂实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa)和CYTOXANTM环磷酰胺(cyclosphamide)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶如苄替哌(bezodepa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；氮丙啶(ethylenimine)和甲基蜜胺包括六甲蜜胺(altretamine)，三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)，三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenins)(具体是bullatacin和bullatacinone)；delta-9-四氢大麻酚(dronabinol，MARINOL)；beta-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)，CPT-11(伊立替康，CAMPTOSAR)，acetylcamptothecin，东莨菪亭，和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)，卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；cryptophycins(具体是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；pancratistatin；sarcodictyin；spongistatin；氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥，萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosmfaide)，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥；美法仑，新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)，松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素诸如enediyne抗生素(例如刺孢霉素(calicheamicin)，具体是刺孢霉素γ1和刺孢霉素ω1(见，例如，Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括蒽环类抗生素A；esperamicin；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色素蛋白enediyne抗生素生色团)，aclacinomysins，放射菌素(actinomycin)，authramycin，氮丝氨酸(azaserine)，博莱霉素(bleomycin)，放线菌素C(cactinomycin)，carabicin，去甲柔红霉素(carminomycin)，嗜癌霉素(carzinophilin)，chromomycinis，更生霉素(dactinomycin)，柔红霉素，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星，氰基吗啉代-多柔比星，2-吡咯啉-多柔比星和去氧多柔比星)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，发波霉素(marcellomycin)，丝裂霉素诸如丝裂霉素 C，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素；链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶呤，吉西他滨(GEMZAR)，喃氟啶(UFTORAL)，卡培他滨(XELODA)，epothilone，5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物例如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氧氟尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷；雄激素类如卡普睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide)，邻氯苯对氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如叶酸(frolinic acid)；醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；elliptinium acetate；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登素类(maytansinoids)诸如美登素(maytansine)和柄型菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；nitraerine；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合体(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺(trichlorrotriethYlamine)；单端孢霉烯(trichothecene)(具体是T-2毒素，verracurin A，杆孢菌素(roridin)A和anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春碱酰胺(ELDISINE，FILDESIN)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；溴丙哌嗪(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；三胺硫磷(thiotepa)；紫杉烷(taxoid)，如TAXOL紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)，紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒配制剂(albumin-engineered nanoparticle formulation ofpaclitaxel)(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)，和doxetaxel(TAXOTERE)；chloranbucil；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱(VELBAN)；铂；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(ONCOVIN)；奥沙利铂(oxaliplatin)；leucovovin；；长春瑞宾(vinorelbine)(NAVELBINE)；novantrone；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素；氨基蝶呤；伊拜膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸类(retinoids)诸如维甲酸；以及上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物；以及两或多种上述药物的组合，诸如CHOP，其为环磷酰胺，阿霉素，长春新碱和泼尼松龙的联合疗法的简称，以及FOLFOX，其为利用奥沙利铂(ELOXATINTM)以及5-FU和leucovovin的联合治疗方案的简称。
此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌激素制剂和选择性雌激素受体调节物(SERM)，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)，雷洛昔芬(raloxifene)(EVISTA)，屈洛昔芬(droloxifene)，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奥那司酮(onapristone)，和托瑞米芬(FARESTON)；抑制芳香酶的芳香酶抑制物，该酶调节肾上腺中的雌激素生成，诸如，例如4(5)-咪唑，氨鲁米特(aminoglutethimide)，MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)，AROMASIN依西美坦(exemestane)，formestanie，法倔唑(fadrozole)，RIVISOR伏氯唑(vorozole)，FEMARA来曲唑(letrozole)，和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole)；和抗雄激素制剂如氟他氨(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，比卡鲁胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，具体是抑制异常细胞增生所涉及的信号途径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，诸如，例如，PKC-α，Ralf和H-Ras；以及表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗诸如THERATOPE疫苗以及疫苗诸如基因治疗疫苗，例如，ALLOVECTIN疫苗，LEUVECTIN疫苗，和VAXID疫苗；拓扑异构酶1抑制物(LURTOTECAN)；rmRH(例如ABARELIX)，lapatinibditosylate(ErbB-2 and EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制物，也已知为GW572016)；COX-2抑制物诸如塞来考昔(celecoxib)(CELEBREX；4-(5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺；和上述任何物质的可药用盐、酸或衍生物。
术语“细胞因子”是由一个细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白的总称。这类细胞因子有淋巴因子，单核因子，和传统的多肽激素。包括生长激素，如人生长激素，N-甲二磺酰人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松驰素；前松驰素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲状腺刺激素(TSH)，促黄体(生成)激素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳激素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和β；苗勒管(mullerian)-抑制物；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素(activin)；血管内皮生长因子(例如，VEGF，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E)；胎盘来源的生长因子(PlGF)；血小板来源的生长因子(PDGF，例如，PDGFA，PDGFB，PDGFC，PDGFD)；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-alpha；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factors)；干扰素如干扰素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1，IL-lalpha，IL-1beta，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-1 1，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20-IL-30；促分泌剂/子宫珠蛋白；制瘤素M(OSM)；；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。本文中术语细胞因子包括天然蛋白或来自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。
本发明使用的术语“前体药物”是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其相对于亲本药物对肿瘤细胞的细胞毒作用较小且可酶促活化或被转换成更具活性的亲本形式。例见Wilman，“癌症化疗中的前体药物”BiochemicalSociety Transaction，14，pp.375-382，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，“前体药物一种药物定向运送的化学方法”定向药物运送，Borchardt等(编)，pp.247-267，Humana press(1985)。本发明的前体药物包括，但不限于含有磷酸盐的前体药物，含有硫代磷酸盐的前体药物，含有硫酸盐的前体药物，含有肽的前体药物，D-氨基酸修饰的前体药物，糖基化的前体药物，含有β-内酰胺的前体药物，任选含有取代的苯氧乙酰胺的前体药物或任选含有取代的苯基乙酰胺的前体药物，可转化为更具细胞毒活性的游离药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前体药物。可衍生为本发明所用前体药物形式细胞毒药物包括，但不限于上述化疗试剂。
“血管生成因子或药剂”是刺激血管形成的生长因子，例如促进血管生成，内皮细胞生长，血管稳定性和/或脉管形成等。例如，血管生成因子包括但不限于，VEGF和VEGF家族成员，PLGF，PDGF家族，纤维母细胞生长因子家族(FGFs)，TIE配体(血管生成素)，ephrins，ANGPTL3，ANGPTL4，等。其也包括促进伤口愈合的因子，诸如生长激素，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)，VIGF，表皮生长因子(EGF)，CTGF及其家族的成员，以及TGF-α和TGF-β。见例如，Klagsbrun and D’Amore，Annu.Rev.Physiol.，53217-39(1991)；Streit and Detmar，Oncogene，223172-3179(2003)；Ferrara & Alitalo，NatureMedicine 5(12)1359-1364(1999)；Tonini et al.，Oncogene，226549-6556(2003)(例如Table 1 listing angiogenic factors)；and，Sato Int.J.Clin.Oncol.，8200-206(2003)。
″抗血管生成药剂″或“血管生成抑制剂”指小分子量物质，多核苷酸，多肽，分离的蛋白，重组蛋白，抗体，或其偶联物或融合蛋白，其抑制血管生成，脉管形成，或不良的血管通透性，无论是直接还是间接。例如，抗血管生成药剂是上述血管生成剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF抗体，VEGF受体抗体，阻断VEGF受体信号的小分子(例如PTK787/ZK2284，SU6668)。抗血管生成药剂也包括天然血管生成抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)，内皮他丁(endostatin)，等，见例如，Klagsbrun and D’Amore，Annu.Rev.Physiol.，53217-39(1991)；Streit and Detmar，Oncogene，223172-3179(2003)(例如表3列出了恶性黑素瘤中的抗血管生成疗法)；Ferrara & Alitalo，Nature Medicine5(12)1359-1364(1999)；Tonini et al.，Oncogene，226549-6556(2003)(例如表2列出了抗血管生成因子)；和，Sato Int.J.Clin.Oncol.，8200-206(2003)(例如表1列出临床实验中使用的抗血管生成药剂)。
本文术语“标记”指可检测的化合物或组合物，其直接或间接偶联于多肽。该标记本身可为可检测的(例如放射同位素标记或荧光标记)，或如果是酶标记，可催化可检测底物化合物或组合物的化学变化。
“分离的”核酸分子，是从在多肽核酸的天然来源其通常结合的至少一种污染性核酸分子鉴定并分离出的核酸分子。分离的核酸分子并非其天然形式或在其天然环境中。分离的核酸分子因此与其存在与天然细胞中的形式不同。然而，分离的核酸分子包括包含的通常表达这样的多肽的细胞中，其中例如所述核酸分子在染色体中的位置与天然细胞中的情况不同。
术语“控制序列”指在具体宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所需的DNA序列。适于原核生物的控制序列，例如包括启动子，可选操纵序列，以及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子，多腺苷化信号以及增强子。
当核酸与另一核酸序列发生功能上的关系时，该核酸即为“可操作地连接于”另一核酸。例如，如果DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则编码前序列或分泌型前导序列(例如，信号序列或信号肽)的DNA与编码多肽的DNA可操作性地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接于编码序列；如果核糖体结合位点的位置有利于翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接于编码序列。一般而言，“可操作地连接于”是指被邻接的DNA序列是连续的，并且在例如分泌型前导序列的情况下为邻接的并处于阅读相。但是增强子不一定必须是相邻的。连接(linking)通过在方便的限制性位点进行接合(ligation)来完成。若这样的位点不存在，可依照常规实施方法使用合成的寡核苷酸接头(adaptor)或连接体。
术语“细胞”，“细胞系”，和“细胞培养物”可互换使用，并且所有所述名称包括子代。因此，术语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞以及来自其的培养物，而不考虑传代数。还应理解所有子代的DNA含量可不精确地一致，这是由于有意或无意突变造成的。对最初转化的细胞进行筛选得到的具有相同功能或生物活性的突变体子代包括在本发明内。不同名称含义不同时，可从上下文明确看出。
ANGPTL4血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)是分泌蛋白并且是血管生成素家族的成员。其还已知为肝纤维蛋白原/血管生成素-相关蛋白(HFARP)(Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000))，PGAR(PPARγ血管生成素相关蛋白)(Yoon，et al.，Mol.Cell Biol.，205343-5349(2000))，禁食诱导的脂肪因子(FIAF)(Kerten et al.，J.Biol.Chem.，27528488-28493(2000))；血管生成素-相关蛋白(ARP-4)；NL2(见美国专利6,348,350；6,372,491；和6,455,496)；以及Ang6。
