乙肝病毒s抗原的检测方法

专利名称：乙肝病毒s抗原的检测方法
技术领域：
本发明涉及能识别乙肝病毒(HBV)s抗原(HBs抗原)的新颖表位的探针与利用该探针检测HBV或HBs抗原的方法。
背景技术：
主要通过检测病毒或病毒相关组分(蛋白质或核酸)或通过检测病毒感染后活体产生的特异性抗体来诊断病毒感染。
一般通过确认存在HBs抗原或HBc抗体来获知HBV感染。乙肝病毒e抗原(HBe抗原)的含量、该抗原的抗体含量或HBV的DNA(HBV-DNA)含量可作为HBV感染与HBV携带者的临床状态或对预后和治疗效果判断的指标来检测。
在构成HBV病毒颗粒(HBV颗粒)的抗原中，HBs抗原是感染性HBV颗粒表面的主要组成型包膜蛋白，其锚定在包裹了含HBV-DNA的核心颗粒的源自肝细胞的脂双层中。感染了HBV的患者血液中由HBs抗原构成的非感染性小球形颗粒或管状颗粒。该小球形颗粒在血液中含量最丰富，每一个或几个HBV颗粒可观察到约1000个小球形颗粒。目前可购得的大多数HBs抗原检验试剂主要检测小球形颗粒形式的HBs抗原。
HBs抗原是由226个氨基酸残基(氨基酸号1-226)构成，穿过脂双层4次的膜蛋白。虽然HBs抗原的跨膜结构的模型尚未完全阐明，Howard等(Howard等，《病毒性肝炎与肝脏疾病》(Viral Hepatitis and Liver Disease)，(ZuckermanAJ，Alan R编)，第1094-1101页，Liss Inc.，纽约，1988)提出HBs抗原由以下部分构成脂双层外，由HBs抗原的N末端1-11位构成的(ER腔侧)区；由12-28位构成，穿过脂双层的疏水性跨膜区域；脂双层内由29-80位构成的区域；由81-97位构成的疏水性跨膜区域；由98-156位构成的亲水性ER腔区域；与157-226位构成的两个疏水性跨膜区域(

图1)。
常规方法检测HBs抗原所用的主要共有“a”决定子位于氨基酸110-156位，其包含在位于ER腔侧的98-156位氨基酸中，即病毒颗粒的表面。据报道此共有“a”决定子由其中存在至少4个表位的复杂高级结构构成(冈本宏明，Nippon Rinsho，Bunshi Kan-En Uirusubyogaku，Kiso-Rinsho-Yobo(日本临床，分子肝炎病毒学，基础临床预防)，下卷，甲型、乙型、丁型、戊型肝炎病毒，第212-222页，1995年10月26日出版)。
HBV是DNA病毒，但已知HBV可发生与RNA病毒相当的突变，因为在病毒增殖期间，其DNA复制为RNA，再通过逆转录酶从此RNA合成DNA。因此，据估计，感染了HBV的个体中会发生具有各种突变的突变体。当给这种个体中的HBV施加外部选择压力，例如中和抗体时，会发生对压力敏感的HBV病毒株减少的现象，而对压力耐受或不敏感的突变体增加。近年来，逐渐成问题的所谓“逃避突变体”是在该主要共有的“a”决定子中发生氨基酸取代、缺失或插入，从而该突变体可通过逃避识别突变前的“a”决定子的抗体来维持其感染能力。
发生逃避突变体的相关问题是此突变体可维持持久的感染能力，因为它能规避通过接种利用突变前的“a”决定子的疫苗所诱导的抗体。
另一问题是常规HBs抗原检测方法不能检测此逃避突变体。在共有“a”决定子上具有突变的逃避突变体一般与针对野生型HBV的共有“a”决定子的单克隆抗体具有较低的反应性，因此，常规HBs抗原检测方法所用的、针对野生型共有“a”决定子的单克隆抗体不能识别逃避突变型HBV的HBs抗原，从而不能发现实际发生的HBV感染。例如，据报道145Arg突变体，即其中145位的氨基酸从野生型的Gly改变为Arg的突变体，与针对共有“a”决定子的单克隆抗体的反应性显著降低(冈本宏明，Nippon Rinsho，Bunshi Kan-EnUirusubyogaku，Kiso-Rinsho-Yobo(日本临床，分子肝炎病毒学，基础临床预防)，下卷，甲型、乙型、丁型戊型肝炎病毒，第212-222页，1995年10月26日出版)。实际上，据报道，在用常规HBs抗原检测试剂进行的HBV筛选测试中呈HBs抗原阴性的输血导致了HBV感染(Thiers等，Lancet，ii，1273-1276，1988)。
在HBV急性感染中，报道了HBV感染的患者在感染最初阶段是HBs抗原阳性，然后转变为HBs抗原阴性同时变为Hbs抗体阳性的现象。患者变为HBs抗体阳性的原因在于患者体内产生针对HBs抗原的共有“a”决定子的抗体。该患者针对共有“a”决定子的抗体与HBs抗原测试试剂所用的单克隆抗体所识别的共有“a”决定子的同一区域相结合，从而导致两种抗体间发生竞争，通过竞争降低了HBs抗原测试试剂的灵敏度，进而阻止了测试试剂对HBV的检测。

