治疗疾病的方法

专利名称：治疗疾病的方法
优先权声明本申请要求2004年9月13日提交的美国专利申请系列号10/940,269和2005年3月11日提交的美国专利申请系列号11/077,664的优先权，它们各自的整个内容在这里引作参考。
背景Sir2蛋白是一种使用NAD作为辅因子的脱乙酰基酶(Imai et al.，2000；Moazed，2001；Smith et al.，2000；Tanner et al.，2000；Tanny and Moazed，2001)。与其它脱乙酰基酶(其中的许多参与基因沉默)不同，Sir2对组蛋白脱乙酰基酶抑制剂如曲古抑菌素A(TSA)不敏感(Imai et al.，2000；Landry et al.，2000a；Smith et al.，2000)。
简述本发明涉及被取代的杂环化合物、包含所述化合物的组合物和使用所述化合物和化合物组合物的方法。化合物和包含它们的组合物可以用于治疗疾病或疾病症状，包括由sirtuin(例如，SIRT1)介导的脱乙酰作用介导的那些。
在一个方面，本发明涉及治疗或预防对象的疾病(例如，本文所述的疾病)的方法。该方法包括，给对象施用有效量的具有式(I)的化合物
其中，R1和R2与它们结合的碳一起，形成C5-C10环烷基，C5-C10杂环基，C5-C10环烯基，C5-C10杂环烯基，C6-C10芳基，或C5-C10杂芳基，它们中的每一个可以任选地被1-5个R5取代；或R1是H，S-烷基，或S-芳基，且R2是氨基烷基，其中氮被烷基、芳基或芳基烷基取代，它们中的每一个任选地进一步被烷基、卤素、羟基或烷氧基取代；R3和R4与它们结合的碳一起，形成C5-C10环烷基，C5-C10杂环基，C5-C10环烯基，C5-C10杂环烯基，C6-C10芳基，或C5-C10杂芳基，它们中的每一个可以任选地被1-5个R6取代；每个R5和R6独立地是卤素，羟基，C1-C10烷基，C1-C6卤代烷基，C1-C10烷氧基，C1-C6卤代烷氧基，C6-C10芳基，C5-C10杂芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12杂芳烷基，C3-C8杂环基，C2-C12链烯基，C2-C12炔基，C5-C10环烯基，C5-C10杂环烯基，羧基，羧酸盐(酯)，氰基，硝基，氨基，C1-C6烷基氨基，C1-C6二烷基氨基，巯基，SO3H，硫酸盐(酯)，S(O)NH2，S(O)2NH2，磷酸盐(酯)，C1-C4亚烷二氧基，氧代，酰基，氨基羰基，C1-C6烷基氨基羰基，C1-C6二烷基氨基羰基，C1-C10烷氧基羰基，C1-C10硫代烷氧基羰基，肼基羰基，C1-C6烷基肼基羰基，C1-C6二烷基肼基羰基，羟基氨基羰基；烷氧基氨基羰基；或R5或R6之一和R7形成含有4-6个碳、1-3个氮、0-2个氧和0-2个硫的环状基团，其可以任选地被氧或C1-C6烷基取代；X是NR7，O，或S；Y是NR7’，O或S；----代表任选的双键；
R7和R7’各自独立地是氢，C1-C6烷基，C7-C12芳基烷基，C7-C12杂芳基烷基；或R7与R5或R6之一形成含有4-6个碳、1-3个氮、0-2个氧和0-2个硫的环状基团，其可以任选地被氧或C1-C6烷基取代；且n是0或1。
实施方案可以包括下述的一个或多个。
在某些实施方案中，n可以是1。
X可以是NR7且Y可以是NR7’。R7和R7’可以各自是，例如，氢或CH3。R7和R7’之一可以是氢，且另一个可以是CH3。
R1和R2可以形成C5-C10环烯基。
R1和R2可以形成C6-C10芳基。
R1和R2可以形成C5-C10环烯基，其可以被R5取代，且R3和R4可以形成C6-C10芳基，其可以被R6取代。
在某些实施方案中，环烯基双键可以在结合R1的碳和结合R2的碳之间。C5-C10环烯基，例如，C6或C7环烯基，可以被R5取代，且C6-C10芳基可以被R6取代。
R6可以是卤素(例如，氟或溴)，C1-C6烷基(例如，CH3)，C1-C6卤代烷基(例如，CF3)或C1-C6卤代烷氧基(例如，OCF3)。R5可以是例如，被取代基取代的C1-C6烷基，所述取代基例如氨基取代基；或氨基羰基(例如被取代的氨基羰基，其被取代基例如芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基、氨基羰基、烷基氨基羰基、烷氧基羰基或其它取代基取代。在每种情况下，取代基可以进一步被其它取代基取代)。
n可以是0。
R1和R2可以形成C5-C10环烯基。
R1和R2可以形成C6-C10芳基。
X可以是NR7，且R7可以是，例如，氢或CH3。
R1和R2可以形成C5-C10环烯基，其可以被R5取代，且R3和R4可以形成C6-C10芳基，其可以被R6取代。
在某些实施方案中，环烯基双键可以在结合R1的碳和结合R2的碳之间。C5-C10环烯基，例如，C6或C7环烯基，可以被R5取代，和C6-C10芳基可以被R6取代。
R6可以是卤素(例如，氯)，C1-C6烷基(例如，CH3)，C1-C6卤代烷基(例如，CF3)或C1-C6卤代烷氧基(例如，OCF3)。R5可以是氨基羰基。
n可以是0。
R1和R2可以形成C5-C10环烯基。
R1和R2可以形成C6-C10芳基。
X可以是NR7，且R7可以是，例如，氢或CH3。
R1和R2可以形成C5-C10环烯基，其可以被R5取代，且R3和R4可以形成C6-C10芳基，其可以被R6取代。
在某些实施方案中，环烯基双键可以在结合R1的碳和结合R2的碳之间。C5-C10环烯基，例如，C6或C7环烯基，可以被R5取代，且C6-C10芳基可以被R6取代。这些化合物可以具有式(II)或式(III) R6可以是卤素(例如，氟或溴)，C1-C6烷基(例如，CH3)，C1-C6卤代烷基(例如，CF3)或C1-C6卤代烷氧基(例如，OCF3)。R5可以是氨基羰基。化合物可以是选自

图1或化合物(IV)，(V)，(VI)，或(VII)的化合物。
在一个实例中，化合物可以是式(VI)的化合物，其具有高对映体过量的单一异构体，其中优势异构体的旋光度是负的，例如，-14.1(c＝0.33，DCM)或，例如，[α]D25-41.2°(c0.96，CH3OH)。在第二个实例中，化合物可以是式(IV)的化合物，其具有高对映体过量的单一异构体，其中优势异构体的旋光度是负的。在有些实例中，施用式(IV)，(V)，或(VII)的化合物，其具有高对映体过量的单一异构体，其中优势异构体具有与上面所示的星号碳相对应的式(VI)化合物的负异构体相同的绝对构型。
相对于非-SIRT1 sirtuin，该化合物可以优先抑制SIRT1，例如，至少1.5，2，5，或10倍优先。该化合物可以具有对SIRT1的Ki，其小于500，100，50，或40nM。
在有些实例中，化合物会降低FOXO转录因子(例如FoxO1或FoxO3)的活性。
量可以是能有效地改善疾病的至少一种症状。疾病或病症可以是，例如，年龄相关的疾病，老年疾病，具有年龄相关的易感性因素的疾病，肿瘤性疾病，非肿瘤性疾病，神经障碍，心血管疾病，代谢紊乱，皮肤病学的疾病，或皮肤病学的组织状况。在一个实施方案中，疾病或病症可以是神经变性疾病或病症，其中神经变性疾病可以至少部分地由多谷氨酰胺聚集介导，例如，亨廷顿氏舞蹈病，脊延髓肌萎缩(SBMA或肯尼迪氏病)，齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩(DRPLA)，脊髓小脑性共济失调1(SCA1)，脊髓小脑性共济失调2(SCA2)，Machado-Joseph病(MJD；SCA3)，脊髓小脑性共济失调6(SCA6)，脊髓小脑性共济失调7(SCA7)，和脊髓小脑性共济失调12(SCA12)。神经变性疾病可以是帕金森氏病或阿尔茨海默氏病。
疾病或病症可以与sirtuin有关或至少部分地由其介导，例如，疾病或病症可以与sirtuin-介导的脱乙酰作用有关或至少部分地由其介导，例如，过度的sirtuin活性或过度水平的脱乙酰基的p53，FoxO1，或FoxO3。sirtuin可以是SIRT1，例如，人SIRT1。
疾病或病症可以是癌症。量可以是，例如，有效地减小癌症或肿瘤细胞块，转移风险，或肿瘤细胞生长的速度。量可以是有效地调节(例如，增加)细胞凋亡。
疾病或病症可以是代谢病，例如代谢综合征或糖尿病(例如，I型糖尿病或II型糖尿病)。量可以是，例如，有效地提高胰岛素敏感性，增加胰岛素分泌，或者其它方式或降低葡萄糖水平。在有些实例中，疾病或病症与代谢病有关，例如心脏疾病相关的糖尿病。
疾病或病症可以是脂肪相关的疾病例如肥胖症或血脂障碍或高脂血症。量可以是，例如，有效地降低对象的体重或预防对象的体重增加。
疾病或病症可以是神经障碍例如阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。量可以是，例如，有效地减轻神经障碍的一种或多种症状。
方法可以包括，施用化合物不止一次，例如，重复施用化合物。可以在一次或多次快速推注或连续施用中，施用化合物。可以从外部(from without)(例如，通过注射，摄入，吸入等)或从内部例如通过植入装置，施用化合物。
方法可以包括，局部地施用化合物。
量可以是有效地增加对象的至少有些细胞中的sirtuin底物(例如，核蛋白，例如，组蛋白或转录因子，例如，p53，FoxO1，或FoxO3)的乙酰化。
对象可以是哺乳动物，例如，人。
可以将对象鉴别为需要这样的治疗或预防。
方法还可以包括，鉴别需要这样的治疗的对象，例如，通过评价对象细胞中的sirtuin活性，评价编码sirtuin的对象核酸中的核苷酸同一性，评价对象的赘生细胞或赘生生长(例如，肿瘤)，评价对象细胞(例如，肿瘤活组织检查)中的遗传组成或基因表达。
方法还可以包括，监测对象，例如，将对象成像，评价对象中的肿瘤大小，评价对象细胞中的sirtuin活性，评价对象中的副作用，例如，肾功能。
在另一个方面，本发明涉及抑制sirtuin-介导的底物(例如FoxO转录因子)的脱乙酰作用的方法。该方法包括，使sirtuin接触式(I)化合物。抑制可以发生在体外、无细胞的培养基中、细胞培养物中或生物体中，例如，哺乳动物，优选人。
在另一个方面，本发明涉及评价多种化合物的方法，该方法包括a)提供包含许多化合物的化合物文库，每种化合物具有式(I)；和b)对于来自该文库的许多化合物中的每一种，i)使化合物接触sirtuin测试蛋白，其包含sirtuin的功能性脱乙酰基酶结构域；和ii)评价在有化合物存在下，化合物和sirtuin测试蛋白之间的相互作用。
实施方案可以包括下述的一种或多种在一个实施方案中，评价化合物和sirtuin测试蛋白之间的相互作用包括，评价sirtuin测试蛋白的酶活性。
在一个实施方案中，评价化合物和sirtuin测试蛋白之间的相互作用包括，评价化合物和sirtuin测试蛋白之间的结合相互作用。
方法还可以包括，基于评价的结果，选择能调节对底物的脱乙酰基酶活性的化合物。底物可以是乙酰化的赖氨酸氨基酸，乙酰化的转录因子(例如，p53，FoxO1，或FoxO3)或它们的乙酰化的肽，乙酰化的组蛋白或它们的乙酰化的肽。
方法还可以包括，基于评价的结果，选择能调节对底物的sirtuin脱乙酰基酶活性的化合物。
方法还可以包括，基于评价的结果，选择能调节sirtuin的化合物。
在一个方面，本发明涉及一种缀合物，其包括靶向试剂和化合物，其中靶向试剂和化合物共价连接，且化合物具有式(I)。
实施方案可以包括下述的一种或多种。
靶向试剂可以是抗体，例如，对细胞表面蛋白(例如，癌症-特异性的抗原)特异性的抗体。
靶向试剂可以是合成肽。
靶向试剂可以是天然存在的蛋白的结构域。
在另一个方面，本发明涉及试剂盒，其包括本文所述化合物，和关于治疗本文所述疾病的使用说明书。试剂盒还可以包括印刷材料，其包含化合物的名称、结构的描述。
在另一个方面，本发明涉及分析或设计结构的方法，该方法包括提供计算机-产生的本文所述化合物(例如，式I化合物)的图像或结构(优选地三维图像或结构)，提供计算机-产生的第二种化合物(例如，另一种本文所述的化合物(例如，式I化合物，NAD)或靶物(例如，sirtuin(例如，人sirtuin，例如，SIRT1，SIRT2，SIRT3，SIRT4，SIRT5，SIRT6，或SIRT7))，或非靶分子(off-target molecule)(例如，SIRT1以外的sirtuin，例如，SIRT2或SIRT3，或非-sirtuin组蛋白脱乙酰基酶))的图像或结构(优选地三维图像或结构)；和对比第一种和第二种化合物的结构，例如，对比结构，例如，与键角有关的参数，分子间或分子内距离，原子或基团的位置；例如，第一代或第二代化合物-预测的化合物与靶物或非靶分子相互作用或抑制它们的能力。
在一个优选的实施方案中，进一步在体外、体内或计算机地(insilico)用靶物或非靶分子评价结构。
在另一个方面，本发明涉及数据库，其包括关于或鉴定结构的信息，关于结构的活性的信息，例如，体外，体内或计算机地，例如，至少5，10，50，或100个记录。
在一个方面，本发明涉及数据库，其包括许多记录，每个记录具有a)关于或鉴定具有本文所述的结构(例如，式I的结构)的化合物的信息；和b)关于患者的参数的信息，该参数与肿瘤性疾病或神经变性疾病有关，例如患者参数。
在一个方面，本发明涉及评价化合物的方法，该方法包括提供具有式I结构的第一种化合物，或具有关于结构的信息的数据记录；提供具有式I结构或不具有式I结构的第二种化合物，或具有关于结构的信息的数据记录；评价第一种化合物和第二种化合物，例如，体内，体外，或计算机地；和对比第二种化合物与第一种化合物与sirtuin(例如，SIRT1)相互作用(例如，抑制sirtuin)的能力，从而评价第二种化合物与SIRT1相互作用的能力。
在其它方面，本发明涉及组合物，其包含本文任一式的化合物，和药学上可接受的载体。组合物可以含有其它治疗剂，例如，抗肿瘤剂或神经变性疾病药剂。这样的组合物在生产用于前述用途的药物中的应用，也在本发明的范围内。