人ANGPTL4蛋白是406氨基酸的蛋白(例如US Patents 6,348,350，6,372,491 & 6,455,496)，小鼠ANGPTL4是410氨基酸蛋白(Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000))。小鼠和人在氨基酸水平共享大约75％的同一性。Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000)。ANGPTL4具有单个多肽，三个潜在的N糖基化位点，以及四个半胱氨酸，其可参与细胞内二硫键形成。例如，ANGPTL4形成更高级的分子结构，例如图3，图A所示。见例如，例如Ge et al.，J.Biol.Chem.，279(3)2038-2045(2004)；Ge et al.，J.Lipid Res.452071-2079(2004)；和Mandard et al.，J.of Biol.Chem.，279(33)34411-34420(2004)。ANGPTL4也可经蛋白水解加工。也见，例如Ge et al.，J.Biol.Chem.，279(3)2038-2045 (2004)；和 Mandard et al.，J.of Biol.Chem.，279(33)34411-34420(2004)。如本文所述，ANGPTL4的取代R162G和R164E导致变体ANGPTL4在SDS-凝胶上的分子量高于野生型(或天然)蛋白(见图3，图B)。
血管生成素家族的保守区包括螺旋区以及C末端纤维蛋白原(FBN)样结构域。见例如，Kim et al.，Biochem.J.346603-610(2000)。据提示ANGPTL4以常规方式蛋白经水解加工释放C末端纤维蛋白原样结构域。见例如，Ge etal.，J.Biol.Chem.，279(3)2038-2045(2004)。血管生成素家族的其它成员包括血管生成素1，血管生成素2和血管生成素3/血管生成素4，其结合Tie2受体。见例如，Davis et al.，Cell87，1161-1169(1996)；Maisonpierre et al.，Science277，55-60(1997)；Valenzuela et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，1904-1909(1999)；美国专利5,521,073；5,650,490；和，5,814,464。血管生成素1和4是Tie2受体的激动剂，而血管生成素2和3是Tie2受体的拮抗剂(以及可能的激动剂)。见例如，Folkman & D’Amore，Cell，871153-1155(1996)；Suri et al.，Cell，871171-1180(1996)；Masionpierre et al.，Science 27755-60(1997)；and，Ward & Dumont，Seminars in Cell & Developmental Biology，1319-27(2002)。
ANGPTL4结合整合素αvβ5。见例如，图9，图A-E。该家族的另一成员，血管生成素-样3蛋白(ANGPTL3)是结合整合素αvβ3的血管生成因子。见例如，US专利申请20030215451，其公开于2003-11-20，以及Camenisch etal.，J.Biol.Chem.，277(19)17281-17290(2002)。ANGPTL3不结合受体Tie2。Camenish et al.，Journal of Biol.Chem.277(19)17281-17290(2002)。ANGPTL3也是血浆脂质水平调节物。见例如，Koishi et al.，Nat.Genetics 30151-157(2002)。
ANGPTL4结合整合素αvβ5。见例如，图11，12和13。整合素αVβ5是细胞外基质蛋白包括玻连蛋白和Del-1的受体(见例如，Stupack and Cheresh，Journal of Cell Science 1153729-3738(2002))。Alpha v-整合素参与肿瘤进展和转移。见例如，Marshall，J F and Hart，I R Semin.Cancer Biol.7(3)129-38(1996)。此外，alpha v-整合素在血管生成中的作用也已经显示。见例如，Eliceiri，B P and Cheresh，D A Molecular Medicine 4741-750(1998)。例如，αVβ5的单克隆抗体抑制兔角膜和鸡绒毛膜尿囊膜模型中VEGF诱导的血管生成作用。见例如，M.C.Friedlander，et al.，Science 2701500-1502(1995)。αVβ3和αVβ5的拮抗剂以抑制生长因子和肿瘤诱导的血管生成作用。见例如，Eliceiri and Cheresh，Current Opinion in Cell Biology，13563-568(2001)。
本发明提供了调节物的组合物，例如血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)的激动剂或拮抗剂以及这些调节物与其它治疗剂的组合。例如，ANGPTL4的拮抗剂与抗癌药剂的组合以及它们在阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长中的用途在本文提供。本发明还提供利用ANGPTL4拮抗剂和/或其它抗癌药剂阻断或减慢复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法。ANGPTL4的拮抗剂的组合物以及抗血管生成药物的组合以及它们用于阻断或减慢肿瘤形成或非肿瘤形成性疾病的新生血管化的用途也在本发明提供。
ANGPTL4调节物及其用途ANGPTL4调节物是调节ANGPTL4活性的分子，例如激动剂和拮抗剂。术语“激动剂”指ANGPTL4的肽和非肽类似物，以及特异性结合所述ANGPTL4分子的抗体，条件是它们具有通过天然ANGPTL4受体(例如αVβ5整合素)产生信号的能力。术语“激动剂”在本发明根据ANGPTL4受体(例如αVβ5)的生物作用定义。一些实施方案中，激动剂具有天然ANGPTL4的生物活性，如上所述，诸如促进增殖、迁移和/或细胞粘附，和/或调节脂质动态平衡。
术语“拮抗剂”用于指能抑制ANGPTL4生物活性的分子，而不考虑它们是否能结合ANGPTL4或其受体，例如，αVβ5。例如，能结合ANGPTL4或其受体的拮抗剂包括抗-ANGPTL4和抗-αVβ5抗体。抑制ANGPTL4表达的拮抗剂包括在内，例如，ANGPTL4-SiRNA。拮抗剂 ANGPTL4可通过例如抑制ANGPTL4的活性，例如粘附、迁移、增殖和/或调节ANGPTL4的脂质动态平衡活性来评估。就αVβ5整合素受体活性而言，αVβ5整合素受体的调节物可通过本领域抑制的方法确定。例如，可使用J.W.Smith et al.in J.Biol.Chem.26512267-12271(1990)所用的方法。
治疗用途ANGPTL4也是癌的靶。在体外或体内，ANGPTL4在肿瘤细胞中表达时，导致肿瘤细胞增殖(见例如，图4，图5，图7和图8，图A和图B)。当ANGPTL4在正在用抗血管生成因子例如抗-VEGF抗体治疗的肿瘤中表达，肿瘤可保持生长的能力(见例如，图8，图C)。ANGPTL4也导致肿瘤细胞迁移(见例如，图9)。其也在肾癌中上调。见例如，attorney docket numberP5032R1；WO 02/07941；和Le Jan et al.，American Journal of Pathology，162(5)1521-1528(2003)。此外，ANGPTL4是促血管生成因子(见例如，S.LeJan et al.，Am.J.Pathol.，162(5)1521-1528(2003))，其是癌症治疗的靶。和VEGF一样(Shweiki et al.，Proc.Natl.Acad Sci，USA 92768-772(1995)，ANGPTL4应答于低氧表达增加。见例如，Le Jan et al.，American Journal ofPathology，162(5)1521-1528(2003)。
在各种条件下，ANGPTL4结合肿瘤细胞，例如A673细胞(例如图6，图A和B)。如例如图4，图A和图B所示，当细胞用表达ANGPTL4的表达构建体转导时，ANGPTL4刺激一些肿瘤细胞在体外的生长。图4，图C也显示加入ANGPTL4转导的COS7细胞的经调节的培养基诱导A673细胞的增殖。也见，图7，图A和B。ANGPTL4包被在培养皿上时，ANGPTL4诱导A673细胞的细胞增殖(见图5)，但不诱导肾上皮细胞的、肾小球系膜细胞或HUVEC的细胞增殖。ANGPTL4以诱导肿瘤细胞的细胞迁移。见例如，图9。
ANGPTL4主要在脂肪组织，胎盘，肝和肾中表达并在ob/ob(leptin敲除)和db/db(leptin受体敲除)小鼠中上调。见例如，Yoon et al.，Mol.Cell Biol.205343-5349(2000)；Kim et al.，Biochem.J，346603-610(2000)；Kersten et al.，J.Biol.Chem.，27528488-28493(2000)；和Le Jan et al.，American Journal ofPathology 162(5)1521-1528(2003)。据报道ANGPTL4也是脂质调节物以及脂蛋白酶的抑制物。见例如，Yu et al.，PNAS USA 102(5)1767-1772(2005)；Yoshida et al.，J.Lipid Res.431770-1772(2002)；和Wiesner et al.，J.Endocrinology 180R1-R6(2004)。ANGPTL4表达在脂肪细胞中也受PPARgamma和alpha的诱导，并由饥饿诱导。其也调节前脂肪细胞和肝细胞增殖，和/或前脂肪细胞迁移以及调节血清甘油三酯和胆固醇水平。见，U.S.临时专利申请60/589,875，和同时提交的Attorney Docket P2156R1，其包含在本文作为参考。研究人员报道了血管生成和脂肪生成之间的关系。见例如，Sierra-Honigmann et al.，“Biological Action of Leptin as an Angiogenic Factor”Science 2811683-1686；(1998)；Rupnick et al.，“Adipose tissue mass can beregulated through the vasculature”Proc. Nat. Acad.Sci. USA，99(16)10730-10735(2002)；和Fukumura et al.，“Paracrine Regulation ofAngiogenesis and Adipocyte Differentiation During In Vivo Adipogenesis.”Circ.Res.93e88-e97(2003)。
根据本发明，预计ANGPTL4调节物和/或ANGPTL4调节物与其它治疗剂的组合可用于治疗各种肿瘤或非肿瘤疾病。一个实施方案中，ANGPTL4调节物，例如ANGPTL4的拮抗剂用于抑制癌细胞或肿瘤生长。例如，如图10，图A和图B所述，抗ANGPTL4多克隆抗体以剂量依赖方式抑制肿瘤生长。ANGPTL4可导致肿瘤细胞迁移(见例如图9)。根据本发明，ANGPTL4拮抗剂也可用于抑制肿瘤的转移。ANGPTL4也诱导前脂肪细胞的迁移。见，美国临时专利申请60/589,875，以及同时提交的Attorney Docket P2156R1。一些实施方案中，一或多种抗癌药剂可与ANGPTL4拮抗剂一起给药，抑制癌细胞或肿瘤的生长。见本发明题为联合治疗的部分。
待治疗的肿瘤疾病的实例包括但不限于，术语“癌”或“癌性的”中所述的那些。可利用本发明的拮抗剂治疗的非肿瘤形成疾病包括，但不限于，例如不良或异常肥大，关节炎，类风湿性关节炎(RA)，银屑病，银屑斑块，肉样瘤病(sarcoidosis)，动脉粥样硬化，动脉粥样硬化斑块，心肌梗死造成的水肿，糖尿病和其它增殖性视网膜并包括早产儿视网膜病，晶状体后纤维组织增生症，新生血管性青光眼，与年龄相关的黄斑退行性改变，糖尿病性黄斑水肿，角膜新生血管形成，角膜移植物新生血管形成，角膜移植物排斥，视网膜/脉络膜新生血管形成，眼房角新生血管化(neovascularization of theangle)(发红(rubeosis))，眼新生血管疾病，血管在狭窄，动静脉畸形(AVM)，脑膜瘤，血管瘤，甲状腺肥大(包括Grave’s病)，角膜及其它组织的移植，慢性炎症，肺部炎症，急性肺损伤/ARDS，脓毒症，原发性肺动脉高压，恶性肺渗出，大脑水肿(例如与急性发作综合征/封闭性头部损伤/创伤有关)，滑膜炎症，RA中的血管翳形成，骨化性肌炎，肥厚性骨形成(hypertropic boneformation)，骨关节炎(OA)，顽固性腹水，多囊卵巢疾病，子宫内膜异位症，液体第三间隔疾病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎，间隔综合征，烧伤，肠疾病)，子宫平滑肌瘤，早产，慢性炎症诸如IBD(克隆氏病和溃疡性结肠炎)，肾同种异体移植物排斥，炎性肠病，肾病综合征，不良或异常组织团块生长(非癌性)，肥胖症，脂肪组织团块生长，血友病性关节，肥大性瘢，毛发生长抑制，Osler-Weber综合征，脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生症，硬皮病，沙眼，血管粘附，滑膜炎，皮炎，先兆子痫，腹水，心包渗出液(诸如与心包炎相关)，和胸膜积液。
ANGPTL4调节物，例如ANGPTL4激动剂或活化物，可用于治疗病理疾病。ANGPTL4调节物，例如ANGPTL4激动剂可用于治疗需要血管生成或新生血管形成和/或肥大的病理疾病，其包括但不限于例如，血管损伤，创伤，裂伤，切口，烧伤，溃疡(例如糖尿病，压力性溃疡，血友病性溃疡，静脉曲张溃疡)，组织生长，重量增加，外周动脉疾病，分娩的诱导，毛发生长，大疱性表皮松解，视网膜萎缩，骨折，骨脊髓融合，半月板撕伤等。也见，美国临时申请60/589,875和同时提交的Attorney Docket P2156R1。
联合治疗如上所示，本发明提供联合治疗，其中ANGPTL4拮抗剂与另一种治疗一起给药。例如，ANGPTL4拮抗剂与抗癌治疗剂和抗新生血管形成治疗剂联合给药以治疗肿瘤形成或非肿瘤形成疾病。一个实施方案中，肿瘤形成和非肿瘤形成疾病的特征在于与异常或不良血管生成相关的病理疾病。ANGPTL4拮抗剂可连续或与另一种对于所述目的有效的药剂联合给药，而无论在相同或分离的组合物中。可选或此外，可给药ANGPTL4的多重抑制剂。
本发明的拮抗剂和/或药剂的给药可同时进行，例如作为单个组合物或作为两个或更多不同的组合物，其中利用相同或不同的给药途径。可选或此外，所述给药可以任何顺序依次进行。一个实施方案中，范围在数分钟到数天到数周的间隔可存在两或多个组合物的给药之间。例如，可首先给药抗癌剂，然后给药ANGPTL4抑制剂。然而，同时给药或先给药ANGPTL4拮抗剂也可。
与ANGPTL4拮抗剂联合给药的有效量的治疗剂由医师或兽医确定。给药剂量和调整用于实现对待治疗疾病的最大化管理。所述剂量还有赖于因素诸如将使用的治疗剂的类型以及治疗的具体患者。抗癌剂的适宜剂量是目前使用的那些，并且可由于抗癌药剂和ANGPTL4拮抗剂的联用作用(协同作用)而降低。一些实施方案中，抑制剂的组合增强单个抑制物的效力。术语“增强”指常用或规定剂量的治疗剂的效力的提高。也见本发明的药物组合物部分。
通常，ANGPTL4拮抗剂和抗癌药剂适于相同或类似的疾病用于阻断或减慢病理性疾病诸如肿瘤生长或癌细胞生长。一个实施方案中，抗癌药剂是抗血管生成药剂。
与癌相关的抗血管生成治疗是目的在于抑制提供营养支持肿瘤生长的肿瘤血管的发育的治疗策略。由于血管生成与原发性肿瘤生长和转移都有关，本发明提供的抗血管生成治疗能抑制原发位点的肿瘤的肿瘤形成生长以及预防继发位点的肿瘤转移，由此允许肿瘤被其它治疗剂攻击。
许多抗血管生成药剂已经被鉴定并且是本领域已知的，包括本发明所列出的那些，例如定义部分列出的那些，以及例如Carmeliet and Jain，Nature407249-257(2000)；Ferrara et al.，Nature ReviewsDrug Discovery，3391-400(2004)；and Sato Int.J.Clin.Oncol.，8200-206(2003)中的。也见，美国专利申请US20030055006。一个实施方案中，ANGPTL4拮抗剂与抗VEGF中和抗体(或片段)和/或其它VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂联用，包括但不限于例如，可溶性VEGF受体(例如VEGFR-1，VEGFR-2，VEGFR-3，neuropillins(例如NRP1，NRP2))片段，能阻断VEGF或VEGFR的适体，中和抗-VEGFR抗体，VEGFR酪氨酸激酶(PTK)的低分子量抑制物，VEGF的反义策略，针对VEGF或VEGF受体的核酶，VEGF的拮抗剂变体；以及其组合。可选或此外，两或多种血管生成抑制剂可共同给药抗体。一些实施方案中，一或多种其它治疗剂，例如抗癌药剂，可与ANGPTL4拮抗剂以及抗血管生成药剂联合给药。
本发明的一些方面中，用于和本发明的拮抗剂进行联合肿瘤治疗的其它治疗剂包括其它癌症治疗剂，(例如手术，放射治疗(例如与放射有关或给药放射活性物质)，化疗，利用本文所列的以及本领域已知的抗癌药剂治疗，以及其组合)。可选或此外，本发明公开的两或多种结合相同或两种或不同抗原的抗体可共同给药患者。有时，给药患者一或多种细胞因子也是有益的。
化疗剂一些方面中，本发明提供阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长的方法，其通过给药还易患或诊断为患有癌症的患者有效量的ANGPTL4拮抗剂和/或血管生成抑制剂以及一或多种化疗剂来进行。多种化疗剂可用于本发明的联合疗法中。涉及的化疗剂的示例性和非限制性列表在本发明“定义”部分提供。
本领域普通技术人员理解，适宜剂量的化疗剂将通常是大约已经用于临床治疗的那些，其中化疗剂单独或与其它化疗剂联合给药。根据治疗的疾病，剂量的变化很可能出现。给予治疗的医师能确定个体受试者的适宜剂量。
复发性肿瘤生长本发明还提供抑制和预防复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法和组合物。例如，图8，图C图示了当肿瘤也表达ANGPTL4时，用抗-VEGF抗体(AVASTIN)治疗的肿瘤逃避治疗(例如一种类型的复发)的能力。
复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长用于描述这样的情况，其中患者接受或利用的一或多种目前可用的疗法(例如癌症疗法诸如化疗，放疗，手术，激素治疗和/或生物疗法/免疫疗法，具体是具体癌症的标准治疗方案)在临床上不适合治疗患者或者患者不再从所述治疗获得任何有益效果，从而使得这些患者需要其它有效治疗。本文中该术语也用于描述“非反应性/顽固性”患者的情形，例如其描述了对治疗不应答并出现副作用，产生抗药性，对治疗不应答，对治疗应答不满意等的患者。各种实施方案中，癌症是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，其中癌细胞的数目没有明显降低，或增加，或没能进一步减小癌细胞体积或数量。癌细胞是否复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的确定可通过本领域已知用于评估癌细胞治疗有效性的体内或体外方法，其中在该背景中使用本领域接受的“复发”或“顽固性”或“非应答性”的含义。