发明内容
本发明要解决的问题常规HBs抗原测试试剂利用针对野生型HBV的共有“a”决定子的单克隆抗体，故其不能检测在共有“a”决定子上具有突变的逃避突变体，当将以此测试试剂判断为阴性的血液用于输血时，可能导致HBV感染。本发明的目的是开发一种能检测这种HBV逃避突变体的探针与利用此探针检测HBs抗原的方法。
本发明的另一目的是开发一种不被针对共有“a”决定子的患者抗体所阻止，即使在受感染患者的HBs抗体阳性样品中也能检测HBs抗原的探针，以及利用此探针检测HBs抗原的方法。
解决问题的方法本发明人利用抗体作为探针成功地解决了上述问题，所述抗体能识别位于由SEQ ID NO1所示氨基酸序列构成的肽上的表位。
即，本发明涉及的探针能识别位于对应于乙肝病毒s抗原中26-80位氨基酸序列构成的肽上的表位，具体地说该探针能识别位于SEQ ID NO1所示氨基酸序列构成的肽上的表位。
本发明也涉及检测乙肝病毒或乙肝病毒抗原的方法，所述方法包括利用上述探针。
在本说明书中，226个氨基酸残基构成的HBs抗原中部分氨基酸序列的位置以指定该抗原的N-末端氨基酸残基为数字1来表示。在HBV基因的S区域中有Pre-S1、Pre-S2和S基因来编码由389-400个氨基酸残基构成，受Pre-S1基因+Pre-S2基因+S基因控制的大S蛋白；由281个氨基酸残基构成，受Pre-S2基因+S基因控制的中等S蛋白；由226个氨基酸残基构成，受S基因控制的小S蛋白(三田村圭二，Nippon Rinsho，Bunshi Kan-En Uirusubyogaku，Kiso-Rinsho-Yobo(日本临床，分子肝炎病毒学，基础临床预防)，下卷，第13-27页，1995年10月26日出版)。除非另有说明，本文所用的术语“HBs抗原”一般表示小S蛋白。然而，本发明的检测方法也可检测所有大S蛋白、中等S蛋白与小S蛋白，因此该方法检测的乙肝病毒s抗原(HBs抗原)包含以上3种蛋白。
本发明探针能识别SEQ ID NO1所示氨基酸序列构成的肽上的表位，通常是能特异性识别该表位的多克隆抗体或单克隆抗体。该抗体的具体例子是杂交瘤细胞株1C10、4A3或6G6产生的单克隆抗体，这些细胞株在2004年9月9日由日本，茨城县，Tsukuba市，東1丁目1番地1，中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心以登录号FERM ABP-10115、ABP-10116和ABP-10117保藏。
SEQ ID NO1所示的氨基酸序列对应于HBs抗原的26-80位的氨基酸序列，即HBs抗原脂双层内的亲水性区域。此表位位于HBV病毒颗粒、小球形颗粒或管状颗粒内，与位于ER腔侧、含HBs抗原共有“a”决定子的区域不同，该表位不经受选择压力，例如能诱导逃避突变体的中和抗体。因此，与常规方法所用的共有“a”决定子相比，以上表位中的突变几乎不经受选择压力，利用本发明表位，很少或从不发生只有特定突变体占据优势从而造成只有不与HBs抗原检测试剂发生反应的突变体增加的情况。
当利用本发明的探针检测HBs抗原时，其几乎不受患者针对HBs抗原的抗体干扰。这可能是因为本发明探针所识别的表位处于HBV颗粒、小球形颗粒与管状颗粒的内部，因而与HBs抗原的共有“a”决定子相比，此表位不易在感染HBV的患者体内起到免疫原的作用，因此抑制了患者产生针对该表位的抗体。
通过利用本发明的探针，即使在共有“a”决定子上具有突变的逃避突变体中，亦可能可靠地检测HBs抗原。
为利用本发明探针检测样品的HBV颗粒、小球形颗粒或管状颗粒中的HBs抗原，位于脂双层内部或球形或管状颗粒中的HBs抗原26-80位的氨基酸序列上的表位应处于可与该探针接触的状态。
本发明的另一方面是检测样品中HBV或HBs抗原的方法，所述方法包括向样品中加入能使脂双层或蛋白质凝聚物变性的变性剂，通常是蛋白质变性剂，例如表面活性剂、离液离子等，特别是表面活性剂从而能用本发明探针检测样品中的HBs抗原。
在本发明中，利用变性剂使HBV颗粒、小球形颗粒与管状颗粒变性，从而使由HBs抗原26-80位的氨基酸序列构成的它们的内部区域，即存在于HBs抗原的脂双层内部的亲水性区域与外部相接触。本文可用的变性剂是能破坏HBV颗粒的脂双层并断裂小球形颗粒和管状颗粒中HBs抗原问的键(凝聚)但不使本发明探针失活的变性剂，通常可用诸如十二烷基硫酸钠的表面活性剂。
本发明也提供检测HBV病毒的方法，所述方法包括利用本发明的探针、变性剂与能特异性识别除HBs抗原以外的HBV抗原的探针，以及具有这种构成的检测HBV的试剂，即该试剂包括本发明的探针、变性剂与能特异性识别除HBs抗原以外的HBV抗原的探针。
通过与本发明的探针联用的某探针检测除HBs抗原以外的HBV抗原，例如HBcr抗原(WO02/14871)，可将因只检测HBs抗原而错误判断为HBV阴性的HBV患者样品可靠地判断为HBV阳性。
如上所述，已知HBs抗原能以与RNA病毒相当的高频率发生突变。因此，突变型HBs抗原也可由不同于HBs抗原26-80位的氨基酸序列中SEQ ID NO1所示氨基酸序列的序列构成。
然而，即使具有这种突变的HBs抗原，如果确定了其氨基酸序列，也能根据本说明书的内容在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达与纯化。得到针对这种纯化的突变型HBs抗原的探针，将其用于检测HBs抗原。因此，在本发明中，对应于HBs抗原26-80位的氨基酸序列的序列不限于识别SEQ ID NO1所示氨基酸序列上表位的探针或利用所述探针的检测方法。
本发明的作用利用本发明的探针与利用该探针检测HBV或HBs抗原的方法，能高度敏感性地检测在HBs抗原的共有“a”决定子上具有突变、不能用常规HBs抗原检测方法检测的逃避突变体等，从而可高度可靠地判断HBV感染。即使如果针对HBs抗原的共有“a”决定子的患者抗体抑制了HBs抗原的检测，采用本发明的检测方法也能可靠地判断HBV感染。
即使患者的抗体与本发明的探针竞争并抑制了HBs抗原的检测，通过联用酸化剂或碱化剂与变性剂预处理能可靠地判断HBV感染。
联用本发明的探针与能识别另一HBV抗原的探针来同时检测HBs抗原与另一HBV抗原，能更可靠地检测HBV感染。
附图简述图1阐述了HBs抗原的二级结构。
实施本发明的最佳方式本发明的探针可以是能特异性识别对应于HBs抗原26-80位的氨基酸序列(例如SEQ ID NO1所示氨基酸序列)构成的肽上表位的任何探针，通常可用针对抗原，例如上述肽或HBs抗原产生的抗体，特别是单克隆抗体。
可通过利用编码该肽的基因的重组基因技术或化学合成制备SEQ ID NO1所示氨基酸序列构成的肽，采用本身已知的各种方法或仪器等可得到这种制备工艺。
可通过从HBV患者血清中分离病毒基因，经PCR扩增该目标基因来制备含有编码SEQ ID NO1所示氨基酸序列的核苷酸序列的基因片段。利用源自PCR期间加入的接头的限制性酶切位点或源自基因片段所插入的质粒的限制性酶切位点，可将该基因克隆入表达载体。