在另一个方面，本发明是治疗或预防对象中特征在于不希望的细胞增殖的疾病(例如，癌症，例如，依赖于p53的癌症或独立于p53的癌症)的方法。该方法包括，施用SIRT1拮抗剂。例如，SIRT1拮抗剂可以是下述的一种或多种SIRT1的反义，RNAi，抗体，细胞内抗体，和通过本文所述的方法鉴别出的其它化合物，例如，诱导SIRT1表达细胞的细胞凋亡的化合物。
在一个优选的实施方案中，该方法包括，与一种或多种治疗剂(例如，用于治疗不希望的细胞增殖的治疗剂或药剂)联合施用SIRT1拮抗剂。治疗剂包括，例如以下一种或多种化疗剂，放射性同位素，和细胞毒素。化疗剂的实例包括紫杉酚，细胞松弛素B，短杆菌肽D，丝裂霉素，依托泊苷，tenoposide，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，白消安，顺铂，多柔比星，柔红霉素，二羟基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，光辉霉素，苯丁酸氮芥，吉西他滨，放线菌素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，嘌呤霉素，maytansinoid和其类似物或同系物。其它治疗剂包括但不限于，抗代谢物(例如，甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶，氨烯咪胺)，烷化剂(例如，氮芥，塞替派，苯丁酸氮芥，CC-1065，美法仑，卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链唑霉素，丝裂霉素C，和顺式-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(以前称作道诺霉素)和多柔比星)，抗生素(例如，更生菌素(以前称作放线菌素)，博来霉素，光辉霉素，和氨茴霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱，长春碱，紫杉酚和maytansinoid)。放射性同位素可以包括α，β和/或γ放射体。放射性同位素的实例包括212Bi，213Bi，131I，211At，186Re，90Y和117Lu。
可以同时或序贯地施用SIRT1拮抗剂和治疗剂。
包装产品也在本发明的范围内。包装产品包括容器，在容器中的前述化合物之一，和与容器相伴随的指示施用化合物来治疗本文所述的病症(例如，癌症或神经变性疾病)、疾病或疾病症状(包括本文所述的那些)的标识(例如，标签或插页)。
对象可以是哺乳动物，优选人。对象也可以是非-人对象，例如，动物模型。在某些实施方案中，方法还可以包括鉴别对象。鉴别需要这样的治疗的对象，可以是对象或保健人员的判断，且可以是主观的(例如，意见)或客观的(例如，通过测试或诊断方法可测量的)。
术语“哺乳动物”包括生物体，其包括小鼠，大鼠，牛，绵羊，猪，兔子，山羊，和马，猴子，狗，猫，且优选人。
术语“治疗”或“治疗的”指向对象施用本文所述的化合物，其目的是治愈、痊愈、减轻、缓解、改变、治疗、改善、提高或影响疾病，例如，感染，疾病的症状或向疾病的倾向。
上述化合物的有效量范围可以是约0.1mg/Kg至约500mg/Kg，或者约1至约50mg/Kg。有效剂量也可以随给药途径、以及与其它试剂共同使用的可能性而变化。
术语“卤代”或“卤素”指氟、氯、溴或碘中的任意基团。
术语“烷基”指含指示数目的碳原子的直链或支链的烃链。例如，C1-C12烷基表示该基团中可具有1-12(含两端值)个碳原子。术语“卤代烷基”指其中一个或多个氢原子被卤素替代的烷基，且包括其中所有氢都已经被卤素替代的烷基(例如，全氟烷基)。术语“芳基烷基”或“芳烷基”指其中烷基氢原子被芳基替代的烷基。芳烷基包括其中超过一个氢原子已经被芳基替代的基团。“芳基烷基”或“芳烷基”的实例包括苄基，2-苯乙基，3-苯丙基，9-芴基，二苯甲基，和三苯甲基。
术语“亚烷基”指二价烷基，例如，-CH2-，-CH2CH2-，和-CH2CH2CH2-。
术语“链烯基”指含有2-12个碳原子且具有一个或多个双键的直链或支链的烃链。链烯基的实例包括但不限于，烯丙基，丙烯基，2-丁烯基，3-己烯基和3-辛烯基。双键碳之一可以任选地是链烯基取代基的附着点。术语“炔基”指含有2-12个碳原子且特征在于具有一个或多个三键的直链或支链的烃链。炔基的实例包括但不限于，乙炔基，丙炔基，和3-己炔基。三键碳之一可以任选地是炔基取代基的附着点。
术语“烷基氨基”和“二烷基氨基”分别指-NH(烷基)和-NH(烷基)2。术语“芳烷基氨基”指-NH(芳烷基)。术语“烷基氨基烷基”指(烷基)NH-烷基-；术语“二烷基氨基烷基”指(烷基)2N-烷基-。术语“烷氧基”指-O-烷基。术语“巯基”指SH。术语“硫代烷氧基”指-S-烷基。术语”硫代芳基氧”指-S-芳基。
术语“芳基”指芳族单环、二环或三环烃环系统，其中能发生取代的任意环原子可以被取代(例如，被一个或多个取代基取代)。芳基的实例包括但不限于，苯基，萘基，和蒽基。
如本文使用的术语“环烷基”包括具有3至12个碳的饱和环状、二环、三环或多环烃基。任意的环原子可以被取代(例如，被一个或多个取代基取代)。环烷基可以含有稠合环。稠合环是具有一个共同碳原子的环。环烷基的实例包括但不限于，环丙基，环己基，甲基环己基，金刚烷基，和降冰片烷基。
术语“杂环基”指非芳族3-10元单环、8-12元双环或11-14元三环环系统，如果是单环则具有1-3个杂原子，如果是双环则具有1-6个杂原子，或如果是三环则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果分别是单环、双环、或三环，则为碳原子和1-3、1-6、或1-9个N、O或S杂原子)。杂原子可以任选地是杂环基取代基的附着点。任意的环原子可以被取代(例如，被一个或多个取代基取代)。杂环基可以含有稠合环。稠合环是具有一个共同碳原子的环。杂环基的实例包括但不限于，四氢呋喃基，四氢吡喃基，哌啶基，吗啉代，吡咯啉基，嘧啶基，喹啉基，和吡咯烷基。
术语“环烯基”指具有5至12个碳、优选地5至8个碳的部分饱和的非芳族的环状、双环、三环或多环烃基。不饱和的碳可以任选地是环烯基取代基的附着点。任意的环原子可以被取代(例如，被一个或多个取代基取代)。环烯基可以含有稠合环。稠合环是具有一个共同碳原子的环。环烯基的实例包括但不限于，环己烯基，环己二烯基，或降冰片烯基。
术语“杂环烯基”指部分饱和的非芳族5-10元单环、8-12元双环、或11-14元三环环系统，如果是单环则具有1-3个杂原子，如果是双环则具有1-6个杂原子，或如果是三环则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N、或S(例如，如果分别是单环、双环、或三环，则为碳原子和1-3、1-6、或1-9个N、O或S杂原子)。不饱和的碳或杂原子可以任选地是杂环烯基取代基的附着点。任意的环原子可以被取代(例如，被一个或多个取代基取代)。杂环烯基可以含有稠合环。稠合环是具有一个共同碳原子的环。杂环烯基的实例包括但不限于，四氢吡啶基和二氢吡喃基。
术语“杂芳基”指芳族5-8元单环、8-12元双环、或11-14元三环环系统，如果是单环则具有1-3个杂原子，如果是双环则具有1-6个杂原子，或如果是三环则具有1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N、或S(例如，如果分别是单环、双环、或三环，则为碳原子和1-3、1-6、或1-9个N、O或S杂原子)。任意的环原子可以被取代(例如，被一个或多个取代基取代)。
术语“氧代”指氧原子，当结合碳时，它形成羰基，当结合氮时，它形成N-氧化物，且当结合硫时，它形成亚砜或砜。
术语“酰基”指烷基羰基，环烷基羰基，芳基羰基，杂环基羰基，或杂芳基羰基取代基，其中的任一个可以被进一步取代(例如，被一个或多个取代基取代)。
术语“氨基羰基，”烷氧基羰基，”肼基羰基，和羟基氨基羰基分别指基团-C(O)NH2，-C(O)O(烷基)，-C(O)NHNH2，和-C(O)NHOH。
术语“酰氨基”指-NHC(O)-，其中N是附着点。
术语“取代基”指在烷基、环烷基、链烯基、炔基、杂环基、杂环烯基、环烯基、芳基或杂芳基的任意原子上“取代”的基团。任意的原子可以被取代。合适的取代基包括但不限于，烷基(例如，C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，C10，C11，C12直链或支链的烷基)，环烷基，卤代烷基(例如，全氟烷基例如CF3)，芳基，杂芳基，芳烷基，杂芳烷基，杂环基，链烯基，炔基，环烯基，杂环烯基，烷氧基，卤代烷氧基(例如，全氟烷氧基例如OCF3)、卤素，羟基，羧基，羧酸盐(酯)，氰基，硝基，氨基，烷基氨基，SO3H，硫酸盐(酯)，磷酸盐(酯)，亚甲二氧基(-O-CH2-O-，其中氧结合到邻位原子上)，亚乙二氧基，氧代，硫代(例如，C＝S)，亚胺基(烷基，芳基，芳烷基)，S(O)n烷基(其中n是0-2)，S(O)n芳基(其中n是0-2)，S(O)n杂芳基(其中n是0-2)，S(O)n杂环基(其中n是0-2)，胺(单-，二-，烷基，环烷基，芳烷基，杂芳烷基，芳基，杂芳基，和它们的组合)，酯(烷基，芳烷基，杂芳烷基，芳基，杂芳基)，酰胺(单-，二-，烷基，芳烷基，杂芳烷基，芳基，杂芳基，和它们的组合)，氨磺酰(单-，二-，烷基，芳烷基，杂芳烷基，和它们的组合)。在一个方面，基团上的取代基独立地是任一个单独的前述取代基，或前述取代基的任意子集。在另一个方面，取代基可以自己被任一个前述取代基取代。
在下面的附图和详述中，描述了本发明的一个或多个实施方案的细节。从详述和附图以及权利要求中，可以明白本发明的其它特征、目的和优点。
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附图描述图1是代表性化合物和数据的表。
图2是计算机-产生的模型，其显示了结合在SIRT的活性部位的化合物8的一种可能的取向。
图3a是描述化合物8对哺乳动物SirT1的抑制的图。
图3b是仅用依托泊苷或用依托泊苷和化合物8处理的NCI-H460细胞的蛋白印迹。
图4是描述化合物8的对映体8(-)导致p53乙酰化的增加的条形图。
图5是描述抑制SirT催化活性的化合物也引起p53乙酰化的蛋白印迹。
图6是描述与对映体8(+)相比化合物8的对映体8(-)优先抑制酵母sir2的图。
图7是描述化合物8抑制U2OS细胞和MCF-7细胞中的SirT1的有效性的凝胶测定。
图8是描述化合物8对DNA损伤后的细胞存活的影响的图。
图9是描述化合物8对NCI-H460细胞的细胞存活的影响的图。
图10是描述化合物8导致废除血清饥饿-介导的细胞周期抑制剂p27的上调的条形图。
详细描述示例性化合物的结构可以用于实践本发明的示例性化合物具有通式(I)，且含有被取代的5或6元环核心，后者分别含有1个或2个氧、氮或硫原子作为环的组成原子，例如，下式(I)中的X和Y。
任意的环碳原子可以被取代。例如，R1，R2，R3，和R4可以包括但不限于被取代的或未被取代的烷基，环烷基，链烯基，炔基，杂环基，杂环烯基，环烯基，芳基，杂芳基等。5或6元环核心可以是饱和的，即不含有双键，或部分或完全饱和的，即分别含有一个或两个双键。当n＝0时，“X”可以是氧、硫或氮，例如，NR7。取代基R7可以是，不限于，氢，烷基，例如，C1，C2，C3，C4烷基，SO2(芳基)，酰基，或环氮可以形成氨基甲酸酯或脲基的一部分。当n＝1时，X可以是NR7，O，或S；且Y可以是NR7’，O或S。X和Y可以是杂原子的任意组合，例如N，N，N，O，N，S，等。
式(I)化合物的一个优选子集包括具有一个(或优选地2个)与5或6元环核心稠合的环的化合物，例如，R1和R2与它们结合的碳一起，和/或R3和R4与它们结合的碳一起，可以形成例如，C5-C10环烷基(例如，C5，C6，或C7)，C5-C10杂环基(例如，C5，C6，或C7)，C5-C10环烯基(例如，C5，C6，或C7)，C5-C10杂环烯基(例如，C5，C6，或C7)，C6-C10芳基(例如，C6，C8或C10)，或C6-C10杂芳基(例如，C5或C6)。稠合环组合可以包括但不限于下述的一种或多种