本发明提供阻断或减慢受试者中复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法，通过给药本发明的ANGPTL4拮抗剂阻断或减慢受试者中的复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长来进行。一些实施方案中，ANGPTL4拮抗剂可在癌症治疗后给药。一些实施方案中，ANGPTL4与癌症治疗同时给药。可选或此外，ANGPTL4拮抗剂疗法与另一癌症治疗交替给药，其可以任何顺序进行。本发明还包括给药一或多种ANGPTL4抑制抗体来防止易患癌症的患者中癌症的开始或复发的方法。通常，受试者曾经或正在接受癌症治疗。一个实施方案中，所述癌症治疗是利用抗血管生成药剂的治疗。抗血管生成药剂包括本领域已知的那些以及本发明定义部分中的那些。一个实施方案中，抗血管生成药剂是抗-VEGF中和型抗体或片段(例如人源化的A4.6.1，AVASTIN(Genentech，South San Francisco，CA)，Y0317，M4，G6，B20，2C3，等)。见例如，U.S.Patents 6,582,959，6,884,879，6,703,020；WO98/45332；WO96/30046；WO94/10202；EP 0666868B1；US Patent Applications 20030206899，20030190317，20030203409，和20050112126；Popkov et al.，Journal ofImmunological Methods 288149-164(2004)；和Attorney Docket No.PR2072-4。其它药剂可与ANGPTL4拮抗剂联合给药以阻断或减慢复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，例如参见本发明联合治疗的部分。
一个实施方案中，给药本发明的ANGPTL4拮抗剂或其它减少ANGPTL4表达的治疗剂以逆转癌细胞对具体生物、激素、反射和化疗药剂的抗性或减小其敏感性，由此使得癌细胞对于一或多种这些药剂重新敏感化，其可随后给药(或继续给药)以治疗或管理癌症，包括防止转移。
抗体本发明的抗体包括抗-ANGPTL4抗体或ANGPTL4的抗原结合片段，抗-αVβ5抗体或本文所述的其它抗体。示例性抗体包括，例如多克隆，单克隆，人化的，片段，多特异性，异源偶联的，多价的，效应功能等抗体。抗体可为激动剂或拮抗剂。
抗体本发明的抗体包括抗-ANGPTL4和抗-ANGPTL4片段抗体，作为抗血管生成药剂或血管生成抑制剂的抗体，作为抗癌药剂的抗体，ANGPTL4受体的抗体，例如抗-αVβ5抗体，或本发明所述的其它抗体。示例性抗体包括例如，多克隆，单克隆，人源化的，片段，多特异性，异源偶联的，多价的，效应功能等抗体。
多克隆抗体本发明的抗体包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。例如，抗ANGPTL4的多克隆抗体通过多次给动物皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂而产生。用双功能试剂或衍生试剂，如马来酰亚氨苯甲酰基硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(R和R1是不同烷基)，将所述相关抗原与在所免疫的物种中具有免疫原性的蛋白(如匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)进行偶联是有用的。
用ANGPTL4、免疫原性偶联物或衍生物免疫动物，方法是，将100μg或5μg蛋白或偶联物(分别针对兔或鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混合，在多位点皮内注射该溶液。1个月后，多位点皮下注射起始量的1/5-1/10的肽或与弗氏完全佐剂中的偶联物来加强免疫。7-14天后，对动物采血，测定血清中的抗体滴度。对动物的加强免疫直到滴度达到平台期为止。通常给动物加强注射相同抗原的偶联物，但也可以是偶联至不同蛋白和/或通过不同的交联剂偶联。偶联物还可以是重组细胞培养物中产生的融合蛋白。此外，可用明矾等聚集剂增强免疫应答。
单克隆抗体例如，单克隆抗体可用由Kohler等，自然(1975)首次描述的杂交瘤技术制备，或用重组DNA方法制备(美国专利4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适合的宿主动物如仓鼠，以激发那些产生或能产生与用于免疫之蛋白特异性结合的抗体的淋巴细胞。另外，可体外免疫淋巴细胞。然后用适当融合剂，如聚乙二醇，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体原理及应用，pp.59-103(Academic Press，1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种至适当培养基中并培养，优选该培养基含有一或多种能抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。
通常骨髓瘤细胞是那些能有效融合、支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平产生抗体，并对诸如HAT培养基等类似培养基敏感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute Cell Distreibution Center，San Diego，California USA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤细胞和由美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或X63-Ag8-653细胞。也有报道称人骨髓瘤以及小鼠-人异质性骨髓瘤细胞系可用于产生人单克隆抗体(Kozbor，免疫学杂志1333001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体制备技术及应用，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
可在含有生长的杂交瘤细胞的培养基中分析针对例如ANGPTL4，αVβ5或血管生成分子的单克隆抗体的产生。优选，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合试验，如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析。单克隆抗体的结合亲和力可通过如Muson等，Anal.Biochem.，107220(1980)所述Scatchard分析来测定。
一旦鉴定出能产生具有所需特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，将这些克隆通过有限稀释法进一步克隆并用标准方法进行培养(Goding，单克隆抗体原理及应用，pp.59-103(Academic Press，1986))。适于此目的的培养基包括如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可作为腹水中肿瘤的形式在动物体内生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体可用常规免疫球蛋白纯化方法如蛋白-A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基、腹水或血清中适宜地分离。
单克隆抗体也可卡通过重组DNA方法制备，诸如美国专利4,816,567中描述的那些。编码单克隆抗体的DNA可用常规方法很容易地分离和测序(如利用能与编码小鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是这类DNA的优选来源。DNA分离后，可将其插入表达载体中，然后用此表达载体转染宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以便在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。抗体的重组产生在下文详细描述。
在另一实施方案中，可从用Mccafferty等，自然，348552-554(1990)所述技术产生的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等，自然，352624-628(1991)和Marks等，分子生物学杂志222581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库分离鼠和人的抗体。后来的文献描述了通过链改组制备高亲和力(nM范围)的人型抗体(Marks等，生物/技术10779-783(1992))，以及用于构建大规模噬菌体文库的组合感染和体内重组方法(Waterhouse等，核酸研究212265-2266(1993))。因此，这些技术都可取代传统单克隆抗体杂交瘤技术来分离克隆抗体。
DNA也可通过例如用人类重链和轻链的恒定区编码序列取代小鼠同源序列来修饰(美国专利4,816,567；Morrison等，美国国家科学院学报816851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价结合来修饰。
通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗体恒定区，或取代抗体的一个抗原结合点的可变区，形成二价嵌合抗体，其中一个抗原结合位点特异于一种抗原而另一个抗原结合位点特异于另一种抗原。
人源化抗体和人抗体本发明的抗体可包括人源化的或人抗体。人源化抗体中已导入一或多个源自非人类的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常称为“引进的”残基，它们通常来自“引进的”可变区。人源化过程基本如Winter及其同事(Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科学，2391534-1536(1988))所述，用高变区序列取代人类抗体的相应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中完整人类可变区的很少一部分被非人类物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中高变区残基且可能有部分FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。
对用于制备人源化抗体的人类可变区包括重链和轻链的选择，对降低抗原性非常重要。根据所谓“最适应”方法，针对已知人类可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗体可变区序列。将与啮齿类的序列最相似的人类序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等，免疫学杂志，1512296(1993)；Chothia等，分子生物学杂志，196901(1987))。另一种方法是用人类轻链或重链特定亚型的所有抗体的共有序列作为特定框架区。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等，美国国家科学院学报，894285(1992)；Presta等，免疫学杂志，1512623(1993))。
更重要的是，将抗体人源化后保留了对抗原的高亲和力和其它有利的生物特性。为达到此目的，在一种优选方法中，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物来制备人源化抗体。免疫球蛋白三维模型已有商品，是本领域技术人员所熟悉的。还有用于描述和展示所选免疫球蛋白序列可能的三维构象的计算机程序。通过观察这些展示结果可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基，通过这种方法，可从受者和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质，如对靶抗原的亲和力增加。总之，CDR残基直接并且最主要涉及对抗原结合的影响。
可选可制备如下转基因动物(如小鼠)，它们通过免疫能产生人类抗体的所有成分而不产生内源免疫球蛋白。例如，有报道称，嵌合及种系(germ-line)突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体的产生被完全抑制。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转移到这类种系突变小鼠中将导致因抗原攻击而诱导人类的抗体产生。见例如，Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immuno.，733(1993)；and Duchosal et al.Nature355258(1992).Human antibodies can also be derived from phage-displaylibraries(Hoogenboom et al.，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks et al.，J. Mol.Biol.，222581-597(1991)；Vaughan et al.Nature Biotech 14309(1996))。
人抗体也可利用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222581(1991))。据此技术，将抗体V区基因克隆在与丝状噬菌体(如M13或fd)主要或次要衣壳蛋白基因相同的框架内，并在噬菌体颗粒的表面展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，根据抗体的功能特点进行的选择也导致对显示这些性质的抗体的编码基因进行选择。因此，噬菌体模仿了B细胞的部分特点。噬菌体展示可以以多种形式进行；这些综述见Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，结构生物学的最新观点(Current Opinion in Structural Biology)3564-571(1993)。可使用V基因片段的多个来源进行噬菌体展示。Clackson等，自然，352624-628(1991)从免疫小鼠脾脏来源的V基因的随机组合小文库中分离了抗-恶唑酮抗体的多样性阵列。可基本如Marks等，分子生物学杂志222581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)所述构建未免疫人类供者的V基因所有组成成分，并分离针对抗原多样性阵列(包括自身抗原)的抗体。亦参见美国专利5565332和5573905。Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan RLiss，p 77(1985)和Boerner et al.，J.Immunol.，147(1)86-95(1991))。人类抗体也可通过体外活化的B细胞而产生(见美国专利5,567,610和5,229,275)。
抗体片段抗体片段也包括在本发明中。已开发了生成抗体片段的多种技术。传统上，这些片段通过对完整抗体的蛋白水解性消化获得(见Morimoto等，生物化学和生物物理学方法杂志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24107-117(1992))和Brennan等，科学，22981(1985))。但现在可直接通过重组宿主细胞产生这些片段。例如，可从上述抗体噬菌体库分离抗体片段。另外，可从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，并经化学连接形成F(ab’)2片段(Carter等，生物/技术10163-167(1992))。依据另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养中分离F(ab’)2片段。其它产生抗体片段的技术对本领域技术人员是显而易见的。在其它实施方案中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO 93/16185；美国专利5,571,894；和美国专利5,587,458。Fv和sFv是与缺乏恒定区的完整结合位点反应的唯一种类；因此它们适于降低体内使用过程中的非特异性结合。SFv融合蛋白可构建成在sFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白的融合。见，Antibody Engineering，cd.Borrebacck，supra。抗体片段也可以是“线性化抗体”，如美国专利5,641,870所述。这类线性化抗体片段可以是单特异性或双特异性的。
多特异性抗体(例如双特异性)本发明的抗体也包括，例如，多特异抗体，其对至少两种不同的抗原具有结合特异性。尽管此种分子通常只结合两种抗原(即双特异抗体，BsAbs)，具有附加特异性的抗体例如三特异抗体也包含在文中所用的术语中。BsAbs的实例包括具有针对肿瘤抗原的一条臂和针对细胞毒作用触发分子(cytotoxic trigger molecule)的另一条臂的那些抗体，例如抗-FcγRI/抗-CD15，抗-p185HER2/FcγRIII(CD16)，抗-CD3/抗-恶性B-细胞(1D10)，抗-CD3/抗-p185HER2，抗-CD3/抗-p97，抗-CD3/抗-肾细胞癌，抗-CD3/抗-OVCAR-3，抗-CD3/L-D1(抗-结肠癌)，抗-CD3/抗-黑色素细胞刺激激素类似物，抗-EGF受体/抗-CD3，抗-CD3/抗-CAMA1，抗-CD3/抗-CD19，抗-CD3/MoV18，抗-神经细胞粘附分子(NCAM)/抗-CD3，抗-叶酸结合蛋白(FBP)/抗-CD3，抗-泛癌相关抗原(AMOC-31)/抗-CD3；一条臂特异地结合肿瘤抗原而另一条臂结合毒素的BsAbs例如抗-皂草素/抗-Id-1，抗-CD22/抗-皂草素，抗-CD7/抗-皂草素，抗-CD38/抗-皂草素，抗-CEA/抗-蓖麻毒素A链，抗-干扰素-α(IFN-α)/抗-杂交瘤独特型，抗-CEA/抗-长春花碱；转化酶活化的前体药物的BsAbs例如抗-CD30/抗-碱性磷酸酶(催化磷酸丝裂霉素前药物向丝裂霉素醇的转化)；可用作纤维蛋白溶解剂的例如抗-纤维蛋白/抗-组织纤溶酶原激活物(tPA)，抗-纤维蛋白/抗-尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)；将免疫复合物靶向细胞表面受体的BsAbs例如抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受体(例如FcγRI，FcγRII或FcγRIII)；用于治疗感染性疾病的BsAbs例如抗-CD3/抗-单纯疱疹病毒(HSV)，抗-T-cell受体CD3复合物/抗-流感病毒，抗-FcγR/抗-HIV；体外或体内检测肿瘤的BsAbs例如抗-CEA/抗-EOTUBE，抗-CEA/抗-DPTA，抗-D185HER2/抗-半抗原；作为疫苗佐剂的BsAbs；和作为诊断工具的BsAbs例如抗-兔IgG/抗-铁蛋白，抗-辣根过氧化物酶(HRP)/抗-激素，抗-生长抑素/抗-物质P，抗-HRP/抗-FITC，抗-CEA/抗-β-半乳糖苷酶。三特异抗体的实例包括抗-CD3/抗-CD4/抗-CD37，抗-CD3/抗-CD5/抗-CD37和抗-CD3/抗-CD8/抗-CD37。双特异抗体可被制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。完整双特异性抗体的传统制备方法是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein等，自然，305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链轻链随机分配，这些四交瘤(quadroma)可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量很低。类似的方法见WO93/08829和Traunecker等，EMBO J，103655-3659(1991)。
依据另一种方法，可将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含铰链区的至少一部分、CH2及CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主生物。这使得在使用非等比的三种多肽链进行构建的实施方案中，能够非常灵活地调整三种多肽片段的相互比例，以获得最佳产量。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例无特别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。