将此表达载体转化入宿主，例如大肠杆菌中，培养大肠杆菌得到位于脂双层内部的HBs(26-80)抗原。采用诸如超声破碎细胞、离心与各种层析技术的常规技术可实现从经培养得到的微生物中收集与纯化目标蛋白质的方法。即，当采用上述方法有效地表达目标蛋白质时，许多蛋白质在微生物中形成内含体。利用此特征，可在生理条件(例如生理盐水)下将这些微生物悬浮在缓冲液中，然后超声破碎细胞，离心破碎的微生物物质回收不可溶组分。用6M脲提取回收的不可溶组分，凝胶过滤得到高纯度的trpE-HBs(26-80)抗原，然后将其用作免疫原。
可通过单用上述HBs(26-80)抗原或多肽(下文称为本发明抗原)或将与BSA、KLH等偶联的本发明抗原与佐剂(例如完全弗氏佐剂)的混合物周期性免疫动物，例如大鼠、家兔、山羊或绵羊，然后收集其血清来制备本发明的探针，例如多克隆抗体。为获得具有特异性识别位点的多克隆抗体，有可利用目标区域中的部分肽作为免疫原的方法。
熟知利用杂交瘤制备单克隆抗体。例如，单用本发明抗原或其与BSA、KLH等的偶联物作为与佐剂(例如完全弗氏佐剂)的混合物周期性免疫动物，例如BALB/c小鼠。当血液中的抗体滴度增加时，在最后一次免疫中将本发明抗原给予尾静脉，无菌切下脾脏，将脾细胞与合适的小鼠骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤。可采用Kohler和Milstein的方法(Nature，256495-497，1975)实施此方法。
在合适培养基中培养采用上述方法得到的杂交瘤，然后选择并克隆产生能与本发明抗原发生特异性反应的抗体的杂交瘤细胞。为克隆产生抗体的杂交瘤，不只可采用有限稀释也能采用软琼脂方法(Eur J Immuno1.，6511-519，1976)。可在培养基或小鼠腹腔中培养此杂交瘤从而在培养基或腹水中制备单克隆抗体。
可采用例如蛋白A的柱层析的方法纯化血清中的多克隆抗体或培养基或腹水中制备的单克隆抗体。可采用，例如利用载体固定的抗原的亲和层析方法处理多克隆抗体，从而只纯化能与特定抗原反应的抗体，也可以类似方式得到不与特定抗原反应的抗体。
除了单克隆抗体与多克隆抗体，可制备用作探针的分子。例如，Hoogenboon的综述(Trends in Biotechnology，1562-70，1997)详述了重组抗体。
本发明所用的变性剂可以是能破坏HBV颗粒的脂双层结构并断裂小球形颗粒和管状颗粒中HBs抗原间的键(凝聚)的任何变性剂。例如，可利用脲、酸化剂与碱化剂，表面活性剂特别有效。表面活性剂包括非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂与阴离子表面活性剂，以上任一种只要能破坏脂双层的结构就可用。例如，非离子表面活性剂，如吐温20与Nonidet P-40能有效地破坏脂双层结构从而使本发明的表位暴露，虽然它们的表面活性不是很强。
认为阴离子表面活性剂，例如SDS与Sarcosyl具有强表面活性，这种表面活性剂也能使本发明的表位暴露。用强表面活性剂处理可能破坏蛋白质的构象表位，因而在某些情况中识别构象表位的抗体不能与抗原结合；在此情况中，可利用能识别HBs抗原的线性表位的探针来检测抗原。
变性剂的作用不只能有效地释放存在于样品中的HBs抗原，也能使单克隆抗体易于和HBs抗原结合。
在本发明中，特别优选利用能特异性地与用上述表面活性剂变性的抗原相结合的探针。当将抗体用作探针时，该抗体应是能与通过上述变性处理而暴露和变性的本发明表位相结合的探针。
例如，当利用具有强表面活性的具体表面活性剂时，需要选择针对利用该表面活性剂而暴露和变性的表位的单克隆抗体。因此，需要用已用表面活性剂变性处理过的、对应于HBs抗原26-80位的氨基酸(序列)构成的肽(例如，SEQID NO1所示氨基酸序列构成的肽)免疫动物，也需要用所述肽选择抗体。
为筛选抗体，将经变性处理的肽抗原固定在固相上，在含有表面活性剂的溶液中筛选与该抗原反应的单克隆抗体，从而得到适合于免疫测定的本发明抗体。由于筛选溶液含有表面活性剂，可得到能耐受表面活性剂的变性作用的单克隆抗体。
可采用免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫斑点测定、放射性免疫测定与基于凝集的试验或其它熟知的免疫测定来检测样品中经变性处理的HBs抗原。当利用标记的抗体检测时，可使用标记物诸如荧光物质、化学发光物质、放射性物质或酶。
例如，当采用根据ELISA夹心反应原理的方法来检测样品中的HBs抗原时，所述方法包括以下步骤。首先，将能识别位于脂双层内部的表位的抗体等与固体支持物(例如，微滴定孔的内壁)结合。然后，用牛血清白蛋白等封闭以防止非特异性反应。向此支持物加入用表面活性剂等处理过的样品，从而使固定于其上的抗体捕获HBs抗原。针对捕获的HBs抗原的标记抗体等可与该HBs抗原反应来检测。待与固体支持物结合的抗体可以是能与位于脂双层内部的表位结合的任何抗体。标记的抗体可以是能与HBs抗原结合的任何抗体。它们的组合是随意的，可选择能实现高选择性与高特异性的组合。
上述可用的固体支持物包括聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯微滴定板、试管、毛细管、珠(乳胶颗粒、红细胞、金属化合物等)、膜(脂质体等)与过滤器等。可检测其中的本发明HBs抗原的样品包括生物学体液，例如全血、血浆、血清、尿、唾液与脑脊液以及组织，例如肝脏组织。
将样品中的HBs抗原处理为适合于和探针，例如单克隆抗体(发生)结合反应的状态而不涉及复杂过程的方法对本发明很重要。即，溶解样品所含HBs抗原的脂双层从而使原来不暴露于病毒颗粒表面的表位变得暴露是重要的。
实施例以下实施例是为说明本发明，而不是要限制本发明的范围。
实施例1trpE-HBs(26-80)抗原的表达与纯化(A)构建表达TrpE-HBs(26-80)抗原的质粒采用以下方法构建HBs(26-80)区域的表达质粒。将100μl HBV患者的血清与100μl DNA提取物[10μl 1M Tris-HCl(pH 8.4)，8μl 250mM EDTA，40μl 10％SDS，8μl 5M NaCl，10μl 20mg/ml蛋白酶K，1μl tRNA(5μg/μl)，与23μl无菌水]混合，54℃培育30分钟。将样品与200μl苯酚/氯仿(1/1)溶液混合，然后15Krpm离心5分钟得到上清液，向上清液中加入150μl异丙醇与7μl 5M NaCl，-20℃静置1小时。4℃，15Krpm离心5分钟后，用70％乙醇洗涤沉淀物，然后再4℃以15Krpm离心5分钟。风干沉淀物，溶解于20μl无菌水得到HBV DNA溶液。