优选的组合包括B，例如具有C6芳基和C6环烯基(B1)，和C，例如具有C6芳基和C7环烯基(C1) 这些稠合环系统中的每一个可以任选地被取代基取代，所述取代基可以包括但不限于卤素，羟基，C1-C10烷基(C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，C10)，C1-C6卤代烷基(C1，C2，C3，C4，C5，C6，)，C1-C10烷氧基(C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，C10)，C1-C6卤代烷氧基(C1，C2，C3，C4，C5，C6，)，C6-C10芳基(C6，C7，C8，C9，C10)，C5-C10杂芳基(C5，C6，C7，C8，C9，C10)，C7-C12芳烷基(C7，C8，C9，C10，C11，C12)，C7-C12杂芳烷基(C7，C8，C9，C10，C11，C12)，C3-C8杂环基(C3，C4，C5，C6，C7，C8)，C2-C12链烯基(C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，C10，C11，C12)，C2-C12炔基(C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，C10，C11，C12)，C5-C10环烯基(C5，C6，C7，C8，C9，C10)，C5-C10杂环烯基(C5，C6，C7，C8，C9，C10)，羧基，羧酸盐(酯)，氰基，硝基，氨基，C1-C6烷基氨基(C1，C2，C3，C4，C5，C6，)，C1-C6二烷基氨基(C1，C2，C3，C4，C5，C6，)，巯基，SO3H，硫酸盐(酯)，S(O)NH2，S(O)2NH2，磷酸盐(酯)，C1-C4亚烷二氧基(C1，C2，C3，C4)，氧代，酰基，氨基羰基，C1-C6烷基氨基羰基(C1，C2，C3，C4，C5，C6，)，C1-C6二烷基氨基羰基(C1，C2，C3，C4，C5，C6，)，C1-C10烷氧基羰基(C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，C10)，C1-C10硫代烷氧基羰基(C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，C10)，肼基羰基，C1-C6烷基肼基羰基(C1，C2，C3，C4，C5，C6，)，C1-C6二烷基肼基羰基(C1，C2，C3，C4，C5，C6，)，羟基氨基羰基等。优选的取代基包括卤素(例如，氟，氯，溴)，C1-C10烷基(例如，C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，C8，C9，C10)，C1-C6卤代烷基(例如，C1，C2，C3，C4，C5，C6，例如，CF3)，C1-C6卤代烷氧基(例如，C1，C2，C3，C4，C5，C6，例如，OCF3)，或氨基羰基。可以根据需要选择2个稠合环上的取代型式，例如，一个环可以被取代，而另一个环不取代，或者两个环都可以被1-5个取代基(1，2，3，4，5个取代基)取代。每个环上的取代基的数目可以相同或不同。下面显示了优选的取代型式
在某些实施方案中，当n是0且X是NR7时，氮取代基R7可以与含有例如4-6个碳、1-3个氮、0-2个氧和0-2个硫的稠合环之一形成环状结构。该环状结构可以任选地被氧或C1-C6烷基取代。
本发明预见到的取代基和变量的组合，仅仅是会导致形成稳定的化合物的那些。如本文所使用的，术语“稳定的”指这样的化合物，其具有足以允许生产的稳定性，且其会将化合物的完整性维持足以用于本文所述目的(例如，治疗性或预防性地施用给对象)的时间段。
示例性化合物包括下面的表1中所述的那些*表1示例性化合物
*具有指定为A的活性的化合物具有小于1.0μM的IC50。具有指定为B的活性的化合物具有1.0μM至10.0μM的IC50。具有指定为C的活性的化合物具有大于10.0μM的IC50。指定为D的化合物在该测定中未测试。
通过体外(基于细胞的和基于非细胞的)和体内方法，可以鉴别出可以用于实现本发明的化合物。在实施例中描述了这些方法的说明。
示例性化合物的合成本文所述的化合物可以从商业来源(例如，Asinex，Moscow，Russia；Bionet，Camelford，England；ChemDiv，SanDiego，CA；Comgenex，Budapest，Hungary；Enamine，Kiev，Ukraine；IF Lab，Ukraine；Interbioscreen，Moscow，Russia；Maybridge，Tintagel，UK；Specs，The Netherlands；Timtec，Newark，DE；Vitas-M Lab，Moscow，Russia)得到，或使用可商业上得到的原料和试剂，如下所示通过常规方法合成。例如，可以如下面的方案1所示，合成示例性化合物4。
方案1 溴化的β-酮酯1可以与4-氯苯胺缩合，随后环化可以产生吲哚2。酯皂化可以产生酸3。最后与PyAOP氨基化，可以产生酰胺4。其它方法是本领域已知的，参见，例如，美国专利3,859,304，美国专利3,769,298，J.Am.Chem.Soc.1974，74，5495。上面的合成可以延伸到其它苯胺，例如，3，5-二氯苯胺，3-氯苯胺，和4-溴苯胺。使用N-取代的苯胺，例如，4-氯-N-甲基苯胺，可以得到区域异构的产物，例如，5。
通过诸如柱色谱、高压液相色谱或重结晶等方法，可以从反应混合物分离本文所述的化合物并进一步纯化。如熟练的技术人员可以明白的，本领域的普通技术人员会明白合成本文通式化合物的其它方法。另外，可以以备选的次序或顺序，进行各合成步骤，以产生目标化合物。可用于合成本文所述的化合物的合成化学转化和保护基方法(保护和去保护)，是本领域已知的，且包括，例如，记载在例如下述文献中的那些R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCHPublishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groupsin Organic Synthesis，2d.Ed.，John Wiley and Sons(1991)；L.Fieser和M.Fieser，Fieser and Fieser′s Reagents for OrganicSynthesis，John Wiley and Sons(1994)；和L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley andSons(1995)，和它们的后续版本。
本发明的化合物可以含有一个或多个不对称中心，从而作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、单独的非对映体和非对映体混合物存在。这些化合物的所有这样的异构体形式，都清楚地包含在本发明中。本发明的化合物也可以含有可限制键旋转的连接(例如，碳-碳键)或取代基，例如由于环或双键的存在引起的限制。因此，所有顺式/反式和E/Z异构体都清楚地包含在本发明中。本发明的化合物还可以多种互变异构形式表示，在这样的情况下，本发明清楚地包括本文所述化合物的所有互变异构形式，即使可能只表示了一种互变异构形式(例如，环系统的烷基化可能导致多个位点的烷基化，本发明清楚地包括所有这样的反应产物)。这样的化合物的所有这样的异构形式都清楚地包括赞本发明中。本文所述化合物的所有晶形都清楚地包括在本发明中。
可用于分离异构体(例如，立体异构体)的技术，属于本领域的常识，且记载在Eliel，E.L.；Wilen，S.H.；Mander，L.N.Stereochemistry of Organic Compounds，Wiley Interscience，NY，1994。例如，通过形成非对映体盐，例如用手性碱，例如，(+)或(-)α-甲基苄基胺，或通过使用手性柱的高效液相色谱，可以将化合物3或4拆分成高对映体过量(例如，60％，70％，80％，85％，90％，95％，99％或更大)。在有些实施方案中，直接在手性柱上纯化粗产物4，提供对映体富集的化合物。
为了解释的目的，下面显示了化合物4的对映体。
在有些实例中，施用本文公开的化合物，其中一种异构体(例如，R异构体或S异构体)以高对映体过量存在。通常，与具有+32.8(c＝0.38，DCM)或[α]D25+22.72°(c0.910，CH3OH)的正旋光度的对映体相比，具有负旋光度(例如，-14.1(c＝0.33，DCM)或[α]D25-41.18°(c0.960，CH3OH))的化合物4的异构体具有更大的针对SirT1酶的活性。因此，在有些实例中，有利地向对象施用具有高对映体过量的具有负旋光度的异构体的化合物4，来治疗疾病。
尽管化合物4的对映体提供了立体异构体的一个实例，也预见到其它立体异构体，例如如下面的化合物6和7所述。
如同式4的化合物，在有些情况下，有利地向对象施用具有比它的对映体更大的对SirT1的亲和力的化合物6或7的异构体。例如，在有些实例中，有利地施用富集(-)旋光异构体的化合物7，其中酰胺(或其它取代基)具有与化合物4的负异构体相同的构型。
在有些实例中，有利地施用具有下述结构之一的化合物，其中酰胺(或其它取代基)的立体化学结构与具有负旋光度的化合物4中的酰胺相符。
(n是0至4的整数)本发明的化合物包括化合物本身，以及它们的盐和它们的前药(如果适用)。盐，例如，可以在阴离子和本文所述化合物上的带正电荷的取代基(例如，氨基)之间形成。合适的阴离子包括氯离子，溴离子，碘离子，硫酸根，硝酸根，磷酸根，柠檬酸根，甲磺酸根，三氟乙酸根，和乙酸根。类似地，盐也可以在阳离子和本文所述化合物上的带负电荷的取代基(例如，羧酸根)之间形成。合适的阳离子包括钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，和铵阳离子，例如四甲基铵离子。前药的实例包括酯和其它药学上可接受的衍生物，其在施用给对象后，能提供活性化合物。
可通过附属合适的官能团而修饰本发明的化合物，从而提高所选择的生物学性质，例如靶向特定组织。这样的修饰是本领域已知的，且包括能增加向给定生物学区室(例如，血液、淋巴系统、中枢神经系统)中的生物学渗透、增加口服利用度、增加溶解度以允许注射给药、改变代谢和改变排泄速率的那些。
在一个备选实施方案中，本文所述的化合物可以用作平台或支架，其可以用于组合化学技术中，用于制备化合物的衍生物和/或化学文库。化合物的这种衍生物和文库具有生物活性，且可用于鉴别和设计具有特定活性的化合物。适合使用本文所述化合物的组合技术是本领域已知的，其示例为Obrecht，D.和Villalgrodo，J.M.，Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis ofSmall-Molecular-Weight Compounds Libraries，Pergamon-ElsevierScience Limited(1998)，且包括下述的那些，例如″split和pool″或″平行″合成技术，固相和溶液相技术，和编码技术(参见，例如，Czarnik，A.W.，Curr.Opin.Chem.Bio.，(1997)1，60。因而，一个实施方案涉及使用本文所述化合物产生衍生物或化学文库的方法，包括1)提供包含许多孔的物体；2)在每个孔中提供通过本文所述方法鉴别出的一种或多种化合物；3)在每个孔中提供另外一种或多种化合物；4)从每个孔分离所得到的一种或多种产物。一个备选实施方案涉及使用本文所述的化合物产生衍生物或化学文库的方法，包括1)提供附着到固体支持物上的一种或多种本文所述的化合物；2)用一种或多种另外的化学试剂处理通过本文所述方法鉴别出的附着到固体支持物上的一种或多种化合物；3)从固体支持物分离所得到的一种或多种产物。在上述方法中，″标签″或标识符或标记部分可以附着到和/或脱离本文所述的化合物或它们的衍生物，以促进对目标产物或它们的中间体的跟踪、识别或分离。这样的部分是本领域已知的。在前述方法中使用的化学试剂可以包括，例如，溶剂，试剂，催化剂，保护基和去保护基试剂等。这样的化学试剂的实例是在本文参考的各种合成和保护基化学教科书和论文中出现的那些。
SirtuinSirtuin是沉默信息调节剂(SIR)家族基因的成员。Sirtuin是蛋白，其包括SIR2结构域，后者定义为在Pfam家族“SIR2”-PF02146中评分为击中(hits)的氨基酸序列。该家族在INTERPRO数据库中称作INTERPRO描述(登录项IPR003000)。为了鉴别“SIR2”结构域在蛋白序列中的存在，并确定目标多肽或蛋白具有特定性能，可以针对HMM的Pfam数据库(例如，Pfam数据库，版本9)，使用默认参数，搜索蛋白的氨基酸序列(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search)。SIR2结构域在Pfam中被索引为PF02146，且在INTERPRO中被索引为INTERPRO描述(登录项IPR003000)。例如，hmmsf程序，其可以作为搜索程序的HMMER包的一部分得到，是MILPAT0063的家族特异性的默认程序，且15的分数是确定击中的默认阈值分数。或者，可以降低确定击中的阈值分数(例如，至8比特)。Pfam数据库的描述可以参见“The Pfam ProteinFamilies Database”Bateman A，Birney E，Cerruti L，Durbin R，Etwiller L，Eddy SR，Griffiths-Jones S，Howe KL，Marshall M，Sonnhammer EL(2002)Nucleic Acids Research 30(1)276-280和Sonhammer et al.(1997)Proteins 28(3)405-420，且HMM的详细描述可以参见，例如，Gribskov et al.(1990)Meth.Enzymol.183146-159；Gribskov et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA844355-4358；Krogh et al.(1994)J.Mol.Biol.2351501-1531；和Stultz et al.(1993)Protein Sci.2305-314。
由SIR2基因家族的成员编码的蛋白可以在250氨基酸核心结构域表现出高序列保守。该家族中的一个较好表征的基因是酿酒酵母SIR2，其参与沉默HM基因座，后者含有指定酵母接合型、端粒位置效应和细胞老化的信息(Guarente，1999；Kaeberlein et al.，1999；Shore，2000)。酵母Sir2蛋白属于组蛋白脱乙酰基酶家族(综述见Guarente，2000；Shore，2000)。Sir2蛋白是一种脱乙酰基酶，其可以使用NAD作为辅因子(Imai et al.，2000；Moazed，2001；Smith etal.，2000；Tanner et al.，2000；Tanny和Moazed，2001)。与其它脱乙酰基酶(其中的许多参与基因沉默)不同，Sir2对组蛋白脱乙酰基酶抑制剂如曲古抑菌素A(TSA)相对不敏感(Imai et al.，2000；Landry et al.，2000a；Smith et al.，2000)。哺乳动物Sir2同源物(例如SIRT1)具有NAD-依赖性的脱乙酰基酶活性(Imai et al.，2000；Smith et al.，2000)。