在该方法的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体由一条臂上的带有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现这种不对称结构有利于从非必要免疫球蛋白链的混合中分离出所需双特异性化合物，因为只有该双特异性分子的一半上存在免疫球蛋白轻链，这使得分离更加容易。此方法公开于WO94/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节，见Suresh等，酶学方法，121210(1986)。
根据WO96/27011所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异源二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子的界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。这使得异二聚体的产量比其它不需要的终产物如同型二聚体的高。
从抗体片段制备双特异性抗体的技术已有文献。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brennan等，科学22981(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解制备F(ab’)2片段的方法。这些片段在二巯基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的巯基，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab′片段被转化为硫硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。其中一种Fab′-TNB衍生物经巯基乙胺还原成Fab′-硫醇，再与等分子量的其它Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固相化中所用的试剂。
近期的进展促进了Fab′-SH片段从大肠杆菌的直接回收，该片段可经化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，实验医学杂志，175217-225(1992)中描述了完全人源化双特异性抗体F(ab′)2分子的产生。每一Fab′片段分别从大肠杆菌中分泌出来，经体外直接化学偶联形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶的裂解活性。
直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，免疫学杂志，148(5)1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分通过基因融合而连接。使抗体的同型二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同型二聚体。由Hollinger等，美国国家科学院学报，906444-6448(1993))描述的“二价抗体”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有重链可变区(VH)，其通过接头与轻链可变区(VL)相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的VH和VL结构域被迫与另一片段上的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。此外还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体的策略。见Gruber等，免疫学杂志，1525368(1994)。
还考虑了二价以上的抗体。如可制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学杂志，14760(1991)。
异源偶联的抗体双特异性抗体包括交联抗体或“异源偶联的”抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与亲和素偶联，使另一抗体与生物素偶联。有观点认为，这类抗体可用于将免疫细胞靶向不想要的细胞(美国专利4676980)，也可用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，EP03089)。异源偶联抗体可通过任何适当的交联方法制备。适当的交联制剂和多种交联技术为本领域已知，可在美国专利4676980号中获得。
多价抗体本发明的抗体包括多价抗体。多价抗体比二价抗体可更快地被表达与该抗体结合的抗原的细胞内化(和/或异化)。本发明的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如四价抗体)(它们不是IgM类)，通过使编码所述抗体多肽链的核酸重组表达可轻易制备该抗体。多价抗体可以包含二聚体化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚体化结构域包括Fc区或铰链区，或由它们组成。在本文中，抗体包含一个Fc区和三个或更多个位于Fc区氨基端的抗原结合位点。优选的多价抗体在此包括三到约八个抗原结合位点，但优选四个抗原结合位点，或由它们组成。多价抗体包括至少一条多肽链(并优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变区。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变区，VD2是第二可变区，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，多肽链可包括VH-CH1-柔韧接头(flexiblelinker)-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选进一步包含至少二个(优选四个)轻链可变区多肽。例如本文的多价抗体可包含从约二个到约八个轻链可变区多肽。本文的轻链可变区多肽包含轻链可变区以及可选地进一步包含CL结构域。
效应物功能改造也需要修饰本发明抗体的效应物功能，以提高抗体在例如癌症治疗中的有效性。例如，可在Fc区引入半胱氨酸残基，使得在此区形成链间二硫键。由此产生的同型二聚体抗体可提高内在化能力和/或增强补体介导的细胞杀伤作用和抗体介导的细胞毒(ADCC)。见Caron等，实验医学杂志1761191-1195(1992)和Shopes，B.免疫学杂志1482918-2922(1992)。具有增强的靶向活性的同型二聚体抗体也可用Wolffe等，癌症研究532560-2565(1993)所述异源双功能交联剂制备。或者，可通过工程改造产生具有双FC区并因此具有增强的补体裂解效应及ADCC能力的抗体。见Stevenson等，抗癌药物的设计(Anti-Cancer drug design)3219-230(1989)。为了提高拮抗剂的血清半衰期，一种方法是在拮抗剂(尤其抗体片段)中掺入补救受体结合表位，如美国专利5,739,277所述。本文中术语“补救受体结合表位”是指IgG(例如IgG1，IgG2、IgG3、或IgG4)Fc区中负责延长该IgG分子的体内血清半衰期的表位。
免疫偶联物本发明还涉及免疫偶联物，所述免疫偶联物包含与细胞毒性药剂结合的抗体，细胞毒性药剂例如化学治疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射偶联物)。多种放射性核素可用于制备放射偶联抗体。实例包括但不限于，例如，212Bi，131I，131In，90Y和186Re。
用于产生所述免疫偶联物的化疗剂已经在上文描述。例如，BCNU，链脲菌素(streptozoicin)，长春新碱和5-氟尿嘧啶，美国专利5,053,394，5,770,710所述的已知统称为LL-E33288复合物的药剂家族，以及esperamicins(美国专利5,877,296)等(也参见本文的化疗剂的定义)可偶联于抗-ANGPTL4或抗-血管生成抗体或其片段。
为了选择性破坏细胞，抗体可包括高度放射活性的原子。多种放射活性同位素可用于产生放射偶联的抗-ANGPTL4或其片段。实例包括但不限于211At，131I，125I，90Y，186Re，188Re，153Sm，212Bi，32P，212Pb，111In以及Lu的放射性同位素等。当所述偶联物是用于诊断时，其可以包含用于闪烁成像研究的放射性原子，例如Tc99或I123、或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，例如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以用已知的方法将放射标记物或其它标记物掺入到所述偶联物中。例如，可以利用包含，例如适当位置的氟-19或氢的适合的氨基酸前体，通过化学的氨基酸合成来生物合成或化学合成所述肽。Tc99或I123、Re186、Re188和In111标记物可以通过肽中的半胱氨酸残基附着上。钇-90可以通过赖氨酸残基附着。IODOGEN法(Fraker等，Biohem.Biophys.Res.Commun.8049-57(1978)可用于掺入碘-123。在″Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy″(Chatal，CRC Press1989)中描述了结合放射性核素的其它方法。
可以应用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolacca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。例见1993年10月28日公开的WO93/21232。
抗体与细胞毒制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯，iminothiolane(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(如亚氨基己二酸二甲酯盐酸盐)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glutareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科学2381098(1987)所述制备。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至拮抗剂的示例性偶联剂。见WO94/11026。这种接头可能是有利于细胞毒药物在细胞内释放的“可断开的接头”。例如，可使用酸不稳定型接头，肽酶敏感型接头，二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等，癌症研究52127-131(1992))。
可选，可制备包含抗-ANGPTL4，抗αvβ5或抗血管生成抗体和细胞毒剂的融合蛋白，例如通过重组技术或肽合成。DNA的长度可包括编码偶联物的两个部分的分别的区域，其或者相邻或者通过编码不破坏偶联物所需性质的接头肽的区域分隔。
在一些实施方案中，拮抗剂可与肿瘤预靶向中应用的“受体”(如链霉亲和素)偶联，将该拮抗剂-受体偶联物给予患者，之后用清除剂除去循环中未结合的偶联物，再给予已偶联了细胞毒制剂(如放射性核苷酸)的“配体”(如亲和素)。一些实施方案中，抗体和具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶诸如脱氧核糖核酸酶；Dnase)形成免疫偶联物。
美登木素和美登木素生物碱本发明还提供偶联于一或多个美登木素生物碱分子的本发明的抗体。美登木素生物碱是有丝分裂抑制物，通过抑制微管蛋白的聚合起作用。美登素最早自东非灌木齿叶美登木(美国专利3,896,111)分离。随后，发现特定的微生物也可产生美登木素生物碱，例如美登木醇(maytansinol)和C-3美登木醇酯(美国专利4,151,042)。本领域人员熟悉合成美登木醇和美登木醇类似物，并在例如美国专利4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533中公开，其公开内容在此包含作为参考。
例如，抗-ANGPTL4抗体或抗-αVβ5抗体或抗血管生成抗体偶联物美登木素生物碱分子而不明显降低抗体或美登木素生物碱分子的生物活性。偶联于每个抗体分子的平均3-4个美登木素生物碱分子显示可有效增强靶细胞的细胞毒性而不会对抗体的功能或溶解性造成不利影响，但预期即使一个毒素/抗体分子将相对于裸抗体的使用提高细胞毒性。美登木素生物碱是本领域已知的并可通过已知技术合成并分离自自然来源。适宜的美登木素生物碱公开于例如美国专利5,208,020以及上文所述的其他专利和非专利文献。一个实施方案中，美登木素生物碱是美登醇(maytansinol)和在芳香环或美登醇的其他位置修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇的酯。
本领域已知多种制造抗体-美登木素生物碱偶联物的连接基团，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利EP 0 425 235 B1，和Chari等CancerResearch52127-131(1992)公开的那些。连接基团包括二硫基，硫醚基，酸不稳定基团，光不稳定基团，肽酶不稳定基团，或酯酶不稳定基团，如上述专利所公开，优选二硫基和硫醚基。
抗体和美登木素生物碱的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚胺基硫烷(iminothiolane)(IT)，亚胺酸酯的双功能衍生物(如盐酸二甲基己二酸亚氨酯(dimethyladipimidate HCl))，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glutareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。尤其优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173723-737 )和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)来提供二硫连接。
接头可附着于美登木素生物碱分子的不同位点，这取决于连接的类型。例如，使用传统的偶联技术通过与羟基反应形成酯连接。该反应可出现在含有羟基的C-3位置，经羟甲基修饰的C-14位置，经羟基修饰的C-15位置，以及含羟基的C-20位置。在优选的实施方案中，在美登木醇或美登木醇类似物的C-3位置形成连接。
加利车霉素(calicheamicin)另一种目的免疫偶联物包括抗-ANGPTL4抗体或偶联于一或多个加利车霉素分子的抗-αVβ5抗体。抗体的加利车霉素家族能在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。加利车霉素家族的偶联物的制备见美国专利5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285，5,770,701，5,770,710，5,773,001，5,877,296均属于American Cyanamid Company)可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于，γ1I，α2I，α3I，N-乙酰-γ1I，PSAG和θI1(Hinman et al.，CancerResearch 533336-3342(1993)，Lode et al.，Cancer Research 582925-2928(1998)以及前述属于American Cyanamid的美国专利)。另一种可与抗体偶联的抗肿瘤药物是QFA，其为抗叶酸素。加利车霉素和QFA具有细胞内作用位点并不容易透过胞质膜。因此，通过抗体介导的内化进行的这些药剂的细胞吸收大大提高它们的细胞毒效应。
其他抗体修饰涉及其他抗体修饰。例如，抗体可连接于各种非蛋白性聚合物，例如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯，或聚乙二醇以及聚丙二醇的共聚物。抗体也可包埋在通过例如凝聚技术或界面聚合在胶质药物递送系统(例如脂质体，白蛋白微球体，微乳液，纳米颗粒或纳米胶囊)或粗乳液中制备的微胶囊中(例如分别为羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊以及聚-(methylmethacylate)微胶囊。所述技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.，(1980)。
脂质体和纳米颗粒本文公开的抗体还可在脂质体中配制。例如，本发明的抗体也可配制成免疫脂质体。含有所述抗体的脂质体可通过本领域已知方法制备，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.823688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.774030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545。在美国专利5,013,566中公开了循环时间已增加了的脂质体。通常，脂质体的配制和使用是本领域技术人员已知的。
特别有用的脂质体可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物经反相蒸发法产生。通过使脂质体在挤压之下穿过指定孔径大小的滤膜，可获得具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可如Martin等，J.Biol.Chem.，257286-288(1982)所述，经二硫键交换反应与脂质体偶联。可选，化疗剂(诸如Doxorubicin)可包含在脂质体内。见Gabizon et al.J.National Cancer Inst.81(19)1484(1989)。
其他用途本发明的抗体具有多种用途。例如，抗-ANGPTL4抗体可用于ANGPTL4或ANGPTL4片段的诊断实验中，例如，检测其在特定细胞、组织或血清中的表达，从而检测疾病，例如检测本发明所述的疾病等。一个实施方案中，ANGPTL4抗体可用于选择可利用本发明提供的方法治疗的患者群。本领域已知的各种诊断试验技术可使用，诸如，竞争结合试验，直接或间接夹心试验以及在异质或同质期进行的免疫沉淀测定(Zola，Monoclonal AntibodiesAManual of Techniques，CRC Press，Inc.(1987)pp.147-158)。诊断实验中使用的抗体可用可检测部分标记。所述可检测部分应能直接或间接产生可检测信号。例如，所述可检测部分可为放射同位素，诸如3H，14C，32P，35S，或125I，荧光或化学发光化合物，诸如荧光素异硫氰酸酯，若丹明，或萤光素，或酶，诸如碱性磷酸酶，beta-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。本领域已知的任何将抗体与可检测部分偶联的方法可使用，包括Hunter et al.，Nature，144945(1962)；David et al.，Biochemistry，131014(1974)；Pain et al.，J.Immunol.Meth.，40219(1981)；and Nygren，J.Histochem.And Cytochem.，30407(1982)描述的方法。
抗-ANGPTL4抗体可用于对来自重组细胞培养物或天然来源的ANGPTL4进行亲和纯化。在该过程中，使用本领域已知的方法将抗ANGPTL4抗体固定于适宜支持物上，诸如Sephadex树脂或滤纸。然后使该固定的抗体与含有待纯化的ANGPTL4的样品接触，然后用可基本去除样品中除外ANGPTL4的所有物质的适宜溶剂洗涤支持物，其中的ANGPTL4结合于固定的抗体。最后，利用另一种适宜的溶剂洗涤支持物，将ANGPTL4从抗体释放。