5μl此HBV DNA溶液利用两种引物(即，5’-GAATTCCTCACAATACCACAGAGTCTA-3’(SEQ ID NO2)和5’-GGATCCTTAAAAACGCCGCAGACACATCCAGCG-3’(SEQ ID NO3))进行PCR。利用GeneAmpTM(Perkin Elmer Cetus制造的DNA扩增试剂试剂盒)以95℃1分钟DNA变性、55℃1分钟退火与72℃1分钟DNA合成为条件进行PCR，采用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，玻璃粉方法(glass powder method)(GeneClean)纯化得到的DNA片段。37℃，用20μl限制性酶切反应溶液[50mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，100mM NaCl，15 U EcoRI酶与15 U BamHI酶]消化0.5μg该扩增的HBs(26-80)基因片段1小时，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳来纯化约180-bp的EcoRI-BamHI片段。
然后，在37℃用20μl限制性酶反应溶液[50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，100mM NaCl，15 U EcoRI酶与15 U BamHI酶]消化0.5μg DNA(即表达载体pATtrpE)1小时，再向反应溶液中加入39μl水，接着将溶液在70℃加热处理5分钟，向其中加入1μl(250 U/μl)细菌碱性磷酸酶(BAP)，37℃培育1小时。
苯酚提取该反应溶液，乙醇沉淀得到的水相，干燥沉淀物。将0.5μg所得的EcoRI-BamHI-处理的载体DNA与上述180-bp HBs(26-80)片段加入1μl(350U/μl)T4连接酶与5μl 10×连接酶缓冲液[660 mM Tris-HCl(pH7.5)，66mMMgCl2，100mM二硫苏糖醇，1mM ATP]制备的混合物中，然后用水调节至50μl，16℃培育过夜进行连接反应。为获得表达质粒pATtrpE-HBs(26-80)，利用此连接反应溶液转化大肠杆菌HB101。
采用氯化钙方法[Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159-162，(1970)]制备用于转化的感受态大肠杆菌菌株。转化的大肠杆菌涂布在含有25μg/ml氨苄西林的LB平板(1％胰蛋白胨，0.5％NaCl，1.5％琼脂)上，37℃培育过夜。利用铂接种环将平板上出现的转化的细菌菌落转移至含有25μg/ml氨苄西林的LB培养基中，37℃培育过夜。
离心1.5ml转化的细菌培养液收集细菌，采用碱方法[Manniatis等，《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，(1982)]进行质粒DNA的少量制备。37℃，用20μl限制性酶切反应溶液[50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，100mM NaCl，15 U EcoRI酶和15 UBamHI酶]消化1μg得到的质粒DNA1小时，然后采用琼脂糖凝胶电泳分离pATtrpE-HBs(26-80)表达质粒得到约180-bp EcoRI-BamHI片段。
(B)TrpE-HBs(26-80)抗原的表达与纯化将含有表达质粒pATtrpE-HBs(26-80)的大肠杆菌HB 101菌株接种在含有50μg/ml氨苄西林的3ml 2YT培养液中(1.6％胰蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl)，然后在37℃培养9小时。将1ml此培养液接种入含有50μg/ml氨苄西林的100ml M9-CA培养液(0.6％Na2HPO4，0.5％KH2PO4，0.5％NaCl，0.1％NH4Cl，0.1mM CaCl2，2mM MgSO4，0.5％酪蛋白氨基酸，0.2％葡萄糖)中，然后在37℃培养。当OD600达到0.3时，加入吲哚-丙烯酸至终浓度为40mg/l，再培养16小时。以5 Krpm离心此培养液10分钟收集微生物。
将微生物悬浮在20ml缓冲液A[50 mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，30mM NaCl]中，再次离心得到2.6g表达微生物。将得到的微生物悬浮在10ml缓冲液A中，然后超声破碎大肠杆菌膜，再离心得到含有trpE-HBs(26-80)融合抗原的不可溶组分。
将此不可溶组分溶解于含有8M脲、10mM二硫苏糖醇与1mM EDTA的3ml PBS中，有6M脲存在下经Sephacryl S300HR柱凝胶过滤，从而使trpE-HBs(26-80)融合抗原达到几乎均质。
实施例2制备杂交瘤用6M脲溶解以上述方法制备的多肽[trpE-HBs(26-80)]，然后用含有0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.3)(PBS)将其稀释至终浓度为0.2-1.0mg/ml，与等体积的弗氏佐剂混合后以10-20μg的剂量腹膜内给予4-6周龄的BALB/c小鼠。
以与上述相同的方式每2-4周进行加强免疫，将溶解在PBS中的10μgHBs给予尾静脉进行最终免疫。
最终免疫后3天时，无菌取出小鼠的脾脏，然后用剪刀与金属筛网使其破碎为单个细胞，用RPMI-1640培养液洗涤3次。用RPMI-1640培养基洗涤对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/Oag14三次，将细胞以1∶5的比例与脾细胞混合。以200×g离心5分钟后，弃去上清液，轻缓混合下将含有50％聚乙二醇(PEG)4000(Merck)的1ml RPMI-1640培养基缓慢加入细胞团中，然后再加入10ml RPMI-1640培养基以实现细胞融合。
离心(200×g，5分钟)得到的融合细胞以除去PEG，融合悬浮在含有10％胎牛血清和次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸腺嘧啶(HAT)的RPMI-1640培养液中，涂布到96-孔细胞培养板上。培养约10天只使杂交瘤增殖后，采用ELISA方法选择产生目标抗体的克隆从而得到产生具有所需反应特异性的单克隆抗体的杂交瘤。
采用有限稀释将得到的杂交瘤制成单克隆从而得到产生抗体的杂交瘤。得到的杂交瘤分别命名为6G6、4A3和1C10。这些杂交瘤细胞在2004年9月9日由国际专利生物保藏单位(IPOD)，日本的国立高级工业科学与技术研究所(AIST)保藏。
实施例3单克隆抗体的制备与分析采用实施例2所述方法得到的各杂交瘤植入已给予降植烷的BALB/c小鼠腹腔内，获得在腹水中产生的单克隆抗体。
利用蛋白A琼脂糖柱通过亲和层析纯化含有单克隆抗体的IgG组分。
利用TrpE-HBs(26-80)抗原与由20个氨基酸构成的各个合成肽分析所得的各单克隆抗体的靶表位，结果(如表1所示)发现这些单克隆抗体识别位于脂双层内部的HBs抗原表位(氨基酸号26-80)，所述合成肽根据源自HBs区域的序列合成。