示例性哺乳动物sirtuin包括SIRT1，SIRT2，和SIRT3，例如，人SIRT1，SIRT2，和SIRT3。本文所述的化合物可以抑制哺乳动物sirtuin(例如，SIRT1，SIRT2，或SIRT3)的一种或多种活性，例如，其Ki小于500，200，100，50，或40nM。例如，化合物可以抑制脱乙酰基酶活性，例如，对于天然的或人工的底物，例如，本文所述的底物，例如，如下。
SIRT1的天然底物包括组蛋白，p53，和FoxO转录因子例如FoxO1和FoxO3。SIRT1蛋白可结合许多其它蛋白，它们称作“SIRT1结合伴侣”。例如，SIRT1结合p53，并在p53途径中起作用，例如，p53的K370，K371，K372，K381，和/或K382，或包括这些赖氨酸中的一个或多个的肽。例如，肽的长度可以是5至15个氨基酸。SIRT1蛋白也可以使组蛋白脱乙酰化。例如，SIRT1可以使组蛋白H3或包含这些赖氨酸中的一个或多个的小肽的赖氨酸9或14脱乙酰化。组蛋白脱乙酰作用会改变局部的染色质结构，从而可以调节附近的基因的转录。许多SIRT1结合伴侣是转录因子，例如，识别特定的DNA位点的蛋白。例如，SirT1会使叉头蛋白(即FoxO蛋白)脱乙酰化并下调。SIRT1和SIRT1结合伴侣之间的相互作用可以向基因组的特定区域递送SIRT1，并可以导致底物(例如，定位于该特定区域的组蛋白和转录因子)的局部显现。
SIRT2的天然底物包括微管蛋白，例如，α-微管蛋白。参见，例如，North et al.Mol Cell.2003 Feb；11(2)437-44。示例性的底物包括包含α-微管蛋白的赖氨酸40的肽。
其它示例性的sirtuin底物包括细胞色素C和其乙酰化的肽。
术语“SIRT1蛋白”和“SIRT1多肽”在本文中可互换地使用，且指与250氨基酸保守的SIRT1催化结构域(SEQ ID NO1的氨基酸残基258至451)至少25％相同的多肽。SEQ ID NO1描述了人SIRT1的氨基酸序列。在优选的实施方案中，SIRT1多肽可以与SEQ ID NO1、或SEQ ID NO1的氨基酸残基258至451之间的氨基酸序列具有至少30，40，50，60，70，80，85，90，95，99％同源性。在其它实施方案中，SIRT1多肽可以是片段，例如，能实现下述一项或多项的SIRT1片段在NAD和/或NAD类似物存在下，脱乙酰化底物，且能结合靶蛋白，例如，转录因子。可以评价这样的功能，例如，通过本文所述的方法。在其它实施方案中，SIRT1多肽可以是“全长”SIRT1多肽。如本文所使用的术语“全长”指至少具有天然存在的SIRT1多肽(或本文所述的其它蛋白)的长度的多肽。“全长”SIRT1多肽或其片段也可以包括其它序列，例如，纯化标记，或其它附着的化合物，例如，附着的荧光团，或辅因子。相对于天然存在的Sir2家族成员，术语“SIRT1多肽”也可以包括包含一个或多个置换(例如，1至10个置换)的序列或变体。“SIRT1活性”指SIRT1的一种或多种活性，例如，底物(例如，氨基酸，肽，或蛋白)的脱乙酰作用，底物例如转录因子(例如，p53)或组蛋白蛋白(例如，在辅因子例如NAD和/或NAD类似物存在下)，和向靶物(例如，靶蛋白，例如，转录因子)的结合。
如本文所使用的，蛋白的“生物活性部分”或“功能结构域”包括目标蛋白的参与相互作用的片段，所述相互作用例如分子内或分子间的相互作用，例如，结合或催化相互作用。分子间相互作用可以是特定的结合相互作用或酶促相互作用(例如，相互作用可以是瞬时的，和形成或破坏共价键)。分子间相互作用可以是在蛋白和另一种蛋白之间，蛋白和另一种化合物之间，或蛋白的第一种分子和第二种分子之间(例如，二聚化相互作用)。蛋白的生物活性部分/功能结构域包括这样的肽，其包含与蛋白的氨基酸序列足够同源或源自它的氨基酸序列，所述蛋白包含比全长天然蛋白少的氨基酸，且表现出天然蛋白的至少一种活性。通过多种技术，包括截短分析、定点诱变和蛋白水解，可以鉴别出生物活性部分/功能结构域。通过适当的生物化学或生物学(例如，遗传学)测定，可以测定突变体或蛋白水解片段的活性。在有些实施方案中，功能结构域独立地折叠。典型地，生物活性部分包含具有蛋白(例如，SIRT1)的至少一种活性的结构域或基序。示例性结构域是SIRT1核心催化结构域。蛋白的生物活性部分/功能结构域可以是长度为例如10，25，50，100，200或更多个氨基酸的多肽。蛋白的生物活性部分/功能结构域可以用作开发调节SIRT1的试剂的靶物。
下面是示例性SIR序列＞sp|Q96EB6|SIR1_人NAD-依赖性的脱乙酰基酶sirtuin 1(EC3.5.1.-)(hSIRT1)(hSIR2)(SIR2-样蛋白1)-智人(Homo sapiens)(人)。
MADEAALALQPGGSPSAAGADREAASSPAGEPLRKRPRRDGPGLERSPGEPGGAAPEREVPAAARGCPGAAAAALWREAEAEAAAAGGEQEAQATAAAGEGDNGPGLQGPSREPPLADNLYDEDDDDEGEEEEEAAAAAIGYRDNLLFGDEIITNGFHSCESDEEDRASHASSSDWTPRPRIGPYTFVQQHLMIGTDPRTILKDLLPETIPPPELDDMTLWQIVINILSEPPKRKKRKDINTIEDAVKLLQECKKIIVLTGAGVSVSCGIPDFRSRDGIYARLAVDFPDLPDPQAMFDIEYFRKDPRPFFKFAKEIYPGQFQPSLCHKFIALSDKEGKLLRNYTQNIDTLEQVAGIQRIIQCHGSFATASCLICKYKVDCEAVRGDIFNQVVPRCPRCPADEPLAIMKPEIVFFGENLPEQFHRAMKYDKDEVDLLIVIGSSLKVRPVALIPSSIPHEVPQILINREPLPHLHFDVELLGDCDVIINELCHRLGGEYAKLCCNPVKLSEITEKPPRTQKELAYLSELPPTPLHVSEDSSSPERTSPPDSSVIVTLLDQAAKSNDDLDVSESKGCMEEKPQEVQTSRNVESIAEQMENPDL
KNVGSSTGEKNERTSVAGTVRKCWPNRVAKEQISRRLDGNQYLFLPPNRYIFHGAEVYSDSEDDVLSSSSCGSNSDSGTCQSPSLEEPMEDESEIEEFYNGLEDEPDVPERAGGAGFGTDGDDQEAINEAISVKQEVTDMNYPSNKS (SEQ ID NO1)＞sp|Q8IXJ6|SIR2_人NAD-依赖性的脱乙酰基酶sirtuin 2(EC3.5.1.-)(SIR2-样)(SIR2-样蛋白2)-智人(Homo sapiens)(人)。
MAEPDPSHPLETQAGKVQEAQDSDSDSEGGAAGGEADMDFLRNLFSQTLSLGSQKERLLDELTLEGVARYMQSERCRRVICLVGAGISTSAGIPDFRSPSTGLYDNLEKYHLPYPEAIFEISYFKKHPEPFFALAKELYPGQFKPTICHYFMRLLKDKGLLLRCYTQNIDTLERIAGLEQEDLVEAHGTFYTSHCVSASCRHEYPLSWMKEKIFSEVTPKCEDCQSLVKPDIVFFGESLPARFFSCMQSDFLKVDLLLVMGTSLQVQPFASLISKAPLSTPRLLINKEKAGQSDPFLGMIMGLGGGMDFDSKKAYRDVAWLGECDQGCLALAELLGWKKELEDLVRREHASIDAQSGAGVPNPSTSASPKKSPPPAKDEARTTEREKPQ (SEQ ID NO2)＞sp|Q9NTG7|SIR3_人NAD-依赖性的脱乙酰基酶sirtuin 3，线粒体前体(EC 3.5.1.-)(SIR2-样蛋白3)(hSIRT3)-智人(Homosapiens)(人)。
MAFWGWRAAAALRLWGRVVERVEAGGGVGPFQACGCRLVLGGRDDVSAGLRGSHGARGEPLDPARPLQRPPRPEVPRAFRRQPRAAAPSFFFSSIKGGRRSISFSVGASSVVGSGGSSDKGKLSLQDVAELIRARACQRVVVMVGAGISTPSGIPDFRSPGSGLYSNLQQYDLPYPEAIFELPFFFHNPKPFFTLAKELYPGNYKPNVTHYFLRLLHDKGLLLRLYTQNIDGLERVSGIPASKLVEAHGTFASATCTVCQRPFPGEDIRADVMADRVPRCPVCTGVVKPDIVFFGEPLPQRFLLHVVDFPMADLLLILGTSLEVEPFASLTEAVRSSVPRLLINRDLVGPLAWHPRSRDVAQLGDVVHGVESLVELLGWTEEMRDLVQRETGKLDGPDK (SEQ ID NO3)＞sp|Q9Y6E7|SIR4_人NAD-依赖性的脱乙酰基酶sirtuin 4(EC3.5.1.-)(SIR2-样蛋白4)-智人(Homo sapiens)(人)。
MKMSFALTFRSAKGRWIANPSQPCSKASIGLFVPASPPLDPEKVKELQRFITLSKRLLVMTGAGISTESGIPDYRSEKVGLYARTDRRPIQHGDFVRSAPIRQRYWARNFVGWPQFSSHQPNPAHWALSTWEKLGKLYWLVTQNVDALHTKAGSRRLTELHGCMDRVLCLDCGEQTPRGVLQERFQVLNPTWSAEAHGLAPDGDVFLSEEQVRSFQVPTCVQCGGHLKPDVVFFGDTVNPDKVDFVHKRVKEADSLLVVGSSLQVYSGYRFILTAWEKKLPIAILNIGPTRSDDLACLKLNSRCGELLPLIDPC (SEQ ID NO4)＞sp|Q9NXA8|SIR5_人NAD-依赖性的脱乙酰基酶sirtuin 5(EC3.5.1.-)(SIR2-样蛋白5)-智人(Homo sapiens)(人)。
MRPLQIVPSRLISQLYCGLKPPASTRNQICLKMARPSSSMADFRKFFAKAKHIVIISGAGVSAESGVPTFRGAGGYWRKWQAQDLATPLAFAHNPSRVWEFYHYRREVMGSKEPNAGHRAIAECETRLGKQGRRVVVITQNIDELHRKAGTKNLLEIHGSLFKTRCTSCGVVAENYKSPICPALSGKGAPEPGTQDASIPVEKLPRCEEAGCGGLLRPHVVWFGENLDPAILEEVDRELAHCDLCLVVGTSSVVYPAAMFAPQVAARGVPVAEFNTETTPATNRFRFHFQGPCGTTLPEALACHENETVS (SEQ ID NO5)＞sp|Q8N6T7|SIR6_人NAD-依赖性的脱乙酰基酶sirtuin 6(EC3.5.1.-)(SIR2-样蛋白6)-智人(Homo sapiens)(人)。
MSVNYAAGLSPYADKGKCGLPEIFDPPEELERKVWELARLVWQSSSVVFHTGAGISTASGTPDFRGPHGVWTMEERGLAPKFDTTFESARPTQTHMALVQLERVGLLRFLVSQNVDGLHVRSGFPRDKLAELHGNMFVEECAKCKTQYVRDTVVGTMGLKATGRLCTVAKARGLRACRGELRDTILDWEDSLPDRDLALADEASRNADLSITLGTSLQIRPSGNLPLATKRRGGRLVIVNLQPTKHDRHADLRIHGYVDEVMTRLMKHLGLEIPAWDGPRVLERALPPLPRPPTPKLEPKEESPTRINGSIPAGPKQEPCAQHNGSEPASPKRERPTSPAPHRPPKRVKAKAVPS (SEQ IDNO6)＞sp|Q9NRC8|SIR7_人NAD-依赖性的脱乙酰基酶sirtuin 7(EC3.5.1.-)(SIR2-样蛋白7)-智人(Homo sapiens)(人)。
MAAGGLSRSERKAAERVRRLREEQQRERLRQVSRILRKAAAERSAEEGRLLAESADLVTELQGRSRRREGLKRRQEEVCDDPEELRGKVRELASAVRNAKYLVVYTGAGISTAASIPDYRGPNGVWTLLQKGRSVSAADLSEAEPTLTHMSITRLHEQKLVQHVVSQNCDGLHLRSGLPRTAISELHGNMYIEVCTSCVPNREYVRVFDVTERTALHRHQTGRTCHKCGTQLRDTIVHFGERGTLGQPLNWEAATEAASRADTILCLGSSLKVLKKYPRLWCMTKPPSRRPKLYIVNLQWTPKDDWAALKLHGKCDDVMRLLMAELGLEIPAYSRWQDPIFSLATPLRAGEEGSHSRKSLCRSREEAPPGDRGAPLSSAPILGGWFGRGCTKRTKRKKVT (SEQ ID NO7)对于本文所述的天然的或人工的底物，示例性的本文所述的化合物可以将SIRT1或其功能结构域的活性抑制至少10，20，25，30，50，80，或90％。例如，化合物可以具有小于500，200，100，或50nM的Ki。
本文所述的化合物也可以调节sirtuin和转录因子之间形成的复合物，例如，增加或减少复合物形成，破坏，和/或稳定性。示例性sirtuin-TF复合物包括Sir2-PCAF，SIR2-MyoD，Sir2-PCAF-MyoD，Sir2-p53，Sir2-FoxO1，和Sir2-FoxO3。本文所述的化合物也可以调节受Sir2调节的基因的表达，例如，在Fulco et al.(2003)Mol.Cell1251-62的表1中所述的基因。