本发明多肽的共价修饰本发明的多肽例如多肽拮抗剂片段，融合分子(例如免疫融合分子)，本发明的抗体的共价修饰包含在本发明的范围内。如果可以，它们可通过化学合成或酶或化学裂解所述多肽来制备。其他类型的多肽共价修饰通过使靶向的多肽氨基酸残基与能与选定的侧链或N-或C-末端残基反应的有机衍生化药剂反应或将修饰的氨基酸或非天然氨基酸掺入生长中的多肽链来导入分子，例如，Ellman et al.Meth.Enzym.202301-336(1991)；Noren et al.Science 244182(1989)；和，&US专利申请20030108885和20030082575。
半胱氨酰残基通常与α-卤代乙酸酯(以及相应的胺)诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应产生羧甲基或羧基氨基甲基衍生物。半胱氨酸残基也通过与溴代三氟丙酮，α-溴代-β-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸，氯代乙酰磷酸(chloroacetylphosphate)，N-烷基马来酰亚胺，3-硝基-2-吡啶基二硫化物，甲基2-吡啶基二硫化物，p-对氯汞苯甲酸，2-氯汞基-4-硝基酚，或氯代-7-硝基苯基-2-氧杂(oxa)-1，3-二唑。组氨酰残基通过在pH 5.5-7.0与焦碳酸二乙酯反应衍生化，这是因为该药剂对于组氨酰侧链的相对特异性。对-溴苯酰甲基溴也有用；该反应通常在pH6.0在0.1mM二甲胂酸钠中进行。
赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸或其它羧酸酐反应。利用这些试剂进行衍生化对于反转赖氨酰残基的电荷有效。其它适宜衍生化含有α-氨基的残基的药剂包括亚氨酸酯，诸如甲代吡啶基亚氨酸甲酯(methyl picolinimidate)，磷酸吡哆醛，吡哆醛，氯代氢硼化物，三硝基苯磺酸，O-甲基异脲，2，4-戊二酮，和转氨酶催化的与乙醛酸盐的反应。
精氨酰残基通过与一或多种常规药剂反应来修饰，其中包括苯乙二醛，2，3-丁二酮，1，2-肌醇和水合茚三酮。精氨酸残基的衍生化需要在碱性条件中进行反应，因为胍功能基团可pKa较高。此外，这些药剂可与赖氨酸的基团以及精氨酸epsilon-氨基基团反应。
酪氨酰残基的具体修饰具体可通过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷反应而将光谱标记导入酪氨酰残基。通常，N-乙酰咪唑(acetylimidizole)和四硝基甲烷可使用以分别形成O-乙酰酪氨酰种类和3-硝基衍生物。酪氨酰残基利用125I或131I碘化以制备用于放射免疫测定的标记的蛋白。
羧基侧链(天冬氨酰或谷氨酰基)通过与碳化二亚胺(R-N＝C＝N-R’)反应选择性修饰，其中R和R’是不同的烷基基团，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-azonia-4，4-甲己胺)碳化二亚胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应转化成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。
谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基经常被脱去酰胺基分别成为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。这些残基在中性或碱性条件下脱去酰胺基。这些残基的脱酰胺基形式在本发明的范围内。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟化形式，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco，pp.79-86(1983))，N末端胺的乙酰化，以及任意C末端羧基酰胺化。
另一种类型的共价修饰涉及通过化学或酶的方法将苷类偶联于本发明的多肽。这些方法的优势在于它们不需要在具有N或C-连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生多肽。根据所用偶联模式，糖可连接于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基诸如半胱氨酸的，(d)游离羟基诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些，(e)芳香残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法在1987-9-11公开的WO 87/05330以及Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)中描述。
去除本发明多肽上存在的碳水化物部分可通过化学或酶的方法实现。化学去糖基化需要将多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。该处理导致除外连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖被裂解，而保持多肽完整。化学糖基化由Hakimuddin，et al.Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)and by Edge et al.Anal.Biochem.，118131(1981)描述。碳水化合物部分(例如抗体上的)的酶裂解可通过利用各种内切和外切糖苷酶如Thotakura et al.Meth.Enzymol.138350(1987)所述实现。
本发明多肽的另一种共价修饰包括将多种非蛋白聚合物中的一种与多肽相连，所述聚合物例如聚乙二醇或聚氧乙烯，其方式如美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述。
载体，宿主细胞和重组方法本发明所述多肽可利用轻易可得的技术和材料重组制备。
为进行本发明多肽例如ANGPTL4或抗ANGPTL4抗体，抗αvβ5抗体或抗血管生成抗体例如抗VEGF抗体的重组生产，分离编码它的核酸并把核酸插入可复制的载体中进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码糖蛋白的DNA易于利用传统方法分离和测序(例如，通过使用能够与编码糖蛋白的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的组分通常包括，但不限于，以下物质中的一种或多种信号序列，复制起点，一个或多个标记基因，增强子，启动子，和转录终止序列。
信号序列成分本发明的多肽不仅可直接被重组生产，也可以作为与异源多肽的融合蛋白被生产，该异源多肽优选是信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定切割位点的其它多肽。选定的异源信号序列优选是可由宿主细胞识别和加工(即，由信号肽酶切割)的序列。对于不识别和加工天然多肽信号序列的原核细胞，信号序列由以下原核信号序列取代，例如选自碱性磷酸酶，青霉素酶，1pp，或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌物，天然信号序列可由例如酵母转化酶前导序列，α因子前导序列(包括糖酵母(Saccharomyces)和克鲁维酵母(Kluyveromyces)α-因子前导序列)，或酸性磷酸酶前导序列，白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列，或WO 90/13646中所述的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列，例如，单纯疱疹gD信号。
在阅读框架中，此种前体区的DNA连接于编码所述抗体的DNA。
复制成分的起点表达载体和克隆载体都包含能使该载体在一或多种选定的宿主细胞中复制的核酸序列。一般情况下，在克隆载体中，这种序列是能使该载体独立于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自我复制序列。这样的序列在各种细菌、酵母和病毒中都是众所周知的。质粒pBR322的复制起点适合大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合酵母菌，多种病毒起点(SV40，多瘤病毒(Polyoma)，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。复制组分的起点一般不是哺乳动物表达载体所必需的(SV40起点的使用通常仅仅是由于其包含早期启动子)。
选择基因成分表达载体和克隆载体应该包含选择基因，也称选择标记。典型的选择基因编码具有以下性质的蛋白(a)赋予对抗生素或其它毒素(如氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四环素)的抗性，(b)弥补营养缺陷，或(c)提供复合培养基不能供给的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个实例是利用药物限制宿主细胞的生长。那些被异源基因成功转化的细胞产生一种赋予药物抗性的蛋白，从而在该选择环境中存活。这种显性选择可以采用的药物有新霉素，霉酚酸和潮霉素。
适合于哺乳动物细胞的另一例选择标记是允许鉴定能摄取多肽核酸的细胞的那些标记，如DHFR或胸苷激酶，金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等。
例如，用DHFR选择基因转化的细胞首先通过将所有转化体培养在包含氨甲蝶呤(Mtx，为DHFR的一种竞争型拮抗剂)的培养基中来进行鉴定。当采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞包括DHFR活性有缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
或者，宿主细胞(尤其包含内源DHFR的野生型宿主)被编码本发明多肽的DNA序列，野生型DHFR蛋白，以及另一种选择标记如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)转化或共转化以后，可以通过在含有针对该选择标记的选择试剂如氨基糖苷类抗生素(如卡那霉素，新霉素或G418)的培养基中培养细胞来进行选择。参见美国专利4,965,199。
适用于酵母的合适选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，28239(1979))。Trp1基因为不能在色氨酸中生长的酵母突变株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了选择标记(Jones，Genetics，8512(1977))。此后，酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在提供了通过在缺乏色氨酸的条件中生长而检测转化的有效环境。类似地，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)可以由携带Leu2基因的已知质粒来补充。
此外，源自1.6μm环状质粒pKD1的载体可以用于转化克鲁维酵母(Kluyveromyces)。Bianchi等，Curr.Genet.，12185(1987)。可选地，Van den Berg，Bio/Technology，8135(1990)报道了一种用于在乳克鲁维酵母(K.lactis)中大规模制备重组小牛凝乳酶的表达系统。已公开由克鲁维酵母的工业生产菌株产生分泌重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体。Fleer等，Bio/Technology，9968-975(1991)。
启动子成分表达载体和克隆载体通常包含能被宿主生物识别的启动子，它与多肽核酸可操作相连。适用于原核宿主的启动子，包括phoA启动子，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统，和杂化启动子如tac启动子。然而，也可以使用其它已知的细菌启动子。适用于细菌系统的启动子还包含与编码多肽的DNA可操作相连的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
真核生物的启动子序列也是已知的。几乎所有的真核基因在转录起始点上游约25-30个碱基处具有AT-富集区。很多基因在其转录起始点上游70-80个碱基处有另一种序列CNCAAT，其中X可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3’端是AATAAA序列，它可以作为一种信号用于将poly-A尾添加到编码序列3’端。所有这些序列都适合于插入真核表达载体中。
适用于酵母宿主的启动序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.，2552073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7149(1968)；Holland，Biochemistry，174900(1978))的启动子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸异构酶，3-磷酸甘油变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母启动子，即那些还具有由生长条件控制转录的优点的诱导型启动子，是下述基因的启动子区醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73,657中进一步描述了适用于酵母表达系统的载体和启动子。酵母增强子与酵母启动子联合使用也是有利的。
在哺乳动物宿主细胞中，从载体转录抗体可以受启动子调控，所述启动子例如来自病毒基因组，如多形瘤病毒、鸡痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的启动子，或者来自异源哺乳动物的启动子，如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子等，来自热休克蛋白的启动子，前提是这些启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子可以作为还包含SV40病毒复制起点的SV40限制性片段而方便地获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子可以作为Hind III E限制性片段方便地获得。美国专利4,419,446中公开了在哺乳动物宿主中用牛乳头瘤病毒作为载体来表达DNA的系统。美国专利4,601,978中叙述了对这个系统的改进。另见Reyes等，Nature，297598-601(1982)中关于在单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中表达人β干扰素cDNA。可选地，可将劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
增强子成分编码本发明多肽的DNA在高等真核生物中的转录常常通过将增强子序列插入载体中来增加。目前已知很多哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。但通常使用真核细胞病毒的增强子。实例包括在其复制起始点晚期侧(late side)的SV40增强子(bp100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，在其复制起始点晚期侧的多形瘤增强子，和腺病毒增强子。也可参见Yaniv，Nature，29717-18(1982)所述用于活化真核启动子的增强元件。所述增强子可以剪接插入载体中抗体编码序列的5’或3’位置，但优选位于启动子的5’位置。
转录终止成分用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有核细胞)的表达载体，还包括对转录终止和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常来自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶尔为3’)非翻译区。这些区域包含转录为编码抗体的mRNA的非翻译区中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一种有用的转录终止元件是牛生长激素多腺苷化区。见WO94/11026和其中公开的表达载体。
宿主细胞的选择和转化克隆或表达本文所述载体中DNA的适宜宿主细胞，包括原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如，大肠杆菌(E.coli)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文菌属(Erwinia)，克雷白菌属(Klebsiella)，变形菌杆属(Proteus)，沙门菌属(Salmonella)(如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium))，沙雷菌属(Serratia)(如粘质沙雷菌(Serratia marcescans))和志贺菌属(Shigella)等，以及芽孢杆菌属(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中所述地衣芽孢杆菌41P)等，假单胞菌属(Pseudomonas)如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，及链霉菌(Streptomyces)。优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但其它菌株，如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些实例是用于说明，并非限制。
除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合于抗体编码载体的克隆或表达的宿主。酿酒酵母或常见的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。还有多个其它属、种和株已有商品供应，并且可以用于本发明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如乳克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维氏酵母(K.marxianus)等；yarrowia(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28265-278(1988))；念珠菌属；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙链孢霉；许旺氏酵母属(schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(schwanniomycesoANGPTL4identalis)等；和丝状真菌，例如链孢霉属、青霉属、Tolypocladium以及曲霉属宿主如构巢曲霉和黑曲霉。