表1

利用抗-小鼠Ig同种型抗体采用同种分型试剂盒(Zymed)鉴定各单克隆抗体的(亚)类。结果如表2所示，6G6和4A3的亚类是IgGl、κ，1C10的亚类是IgG2a、κ。
能识别存在于本发明氨基酸号31-70区域中的抗原表位的抗体未见报道，发现单克隆抗体6G6、4A3和1C10各自识别新颖的表位。
表2

实施例4检验利用表面活性剂的检测方法用含有0.15M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)将抗-HBs抗原的单克隆抗体6G6稀释至6μg/ml的终浓度，然后以每孔80μl的体积移液至96-孔微滴定板(Nunc)上。将微滴定板置于4℃过夜，用含有0.15M NaCl的0.35ml10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)洗涤两次，然后加入含有0.5％酪蛋白-Na的0.35ml10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)(下文称为封闭溶液)，再于室温培育2小时。
除去封闭溶液后，向各孔加入含有0.15M NaCl、1％BSA和0.5％酪蛋白-Na的40μl 100mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)(其中加入了终浓度为4％或8％的各种表面活性剂)与40μl检测样品，然后在室温反应1小时，用0.35 ml洗涤溶液洗涤5次后，加入80μl用过氧化物酶(POD)标记的单克隆抗体(5C3)，混合物在室温反应30分钟。用0.35 ml洗涤溶液洗涤各孔6次，其与80μl底物(邻苯二胺，下文称为OPD)溶液在室温反应30分钟后，向各孔加入80μl 2N硫酸溶液，然后检测其在波长为492nm处的吸光度(OD492)，以其在630nm处的吸光度用作参比值。
采用各种表面活性剂时检测HBS阳性血清的结果见表3。当利用不含表面活性剂的缓冲液检测HBs抗原阳性血清时，不能检测HBs抗原，但当利用含有各种表面活性剂(阴离子、阳离子、两性与非离子表面活性剂)的缓冲液检测时可获得足够的信号从而能清楚地检测HBs抗原。因此这说明可以利用各种表面活性剂使表位暴露于外部来检测存在于HBs抗原脂双层内部的新颖表位。
用过氧化物酶标记的单克隆抗体5C3是通过表达由1-226位氨基酸序列构成的抗原(即全长HBs抗原)，然后纯化此重组抗原并用它免疫小鼠获得的一种单克隆抗体。证实如此获得的抗体5C3能与以上重组HBs抗原结合。然而，当根据HBs抗原1-226位的氨基酸序列合成各自由20个氨基酸构成，彼此有10个氨基酸重叠的合成肽并通过与实施例3相同的方法检验它们与抗体5C3的结合(情况)时，抗体5C3不与任何合成肽反应。因此，据估计抗体5C3不识别HBs抗原的氨基酸序列的线性表位，而识别其构象表位。
表3