体外测定在有些实施方案中，可以在体外测定与SIRT1的相互作用，例如，结合。反应混合物可以包括SIRT1辅因子例如NAD和/或NAD类似物。
在其它实施方案中，反应混合物可以包括SIRT1结合伴侣，例如，转录因子，例如，p53或p53以外的转录因子，例如FoxO1或FoxO3，且可以筛选化合物，例如，在体外测定中，以评价实验化合物的调节SIRT1和SIRT1结合伴侣(例如，转录因子)之间的相互作用的能力。例如，通过使组分之一偶联放射性同位素或酶标记，使得可以通过检测复合物中的标记化合物来确定标记的组分向另一组分的结合，可以完成这类测定。组分可以直接或间接地标有125I，35S，14C，或3H，且通过直接计数放射性发射或闪烁计数法，检测放射性同位素。或者，组分可以用例如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，或萤光素酶进行酶标记，且通过确定适当的底物向产物的转化，检测酶标记。也可以使用竞争测定来评价实验化合物和靶物之间的物理相互作用。
无细胞的测定包含，在足以允许2种组分相互作用和结合的条件下和时间内，制备靶蛋白(例如，SIRT1)和实验化合物的反应混合物，从而形成可以去除和/或检测的复合物。
也可以检测2种分子之间的相互作用，例如，使用荧光测定，其中至少一种分子被荧光标记。这样的测定的一个实例包括荧光能量转移(FET，或荧光共振能量转移即FRET)(参见，例如，Lakowicz et al.，美国专利No.5,631,169；Stavrianopoulos，et al.，美国专利No.4,868,103)。选择第一种‘供体’分子上的荧光团标记，使得它发射的荧光能量会被第二种‘受体’分子上的荧光标记吸收，后者由于吸收的能量，又能发荧光。或者，‘供体’蛋白分子可以简单地利用色氨酸残基的天然荧光能。选择能发射不同波长光的标记，使得‘受体’分子标记可以与‘供体’的标记区分开。由于标记之间的能量转移的效率与分子之间的距离有关，可以评估分子之间的空间关系。在结合发生在分子之间的情况下，测定中的‘受体’分子标记的荧光发射应当是最大的。通过本领域熟知的标准的荧光检测方法(例如，使用荧光计)，可以方便地测量FET结合事件。
荧光测定的另一个实例是荧光极化(FP)。对于FP，只需要标记一种组分。通过标记的组分的分子大小的变化，检测结合相互作用。大小变化会改变该组分在溶液中的翻转速率，并检测为FP的变化。参见，例如，Nasir et al.(1999)Comb Chem HTS 2177-190；Jameson etal.(1995)Methods Enzymol 246283；Seethala et al..(1998)AnalBiochem.255257。可以在多孔平板中监测荧光极化，例如，使用Tecan PolarionTM读数器。参见，例如，Parker et al.(2000)Journal of Biomolecular Screening 577-88；和Shoeman，etal..(1999)38，16802-16809。
在另一个实施方案中，使用实时生物分子相互作用分析(BIA)(参见，例如，Sjolander，S.和Urbaniczky，C.(1991)Anal.Chem.632338-2345和Szabo et al.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5699-705)，可以测定SIRT1蛋白结合靶分子的能力。″表面等离子共振″或“BIA”实时检测生物特异性的相互作用，无需标记任何相互作用物(例如，BIAcore)。结合表面处的质量变化(指示着结合事件)会导致表面附近的光折射率的变化(表面等离子共振(SPR)的光学现象)，产生可检测的信号，其可以用作生物分子之间的实时反应的指示。
在一个实施方案中，将SIRT1锚定在固相上。可以在反应(例如，结合反应)结束时检测锚定在固相上的SIRT1/实验化合物复合物。例如，可以将SIRT1锚定在固体表面上，且可以用本文所讨论的可检测的标记，直接或间接地标记实验化合物(其未被锚定)。
可能需要固定化SIRT1或抗-SIRT1抗体，以促进复合形式的与未复合形式的蛋白之一或两者分离，以及适应测定的自动化。可以在适合容纳反应物的任何容器中，在有和没有候选化合物存在下，完成实验化合物向SIRT1蛋白的结合，或SIRT1蛋白与第二种组分的相互作用。这样的容器的实例包括微量滴定板，试管，和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供融合蛋白，其添加允许蛋白之一或两者向基质结合的结构域。例如，可以将谷胱甘肽-S-转移酶/SIRT1融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠子(SigmaChemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，其然后与实验化合物或实验化合物和未吸附的靶蛋白或SIRT1蛋白合并，并在有助于复合物形成的条件下(例如，在盐和pH的生理条件下)温育混合物。温育后，洗涤珠子或微量滴定板孔，以去除任何未结合的组分，在珠子的情况下基质固定化，直接或间接测定复合物，例如，如上所述。或者，复合物可以从基质解离，并使用标准的技术，测定SIRT1结合或活性的水平。
将SIRT1蛋白或靶分子固定化到基质上的其它技术包括，使用生物素和链霉抗生物素的缀合。使用本领域已知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，可以从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化的SIRT1蛋白或靶分子，并固定化在链霉抗生物素-包被的96孔平板(Pierce Chemical)的孔中。
为了进行测定，将未固定化的组分加到含有锚定的组分的包被的表面。反应完成后，在能使形成的任何复合物保持固定化在固体表面上的条件下，去除未反应的组分(例如，通过洗涤)。可以以许多方式，检测锚定在固体表面上的复合物。在预先标记先前未固定化的组分的情况下，检测到固定化在表面上的标记，指示着复合物的形成。在没有预先标记先前未固定化的组分的情况下，可以使用间接标记来检测锚定在表面上的复合物，例如，使用对固定化的组分特异性的标记的抗体(该抗体又可以被直接地或间接地用例如标记的抗-Ig抗体来标记)。
在一个实施方案中，使用会与SIRT1蛋白或靶分子反应、但是不会妨碍SIRT1蛋白向它的靶分子结合的抗体，进行该测定。可以将这样的抗体衍生到平板的孔中，并通过抗体缀合，将未结合的靶物或SIRT1蛋白捕获到孔中。除了上面关于GST-固定化的复合物所述的那些方法以外，检测这样的复合物的方法还包括，使用可与SIRT1蛋白或靶分子反应的抗体进行复合物的免疫检测，以及依赖于检测与SIRT1蛋白或靶分子有关的酶活性的酶联测定。
或者，可以在液相中进行无细胞的测定。在这样的测定中，通过许多标准技术中的任一种，将反应产物与未反应的组分分离，所述技术包括但不限于差速离心(参见，例如，Rivas，G.，和Minton，A.P.，(1993)Trends Biochem Sci 18284-7)；色谱(凝胶过滤色谱，离子交换色谱)；电泳(参见，例如，Ausubel，F.et al.，eds.CurrentProtocols in Molecular Biology 1999，J.WileyNew York.)；和免疫沉淀(参见，例如，Ausubel，F.et al.，eds.(1999)CurrentProtocols in Molecular Biology，J.WileyNew York)。这样的树脂和色谱技术是本领域的技术人员已知的(参见，例如，Heegaard，N.H.，(1998)J Mol Recognit 11141-8；Hage，D.S.，和Tweed，S.A.(1997)J Chromatogr B Biomed Sci Appl.699499-525)。另外，如本文所述，也可以方便地使用荧光能量转移来检测结合，无需从溶液进一步纯化复合物。
在一个优选的实施方案中，测定包括，使SIRT1蛋白或其生物活性部分接触会结合SIRT1的已知化合物，形成测定混合物，使测定混合物接触实验化合物，并确定实验化合物与SIRT1蛋白相互作用的能力，其中确定实验化合物与SIRT1蛋白相互作用的能力包括确定实验化合物与已知化合物相比优先结合SIRT1或其生物活性部分、或调节靶分子的活性的能力。
示例性测定方法包括1536孔格式的SirT1酶测定，它是基于Biomol的商业的“Fluor-de-Lys”测定原理，它是产生荧光的(www.biomol.com/store/Product_data_PDFs/ak500.pdf)。在该测定中，将赖氨酰残基的e-氨基官能团的脱乙酰作用与产生荧光的“显色”步骤相偶联，后者依赖于未封闭的e-氨基官能团，并产生发荧光的氨基甲基香豆素。可以在商业的肉眼检查读数器上读出荧光。
其它测定使用下述疾病或病症的模型系统之一，或本文所述疾病或病症的其它已知模型，也可以评价本文所述的化合物或化合物的文库。
用于评价实验化合物对肌肉萎缩的作用的模型包括，例如，1)去神经导致的大鼠腓肠肌内侧头质量损失，例如，通过在大腿中部割断右坐骨神经；2)固定化导致的大鼠腓肠肌内侧头质量损失，例如，通过以90度弯曲固定右踝关节；3)后肢悬挂导致的大鼠腓肠肌内侧头质量损失；(参见，例如，U.S.2003-0129686)；4)用恶病质的细胞因子白介素-1(IL-1)处理导致的骨骼肌萎缩(R.N.Cooney，S.R.Kimball，T.C.Vary，Shock 7，1-16(1997))；和5)用糖皮质激素地塞米松处理导致的骨骼肌萎缩(A.L.Goldberg，J Biol Chem 244，3223-9(1969))。模型1，2，和3包括通过改变神经活性和/或肌肉经历的外部负荷至不同的程度而诱导产生肌肉萎缩。模型4和5诱导萎缩而不直接影响这些参数MS(实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE))，例如，如Goverman et al.，Cell.72551-60(1993)所述，和如Brok etal.，Immunol.Rev.，183173-85(2001)所综述的灵长类动物模型。
AMD(年龄相关的黄斑变性)的示例性动物模型包括模拟渗出性(湿)黄斑变性的激光诱导的小鼠模型Bora et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1002679-84(2003)；转基因小鼠，其表达突变形式的组织蛋白酶D，导致与″地区性萎缩″形式的AMD有关的特征(Rakoczyet al.，Am.J.Pathol.，1611515-24(2002))；和转基因小鼠，其在视网膜色素上皮中过量表达VEGF，导致CNV。Schwesinger et al.，Am.J.Pathol.1581161-72(2001)。
帕金森氏病的示例性动物模型包括，通过用多巴胺能的神经毒素1-甲基-4苯基1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)处理产生帕金森氏病的灵长类动物(参见，例如，美国申请20030055231和Wichmann et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，991199-213(2003)；6-羟基多巴胺-损伤的大鼠(例如，Lab.Anim.Sci.，49363-71(1999))；和转基因的无脊椎动物模型(例如，Lakso et al.，J.Neurochem.，86165-72(2003)和Link，Mech.Ageing Dev.，1221639-49(2001))。
II型糖尿病的示例性分子模型包括具有缺陷型Nkx-2.2或Nkx-6.1的转基因小鼠；(US 6,127,598)；Zucker糖尿病肥胖fa/fa(ZDF)大鼠(US 6569832)；和猕猴，其自发地形成肥胖症，且经常随后进展成明显的II型糖尿病(Hotta et al.，Diabetes，501126-33(2001)；和转基因小鼠，其具有显性负相的IGF-I受体(KR-IGF-IR)，具有II型糖尿病-样胰岛素抵抗。
神经病的示例性动物和细胞模型包括长春新碱诱导的小鼠(美国申请5420112)或兔子(Ogawa et al.，Neurotoxicology，21501-11(2000))的感觉-运动神经病；用于研究自主神经病的链唑霉素(STZ)-糖尿病大鼠(Schmidt et al.，Am.J.Pathol.，16321-8(2003))；和进行性运动神经病(pmn)小鼠(Martin et al.，Genomics，759-16(2001))。
结构-活性关系和基于结构的设计。还可能使用结构-活性关系(SAR)和基于结构的设计原理来生成与sirtuin相互作用(例如，拮抗或激动sirtuin)的化合物。SAR会提供关于相关化合物在至少一个相关测定中的活性的信息。建立目标化合物的结构特征和活性之间的关联。例如，可能通过评价与本文所述化合物有关的化合物家族的SAR，以鉴别激动剂活性所需的一个或多个结构特征。然后，可以化学地生产改变这些特征的化合物文库。在另一个实施例中，生产预测会相互作用的单一化合物，并体外或体内地评价。
基于结构的设计可以包括，确定sirtuin的功能结构域和化合物的物理相互作用的结构模型。结构模型可以指示如何改造化合物，例如，以改善相互作用或减少不利的相互作用。可以鉴别化合物与sirtuin的相互作用，例如，通过晶体结构的解析，NMR，或基于计算机的建模，例如，对接方法。参见，例如，Ewing et al.J Comput AidedMol Des.2001 May；15(5)411-28.