适合于表达糖基化多肽的宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。目前已经从下述宿主中鉴定了大量的杆状病毒株和变体以及相应的许可型昆虫宿主细胞草地夜蛾(Spodoptera Frugiperda，毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus，蚊子)、Drosophila melanogaster(果蝇)和家蚕蛾(Bombyx mori)等。用于转染的各种病毒株公众可以获得，例如加利福尼亚Y级夜蛾(Autographa california)NPV的L-1变体和家蚕蛾NPV的Bm-5株，并且这些病毒可以在此用作本发明的病毒，尤其是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草等的植物细胞培养物也可以用作宿主。
然而，关注最多的是脊椎动物细胞，而且在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞已经成为常规方法。有效哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293细胞或经过再克隆以便能在悬浮培养物中生长的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.3659(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.774216(1980))；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；小鼠骨髓瘤细胞，例如NSO(如RCB0213，Bebbington等，Bio/Technology 10169(1992))和SP2/0细胞(例如SP2/0-Ag14细胞，ATCCCRL 1581)；大鼠骨髓瘤细胞，例如YB2/0细胞(例如YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞，ATCC CRL 1662)；和人肝癌细胞系(HepG2)。
利用上述表达或克隆载体转化宿主细胞以进行抗体制备并培养在经改进的常规营养培养基中，所述培养基适于诱导启动子，选择转化体，或扩增编码所需序列的基因。
培养宿主细胞可在多种培养基中培养用于生产本发明多肽的宿主细胞。作为商品提供的培养基例如Ham’s F10(Sigma)，极限必需培养基(Minimal EssentialMedium)((MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco’s改良的Eagle培养基((DMEM)，Sigma)适宜培养宿主细胞。此外，Ham等，Meth.Enzym.5844(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102255(1980)，美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中所述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。在需要时均可向这些培养基的任何一种补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素，转铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(例如氯化钠，钙，镁，和磷酸盐)，缓冲液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷酸和胸腺嘧啶)，抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)，微量元素(定义为无机化合物，通常终浓度在微摩尔范围内)，和葡萄糖或对等的能源。也可包括本领域熟练技术人员所知的适当浓度的任何其它必需添加剂。培养条件，例如温度，pH，等是此前选择用于表达的宿主细胞的条件，并且是本领域普通熟练技术人员显而易见的。培养条件诸如温度，pH等，是被选用于表达的宿主细胞的那些条件，并且是本领域技术人员所已知的。
多肽纯化使用重组技术时，本发明的多肽例如ANGPTL4，抗-ANGPTL4抗体或抗-αvβ5抗体，或抗血管生成抗体可在细胞内，壁膜间隙产生，或直接分泌到培养基中。本发明的多肽可收集自培养基或宿主细胞裂解物。如果是膜结合的，其可利用适宜洗涤溶液(例如Triton-X 100)或通过酶促裂解释放自膜。用于表达本发明多肽的细胞可通过各种物理或化学方法破坏，诸如冻-干循环，超声波降解法，机械破坏或细胞裂解剂。
需要从重组细胞蛋白或多肽纯化本发明的多肽。以下步骤是适宜纯化步骤的实例在离子交换柱上分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅胶上层析，在阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱，DEAE等)上进行肝素SEPHAROSETM层析；色层焦集法；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；利用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋白A琼脂糖凝胶柱以去除污染物诸如IgG；以及金属螯合柱以结合本发明多肽的表位标记的形式。各种蛋白纯化方法可使用，诸如本领域已知的那些以及在以下文献中描述的那些Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein PurificationPrinciplesand Practice，Springer-Verlag，New York(1982)。所选纯化步骤有赖于例如使用的制备过程的性质以及产生的具体的本发明的多肽。
例如，由细胞制备的抗体组合物可使用例如如下方法纯化例如，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析和亲和层析，优选亲和层析作为常用的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适宜性有赖于存在于糖蛋白中的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人(γ1，γ2，或γ4重链的糖蛋白(Lindmark等，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。蛋白G用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.515671575(1986))。亲和配体附着的基质通常是琼脂糖，但也可用其它基质。机械稳定的基质例如孔径被控制的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)比使用琼脂糖获得更快的流率而且加工时间更短。对于含有CH3区的抗体，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于纯化。根据待回收的抗体，也可利用其它蛋白纯化技术，例如上文所述那些。也见Carter et al.，Bio/Technology 10163-167(1992)，其描述用于分离分泌入大肠杆菌胞质周隙的抗体的方法。
药物组合物可以制备根据本发明使用的本发明的多肽，本发明的分子，及其组合的治疗配制剂用于保存，方法是将具有适当纯度的所需分子例如多肽与可选的药用载体，赋形剂，或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.ed.(1980))混合形成冻干配制剂或水溶液。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkonium chloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM，PLURONICSTM或乙二醇(PEG)。
活性组分也可包埋在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚计数或通过界面聚合化，例如羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸酯(methylmethacylate)微胶囊，分别在胶体给药系统(例如，脂质体，白蛋白微球体，促乳液，纳米颗粒或纳米胶囊)或粗乳液中制备。所述技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。
一些实施方案中，用于体内给药的配制品必须是无菌的。在冻干和重建之前或之后通过除菌滤膜过滤可容易地实现无菌。
可制备缓释制备物。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有本发明化合物的固体疏水聚合物半通透基质，如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3773919，EP 58,481)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。虽然聚合物诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟乙酸使得能够释放分子100天以上，一些水凝胶释放蛋白的时间持续较短。当包被的抗体在体内保持较长时间时，它们由于在37℃暴露于潮湿环境而发生变性和聚集，导致生物活性的丧失以及免疫原性的可能的改变。可根据涉及的机制设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是细胞间通过硫代二硫化物交换形成S-S键，稳定化可通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制适度含量、使用适宜的添加剂以及开发具体的聚合物基质组合物实现。也见，例如，US Patent No.6,699,501，其描述具有聚合电解质覆盖物的胶囊。
还涉及本发明的药剂(ANGPTL4，ANGPTL4激动剂或ANGPTL4拮抗剂)可通过基因治疗导入受试者。基因治疗指通过将核酸给药受试者进行的治疗。在基因治疗应用中，基因导入细胞以实现治疗有效的基因产物的体内合成，例如通过取代有缺陷的基因。“基因治疗”包括常规基因治疗，其中可通过单次治疗实现持续效应，还包括给药基因治疗药剂，其涉及一次或重复给药治疗有效的DNA或mRNA。反义RNA和DNA可用作阻断一些基因在体内表达的治疗剂。见例如，本文描述的Ad-ANGPTL4-SiRNA。已经显示尽管短的反义寡核苷酸的细胞内低浓度导致其细胞膜吸收有限，可将它们引入细胞，它们在细胞中作为抑制剂。(Zamecnik et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA834143-4146(1986))。可修饰寡核苷酸提高它们的吸收，例如通过用不带电的基团取代它们带负电的磷酸二酯基。基因治疗方法的简述参见例如Goldspiel et al.Clinical Pharmacy 12488-505(1993)；Wu and Wu Biotherapy387-95(1991)；Tolstoshev Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596(1993)；Mulligan Science 260926-932(1993)；Morgan and Anderson Ann.Rev.Biochem.62191-217(1993)；and May TIBTECH 11155-215(1993)。本领域通常已知的可用的重组DNA技术描述于Ausubel et al.eds.(1993)Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY；and Kriegler(1990)Gene Transferand Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY。
存在多种技术可用于将核酸导入存活细胞。所述技术根据核酸转入体外培养的细胞，或在体内转入目的宿主的细胞而不同。适合将核酸导入体外哺乳动物细胞的技术包括脂质体，电穿孔，显微注射，细胞融合，DEAE-葡聚糖，磷酸钙沉淀法等。例如，体内基因转移技术包括但不限于例如，用病毒(通常是逆转录病毒)载体的转染和病毒包膜蛋白-脂质体介导的转染(Dzau etal.，Trends in Biotechnology 11，205-210(1993))。例如，体内核酸转移技术包括利用病毒载体(诸如腺病毒，I型单纯疱疹病毒，慢病毒，逆转录病毒或腺伴随病毒)以及基于脂质的系统(用于基因的脂质介导的转移的有用的脂质是例如DOTMA，DOPE和DC-Chol)进行转染。在基因治疗中使用病毒载体的实例可见于Clowes et al. J.Clin.Invest.93644-651(1994)；Kiem et al.Blood 831467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg Human Gene Therapy4129-141(1993)；Grossman and Wilson Curr.Opin.in Genetics and Devel.3110-114(1993)；Bout et a1.Human Gene Therapy 53-10(1994)；Rosenfeld etal.Science 252431-434(1991)；Rosenfeld et al.Cell 68143-155(1992)；Mastrangeli et al.J.Clin.Invest.91225-234(1993)；and Walsh et al.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300(1993)。
一些情况中，需要对核酸来源提供靶向靶细胞的药剂，诸如，特异于细胞表面膜蛋白或靶细胞的抗体，靶细胞受体的配体等。使用脂质体的情况中，结合于内吞相关的细胞表面膜蛋白的蛋白可用于靶向和/或促进吸收，例如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段，在周期中经过内化的蛋白的抗体，靶向细胞内定位并促进细胞内半寿期的蛋白。受体介导的胞内吞作用的技术在例如Wu et al.，J.Biol.Chem.262，4429-4432(1987)；and Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，3410-3414(1990)中描述。基因标记和基因治疗方案的简述参见Anderson et al.，Science 256，808-813(1992)。
剂量和给药本发明的分子根据已知方法给药人患者，诸如作为药团经静脉内给药或在一段时间内连续输注，经肌内、腹腔内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径，和/或皮下给药。
一些实施方案中，本发明的治疗涉及联合给药ANGPTL4拮抗剂和一或多种抗癌药剂，例如抗血管生成药剂。一个实施方案中，存在其它抗癌药剂，例如一或多种不同的抗血管生成药剂，一或多种化疗剂等。本发明还涉及多重抑制物的给药，例如相同抗原的多重抗体或不同癌活性分子的多重抗体一个实施方案中，不同化疗剂的混合物可与ANGPTL4拮抗剂和/或一或多种抗血管生成药剂一同给药。联合给药包括共给药，其利用分离的配制剂或单个药物配制剂，和/或以任何顺序连续给药。例如ANGPTL4拮抗剂可在给药抗癌药剂之前、之后、交替给药，或可同时给药。一个实施方案中， 一个实施方案中，存在两种(或所有)活性药剂同时显示它们的生物活性的时间段。
为了预防或治疗疾病，适宜剂量的ANGPTL4拮抗剂将有赖于待治疗疾病的类型，如上所述，疾病严重性和过程，抑制物给药是为了预防和治疗，以前的治疗，患者临床病史以及对抑制物的反应，以及主治医师的判断。可在一次和连续多次的治疗中将抑制物适宜地给药患者。在联用治疗方案中，本发明的组合物以治疗有效量或治疗协同量给药。如本发明所述，治疗有效量是这样的量，其使得本发明的组合物和/或ANGPTL4拮抗剂与一或多种其它治疗剂的共给药导致靶疾病或病症的减轻或抑制。联合给药的效果可以是相加的。一个实施方案中，给药的结果是协同效果。治疗协同量是ANGPTL4拮抗剂以及一或多种其它治疗剂(例如血管生成抑制剂)协同或明显减轻或消除具体疾病相关的情形或症状所需的量。
根据疾病的严重程度，大约1μg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的ANGPTL4，ANGPTL4激动剂或ANGPTL4拮抗剂是给药患者的初始候选剂量，给药方式可为一或多次分开的给药或连续输注。根据上述的因素，正常的日剂量可根据给药途径从每天大约10ng/kg到高达100mg/kg或更多，优选大约1.g/kg/天到10mg/kg/天。对于在数天或更长时间内的重复给药，治疗持续到对疾病症状的理想的抑制出现。但是，也可采用其它剂量方案。通常，临床医师将给药本发明的分子直到达到提供所需生物效应的剂量。本发明治疗的过程容易通过常规技术或测定法监测。
例如，血管生成抑制剂例如抗-VEGF抗体诸如AVASTIN(Genentech)的制备和剂量方案可根据生产商的说明使用或由有经验的执业者确定。另一实施方案中，所述化疗剂的制备和剂量可根据生产商的说明使用或由有经验的执业者确定。。化疗剂的制备和剂量也描述于Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。
治疗效力本发明治疗的效力可通过用于评估肿瘤形成或非肿瘤形成疾病中常用的各种端点(endpoint)来测定。例如，癌症治疗可通过例如但不限于肿瘤衰退，肿瘤重量或体积减少，进展时间，存活期，无进展存活，总体反应率，反应持续时间以及生活质量来评估。由于本发明描述的抗血管生成药剂靶向肿瘤脉管系统而不一定是肿瘤细胞本身，它们是一类独特的抗癌药类型，由此需要独特的临床药物反应的测定和定义。例如，二维分析中超过50％的肿瘤缩小是表明反应的标准截留值。但是，本发明的抑制物可导致转移扩散的抑制而不减小原发肿瘤的体积，并且仅仅显示肿瘤生长抑制效果。因此，测定治疗效力的方法可使用，把欧哦例如测定血浆和尿的血管生成标记以及通过放射影像测定反应。
一个实施方案中，本发明可用于增加易患或诊断为患有非肿瘤或肿瘤疾病例如癌症的人患者的存活时间。存活时间定义为首次给药到死亡的时间。一方面，本发明的ANGPTL4拮抗剂于一或多种抗癌药剂一同给药人患者，由此与单一类型的治疗相比有效增加患者的存活时间，例如与单一类型的治疗相比增加大约5％，或大约10％，或大约20％，或大约30％，或大约40％，或大约50％或更多。
另一实施方案中，本发明提供增加易患或诊断为患有非肿瘤或肿瘤疾病例如癌症的患者的无进展存活期的方法。疾病进展的时间定义为给药药物直到疾病进展的时间。一个实施方案中，本发明利用ANGPTL4拮抗剂或一或多种抗癌药剂的联合给药与单独的抗癌治疗相比明显增加无进展存活期至少约2个月，至少约4个月，至少约6个月，至少约8个月，一年以上。
另一实施方案中，本发明的治疗明显增加易患或诊断为患有癌症并用各种治疗剂治疗的的人患者的组的反应率。反应率定义为应答于治疗的被治疗患者的百分比。本发明一个实施方案中，本发明利用ANGPTL4拮抗剂以及一或多种抗癌药剂的联合治疗使得与利用单一类型抗癌疗法(例如单独的化疗)的患者的组相比，治疗的患者组的反应率明显增加，所述增加具有例如小于0.010，小于0.005，或小于0.001的Chi-square p-值。
一方面中，本发明提供增加易患或诊断为患有癌症的人患者或人患者的组的反应持续时间。反应持续时间定义为初次反应到疾病进展的时间。本发明的一些实施方案中，本发明利用ANGPTL4拮抗剂以及一或多种抗癌药剂的联合治疗可获得反应持续时间的例如至少2个月，至少4个月，至少6个月的统计学明显的增加。
制品在本发明的另一实施方案中，提供了含有用于所述方法以及疾病治疗的上述物质的制品。该制品包含容器，标签和包装插入物。合适的容器包括，例如，瓶子，小瓶，注射器等。容器可由诸如玻璃或塑料等各种材料制成。该容器内含有有效治疗疾病的组合物且可以具有无菌入口(例如，该容器可以是具有通过皮下注射针头可刺入的塞子的静脉内用溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性药剂是ANGPTL4调节物。容器上的或者与其相连的标签指示该组合物用于治疗选定的疾病。该产品还可包含第二个容器，该容器中含有药用上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液，林格(Ringer′s)溶液和葡萄糖溶液。它还包含从商业和用户角度需要的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，过滤器，针头，和注射器。