实施例5检测HBs抗原阴性样品采用实施例4的改进方法检测HBs抗原阴性但怀疑感染了HBs的样品中的HBs抗原。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)将抗-HBs抗原的单克隆抗体6G6稀释至6μg/ml的终浓度，然后以每孔100μl的体积移液至96-孔微滴定板(Nunc)上。将微滴定板置于4℃过夜，用含有0.15M NaCl的0.35ml10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)洗涤两次，然后加入含有0.5％酪蛋白钠与3％蔗糖的0.35ml 10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)(封闭溶液)，将混合物置于室温2小时。
除去封闭溶液后，向各孔加入含有0.15M NaCl、10mM EDTA-2Na、0.2％proclin、1％BSA、0.1％酪蛋白钠、3％马血清、2％小鼠血清和10％Brij 35的50μl 100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)与50μl检测样品，室温反应1小时，用0.35ml洗涤溶液洗涤5次后，加入100μl用过氧化物酶(POD)标记的单克隆抗体(5C3)，混合物在室温反应30分钟。
反应后，用0.35ml洗涤溶液洗涤各孔6次，其与100μl底物(邻苯二胺，下文称为OPD)溶液在室温反应30分钟后，向样品中加入2N硫酸溶液，然后检测样品在波长为492 nm处的吸光度(OD492)，以其在630nm处的吸光度作参比值。
所用的样品购自IIC日本；采用Abbott Laboratories的CLIA方法检测HBs抗原与抗-HBs抗体；采用Gen-Probe Incorporated的TMA方法检测HBN-DNA。
表4

表4所示的5份样品通过TMA方法(检测)为HBV-DNA-阳性。这些样品通过Abbott Laboratories的CLIA方法也(检测)为HBs抗体阳性，认为它们是来自感染了HBV患者的血清。然而，第2、3和5号样品通过Abbott Laboratories的HBsAg CLIA方法，即常规的HBs抗原检测方法判断为阴性。
当通过本发明方法判断这些HBs抗原阴性样品时，在第2和5号样品中检测到HBs抗原。HBcrAg检测方法能检测到由本发明检测方法与AbbottLaboratories的HBsAg CLIA方法判断为HBs抗原阴性的第3号样品，同时检测HBs抗原与HBcr抗原可用于更精确地检测HBV抗原。
实施例61)酸化剂的浓度将各种浓度的50μl盐酸水溶液加入50μL HBV抗原阴性样品或3份含有抗-HBs抗体的HBV抗原阳性样品(#990493、#990640、#990650)，然后室温培育10分钟，通过以下方法检验作为检测样品的50μL混合物溶液。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)将抗-HBs抗原的单克隆抗体6G6稀释至6μg/ml的终浓度，然后以每孔100μl的体积移液至96-孔微滴定板(Nunc)上。将微滴定板于4℃培育过夜。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)洗涤微滴定板两次，然后加入含有0.5％酪蛋白钠的350μl 10mM磷酸钠缓冲液(pH 7.1)，培育微滴定板2小时。除去封闭溶液后，向各孔加入含有中和抗体的100μl反应缓冲液与每种经样品处理方法得到的各种检测样品，室温振荡反应2小时，用含有0.05％吐温20的350μl 10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)(洗涤溶液)洗涤6次后，加入100μl用过氧化物酶(POD)标记的单克隆抗体(5C3)，混合物在室温反应30分钟。用洗涤溶液洗涤各孔6次，然后与100μl底物(邻苯二胺，下文称为OPD)溶液培育30分钟后，向各孔中加入100μl 2N硫酸溶液，然后检测其在波长为492nm处的吸光度(OD492)，以其在630nm处的吸光度作参比值。表中所示的盐酸浓度是样品与处理试剂混合后处理期间的浓度。
即使将含有抗-HBs抗体的HBs抗原阳性样品(#990493、#990640、#990650)与不含盐酸的溶液在室温培育10分钟，也几乎检测不到HBs抗原活性。处理时从0.05 N的盐酸浓度开始检测到HBs抗原活性，在0.25-1.0N的浓度处出现峰值(表5)。
表5

实施例72)有酸化剂存在下的各种表面活性剂将溶解于1.0N盐酸水溶液的每种30μL各种表面活性剂加入30μL HBV抗原阴性样品或HBs抗原阳性样品(#990493、#990640、#990650)，然后室温培育10分钟，通过1)所述的方法检验作为检测样品的50μL混合物溶液(表6-9)。表中所示的盐酸浓度与表面活性剂浓度是样品与处理试剂混合后处理期间的浓度。
如表6-9所示，3份样品中至少1份显示反应性高于各样品判断标准的表面活性剂判断为有效的表面活性剂。结果发现将各种表面活性剂与酸化剂，例如盐酸或硫酸一起加入时，利用表面活性剂的HBs抗原阳性样品中HBs抗原的免疫反应性增加。判断为有效的表面活性剂是在其分子中具有直链烷基和叔胺或季铵盐的两性或阳离子表面活性剂。
非离子表面活性剂，例如Triton X100和Bridj 35也检测为有效的。具有固醇骨架的表面活性剂，例如CHAPS未显示反应性增加。此外，也检测了阴离子表面活性剂，例如SDS和N-月桂酰肌氨酸钠与脱氧胆酸，但这些表面活性剂在有酸化剂存在时溶解性不佳，因而不能对它们作出检测。
向酸化剂中加入在分子中具有直链烷基与叔胺或季铵盐的两性或阳离子表面活性剂能提高检测灵敏度。将在处理溶液中存在酸化剂时有效的这种表面活性剂用于不存在酸化剂的处理溶液中时，其检测灵敏度显著降低。从上述可知，灵敏度增加的原因是酸化剂使作为HBs抗原检测抑制因素的抗-HBs抗体失活，而加入表面活性剂使位于样品中HBs抗原的脂双层内部的表位暴露于外部，因而显著提高其与6G6的反应性。
表6阳离子(TAC型)