SAR和基于结构的设计方案，以及其它方法，都可以用于鉴别药效团。将药效团定义为化学基团的独特的三维(3D)排列。这样的基团的选择，可能有利于生物活性。由于药学活性的分子必须与对象体内的一种或多种分子结构相互作用以便有效，且分子的目标功能性质源自这些相互作用，每种活性化合物必须含有化学基团的独特排列，其能使该相互作用发生。通常称作描述中心的化学基团可以表示为(a)原子或原子组；(b)伪-原子，例如环的中心，或分子的质心；(c)向量，例如原子对，孤电子对方向，或平面的垂直线。一旦阐述，药效团可以用于搜索化学化合物的数据库，例如，具有与药效团相容的结构的那些。参见，例如，U.S.6,343,257；Y.C.Martin，3D DatabaseSearching in Drug Design，J.Med.Chem.35，2145(1992)；和A.C.Good和J.S.Mason，Three Dimensional Database Searches，Reviews in Comp.Chem.7，67(1996)。数据库搜索查询不仅基于化学性质信息，还基于准确的几何信息。
基于计算机的方案可以使用数据库搜索来发现匹配模板；Y.C.Martin，Database searching in drug design，J.MedicinalChemistry，vol.35，pp 2145-54(1992)，其在这里引作参考。现有的搜索化合物的2-D和3-D数据库的方法是适用的。AmericanCyanamid的Lederle(Pearl River，N.Y.)是分子形状-搜索，3D搜索和数据库的趋势-向量方面的先驱。商业卖主和其它研究组也提供搜索能力(MACSS-3D，Molecular Design Ltd.(San Leandro，Calif.)；CAVEAT，Lauri，G.et al.，University of California(Berkeley，Calif.)；CHEM-X，Chemical Design，Inc.(Mahwah，N.J.))。用于这些搜索的软件，可以用于分析通过它们的显著的化学和几何结构索引的潜在药物化合物的数据库(例如，Standard Drugs File(DerwentPublications Ltd.，London，England)，Bielstein数据库(Bielstein Information，Frankfurt，Germany or Chicago)，和Chemical Registry数据库(CAS，Columbus，Ohio))。
一旦鉴别出与药效团相匹配的化合物，可以体外、体内或计算机地测试它的活性，例如，向sirtuin或其结构域的结合。
在一个实施方案中，可以修饰作为激动剂或候选激动剂的化合物，例如，在Nature.2003 Sep 11；425(6954)191-196中所述的化合物，以鉴别拮抗剂，例如，使用本文所述的方法。例如，可以制备相关化合物的文库，并可以在本文所述的测定中，筛选文库。
本发明化合物的药学上可接受的盐包括源自药学上可接受的无机和有机酸和碱的那些。合适的酸盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、重硫酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡糖庚酸盐、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、棕榈酸盐、pectinate、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。其它酸，例如草酸，尽管它们本身不是药学上可接受的，也可以用于制备用作得到本发明化合物和它们的药学上可接受的酸加成盐的中间体的盐。源自合适碱的盐包括，碱金属(例如，钠)盐、碱土金属(例如，镁)盐、铵盐和N-(烷基)4+盐。本发明还预期了本文公开的化合物的任何碱性含氮基团的季铵化。通过这样的季铵化，可得到水或油-可溶的或可分散的产物。本文任一式的化合物的盐形式可以是羧基的氨基酸盐(例如L-精氨酸，-赖氨酸，-组氨酸盐)。
本文所述式的化合物可例如通过注射、静脉内、动脉内、真皮下、腹膜内、肌内、或皮下给药；或口服、口含、经鼻、透粘膜、局部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药，剂量为约0.5至约100mg/kg体重，或者剂量为1mg至1000mg/剂，每4至120小时，或按照特定化合物的要求。本文所述方法预期了施用有效量的化合物或化合物的组合物，以得到所需或指明的作用。典型地，本发明的药物组合物每天约1至约6次给药。或者，作为连续输注。这样的给药可用作慢性或急性治疗。可与载体物质组合生产单一剂型的活性成分的量，根据所治疗的宿主和特定的给药模式而变化。典型的制剂含有约5％至约95％活性化合物(w/w)。或者，这样的制剂含有约20％至约80％活性化合物。
可能需要比上面列举那些更低或更高的剂量。任何特定患者的具体剂量和治疗方案取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、给药时间、排泄速率、药物组合、疾病、状况或症状的严重程度和病程、患者对疾病、状况或症状的处置、和治疗医师的判断。
患者的情况改善后，如果需要，可施用维持剂量的本发明的化合物、组合物或组合。随后，当症状已经减轻到希望的水平时，随症状而异，可减少给药的剂量或频率或两者，达到保持改善的情况的水平。然而，在疾病症状的任何反复时，患者可能需要在长期基础上间歇治疗。
本文所述组合物包含本文所述式的化合物以及其它治疗剂(如果存在)，其量能有效地实现对疾病或疾病症状的调节，包括本文所述的那些。
术语“药学上可接受的载体或辅剂”指可与本发明化合物一起施用给患者的载体或辅剂，且当以足以递送治疗量的化合物的剂量给药时，不会破坏其药理学活性且无毒。
可用于本发明药物组合物中的药学上可接受的载体、辅剂和赋形剂包括，但不限于，离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，自乳化的药物递送系统(SEDDS)如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐，用于药物剂型中的表面活性剂如吐温或其它类似的聚合物递送基质，血清蛋白如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾，氯化钠，锌盐，胶态二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。环糊精如α-、β-和γ-环糊精，或化学修饰的衍生物如羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-β-环糊精，或其它可溶解的衍生物，也可有利地用于提高本文所述式的化合物的递送。
本发明的药物组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、口含、经阴道或通过植入的贮器给药，优选地通过口服给药或通过注射给药。本发明的药物组合物可以含有任何常规的无毒的药学上可接受的载体、辅剂和赋形剂。在有些情况下，可用药学上可接受的酸、碱或缓冲液调节制剂的pH，从而提高所配制化合物或其递送形式的稳定性。本文所用术语“胃肠外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病损内和颅内注射或输注技术。
药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，例如，无菌可注射水性或油质悬浮液。该悬浮液可按照本领域已知的技术，使用合适的分散剂或湿润剂(如，例如，吐温80)和悬浮剂配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如，在1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的赋形剂和溶剂有甘露糖醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油可常规地用作溶剂或混悬介质。为此目的，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物，适用于制备注射制剂，如同天然的药学上可接受的油，如橄榄油或蓖麻油，特别是以它们的聚氧乙基化的形式。这些油溶液或悬浮液还可包含长链醇稀释剂或分散剂、或羧甲基纤维素或常用于药学上可接受的剂型(如乳液和/或悬浮液)的配制中的类似分散剂。通常用于生产药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它常用的表面活性剂如吐温或司盘和/或其它相似的乳化剂或生物利用度增强剂，也可用于配制的目的。
本发明的药物组合物可以任何口服可接受的剂型口服给药，所述剂型包括，但不限于，胶囊剂、片剂、乳液和含水悬浮液、分散体和溶液。就口服使用的片剂而言，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，如硬脂酸镁。对于以胶囊剂形式口服给药来说，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服施用含水悬浮液和/或乳液时，可将活性成分混悬或溶于油相中，其可与乳化剂和/或混悬剂混合。如果需要，可加入某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。
本发明的药物组合物还可以以直肠给药的栓剂形式施用。通过将本发明化合物与合适的无刺激的赋形剂混合，可以制备这些组合物，所述赋形剂在室温是固体，但在直肠温度是液体，因此会在直肠中融化，从而释放活性组分。这类材料包括，但不限于，可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
当期望的治疗包含局部应用可容易地接近的区域或器官时，本发明的药物组合物的局部给药是有用的。就局部应用于皮肤而言，应当将药物组合物配制成含有混悬或溶解于载体中的活性组分的合适软膏剂。用于局部施用本发明的化合物的载体包括但不限于，矿物油，液体石油，白石油，丙二醇，聚氧乙烯聚氧丙烯化合物，乳化蜡和水。或者，可以将药物组合物配制成合适的洗剂或乳膏，其含有用合适的乳化剂混悬或溶解于载体中的活性化合物。合适的载体包括但不限于，矿物油，脱水山梨醇单硬脂酸酯，聚山梨醇酯60，十六烷基酯蜡，鲸蜡醇(cetearyl alcohol)，2-辛基十二烷醇，苄醇和水。通过直肠栓剂或合适的灌肠剂，也可以将本发明的药物组合物局部地应用于下肠道。局部透皮贴剂也包含在本发明中。
本发明的药物组合物可通过鼻气雾剂或吸入给药。这样的组合物可根据制药领域熟知的技术制备，且可在盐水中制备成溶液，其中使用苄醇或其它合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物、和/或本领域已知的其它增溶剂或分散剂。
使用可植入的装置，可以施用具有本文式的化合物和另外的试剂(例如，治疗剂)的组合物。可植入的装置和有关的技术是本领域已知的，在需要连续或定时释放地递送本文所述化合物或组合物时，可用作递送系统。另外，可植入装置递送系统可用于靶向化合物或组合物递送的特定位点(例如，局限的位点，器官)Negrin et al.，Biomaterials，22(6)563(2001)。在本发明中也可以使用包含替代性的递送方法的定时释放技术。例如，基于聚合物技术、持续释放技术和包封技术(例如，聚合物，脂质体)的定时释放制剂，也可以用于递送本文所述的化合物和组合物。
用于递送本文的活性化疗组合的贴剂，也在本发明范围内。贴剂包括材料层(例如，聚合物，布，纱布，绷带)和本文所述的本文式的化合物。材料层的一侧可以具有粘附到它上面的保护层，以阻止化合物或组合物的通过。贴剂可以另外包括粘合剂，以将贴剂保持在对象上。粘合剂是一种组合物，包括天然或合成来源的那些，当接触对象的皮肤时，其会暂时粘附到皮肤上。它可以是防水的。粘合剂可以位于贴剂上，以使它保持接触对象的皮肤较长的时间段。粘合剂可以由粘性或粘附强度构成，所以它会将装置保持在经受偶然接触的位置，但是，依赖于正面作用(例如，拉开，剥离，或其它故意的移动)，粘合剂屈从于施加于装置或粘合剂本身上的外部压力，并允许破坏粘附接触。粘合剂可以是压力敏感的，也就是说，允许通过将压力(例如，推，摩擦)施加于粘合剂或装置上，将粘合剂(和要粘附到皮肤上的装置)定位在皮肤上。
当本发明组合物包含本文所述式的化合物和一种或多种附加治疗剂或预防剂的组合时，化合物和附加试剂均应以单一疗法方案中通常施用剂量的约1-100％，且更优选约5-95％的剂量水平存在。附加试剂可以作为多次给药方案的一部分，与本发明化合物分开地给药。或者，那些试剂可以是单一剂型的一部分，与本发明化合物共同混合于单一组合物中。
肿瘤性疾病本发明的化合物可以用于治疗癌症。如本文所使用的，术语“癌症”、“过度增殖的”、“恶性的”和“肿瘤的”可互换地使用，指特征在于快速增殖或赘生物的那些细胞、异常状态或状况。该术语包括所有类型的癌性生长或致癌的过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理学类型或侵袭阶段。“病理性过度增殖的”细胞发生在特征在于恶性肿瘤生长的疾病状态中。
术语“瘤形成”的一般医学含义指“新细胞生长”，其作为丧失对正常生长控制的反应而产生，例如指赘生细胞生长。“增生”指经历异常高速度的生长的细胞。但是，如本文所使用的，术语“瘤形成”和“增生”可以互换地使用，如它们的上下文所揭示的，概括地指经历异常的细胞生长速度的细胞。瘤形成和增生包括“肿瘤”，其可以是良性的、恶化前的或恶性的。
癌性疾病的实例包括，但不限于，实体瘤、软组织肿瘤、和转移性病损。实体瘤的实例包括恶性肿瘤，例如各种器官系统的肉瘤、腺癌、和癌，如影响肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如，结肠)、和泌尿生殖道(例如，肾、泌尿道上皮细胞)、咽、前列腺、卵巢的那些以及腺癌，其包括恶性肿瘤，如大多数结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺的非小细胞癌、小肠癌等。也可使用本文所述的化合物治疗或预防前述癌症的转移性病变。
主题方法可以用于治疗各种器官系统的恶性肿瘤，如影响肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如结肠)和泌尿生殖道、前列腺、卵巢、咽的那些，以及腺癌，其包括恶性肿瘤如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、肺的非小细胞癌、小肠癌和食道癌。可治疗的示例性实体瘤包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非-小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
术语“癌”是本领域技术人员公认的，且指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。示例性癌包括由宫颈、肺、前列腺、乳腺、头和颈、结肠和卵巢的组织形成的那些。该术语还包括癌肉瘤，例如，其包括由癌性和肉瘤性组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”指来源于腺组织的癌或其中肿瘤细胞形成可识别的腺结构的癌。
术语“肉瘤”是本领域技术人员公认的，且指间充质衍生的恶性肿瘤。
主题方法也可以用于抑制造血来源(例如，源于髓系、淋巴系或红细胞系)的增生/赘生细胞或其前体细胞的增殖。例如，本发明预见到各种髓细胞性疾病的治疗，包括但不限于，急性前髓细胞白血病(APML)、急性髓细胞白血病(AML)和慢性髓细胞白血病(CML)(综述见Vaickus，L.(1991)Crit Rev.in Oncol./Hemotol.11267-97)。可通过主题方法治疗的淋巴样恶性肿瘤包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，其包括B-系ALL和T-系ALL；慢性淋巴细胞白血病(CLL)、前淋巴细胞白血病(PLL)、毛细胞白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(WM)。恶性淋巴瘤的其它形式包括，但不限于，非何杰金氏淋巴瘤及其变型、外周T-细胞淋巴瘤、成人T-细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)及何杰金氏病。