材料的保藏如前所述，下列材料保藏在美国典型培养物保藏中心，10801 UniversityBoulevard，Manassas，VA.20110-2209，USA(ATCC)

按照布达佩斯条约的规定在国际上认可的用于专利程序的微生物保藏机构并按其实施细则(布达佩斯条约)进行这些保藏。这样保证了该保藏物的活培养物从保藏日起维持30年。按布达佩斯条约的条款该保藏物由ATCC使其可获得且按Genentech，Inc.与ATCC之间的协议进行，该协议保证在相关美国专利颁发时或在任何美国或外国专利申请公开提供给公众时，无论哪一个在先，该保藏物的培养物后代可持久和无限制地为公众获得，且保证按照35 USC§122和依据其委员会规定(包括具体参考886 OG 683的37 C.F.R.§1.14)对其授权的美国专利和商标委员认定的个人获得其子代。
本申请的受让人同意如果保藏的该材料的培养物在合适条件下培养时如果死亡导致丢失或破坏时，该材料将在通知时用另一相同材料迅速替换。该保藏材料的可获得性不应解释为允许违反任何政府机构按其专利法批准的权利来实施本发明。
实施例应理解本发明所述的保藏物，实施例以及实施方案仅仅用于说明，本领域技术人员可理解各种修饰或改变并且其包含在本申请及其权利要求的精神以及范围内。实施例中商业可得的药剂根据生产商说明使用，除非另有说明。
实施例1ANGPTL4刺激肿瘤细胞增殖和细胞迁移腺病毒载体的产生和转导腺病毒构建体已经基本上按照生产商所述，将Not1-Not1 cDNA插入物克隆入Stratagene(LaJolla，CA)的Ad-easy载体构建试剂盒的多接头位点来构建。见例如，Hesser et al.，Blood，104(1)149-158(2004)。
hAngptl4(23-406)(PUR9384)，mAngptl4(184-410)-IgG(PUR9388)和mAngptl4(23-410)(PUR9452)单Flag标记的蛋白的产生使收获的细胞培养物液体在抗-flag M2树脂(Sigma#A-2220)上过夜。用PBS洗涤柱子到基线然后用50mM柠檬酸钠pH3.0洗脱。该体积在Amicon-15 10,000MWCO(Millipore#UFC901024)上浓缩。最后的步骤是透析入1mM HCl/Super Q H2O和0.2um过滤。利用4-20％tris/甘氨酸(Invitrogen#EC6028box)SDS page凝胶+/-10mM DTT确定纯度。通过质谱或Edman’s n-末端测序鉴定正确的蛋白质。
hAngptl4(184-406)-IgG(PUR 9441)n-末端标记的产生以及随后的n-末端hu Fc标记的产生收获的细胞培养物液体在ProSep A(Amersham#113111835)上过柱过夜。用PBS洗涤柱子到基线。然后进行四倍柱体积的0.5M TMAC/PBS pH 7.5洗涤步骤，之后利用PBS洗涤到基线。洗脱步骤利用50mM Na Citrate pH3.0泵。该体积在Amicon-15 10,000MWCO(Millipore#UFC901024)上浓缩。最终的步骤是透析入1mM HCl/Super Q H2O以及0.2um过滤。利用4-20％tris/甘氨酸(Invitrogen#EC6028box)SDS page凝胶+/-10mM DTT确定纯度。通过质谱或Edman’s n-末端测序鉴定正确的蛋白质。重组蛋白也可利用本领域已知的标准技术制备。
Ad-ANGPTL4-SiRNA的产生基于完整长度hANGPTL4序列，产生4个可能的ANGPTL4-SiRNA分子(Qiagen)。基于siRNA抑制hANGPTL4表达的能力选择一个ANGPTL4-SiRNA。其靶向ANGPTL4的以下DNA靶序列GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA(SEQ ID NO.3)，例如，r(GGCCAAGCCUGCCCGAAGAUU)(SEQ ID NO4)和/或r(UCUUCGGGCAGGCUUGGCCAC)(SEQ ID NO5)。利用RNA启动子将该SiRNA克隆入CMVpShuttle-H1.1转移载体，所述启动子例如，H1启动子(GenScript)。SiRNA表达盒随后被克隆以产生腺病毒AdhANGPTL4-SiRNA构建体。腺病毒构建体已经基本上按照生产商的描述，通过将Not1-Not1cDNA插入物克隆入Stratagene(LaJolla，CA)的Ad-easy载体构建试剂盒的多接头位点中来构建。见例如，Hesser et al.，Blood，104(1)149-158(2004)。
ANGPTL4的表达通过利用抗FLAG抗体进行Western印迹分析来确认。选择一个强表达的克隆并根据生产商说明扩大滴度。病毒制备物利用CsCl离心纯化并通过PCR检测回复体。病毒滴度通过96孔细胞裂解试验根据生产商说明测定。这些载体，以及提供的pShuttleCMV-lacZ在BJ5183 electro感受态细菌中利用含有E1和E3区缺失的Ad5基因组的AdEasy载体进行重组。原代病毒母液通过将重组的AdEasy质粒瞬间转染到宿主HEK293细胞中制备。腺病毒母液进一步在HEK293细胞中扩增，并利用CsCl梯度纯化方法如生产商所述进行纯化。腺病毒的工作滴度通过Elisa测定法获得。
mANGPTL4的产生293细胞利用含有编码全长mANGPTL4(1-410)的核酸的构建体瞬时转染。从上清纯化上清并用于试验。
肿瘤细胞体外增殖ANGPTL4刺激人A673横纹肌肉瘤肿瘤细胞(HTB1598)的体外增殖。见图4，图A。Ad-Angptl4，Ad-LacZ，Ad-Angptl13的腺病毒构建体如前述产生(Hesser et al，Blood，104(1)149-158(2004))。A673细胞利用包含腺病毒-ANGPTL4构建体(Ad-Angptl4)，腺病毒-LacZ构建体(Ad-LacZ)对照，或腺病毒-ANGPTL3构建体(Ad-Angptl3)的构建体在感染复数(MOI)100进行转导。A673细胞在5％FCS高葡萄糖DMEM中生长3天后，计数细胞。如图4，图A所示，Ad-Angptl4刺激肿瘤细胞增殖。与Ad-LacZ对照相比，用Ad-Angptl4处理的细胞的细胞数目增加超过2倍。与对照相比，Ad-Angptl4也刺激MCF7细胞的增殖(人乳腺腺癌)大约3倍，TK10细胞(肾细胞癌系)大约2倍，A549细胞(人肺癌)大约1.5倍。Ad-Angptl4也刺激U87MG细胞增殖。见，图4，图B，其中细胞(A673，U87M G，4T-1，或Caki)用含有以下构建体的构建体以感染复数(MOI)500感染腺病毒-ANGPTL4构建体(Ad-Angptl4(2))，腺病毒-LacZ构建体(Ad-LacZ(1))对照，或腺病毒ANGPTL4-SiRNA构建体(3)。细胞在5％FCS高葡萄糖DMEM中生长2-3天后，计数细胞。
ANGPTL4转导的COS细胞的经调节的培养基也诱导A673细胞的增殖。见图4，图C。将肝细胞(Hepa)(A)，人微血管内皮细胞(HMEC)(B)，或用腺病毒载体(Ad-Angptl4(2)，Ad-LacZ(1)或Ad-Angptl3(3))转导的COS7(C)的经调节的培养基(上清)加入A673细胞。A673细胞在5％FCS高葡萄糖DMEM中生长4天后，计数细胞。如图4的图C所示，COS细胞+Ad-Angptl4的上清与对照和所用其它细胞类型例如Hepa细胞和HMVEC细胞的上清相比刺激肿瘤细胞增殖。
包被在培养皿上时的Angptl4活性Angptl4对A673细胞的增殖刺激作用通过将蛋白包被于培养皿上检测。板利用小鼠Angptl4，LZ-hANgptl4，纤连蛋白，NL4对照蛋白，IgG-hAngptl4(184-406)，mAngptl3，hAngptl3，mAngptl4(23-410)，Lz-hAngptl4(184-406)，Fc-hAngptl4(184-406)或BSA，以各种浓度包被，例如无包被，0.3μg/ml，3.0μg/ml或30μg/ml。96-孔平底板(MaxiSorp，Nunc，Denmark)在4℃包被过夜。收获人A673肿瘤细胞并在含5％FCS的HG-DMEM培养基中稀释到105细胞/ml。将200μl中的细胞悬液(104细胞/孔)加入包被的孔并将板在37℃保温所选时间。非粘附性细胞通过PBS洗涤去除，并利用结晶紫或Landegren的PNAG法测定细胞粘附。见，Landegren，U.(1984)J.Immunol.Methods 67379-388。结果分别以一式三份的孔的平均OD550或OD405值表示。
类似地，收获分离自人脐带或人肾(Cambrex)的人原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)上皮(epi)和系膜(mesa)细胞并利用相同条件检测。对于增殖实验，采用生产商(Cambrex)提供的用于每种细胞类型的培养基。ANGPTL4不诱导肾上皮细胞、肾系膜细胞或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖，但诱导A673细胞增殖(图5)。
ANGPTL4与A673细胞结合的FACS分析ANGPTL4与人A673细胞的结合通过FACS分析检测。将A673细胞以500,000-1×106细胞/样品孔铺于10cm培养皿中。FACS前细胞分裂。细胞用PBS洗涤一次，然后加入10ml 20mM EDTA的PBS溶液并保温10-20分钟。20分钟后，将细胞从板刮出。加入10ml 5％FCS的PBS溶液并将细胞转移到50ml Falcon管中。细胞在4℃、1.8K rpm离心5分钟。去除上清并将细胞重悬于1ml含5％FCS的PBS溶液。将100μl细胞悬液分配到5ml含有1μg蛋白的试管中并在冰上孵育30分钟或更长时间。使用以下蛋白mAngptl4(23-410)，PUR 9452，0.428mg/ml(2μl/样品)；hAngptl4(23-406)，PUR 9384，+/-90μg/ml(10μl/样品)；hAngptl4(184-406)-IgG，PUR 9441，1.5mg/ml(1μl/样品)；和对照FLAG-BAP(Sigma)0.1mg/ml(2μl/样品)。保温后，将管内充满5ml含5％FCS的PBS溶液，置于冰上。细胞在2K rpm离心5分钟。去除上清。加入抗-FLAG-FITC抗体(Sigma)(2μl抗体(100μg/ml母液)并在冰上孵育5分钟或更长时间。最终的抗体浓度为1μg/ml。加入5ml 5％FCS的PBS溶液并在4℃以1.8K rpm离心细胞5分钟。去除上清并将细胞重悬于含有5％FCS的0.25ml PBS，置于冰上。也可存在0.05％叠氮化钠以防止受体内化。每份样品中加入1μl 1∶50稀释的碘化丙啶(PI)。然后对细胞进行FACS。各种形式的ANGPTL4包括人和小鼠ANGPTL4在各种条件下(图6，图B)，常氧，低氧(0％O2，24小时，或PMA(200nM、24小时)结合A673细胞(图6，图A)。对于低氧实验，将细胞在37℃、5％CO2，95％N2保温箱中保温24小时。可选，细胞在200nM佛波醇酯(PMA)存在下，在37℃保温箱中，5％CO2和常氧条件下活化。
来自表达ANGPTL4的细胞的经调节的培养基检验A673细胞在利用表达Angptl4的细胞的经调节的培养基和加入重组Angptl4的条件下的增殖。将来自用腺病毒构建体(Ad-Angptl4(2)，Ad-LacZ(1)或Ad-LacZ+rmAngptl4(23-410)(3)(5μg/ml))转导的COS7细胞的500μl经调节的培养基(上清)加入A673细胞。细胞在含有5％FCS、高葡萄糖DMEM的培养基中生长7天后(图7，图A)，计数细胞。A673的增殖也通过将重组Angptl4加入具有5％FCS的培养基并使细胞生长4天来检测。培养基中按照所示的浓度加入没有加入物质(1)，缓冲液对照(2)，mAngptl4(23-410)(2.5μg/ml)(3)，hAngptl4(23-406)(2.5μg/ml)(4)，hIgG-hAngptl4(184-406)(2.5μg/ml)(5)或hIgG-mAngptl4(184-410)(2.5μg/ml)(6)。细胞在含有5％FCS、高葡萄糖DMEM的培养基中生长4天(图7，图B)后，计数细胞。来自表达ANGPTL4或加入培养基的重组蛋白的细胞的经调节的培养基对A673细胞的增殖的作用可为细胞密度依赖性的。见图7图A(细胞在所示条件下生长7天的细胞增殖)和图B(细胞在所示条件下生长4天的细胞增殖)。
Angptl4诱导细胞迁移我们检验了Angptl4诱导小鼠4T-1肿瘤细胞的细胞迁移的能力。细胞活动力如所描述那样测定(见例如，Camenisch，et al.，J.Biol.Chem.，277(19)17281-17290(2002))，其中利用孔径为3μm的HTS多孔组织培养插入物(Becton Dickinson，NJ)。将hANGPTL4(1-406)稀释于50/50/0.1％BSA中使其浓度达到5，1和0.2μg/ml。作为阳性对照，将膜与含有10％胎牛血清(FCS)或0.1μg/ml重组人PDGF-BB(R&D Systems)的培养基一起温育。使用50/50/0.1％BSA作为阴性对照。小鼠4T1肿瘤细胞利用PBS洗涤三次并以105细胞/ml大约重悬于50/50/0.1％BSA。检测以下细胞制备物，其中mANGPTL4表示为NL2。

将制备物加入底部小室并将制备物在37℃保温19小时。
将细胞悬液(250μl)加入上方小室并允许细胞在37℃、5％CO2加湿的保温箱中迁移过夜。保温后，从上方和底部小室中吸出培养基，迁移到膜下表面的细胞用甲醇固定(400μl MeOH4℃固定30分钟，去除MeOH并风干40分钟)并用YO-PRO-1碘化物(Molecular Probes，OR)(400μl YO-PRO-1碘化物，浓度10μm(1∶100，来自1mM母液))染色。迁移结果利用Openlab软件(Improvision，MA)在20倍放大率下定量为细胞平均数/显微镜视野。
另一实验中，发现Angptl4诱导A673细胞随4T-1肿瘤细胞的迁移一起迁移。mANGPTL4在50/50/0.1％BSA中稀释到6，1.5和0.375μg/ml。作为阳性对照，将膜与含有10％胎牛血清(FCS)或0.1μg/ml重组人PDGF-BB(R&D Systems)的培养基一起温育。使用50/50/0.1％BSA作为阴性对照。收获4T1和A673细胞并重悬于50/50/0.1％BSA(2×105细胞/ml)。检测以下细胞制备物，其中mANGPTL4表示为NL2。

将750μl制备物加入底部小室并将制备物在37℃保温19小时。
将细胞悬液(250μl)(5×104)加入上方小室并允许细胞在37℃、5％CO2加湿的保温箱中迁移过夜。保温后，从上方和底部小室中吸出培养基，迁移到膜下表面的细胞用甲醇固定(400μl MeOH4℃固定30分钟，去除MeOH并风干40分钟)并用YO-PRO-1碘化物(Molecular Probes，OR)(400μlYO-PRO-1碘化物，浓度10μm(1∶100，来自1mM母液))染色。迁移结果利用Openlab软件(Improvision，MA)在20倍放大率下定量为细胞平均数/显微镜视野。见，图9，其中(1)未添加血清，(2)10％胎牛血清(FCS)，(3)PDGF-BB，(4)ANGPTL4。利用ANGPTL4和10％FCS的情况中，A673和4T-1细胞迁移。因此，Angptl4拮抗剂可用于抑制转移，例如不受任何理论限制，通过防止肿瘤细胞迁移进行。
ANGPTL4在体内增加肿瘤体积人A673横纹肌肉瘤细胞(HTB 1598)如前所述进行培养(Kim et al.，Nature 362841-844(1993)；and，Gerber et al.，Cancer Research，606253-6258(2000))。将0.1ml Matrigel中的5×106A673细胞s.c.注入浅褐色裸小鼠(Harlan Sprague Dawley)的背侧肋区以建立异种移植物。腺病毒构建体以1×108噬斑形成单位(PFU)，肿瘤内(IT)，q7d在第1，7和14天注入。可从侧面和下方利用28-号(gauge)针和0.5ml结核菌素注射器直接注入肿瘤体。腺病毒构建体可为腺病毒-ANGPTL4构建体(Ad-Angptl4)，腺病毒-LacZ构建体(Ad-LacZ)对照或腺病毒-ANGPTL3构建体(Ad-Angptl3)。肿瘤大小在肿瘤植入后的各个天数测定。肿瘤体积测定每隔一天进行，并利用椭圆体积公式(π/6×L×W×H，其中L＝长度，W＝宽度，H＝高度；Tomayko & Reynolds，Cancer Chemother.Pharmacol.，24148-154(1989))计算肿瘤体积。如图8中所示，在注入A673细胞和腺病毒-ANGPTL4构建体(Ad-Angptl4)的小鼠中，与注入Ad-LacZ或Ad-Angptl3构建体的小鼠相比，肿瘤体积(图A)和重量(图B)在统计学上增加(P＜0.0001)。
实施例2利用ANGPTL4治疗的肿瘤逃离抗VEGF治疗的趋势ANGPTL4刺激用抗血管生成药剂例如抗-VEGF(诸如AVASTIN(Genentech，South San Francisco)治疗的肿瘤中的肿瘤细胞增殖。见图8，图C。人A673横纹肌肉瘤细胞(HTB 1598)如前所述培养(Kim et al.，Nature362841-844(1993)；和Gerber et al.，Cancer Research，606253-6258(2000))。0.1ml Matrigel中的5×106A673细胞s.c.注入浅褐色裸小鼠(Harlan SpragueDawley)的背侧肋区以建立异种移植物。腺病毒构建体以1×108噬斑形成单位(PFU)，肿瘤内(IT)，q7d在第1，7和14天注入。腺病毒构建体可为腺病毒-ANGPTL4构建体(Ad-Angptl4)，腺病毒-LacZ构建体(Ad-LacZ)对照或腺病毒-ANGPTL3构建体(Ad-Angptl3)。小鼠也用Avastin(Genentech)以5mg/kgip一周两次治疗。可从侧面和下方利用28-号(gauge)针和0.5ml结核菌素注射器直接注入肿瘤体。肿瘤大小在肿瘤植入后的各个天数测定。肿瘤体积测定每隔一天进行，并利用椭圆体积公式(π/6×L×W×H，其中L＝长度，W＝宽度，H＝高度；Tomayko & Reynolds，Cancer Chemother.Pharmacol.，24148-154(1989))计算肿瘤体积。如图8的图C中所示，联用AVASTIN治疗的情况下，在注入A673细胞和腺病毒-ANGPTL4构建体(Ad-Angptl4)的小鼠(尽管它们已经用AVASTIN处理)中，与注入含有Ad-LacZ或Ad-Angptl3构建体的细胞的小鼠相比，肿瘤体积增加.
实施例3结合ANGPTL4的抗体抑制肿瘤细胞生长检测抗-ANGPTL4抗体抑制ANGPTL4生物活性例如肿瘤细胞增殖能力。将1×104肿瘤细胞(例如HeLa-S3，Caki，U87MG，293，A673，HM7和Calu6)/孔铺于12孔板的含10％FCS的培养基中。允许细胞在37℃、5％CO2加湿的保温箱中保温过夜。培养基换成5％FCS(除了Calu 6细胞，其在10％FCS中)，并将1，2.5，5，或10μg/ml抗-hANGPTL4抗体或抗-Dscr加入孔或不向孔中加入抗体。板置于37℃、5％CO2加湿的保温箱中。加入抗-hANGPTL4抗体2或3天后计数细胞。抗-ANGPTL4抗体抑制HeLa-S3，CakiU87MG，293，A673，和Calu 6的细胞生长，但不抑制HM7细胞的生长。见，图10，图A和B。
实施例4制备结合ANGPTL4的抗体产生多克隆抗体和单克隆抗体的技术是本领域已知的并在本发明描述。可使用的抗原(或免疫原)包括纯化的本发明的蛋白，蛋白片段，包含所述蛋白的融合蛋白，以及在细胞表面表达重组蛋白和/或蛋白片段的细胞。抗原的选择可由本领域技术人员无需过多实验而进行。