表7阳离子(TAB型)
表8两性
表9非离子


实施例83)有酸化剂存在下的蛋白变性剂将溶解于1.0N盐酸水溶液的30μL蛋白变性剂(脲或盐酸胍)加入30μLHBV抗原阴性样品或3份HBs抗原阳性样品(#990493、#990640、#990650)，然后室温培育10分钟，通过1)所述的方法检验作为检测样品的50μL混合物溶液。表10显示了各HBs抗原阳性样品的免疫反应性。表10所示盐酸浓度与蛋白变性剂浓度是样品与处理试剂混合后处理期间的浓度。
样品显示在有酸化剂存在下利用蛋白变性剂的免疫反应性高于只有酸化剂时的免疫反应性；即，用脲使免疫反应性增加约1.5-3倍，用盐酸胍使免疫反应性增加约2-3倍。用酸化剂处理时，血清蛋白等可能变性从而造成沉淀或者在一些情况中变得混浊进而阻碍了移液过程，沉淀物往往是得到假阳性结果的主要原因。由于目标抗原掺入这种沉淀物中，也可能降低灵敏度。发现在处理时加入浓度为0.5M或更高的脲或盐酸胍可显著减少这种沉淀物形成，在处理时加入浓度为1.5-4M的脲与浓度为2-3.5M的盐酸胍此作用尤其更好。
表10

实施例94)有酸化剂存在下检验还原剂将作为还原剂的二硫苏糖醇、盐酸2-巯基乙胺或盐酸2-二乙基氨基乙硫醇溶解于1.0N盐酸水溶液，将此30μL混合溶液加入30μL HBV抗原阴性样品(正常血浆)或3份HBs抗原阳性样品(#990493、#990640、#990650)，然后室温培育10分钟，通过1)所述的方法检验作为检测样品的50μL混合物溶液(表11)。
本文所用的还原剂浓度是其在样品处理期间的浓度。甚至当还原剂加入HBV抗原阴性样品中时，未检测到其信号有变化，但在一份HBs抗原阳性样品(#990640)中，利用浓度为1-5mM的二硫苏糖醇时检测到有30％或更高的增幅。
表11还原剂


实施例105)碱化剂的浓度将50μL各种浓度的氢氧化钠水溶液加入50μL HBV抗原阴性样品或三份含有抗-HBs抗体的HBV抗原阳性样品(#990493、#990640、#990650)，然后在室温培育10分钟，按照以下检测方法检测作为检测样品的50μL混合物溶液。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)将抗-HBs抗原的单克隆抗体6G6稀释至6μg/ml的终浓度，然后以每孔100μl的体积移液至96-孔微滴定板(Nunc)上。将微滴定板于4℃培育过夜。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)洗涤微滴定板两次，然后加入含有0.5％酪蛋白钠的350μl 10mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)，培育微滴定板2小时。除去封闭溶液后，向各孔加入含有中和抗体的100μl反应缓冲液与经各种样品处理方法得到的各检测样品，室温振荡反应2小时，用含有0.05％吐温20的350μl 10mM磷酸钠缓冲液(pH7.3)(洗涤溶液)洗涤6次后，加入100μl用生物素标记的单克隆抗体(HBs124)。混合物在室温反应30分钟。用洗涤溶液洗涤各孔6次，然后向其中加入100μl POD标记的亲和素D，混合物在室温反应30分钟。用洗涤溶液洗涤各孔6次后，向其中加入100μl底物(邻苯二胺，下文称为OPD)溶液，培育30分钟，向各孔中加入2N硫酸溶液后，检测其在波长为492nm处的吸光度(OD492)，以其在630nm处的吸光度作参比值。表中所示的氢氧化钠浓度是样品与处理试剂混合物后处理期间的浓度。
生物素标记的单克隆抗体HBs124是如实施例1所述通过表达与纯化全长HBs抗原(即，由1-226位氨基酸序列构成的抗原)，用该重组抗原免疫小鼠得到的单克隆抗体。证实抗体HBs124与以上重组HBs抗原结合。然而，当根据HBs抗原1-226位的氨基酸序列合成各由20个氨基酸构成，彼此有10个氨基酸重叠的合成肽并通过与实施例3相同的方法检验它们与抗体HBs124的结合(情况)时，抗体HBs124不与任何合成肽反应。因此，据估计抗体HBs124不识别HBs抗原的氨基酸序列的线性表位，而识别其构象表位。
甚至通过在不含氢氧化钠的溶液中室温培育含有抗-HBs抗体的HBV阳性样品(#990493，#990640，#990650)10分钟未检测到HBs抗原活性，但用浓度为0.25-1N的氢氧化钠处理检测到HBs抗原的信号有增加(表12)。
表12

实施例116)有碱化剂存在下的各种表面活性剂浓度将溶解于1.0N氢氧化钠水溶液的30μL各种表面活性剂加入30μL HBV抗原阴性样品或三份HBs抗原阳性样品(#990493、#990640、#990650)，然后室温培育10分钟，通过5)所述的方法检验作为检测样品的50μL混合物溶液(表13-17)。表中所示的氢氧化钠水溶液与表面活性剂浓度是样品与处理试剂混合后处理期间的浓度。
如表13-17所示，3份样品中至少1份显示反应性高于各样品判断标准的表面活性剂判断为有效的表面活性剂。结果发现将各种表面活性剂与碱化剂，例如氢氧化钠一起加入时，利用表面活性剂的HBs抗原阳性样品中HBs抗原的免疫反应性增加。判断为有效的表面活性剂包括阴离子表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠或N-月桂酰肌氨酸钠与在其分子中具有直链烷基和叔胺或季铵盐的两性或阳离子表面活性剂。
非离子表面活性剂，例如Triton X100、吐温20和Bridj 35与具有固醇骨架的表面活性剂，例如CHAPS也检测为有效的。
向碱化剂中加入阴离子表面活性剂或在分子中具有直链烷基与叔胺或季铵盐的两性或阳离子表面活性剂能提高检测灵敏度。将在处理溶液中存在碱化剂时有效的这种表面活性剂用于不存在碱化剂的处理溶液中时，未发现增加检测灵敏度。认为通过联用碱化剂与表面活性剂，作为HBs抗原检测抑制因素的抗-HBs抗体失活，样品中HBs抗原的脂双层内部的表位暴露于外部，从而显著提高其与6G6的反应性。
表13阴离子
表14阳离子(TAC型)