阿尔茨海默氏病阿尔茨海默氏病(AD)是一种复杂的神经变性病，其会导致神经元的不可逆的丧失，且是具有至少部分地由蛋白聚集造成的症状的神经变性疾病的一个实例。本文所述的化合物可以用于改善具有AD的对象的至少一种症状。
阿尔茨海默氏病的临床标志包括记忆、判断、对物理环境的定向和语言的进行性缺损。AD的神经病理学标志包括区域-特异性的神经元丧失、淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结。淀粉样蛋白斑是含有β淀粉样蛋白肽(也称作Aβ，或Aβ42)的细胞外斑块，所述肽是β-淀粉样蛋白前体蛋白(也称作APP)的切割产物。神经原纤维缠结是由异常地高度磷酸化的微管-相关蛋白tau的纤丝组成的不溶的细胞内聚集体。淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结可能有助于通过细胞凋亡导致神经元丧失的继发事件(Clark和Karlawish，Ann.Intern.Med.138(5)400-410(2003)。例如，β-淀粉样蛋白会诱导培养的神经元的半胱天冬酶-2-依赖性的细胞凋亡(Troy et al.J.Neurosci.20(4)1386-1392)。体内斑的沉积可能以类似的方式触发邻近的神经元的细胞凋亡。
编码APP、早老素-1和早老素-2的基因的突变，已经参与早发AD(Lendon et al.JAMA 227825(1997))。已经证实这些蛋白的突变会通过产生Aβ的细胞内途径，促进APP的蛋白酶解加工。Aβ加工的异常调节，可能对形成淀粉样蛋白斑和随后的与斑有关的神经元损伤是重要的。
可以使用多种标准来评价对象中的AD，包括遗传的、生物化学的、生理的和认知的标准。AD的症状和诊断是医学工作人员已知的。下面描述了AD的有些示例性的症状和标记。可以使用关于这些指征和已知与AD有关的其它指征的信息作为“AD-相关的参数”。AD-相关的参数可以包括定性的或定量的信息。定量信息的一个实例是一个或多个方面的数值，例如，蛋白的浓度或数字减影血管造影图。定性信息可以包括评定，例如，医生的评定或二元(“是”/“否”)等。AD-相关的参数包括指示对象未被确诊AD或不具有AD的特定指征的信息，例如，不是AD典型的认知测试结果，或与AD无关的遗传APOE多态性。
渐进性认知缺损是AD的标志。该缺损可以表现为记忆、判断、作出决定、对物理环境的定向和语言的衰退(Nussbaum和Ellis，New Eng.J.Med.348(14)1356-1364(2003))。其它形式的痴呆的排除，可以辅助诊断AD。
神经元死亡会导致AD患者的进行性脑萎缩。成像技术(例如，磁共振成像，或计算机x线体层摄影术)可以用于检测脑中AD-相关的损伤和/或脑萎缩。
AD患者可能表现出源自疾病的病理学的生化异常。例如，AD患者脑脊液中的tau蛋白水平升高(Andreasen，N.et al.Arch Neurol.58349-350(2001))。AD患者的CSF中的淀粉样蛋白β42(Aβ42)肽的水平可以降低(Galasko，D.，et al.Arch.Neurol.55937-945(1998))。AD患者的血浆中的Aβ42水平可以升高(Ertekein-Taner，N.，et al.Science 2902303-2304(2000))。检测来自对象的样品中的生化异常的技术包括，细胞方法、免疫学方法和本领域已知的其它生物学方法。一般指导参见，例如，下述文献中记载的技术Sambrook & Russell，Molecular CloningA LaboratoryManual，3rd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(2001)，Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(GreenePublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)，(Harlow，E.和Lane，D.(1988)AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY)，和它们的更新版本。
例如，可以使用抗体、其它免疫球蛋白和其它特异性的结合配体来检测生物分子，例如，与AD有关的蛋白或其它抗原。例如，可以使用一种或多种特异性的抗体来探测样品。多种格式是可行的，例如，ELISA，基于荧光的测定，蛋白印迹，和蛋白阵列。生产多肽阵列的方法，记载在文献中，例如，De Wildt et al.(2000).Nature Biotech.18，989-994；Lueking et al.(1999).Anal.Biochem.270，103-111；Ge，H.(2000).Nucleic Acids Res.28，e3，I-VII；MacBeath，G.，和Schreiber，S.L.(2000).Science 289，1760-1763；和WO99/51773A1。使用质谱、色谱、电泳、酶相互作用，或使用检测翻译后修饰(例如，磷酸化，遍在蛋白化，糖基化，甲基化，或乙酰化)的探针，也可以分析蛋白。
可以检测来自对象的细胞中的核酸表达，例如，通过手术、提取、死后或其它取样(例如，血液，CSF)得到。可以评价一个或多个基因的表达，例如，通过基于杂交的技术，例如，RNA分析，RT-PCR，SAGE，和核酸阵列。核酸阵列可用于描绘样品中的多个mRNA种类。核酸阵列可以通过多种方法产生，例如，通过光刻方法(参见，例如，美国专利号5,143,854；5,510,270；和5,527,681)，机械方法(例如，如美国专利号5,384,261所述的定向流方法)，基于针的方法(例如，如美国专利号5,288,514所述)，和基于珠子的技术(例如，如PCTUS/93/04145所述)。
通过多种方式，包括酶联测定，使用标记的前体，和核磁共振(NMR)，可以检测与AD有关的代谢产物。例如，NMR可以用于确定样品中基于磷酸盐的化合物的相对浓度，例如，肌酸水平。也可以检测其它代谢参数，例如氧化还原状态，离子浓度(例如，Ca2+)(例如，使用离子敏感的染料)，和膜电势(例如，使用膜片箝技术)。
关于AD-相关的标记的信息可以记录和/或储存在计算机可读格式中。典型地，将信息与关于对象的参照相联系，且也与关于在对象中编码sirtuin的基因中的一个或多个核苷酸的同一性的信息相关联(直接地或间接地)。
在一个实施方案中，使用AD的非-人动物模型(例如，小鼠模型)，例如，评价例如本文所述化合物或化合物的治疗方案。例如，US 6,509,515描述了一种这样的模型动物，其天然地能用于学习和记忆测试。该动物在脑组织中以一定的水平表达淀粉样蛋白前体蛋白(APP)序列，使得动物在出生后较短的时间段内发生进行性神经学疾病，通常在出生后一年内，优选地在出生后2至6个月内。将APP蛋白序列导入动物，或处于胚胎期的动物前身，优选地在单细胞或受精的卵母细胞阶段，通常不迟于约8-细胞阶段。合子或胚胎然后在伪怀孕的养育雌性中发育至足月。将淀粉样蛋白前体蛋白基因导入动物胚胎，以便染色体整合成一种状态，其导致淀粉样蛋白前体蛋白的超内源表达和进行性神经学疾病在脑皮质边缘区域发生，该脑区域在进行性神经学疾病状态(例如AD)中受到显著影响。受影响的转基因动物中的神经胶质瘤病和临床表现模拟神经学疾病。神经学疾病的进展方面的特征在于，减少的探测和/或运动行为和减少的2-脱氧葡萄糖摄入/利用和脑皮质边缘区域的肥大性神经胶质瘤病。另外，观察到的变化类似于在有些衰老动物中观察到的变化。其它动物模型也记载在US5,387,742；5,877,399；6,358,752；和6,187,992。
帕金森氏病帕金森氏病包括黑质中的多巴胺能神经元的神经变性，其导致调节运动功能的黑质纹状体多巴胺系统的变性。该病理又导致运动功能障碍(参见，例如，Lotharius et al.，Nat.Rev.Neurosci.，3932-42(2002))。示例性的运动症状包括运动不能，弯腰体位，步履艰难，姿势不稳定，僵住，肌肉强直，和震颤。示例性非运动症状包括抑郁，缺少动力，被动，痴呆和胃肠功能紊乱(参见，例如，Fahn，Ann.N.Y.Acad.Sci.，9911-14(2003)和Pfeiffer，LancetNeurol.，2107-16(2003))。已经在0.5-1％的65至69岁的人和1-3％80岁和更老的人中，观察到帕金森氏病(参见，例如，Nussbaum etal.，N.Engl.J.Med.，3481356-64(2003))。
本文所述的化合物可以用于改善具有帕金森氏病的对象的至少一种症状。
帕金森氏病的分子标记包括芳族L-氨基酸脱羧酶(AADC)的减少(参见，例如，美国申请20020172664)；黑质纹状体神经元中多巴胺含量的减少(参见，例如，Fahn，Ann.N.Y.Acad.Sci.，9911-14(2003)和Lotharius et al.，Nat.Rev.Neurosci.，3932-42(2002))。在有些家族病例中，PD与编码α-synuclein和parkin(一种E3泛素连接酶)蛋白的单个基因中的突变有关(例如，Riess et al.，J.Neurol.250 Suppl 1I3-10(2003)和Nussbaum et al.，N.Engl.J.Med.，3481356-64(2003))。神经元-特异性的C-末端泛素水解酶基因中的错义突变也与帕金森氏病有关(例如，Nussbaum et al.，N.Engl.J.Med.，3481356-64(2003))。
可以在帕金森氏病的非-人动物模型中评价本文所述化合物或化合物的文库。帕金森氏病的示例性动物模型包括用多巴胺能的神经毒素1-甲基-4苯基1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)处理产生帕金森氏病的灵长类动物(参见，例如，美国申请20030055231和Wichmann et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，991199-213(2003)；6-羟基多巴胺-损伤的大鼠(例如，Lab.Anim.Sci.，49363-71(1999))；和转基因的无脊椎动物模型(例如，Lakso et al.，J.Neurochem.，86165-72(2003)和Link，Mech.Ageing Dev.，1221639-49(2001))。
评价多谷氨酰胺聚集许多种无细胞的测定、基于细胞的测定和生物体测定可以用于评价多谷氨酰胺聚集，例如，亨廷顿多谷氨酰胺聚集。有些实例记载在，例如，U.S.2003-0109476。
测定(例如，无细胞的，基于细胞的，或生物体的)可以包括报道蛋白，其包含具有至少35个多谷氨酰胺的多谷氨酰胺重复区。报道蛋白可以是容易检测的，例如，通过荧光。例如，蛋白缀合到荧光团上，例如，异硫氰酸荧光素(FITC)，别藻蓝蛋白(APC)，R-藻红蛋白(PE)，多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)，Texas Red，Cy3，Cy5，Cy7，或荧光共振能量串联荧光团例如PerCP-Cy5.5，PE-Cy5，PE-Cy5.5，PE-Cy7，PE-Texas Red，和APC-Cy7。在另一个实例中，蛋白是″内在荧光的″，即它具有完全由它的氨基酸序列编码的发色团，且可以在不需要辅因子或底物的情况下发荧光。例如，该蛋白可以包括绿色荧光蛋白(GFP)-样发色团。如本文所使用的，″GFP-样发色团″指内在荧光的蛋白部分，其包含具有一个中心α-螺旋的11-链β-桶，该中心α-螺旋具有缀合的π-共振系统，其包括2个芳族环系统和它们之间的桥。
可以从在天然存在的蛋白中发现的GFP-样发色团，选择GFP-样发色团，所述蛋白例如A.victoria GFP(GenBank登记号AAA27721)，Renilla reniformis GFP，FP583(GenBank登记号AF168419)(DsRed)，FP593(AF272711)，FP483(AF168420)，FP484(AF168424)，FP595(AF246709)，FP486(AF168421)，FP538(AF168423)，和FP506(AF168422)，且只需要包括天然蛋白中保留发色团的内荧光所需的那么多。确定荧光所需的最小结构域的方法，是本领域已知的。Li etal.，J.Biol.Chem.27228545-28549(1997)。
或者，可以从由天然发现的那些修饰的GFP-样发色团中，选择GFP-样发色团。典型地，进行这样的修饰，以提高在异源表达系统中的重组生产(有或没有蛋白序列的变化)，改变天然蛋白的激发和/或发射光谱，促进纯化，促进克隆或作为克隆的结果，或是研究调查的偶然结果。改造这样的修饰的GFP-样发色团和测试它们的荧光活性(单独地，和作为蛋白融合体的一部分)的方法，是本领域熟知的。许多种这样修饰的发色团现在可以商业上得到，且可以容易地用于本发明的融合蛋白中。例如，EGFP(″增强的GFP″)，Cormack et al.，Gene17333-38(1996)；美国专利号6,090,919和5,804,387，是GFP的红色偏移的人结肠-优化的变体，其已经被改造成更亮的荧光，在哺乳动物细胞中更高的表达，和为在流式细胞仪中使用而优化的激发光谱。EGFP可以有用地将GFP-样发色团贡献给融合蛋白，后者还包含多谷氨酰胺区域。许多种EGFP载体(质粒和病毒的)可商业上得到(ClontechLabs，Palo Alto，Calif.，USA)。其它改造的GFP蛋白是已知的。参见，例如，，Heim et al.，Curr.Biol.6178-182(1996)；Cormacket al.，Gene 17333-38(1996)，BFP2，EYFP(″增强的黄色荧光蛋白″)，EBFP，Ormo et al.，Science 2731392-1395(1996)，Heikal etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711996-12001(2000).ECFP(″增强的蓝绿色荧光蛋白″)(Clontech Labs，Palo Alto，Calif.，USA)。GFP-样发色团也可以从其它修饰的GFP得到，包括在美国专利号6,124,128；6,096,865；6,090,919；6,066,476；6,054,321；6,027,881；5,968,750；5,874,304；5,804,387；5,777,079；5,741,668；和5,625,048中所述的那些。
在一个实施方案中，包含具有至少35个多谷氨酰胺的多谷氨酰胺重复区的报道蛋白用于基于细胞的测定中。
在一个实例中，可以使用PC12神经元细胞系，其具有改造成表达由HD基因外显子1编码的蛋白的构建体，所述外显子1含有融合到增强的GFP(绿色荧光蛋白)基因上的交替的重复密码子。参见，例如，Boado et al.J.Pharmacol.And Experimental Therapeutics 295(1)239-243(2000)和Kazantsev et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611404-09(1999)。该基因的表达，会导致共同定位到蛋白聚集物部位的绿色荧光的出现。HD基因外显子1-GFP融合基因是在muristerone调节的诱导型启动子的控制下。一个具体的构建体具有约46个谷氨酰胺重复(由CAA或CAG编码)。其它构建体具有，例如，103个谷氨酰胺重复。PC12细胞生长在DMEM，5％马血清(热灭活的)，2.5％FBS和1％ Pen-Strep，且小量维持在Zeocin和G418上。以5×105细胞/ml培养基的密度，将细胞平板接种在包被有聚-L-赖氨酸盖玻片的24-孔平板中，无任何选择。过夜培养后，加入muristerone，以诱导HD基因外显子1-GFP的表达。可以使细胞接触实验化合物，例如，在平板接种之前或之后，和在诱导之前或之后。可以在配备了Zeiss 510 LSM共焦显微镜和相干氪氩激光器和氦氖激光器的Zeiss倒置100MAxioskop上，获取数据。可以将样品装载到Lab-Tek II分室的用于提高成像的盖玻片系统中。在独立的实验(例如，至少3个或7个独立的实验)中，计数在物镜视野内的亨廷顿蛋白-GFP聚集的数目。