小鼠，诸如Balb/c，利用在完全弗氏佐剂中乳化的抗原免疫，并皮下或腹腔内诸如1-100mg的量。可选，抗原在MPL-TDM佐剂(RibiImmunochemical Research，Hamilton，Mont.)中乳化，并注入动物后足垫。10-12天后，免疫的小鼠随后利用所选佐剂中乳化的附加抗原来增强。数周后，小鼠也可用附加免疫注射增强。血清样品可定期通过眶后取血获得，用于用来检测抗体的ELISA测定法。
检测到适宜抗体滴度以后，可向抗体“阳性”动物最后静脉内注入给定配体。3-4天后，处死小鼠并收获脾细胞。然后将脾细胞(利用35％聚乙二醇)融合于选定的小鼠骨髓瘤细胞系诸如P3X63AgU.1，其可得自ATCC，No.CRL 1597。融合物产生杂交瘤细胞，所述细胞可随后铺于含有用于抑制非融合细胞、骨髓瘤杂合子以及脾细胞杂合子的HAT(次黄嘌呤，氨基蝶呤，胸苷)培养基的96孔组织培养板。
在ELISA中筛选杂交瘤细胞对抗原的反应性。本发明分泌所需抗ANGPTL4的单克隆抗体的“阳性”杂交瘤细胞的确定是本领域技术人员可轻易进行的。
可将阳性杂交瘤细胞经腹腔注入同基因Balb/c小鼠产生含有抗-ANGPTL4单克隆抗体的腹水。可选，杂交瘤细胞可生长在组织培养烧瓶或摇瓶中。腹水中产生的单克隆抗体的纯化可利用硫酸铵沉淀，然后通过凝胶大小排阻层析实现。可选，基于抗体与蛋白A或蛋白G的结合的亲和层析也可使用。
例如，多克隆兔抗体通过用大肠杆菌中产生的500μg重组人ANGPTL4蛋白(23-406)在第1，40和70天免疫兔子进行。第80和120天收获血清，通过蛋白A-sephadex柱纯化抗体。
实施例5封闭型或中和型抗体本文所述针对抗原的抗体可通过本领域已知的多种技术例如ELISA鉴定。例如，板可利用目的多肽例如ANGPTL4或其片段包被，并与针对该多肽例如，ANGPTL4产生的抗体一起保温(见例如，美国专利6,348,350，6,372,491和6,455,496中的描述)。结合的抗体可通过各种方法检测。
拮抗剂(例如封闭或中和型)抗体可通过竞争实验和/或活性测定来鉴定。例如，ANGPTL4的表达刺激肿瘤细胞增殖、迁移、粘附或结合αVβ5整合素。封闭或中和型ANGPTL4抗体的确定可通过抗体阻断肿瘤细胞增殖(见例如，图10，图A和B，D和E)、迁移、粘附(见例如图12)或结合αVβ5(USBiological，37K，Swampscott，Massachusetts)(见例如，图13，图B和C)的能力显示。例如，A673横纹肌肉瘤细胞可铺板并与来自用Ad-hAngptl4转导的COS7细胞的上清以及抗-ANGPTL4抗体，或对照抗体或PBS一起保温。数天后，用胰蛋白酶消化细胞并计数。减少细胞数目的抗体被鉴定为封闭型或中和型抗体。也显示ANGPTL4诱导肿瘤细胞迁移并为促血管生成因子。见例如，LeJan et al.，American Journal of Pathology，164(5)1521-1528(2003)。因此，封闭型或中和型抗ANGPTL4抗体可利用抗体和ANGPTL4在肿瘤细胞迁移实验和/或血管生成实验例如CAM实验中测定。
可用于阻断或减慢肿瘤生长或阻断或减慢癌细胞生长的封闭型或中和型抗ANGPTL4抗体也可通过使用肿瘤细胞在上述培养物和/或在Beige/裸小鼠研究中鉴定。例如，可向裸小鼠中注入肿瘤细胞。肿瘤生长确定后的各个时间，经腹腔向小鼠注入各种剂量的封闭型或中和型ANGPTL4抗体，抗体对照，或PBS，一周依次或两次。肿瘤大小可每周测定，并且实验结论得出时可切除肿瘤并称重。封闭型或中和型抗ANGPTL4抗体可鉴定为阻断或减慢小鼠中肿瘤生长的抗体。
阻断或减慢肿瘤生长或阻断或减慢癌细胞生长的ANGPTL4抗体与抗血管生成药剂的组合可通过利用上述肿瘤细胞培养物和/或Beige/裸小鼠研究中鉴定。如上所述，可对裸小鼠注入肿瘤细胞。肿瘤生长确定后的各个时间，，经腹腔向小鼠注入各种剂量的ANGPTL4拮抗剂与抗癌药剂例如抗血管生成药剂诸如抗-VEGF抗体的组合，或抗ANGPTL4拮抗剂，或抗癌药剂，或抗体对照，或PBS，一周依次或两次。肿瘤大小可每周测定，并且实验结论得出时可切除肿瘤并称重。可鉴定阻断或减慢小鼠中肿瘤生长、或与对照或单独的药剂相比增强对肿瘤生长的阻断或减慢作用的ANGPTL4拮抗剂与抗癌药剂的组合治疗。
实施例6ANGPTL4变体利用标准诱变试剂盒(例如QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Invitrogen，Carlsbad，California))根据生产商的说明制备变体ANGPTL4。在人ANGPTL4序列中产生两个氨基酸突变(见例如图2)。所述取代位于位置162和164(R162G和R164E)，导致RKR变为GKE。ANGPTL4蛋白(L280质粒，aa 1-406)或变体ANGPTL4分离自瞬时转染的COS-7细胞的上清。为了纯化，将上清加载于镍柱上。蛋白通过Western印迹利用抗-FLAG-HRP抗体检测。见，图3，图B。进行取代并将变体ANGPTL4与天然或野生型ANGPTL4蛋白进行比较时，通过Western印迹发现变体ANGPTL4具有高于天然ANGPTL4的分子量。天然蛋白的位置162和164的PKR到GKE的取代防止ANGPTL4的蛋白水解降解。
实施例7Angptl4结合整合素αVβ5血管生成素是分泌型因子，其通过经由它们的纤维蛋白原(FBN)-样结构域结合内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体Tie2调节血管生成。发现分泌的配体的家族中存在的螺旋区对于配体寡聚化是必需的(见例如，Procopio et al.，J.Biol.Chem.，27430196-201(1999))。
类似血管生成素，ANGPTL3和ANGPTL4是分泌型糖蛋白，每种都由N末端信号肽然后是螺旋区和C末端FBN样结构域组成。确定了ANGPTL3通过FBN样结构域结合αVβ3。我们确定了ANGPTL4结合αVβ5。检测αVβ5整合素稳定转染的293-1953细胞系结合或粘附ANGPTL4包被的板的能力。收获细胞并在不含血清、包含以下物质的培养基中稀释到105细胞/mlPBS，1％BSA，1mM CaCl2和1mM MgCl2。细胞与抗-整合素αVβ5抗体(MAB1961(Chemicon，Temecula，CA))或肽或不与上述物质一起37℃预保温15分钟。将重组mANGPTL4，BSA或玻连蛋白(1μg，3μg，10μg，或30μg/ml)包被在Nunc Maxisorp 96-孔平底微量滴定板上，4℃过夜，并用200μl含3％BSA的磷酸缓冲液(PBS)，pH7.4，37℃封闭1.5小时。将细胞悬液(5×104细胞/100μl/孔(5×105/ml))加入包被的板并将板在37℃保温5.5小时。未粘附的细胞用PBS洗涤去除，通过加入200μl CyQuant GD Dye(Molecular Probes(Invitrogen detection Technologies(Carlsbad，California))(1∶400)/细胞裂解缓冲液并保温2-5分钟来测定细胞粘附。样品荧光度利用480nm最大激发和520nm最大发射来测定。可使用Lanndegren的PNAG法(见例如，Landegren，J.Immunol.Methods，67379-388(1984))。与阴性对照BSA相比，表达αVβ5的细胞显示与ANGPTL4和阳性对照玻连蛋白的粘附(USBiological，Swampscott，Massachusetts。见图11。
为测定αVβ5整合素是否足以介导ANGPTL4细胞粘附，在细胞粘附实验中检测封闭型抗体抑制粘附的能力。将功能性封闭型抗体(抗-αVβ5抗体(MAB1961(Chemicon，Temecula，CA))或抗-hANGPTL4抗体)加入293-1953细胞然后与蛋白(BSA(1)，玻连蛋白(2)或ANGPTL4(3))包被的孔保温。见图12。抗-αVβ5和抗-ANGPTL4抗体消除了ANGPTL4细胞粘附活性。
进行其它实验确定ANGPTL4结合αVβ5。进行ELISA实验检测mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端(1-183)和/或IgG-hANGPTL4-C末端(184-406)是否结合αVβ5(USBiological，37K，Swampscott，Massachusetts)包被的板。100μl/孔整合素αVβ5稀释液(1μg/ml包被缓冲液(50mM碳酸盐/重碳酸盐，pH9.6))和包被缓冲液一起在4℃保温过夜。用洗涤缓冲液(PBS，pH7.4，0.05％Tween-20)洗板三次，并加入100μl/孔封闭缓冲液(PBS，pH7.4，0.5％BSA)，在室温轻轻搅拌1小时。各种量(0，0.070μg，0.22μg，0.66μg，2μg，或6μg)的样品，mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端(1-183)和/或IgG-hANGPTL4-C末端(184-406)在样品缓冲液(0.5％BSA，50mM Tris，pH7.4，0.05％Tween 20，1mM MnCl2，50μMCaCl2，50μMMgCl2，100mM NaCl)中进行准备并保温30分钟。将样品加入板(100μl/孔，按照上文所示的量)并在室温保温2小时同时轻轻搅拌。用缓冲液洗涤板，以100μl/孔加入含有抗-Flag-辣根过氧化物酶(HRP)(100ng/ml)(Jackson，#109-036-098)的测定缓冲液(PBS，pH7.4，0.5％BSA，0.05％Tween 20)，并在室温保温1小时同时轻轻搅拌。洗涤板。加入100μl/孔四甲基联苯胺(TMB)(Moss，Inc.)，室温在板中保温直到出现好的颜色。加入100μl/孔终止溶液(1M H3PO4)终止反应。在630nm读板。mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端和IgG-hANGPTL4-C-末端结合αVβ5包被的板，但与板结合的IgG-hANGPTL4-C末端稍多。见图13，图A。
抗-ANGPTL4抗体抑制ANGPTL4与αVβ5包被的板结合。进行ELISA实验。4℃保温100μl/孔的整合素αVβ5稀释液(1μg/ml包被型缓冲液(50mM碳酸盐/重碳酸盐，pH9.6))和包被缓冲液过夜。用洗涤缓冲液(PBS，pH7.4，0.05％Tween-20)洗板三次，并加入100μl/孔的封闭缓冲液(PBS，pH7.4，0.5％BSA)在室温轻轻搅动1小时。将0.6μg-6.0μg样品，mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端(1-183)和/或IgG-hANGPTL4-C末端(183-406)，在样品缓冲液中(0.5％BSA，50mM Tris，pH7.4，0.05％Tween 20，1mM MnCl2，50μMCaCl2，50μMMgCl2，100mM NaCl)与抗-ANGPTL4抗体(1.5μg)或抗-Dscr(1.5μg)一同保温30分钟。保温后，将100μl/孔样品+/-抗体与板在室温一起保温2小时，同时轻轻搅动。板用缓冲液洗涤并加入实验缓冲液(PBS，pH7.4，0.5％BSA，0.05％Tween 20)中的100μl/孔抗-Flag-HRP(100ng/ml)，在室温保温1小时，同时轻轻搅动。洗涤板并加入100μl/孔的TMB，室温在板中保温直到出现良好的颜色。加入100μl/孔终止溶液(1M H3PO4)来终止反应。在630nm读板。与抗-Dscr抗体，5G7单克隆抗体或培养基相比，抗-ANGPTL4抗体降低结合于αVβ5包被的板的mANGPTL4，IgG-hANGPTL4-N末端和IgG-hANGPTL4-C末端的量。见，图13，图B。
另一个实验中，ANGPTL4与整合素αVβ5的结合通过ELISA显示。在该实验中，将80μl/孔的hANGPTL4-C末端，玻连蛋白或BSA(5μg/ml)加入包被缓冲液(50mM碳酸盐/碳酸氢盐，pH9.6)中的板，4℃保温过夜。洗涤该板(洗涤缓冲液PBS，pH7.4，0.05％Tween-20)，加入100μl/孔的封闭缓冲液(PBS，pH7.4，0.5％BSA)以及培养基或抗-hANGPTL4抗体(15μg/100μl)或抗-Dscr抗体(15μg/100μl)，室温保温1小时，同时轻轻搅动。洗涤板，加入αVβ5100μl(3-9μg/ml)，室温保温2小时同时轻轻搅动。洗涤板，将1μg/ml(1∶1000)抗-αVβ5抗体(Chemicon)(5μg/100μl)加入实验缓冲液(PBS，pH7.4，0.5％BSA，0.05％Tween 20)中，室温保温1小时，同时轻轻搅动。保温后，洗涤板，将100μl/孔辣根过氧化物酶(HRP)抗-小鼠(1∶5000)加入实验缓冲液。洗涤板，加入100μl/孔四甲基联苯胺(TMB)，室温保温直到出现良好的颜色。利用100μl/孔1M H3PO4终止反应，在630nm读板。αVβ5结合ANGPTL4(泳道1)和玻连蛋白(泳道4)包被的板。结合被抗-ANGPTL4抗体(泳道2)阻断，但除外对照抗体抗-Dscr(泳道3)或对照蛋白包被在板上(泳道5)的情况。见，图14，图C。
因此，这些发现证实重组ANGPTL4特异性结合αVβ5整合素。
本说明书认为足以使得本领域的技术人员能够实施本发明。本发明不限于保藏的构建体限定的范围，因为保藏物的实施方案是用作对本发明某些方面的单一例证且功能上等同的任何构建体都在本发明范围内。本文的材料保藏不构成承认文字形式的描述不足以使得本发明的任一方面，包括其最佳的更多方面能够实施，也不应解释为将权利要求书的范围局限于所提供的具体例证。事实上，除了本文所示和所述之外，对本发明的各种修饰根据前面的描述对本领域的技术人员将是显而易见的且落在所附权利要求书的范围内。
权利要求
1.阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长的方法，所述方法包括a)给药肿瘤或癌细胞有效量的抗癌药剂；和b)给药肿瘤或癌细胞有效量的血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)拮抗剂，其中联用的有效量阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长。
2.权利要求1的方法，其中所述抗癌药剂包括抗血管生成药剂。
3.权利要求2的方法，其中所述抗血管生成药剂是VEGF拮抗剂。
4.权利要求3的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。
5.权利要求4的方法，其中所述抗-VEGF抗体是人源化的A4.6.1。
6.权利要求1的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂是抗-ANGPTL4抗体。
7.权利要求6的方法，其中所述抗-ANGPTL4抗体结合ANGPTL4(184-406)。
8.权利要求1的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂是抗-αVβ5抗体。
9.权利要求4，6或8的方法，其中所述抗体是人源化的抗体。
10.权利要求1的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂包括SiRNA分子。
11.权利要求10的方法，其中所述SiRNA分子是ANGPTL4-SiRNA分子。
12.权利要求11的方法，其中所述ANGPTL4-SiRNA分子靶向编码ANGPTL4的核酸的DNA序列，其中所述DNA序列包括至少GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA。
13.权利要求1的方法，还包括将第三抗癌药剂给药肿瘤或癌细胞。
14.权利要求13的方法，其中所述第三抗癌药剂是化疗剂。
15.权利要求13的方法，其中所述第三抗癌药剂是其它血管生成抑制剂。
16.权利要求1的方法，其中所述给药步骤(a)和(b)依次进行。
17.权利要求1的方法，其中所述给药步骤(a)和(b)同时进行。
18.权利要求1的方法，其中所述给药步骤(a)和(b)以依次和同时的组合的方式进行。
19.权利要求1的方法，其中所述给药步骤以任何顺序进行。
20.权利要求1的方法，其中所述肿瘤或癌细胞在受试者中。
21.权利要求20的方法，其中所述受试者是人。
22.权利要求20的方法，其中所述受试者患有复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。
23.阻断或减慢受试者中肿瘤细胞生长或癌细胞生长的方法，所述方法包括给药受试者包含有效量抗血管生成药剂和有效量血管生成素样4(ANGPTL4)拮抗剂的联用组合物，其中所述联用的有效量阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞的生长。
24.权利要求23的方法，还包括给药其它药剂，其中所述其它药剂是抗癌药剂。
25.阻断或减慢受试者中的复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法，所述方法包括给药受试者有效量的血管生成素样4(ANGPTL4)拮抗剂，其中所述受试者曾经或正在接受利用抗癌药剂进行的癌症治疗，其中给药有效量的ANGPTL4拮抗剂阻断或减慢复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。
26.权利要求25的方法，其中所述抗-癌药剂是一或多种化疗剂。
27.权利要求25的方法，其中所述抗-癌药剂包括抗血管生成药剂。
28.权利要求27的方法，其中所述抗血管生成药剂包括抗-VEGF抑制剂。
29.权利要求28的方法，其中所述抗-VEGF抑制剂是抗-VEGF抗体。
30.权利要求29的方法，其中所述抗-VEGF抗体是人源化的A4.6.1。
31.权利要求25的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂是抗-ANGPTL4抗体。
32.权利要求25的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂是抗-αVβ5抗体。
33.权利要求29，31，或32的方法，其中所述抗体是人源化的抗体。
34.权利要求25的方法，其中所述ANGPTL4拮抗剂包括SiRNA分子。
35.权利要求34的方法，其中所述SiRNA分子是ANGPTL4-SiRNA分子。
36.权利要求35的方法，其中所述ANGPTL4-SiRNA分子靶向编码ANGPTL4的核酸的DNA序列，其中所述DNA序列包括至少GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA。
37.权利要求25的方法，还包括给药其它药剂，其中所述其它药剂是抗癌药剂。
38.阻断或减慢肿瘤细胞生长或癌细胞生长的方法，所述方法包括给药肿瘤或癌细胞有效量的血管生成素样4(ANGPTL4)拮抗剂，其中所述ANGPTL4拮抗剂是结合ANGPTL4(184-406)的抗体且其中所述有效量阻断或减慢肿瘤生长或癌细胞生长。
39.组合物，其包含结合ANGPTL4(184-406)的抗体和VEGF拮抗剂。
40.组合物，其包含ANGPTL4-SiRNA分子，其中所述ANGPTL4-SiRNA分子靶向编码ANGPTL4的核酸的DNA序列，其中所述DNA序列包括至少GTGGCCAAGCCTGCCCGAAGA。
41.试剂盒，包含第一量的抗血管生成药剂，第二量的血管生成素样4(ANGPTL4)药剂，以及可药用的载体，递送物或稀释剂，以及容器。
42.试剂盒，其包含一定量的抗血管生成药剂以及可药用的载体，递送物或稀释剂，上述物质为第一单位剂量形式；一定量的血管生成素样4(ANGPTL4)拮抗剂以及可药用的载体，递送物或稀释剂，上述物质为第二单位剂量形式；以及容器。
全文摘要
提供了血管生成素样4蛋白的调节物以及它们用于治疗疾病和病理情况的方法。也提供了ANGPTL4拮抗剂与其它治疗剂例如抗癌药剂的组合，以及它们用于治疗易患或诊断为患有癌症或复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的哺乳动物的方法。
文档编号C07K16/00GK101044164SQ200580031689
公开日2007年9月26日 申请日期2005年7月19日 优先权日2004年7月20日
发明者纳波利昂·费拉拉, 汉斯-彼得·格伯, 梁小浣 申请人:健泰科生物技术公司