表15阳离子(TAB型)

表16两性
表17非离子

实施例127)有碱化剂存在下的蛋白变性剂将溶解于1.0N氢氧化钠水溶液的30μL蛋白变性剂(脲或盐酸胍)加入30μL HBs抗原阴性样品或三份HBs抗原阳性样品(#990493、#990640、#990650)，然后室温培育10分钟，通过5)所述的方法检验作为检测样品的50μL混合物溶液。表18显示了各HBs抗原阳性样品的免疫反应性。表18所示的氢氧化钠浓度与蛋白变性剂浓度是样品与处理试剂混合后处理期间的浓度。
三份HBs抗原阳性样品显示在有碱化剂存在下利用蛋白变性剂的免疫反应性高于只有碱化剂时的免疫反应性；即，用脲使免疫反应性增加至少约8倍，用盐酸胍使免疫反应性增加至少约4.5倍。如果只用碱化剂处理，血清蛋白等在中和时可能变性从而造成沉淀或者在一些情况中变得混浊，进而阻碍了移液过程，沉淀物往往是得到假阳性结果的主要原因。由于目标抗原掺入这种沉淀物中，也可能降低灵敏度。发现在处理时加入浓度为1M或更高的脲或盐酸胍可显著减少这种沉淀物形成，在处理时加入浓度为2-4M的脲与浓度为2-3M的盐酸胍此作用尤其更好。
表18

实施例138)有碱化剂存在下检验还原剂将作为还原剂的二硫苏糖醇、盐酸2-巯基乙胺、盐酸2-二乙基氨基乙硫醇、2-巯基乙醇或盐酸三(2-羧乙基)膦溶解于1.0N氢氧化钠，将此30μL溶液加入30μL HBV抗原阴性样品或三份HBs抗原阳性样品(#990493、#990640、#990650)，然后室温培育10分钟，通过5)所述的方法检验作为检测样品的50μL混合物溶液(表19)。
本文所用的还原剂浓度是其在样品处理期间的浓度。甚至通过加入还原剂，HBV抗原阴性样品几乎不显示信号有变化，但所有三份HBs抗原阳性样品显示，分别利用浓度为20mM的盐酸2-巯基乙胺、盐酸二乙基氨基乙硫醇与2-巯基乙醇使信号增加约2-3倍。盐酸三(2-羧乙基)膦更有效，2mM浓度时信号增加1.5倍，10mM时信号增加15倍或更多。
表19还原剂

序列表<110>株式会社先端生命科学研究所(Advanced Life Science Institute，INC.)<120>乙肝病毒s抗原的检测方法<130>SAP-729-PCT<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>55<212>PRT<213>乙肝病毒<400>1Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe1 5 10 15Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr20 25 30Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg35 40 45Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe50 55<210>2<211>27<212>DNA<213>乙肝病毒<400>2gaattcctca caataccaca gagtcta 27<210>3<211>33<212>DNA<213>乙肝病毒<400>3ggatccttaa aaacgccgca gacacatcca gcg3权利要求
1.一种探针，其识别位于由对应于乙肝病毒s抗原中26-80位的氨基酸序列构成的肽上的表位。
2.一种探针，其识别位于由SEQ ID NO1所示氨基酸序列构成的肽上的表位。
3.如权利要求1或2所述的探针，其特征在于，所述探针能识别乙肝病毒s抗原并可利用作为抗原的肽而获得，所述肽由对应于用变性剂变性的乙肝病毒s抗原中26-80位的氨基酸序列或SEQ ID NO1所示氨基酸序列构成。
4.一种检测乙肝病毒或乙肝病毒s抗原的方法，所述方法包括利用权利要求1-3中任一项所述的探针。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述方法在有变性剂存在下进行。
6.如权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，所述变性剂是表面活性剂。
7.如权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，通过用含有(1)酸化剂与(2)作为变性剂的表面活性剂和/或蛋白变性剂的处理试剂处理，以使乙肝病毒s抗原解离以及结合乙肝病毒s抗原的抗体灭活。
8.如权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，通过用含有(1)碱化剂与(2)作为变性剂的表面活性剂和/或蛋白变性剂的处理试剂处理，以使乙肝病毒s抗原解离以及结合乙肝病毒s抗原的抗体灭活。
9.如权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，通过用含有(1)碱化剂与(2)作为变性剂的表面活性剂和/或蛋白变性剂和/或还原剂的处理试剂处理，以使乙肝病毒s抗原解离以及结合乙肝病毒s抗原的抗体灭活。
10.如权利要求4-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，还利用除乙肝病毒s抗原以外的乙肝病毒抗原的探针。
11.一种用于检测乙肝病毒s抗原的试剂，所述试剂包含权利要求1-3中任一项所述的探针以及变性剂。
12.一种用于检测乙肝病毒s抗原的试剂，所述试剂包含权利要求1-3中任一项所述的探针、除乙肝病毒s抗原以外的乙肝病毒抗原的探针以及变性剂。
全文摘要
[问题]要提供一种可用于检测HBV或HBs抗原的探针，利用此探针能检测样品中可能存在的乙肝病毒(HBV)的逃避突变体；与利用此探针的方法。[解决问题的方法]一种探针，其能识别位于包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的肽上的；以及利用此探针检测乙肝病毒或乙肝病毒s抗原的方法。
文档编号C07K14/02GK101023098SQ20058003144
公开日2007年8月22日 申请日期2005年9月21日 优先权日2004年9月22日
发明者槇昇, 福田泰之, 木村达治, 大植千春, 草野修 申请人:株式会社先端生命科学研究所