用于评价样品的其它示例性方式包括高流通量装置，例如Amersham Biosciences IN细胞分析系统和CellomicsTMArrayScanHCS系统，其允许静态地和动态地检测和定量荧光标记的部分的亚细胞定位和浓度。也参见，美国专利号5,989,835。
其它示例性哺乳动物细胞系包括CHO细胞系和293细胞系。例如，具有整合拷贝的HD基因外显子1(其具有大约103Q重复，后者与GFP相融合，成为编码HD基因外显子1 Q103-GFP的融合构建体)的CHO细胞，会在核膜处产生可见的GFP聚集，其可通过显微镜检测到，而具有整合拷贝的融合构建体(其在CHO细胞中编码HD基因外显子1 Q24-GFP)的CHO细胞不会在核膜处产生可见的GFP聚集。在另一个实例中，使用具有整合拷贝的HD基因外显子1(其含有84 CAG重复)的293细胞。
可得到亨廷顿氏舞蹈病的许多动物模型系统。参见，例如，Brouillet，Functional Neurology 15(4)239-251(2000)；Ona etal.Nature 399263-267(1999)，Bates et al.Hum Mol Genet.6(10)1633-7(1997)；Hansson et al.J.of Neurochemistry 78694-703；和Rubinsztein，D.C.，Trends in Genetics，Vol.18，No.4，pp.202-209(对HD的多种动物和非-人模型的综述)。
在一个实施方案中，动物是转基因小鼠，其可以表达(在至少一个细胞中)人亨廷顿蛋白、其一部分、或包含人亨廷顿蛋白或其一部分的融合蛋白，它们具有例如至少36个谷氨酰胺(例如，由编码多谷氨酰胺段的外显子1的CAG重复区段中的CAG重复编码(或者，任意数目的CAG重复可以是CAA))。
这样的转基因小鼠品系的一个实例是R6/2系(Mangiarini et al.Cell 87493-506(1996))。R6/2小鼠是转基因的亨廷顿氏舞蹈病小鼠，其过表达人HD基因的外显子1(在内源启动子的控制下)。R6/2人HD基因的外显子1具有伸长的CAG/多谷氨酰胺重复长度(平均150个CAG重复)。这些小鼠会形成进行性、最终致命的神经学疾病，其具有人亨廷顿氏舞蹈病的许多特征。在R6/2小鼠中，在细胞质和细胞核中，都观察到了异常的聚集物，其部分地由亨廷顿蛋白的N-末端部分(由HD外显子1编码)构成(Davies et al.Cell 90537-548(1997))。例如，在该转基因动物中的人亨廷顿蛋白是由包含至少55个CAG重复、更优选地约150个CAG重复的基因编码。
这些转基因动物可以形成亨廷顿氏舞蹈病-样的表型。这些转基因小鼠的特征在于减少的体重增加，缩短的寿命和运动损伤，所述运动损伤的特征在于异常步态、静止性震颤、后肢蜷缩和出生后8至10周的活动过度(例如R6/2品系；见Mangiarini et al.Cell 87493-506(1996))。表型逐渐向运动功能减退恶化。这些转基因小鼠的脑也表现出神经化学的和组织学的异常，例如神经递质受体(谷氨酸，多巴胺能的)的变化，降低浓度的N-乙酰基天冬氨酸(神经元完整性的一种标记)和减小的纹状体和脑大小。因此，评价可以包括评定与神经递质水平、神经递质受体水平、脑大小和纹状体大小有关的参数。另外，含有全长人亨廷顿蛋白或其转基因部分的异常聚集物存在于这些动物的脑组织中(例如，R6/2转基因小鼠品系)。参见，例如，Mangiarini et al.Cell 87493-506(1996)，Davies et al.Cell90537-548(1997)，Brouillet，Functional Neurology 15(4)239-251(2000)和Cha et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 956480-6485(1998)。
为了测试实验化合物(例如，本文所述的化合物或存在于本文所述的文库中的化合物)在动物模型中的作用，将不同浓度的实验化合物施用给转基因动物，例如通过将实验化合物注射进动物的循环中。在一个实施方案中，评价动物中的亨廷顿氏舞蹈病-样症状。然后监测例如亨廷顿氏舞蹈病-样症状的进展，例如如上面关于小鼠模型所述，以确定实验化合物的治疗是否会导致症状的减轻或延迟。在另一个实施方案中，监测这些动物中亨廷顿蛋白聚集物的解聚。然后可以处死动物，并得到脑切片。然后分析脑切片中是否存在含有转基因人亨廷顿蛋白、其一部分或包含人亨廷顿蛋白或其一部分的融合蛋白的聚集物。该分析可以包括，例如，用抗-亨廷顿蛋白抗体对脑组织切片染色，添加识别抗-亨廷顿蛋白抗体的与FITC缀合的二抗(例如，抗-亨廷顿蛋白抗体是小鼠抗-人抗体，二抗是对人抗体特异性的)，并通过荧光显微镜观察蛋白聚集物。或者，抗-亨廷顿蛋白抗体可以直接缀合FITC。然后通过荧光显微镜观察亨廷顿蛋白聚集物的水平。
也可以得到亨廷顿氏舞蹈病的黑腹果蝇模型系统。参见，例如，Steffan et al.，Nature，413739-743(2001)和Marsh et al.，HumanMolecular Genetics 913-25(2000)。例如，可以将转基因的果蝇改造成表达人亨廷顿蛋白、其一部分(例如外显子1)、或包含人亨廷顿蛋白或其一部分的融合蛋白，融合蛋白中具有例如包含至少36个谷氨酰胺的多谷氨酰胺区(例如，由CAG重复(优选地51个重复或更多个)编码(或者，任意数目的CAG重复可以是CAA))。多谷氨酰胺区可以由编码poly Q段的外显子1的CAG重复区段编码。也可以将这些转基因果蝇改造成在神经元中(例如，在果蝇眼中)表达人亨廷顿蛋白、其一部分(例如外显子1)、或包含人亨廷顿蛋白或其一部分的融合蛋白。
可以将实验化合物(例如，不同浓度的实验化合物)或本文所述的化合物施用给转基因果蝇，例如，通过将包含化合物的药物组合物施用入动物或饲喂化合物作为食物的一部分。化合物的施用可以发生在果蝇生命周期的不同阶段。可以监测动物，以确定化合物的治疗是否会导致亨廷顿氏舞蹈病-样症状的减少或延迟，亨廷顿蛋白聚集物的解聚，或降低的致死率，和/或监测光受体神经元的变性。
在果蝇复眼中，会容易地观察到由于人亨廷顿蛋白、其一部分(例如外显子1)、或包含人亨廷顿蛋白或其一部分的融合蛋白的表达引起的神经变性，所述复眼由每个果蝇小眼的光受体神经元生成的7个可见感杆(亚细胞的集光结构)的规则梯形排列组成。人亨廷顿蛋白、其一部分(例如外显子1)、或包含人亨廷顿蛋白或其一部分的融合蛋白的表达，会导致感杆的进行性丧失。因而，可以评价施用实验化合物的动物的神经元变性。
Morely et al.(2002)Proc.Nat.Acad.USA Vol.9910417描述了用于评价亨廷顿氏舞蹈病相关的蛋白聚集的美丽线虫系统。
评价亨廷顿氏舞蹈病本文所述的化合物可以用于改善对象的亨廷顿氏舞蹈病的至少一种症状。
可得到评价和/或监测亨廷顿氏舞蹈病的许多种方法。已知该疾病的许多种临床症状和指征。亨廷顿氏舞蹈病会造成运动障碍，精神病学困难和认知变化。这些症状的程度、发作年龄和表现可以变化。运动障碍可以包括快速的、胡乱的、舞蹈-样运动，称作舞蹈病。
评价亨廷顿氏舞蹈病的一种方法使用统一的亨廷顿氏舞蹈病评定量表(UNDRS)。也可以单独地或组合地使用单个的测试，以评价是否改善了亨廷顿氏舞蹈病的至少一种症状。UNDRS记载在MovementDisorders(vol.11136-142，1996)和Marder et al.Neurology(54452-458，2000)。UNDRS会定量亨廷顿氏舞蹈病的严重性。它分成多个子部分运动，认知，行为，功能。在一个实施方案中，使用单个的子部分来评价对象。通过将每个部分的不同问题求和，可以计算这些分数。有些部分(例如舞蹈病和肌张力障碍)可以包括将每个肢体、面部、颊-口腔-舌、和躯干分开地评级。
示例性的运动评价包括眼睛跟踪，眼急动引发，眼急动速度，发音困难，舌伸出，指轻打能力，俯卧/仰卧，拳-手-掌顺序，手臂僵硬，运动徐缓，最大张力障碍(躯干，上肢和下肢)，最大舞蹈病(例如，躯干，面部，上肢和下肢)，步态，前后行走，和后退步态。一种示例性治疗可以造成总运动评分4(TMS-4)的变化，这是UHDRS的子量表，例如经一年。
糖尿病本发明提供了治疗和预防糖尿病的方法。糖尿病的实例包括胰岛素依赖型糖尿病和非-胰岛素依赖型糖尿病。例如该方法包括，给患有糖尿病或处于糖尿病危险中的患者施用本文所述的化合物。在有些实例中，通过具有葡萄糖耐量降低(IGT)或空腹高血糖症，可以将患者鉴别为处于发生糖尿病的危险中。
例如，可以将本文所述的化合物以治疗有效量施用给对象，以降低葡萄糖异生，改善血糖控制(即更低的空腹血糖)，或使胰岛素敏感性正常化。可以将化合物施用给患有糖尿病或肥胖症的对象。
胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病)是一种自身免疫病，其中胰岛炎导致胰脏J-细胞的破坏。在I型糖尿病的临床发作时，大量生产胰岛素的b细胞被破坏，仅15％至40％还能生产胰岛素(McCulloch etal.(1991)Diabetes 40673-679)。b-细胞故障导致终生依赖于每天的胰岛素注射和向该疾病的急性和晚期并发症的暴露。
II型糖尿病是葡萄糖内环境稳定受损的代谢病，其特征在于高血糖症或高血糖，作为有缺陷的胰岛素作用(其表现为胰岛素抵抗，有缺陷的胰岛素分泌，或二者)的结果。II型糖尿病患者具有与胰岛素抵抗和/或受损的胰岛素分泌有关的异常的碳水化合物、脂质和蛋白代谢。该疾病会导致胰脏β细胞破坏，最终导致绝对的胰岛素缺乏。没有胰岛素，血液中保持高葡萄糖水平。高血糖的长期作用包括失明、肾衰竭、和向这些区域的较差血液循环，这可以导致脚和踝截肢。在预防患者达到该严重性方面，早期检测是关键的。大多数糖尿病患者具有非-胰岛素依赖形式的糖尿病，现在称作II型糖尿病。
本发明也包括治疗与糖尿病有关或源自糖尿病的病症的方法，所述病症例如终末器官损伤，糖尿病性胃轻瘫，糖尿病性神经病，心律失常等。
II型糖尿病的示例性分子模型包括具有缺陷型Nkx-2.2或Nkx-6.1的转基因小鼠(US 6,127,598)；Zucker糖尿病肥胖fa/fa(ZDF)大鼠(US 6569832)；和猕猴，其自发地形成肥胖症，且随后经常发展成明显的II型糖尿病(Hotta et al.，Diabetes，501126-33(2001)；和转基因小鼠，其具有显性负相的IGF-I受体(KR-IGF-IR)，且具有II型糖尿病-样胰岛素抵抗。
代谢综合征本发明提供了一种治疗代谢综合征的方法，包括给对象施用有效量的本文所述化合物。
代谢综合征(例如，X综合征)的特征在于一个人中的一组代谢危险因素。它们包括向心性肥胖(在腹部和腹部周围过多的脂肪组织)、致动脉粥样化的血脂障碍(血脂障碍-主要是高甘油三酯和低HDL胆固醇-它们促进动脉壁中的斑块集结)；胰岛素抵抗或葡萄糖耐受不良(肌体不能适当地利用胰岛素或血糖)；促血栓形成状态(例如，血液中的高血纤维蛋白原或纤溶酶原激活物抑制剂[-1])；血压升高(即，高血压)(130/85mmHg或更高)；和促炎状态(例如，血液中高敏感性C-反应蛋白升高)。
该综合征的潜在原因是超重/肥胖、身体不活动和遗传因素。患有代谢综合征的人患冠心病、与动脉壁中斑块集结有关的其它疾病(例如，中风和外周血管病)和2型糖尿病的危险增加。代谢综合征与被称作胰岛素抵抗的全身性代谢障碍密切相关，其中肌体不能有效地使用胰岛素。
脂肪细胞相关疾病本发明提供了增强脂肪形成的方法，包含向对象施用本文所述的化合物。例如，对象可以是体重过轻，具有减少的脂肪含量，或需要额外的脂肪细胞，无论是局部地(例如，在局部区域，例如面部皮肤)还是全身地。
化合物也可以用于调节脂肪细胞，例如，脂细胞，例如，脂肪细胞的分化。例如，可以以有效地预防脂肪以正常的或病理的状态积聚的量，施用本文所述的化合物。与脂肪细胞有关的疾病包括肥胖症。“肥胖症”指对象具有大于或等于30的体重指数(BMI)的状况。“超重”指对象具有大于或等于25.0体重指数的状况。体重指数及其它定义参考“NIH Clinical Guidelines on the Identification andEvaluation，and Treatment of Overweight and Obesity in Adults”(1998)。更具体地，肥胖症可以导致连续阶段的II型糖尿病。临床上，可以将这些阶段表征为正常的葡萄糖耐量，葡萄糖耐量降低，高胰岛素血症糖尿病，和低胰岛素血症糖尿病。这样的进行性葡萄糖储存受损与基础血糖的升高有关。
其它脂肪细胞相关疾病的实例包括血脂障碍，和高脂血症(包括高甘油三酯，高LDL，高脂肪酸水平)。
治疗肥胖的示例性模型包括两种主要的动物模型系统1)通过给啮齿类动物饲喂约60％脂肪含量的热量摄取，造成的饮食诱发的肥胖症(DIO)。以该类饮食处理长达12-16周的动物获得显著的体重(＞50％增加)，积累过量的脂肪量，变成高血糖，高胰岛素血症和胰岛素抵抗。在该模型中，可以在开始饮食之前或在形成肥胖症的过程中的任意时间，测试化合物。2)db/db突变型小鼠(苗条蛋白受体自发突变体)。这些动物会表现出与DIO动物类似的表型，但是在不同的读出方面更严重。可以与DIO模型类似地处理动物。作为SirT1抑制剂活性的替代读出，可以随着治疗方案处死同胞动物，并生化地评估不同组织中FoxO1蛋白增加的乙酰化状态，例如肝、肌肉和白脂肪组织。
本文所述的化合物可以用于治疗AMD。黄斑变性包括特征在于与布鲁赫膜和视网膜色素上皮的异常有关的进行性中央视觉丧失的许多种疾病(参见，例如，美国申请20030138798)。AMD发生在1.2％的52至64岁的人群中和20％的超过75岁的患者中(参见，例如，美国申请20030087889)。黄斑变性以两种形式发生″萎缩性″(″非渗出性″或″干″形式)和″渗出性″(″湿″形式)。AMD的较不常见的形式是″萎缩性AMD″，它是由于死亡的RPE细胞所致(美国申请20030093064)。
AMD的症状包括视野中的直线表现为波状；书本、杂志和报纸上的文字变得模糊；和黑暗或空白空间阻断视觉中心(参见，例如，美国申请20030065020)。
可以用于评价AMD状态的示例性分子标记包括编码FBNL的基因的核酸序列或FBNL蛋白的氨基酸序列345Arg＞Trp和362Arg＞Gln；(参见，例如，美国申请20030138798)；色素A2E、N-视黄基-N-亚视黄基乙醇胺的增加，最终导致细胞色素C释放入细胞质(美国申请20030050283)；针对各种黄斑变性-相关分子的自身-抗体，所述分子包括fibulin-3，玻璃体结合蛋白，β-晶体蛋白A2，β-晶体蛋白A3，β-晶体蛋白A4，β-晶体蛋白S，钙网织蛋白，14-3-3蛋白ε，血清铁传递蛋白，白蛋白，角蛋白，丙酮酸羧化酶，或绒毛蛋白2(参见，例如，美国申请20030017501)；补体途径分子(包括丛生蛋白，C6或C5b-9复合物)的异常活性或水平(参见，例如，美国申请20020015957)；和色素脂褐素在视网膜色素上皮(RPE)细胞的溶酶体中的积累(Suter et al.，J Biol Chem.27539625-30(2000))。
组织修复本文所述的化合物也可以用于调节组织修复或组织状态。组织修复的示例性实施包括伤口愈合、烧伤、溃疡(例如，糖尿病患者的溃疡，例如，糖尿病性足溃疡)、外科伤口、疮和擦伤。该方法可以减少该组织的至少一种症状。例如，该方法包括，施用(例如，局部地或全身地)有效量的本文所述的化合物。
化合物可以用于皮肤病学的疾病或病症。
骨骼肌萎缩肌肉萎缩包括许多神经肌肉的、代谢的、免疫的和神经的障碍和疾病，以及饥饿、营养缺乏、代谢性应激、糖尿病、衰老、肌营养不良或肌病。肌肉萎缩发生在老化过程中。肌肉萎缩也源自肌肉的减少使用或废用。症状包括骨骼肌组织量的减少。在男人中，在50至80岁肌肉量减少1/3。
肌肉萎缩的有些分子特征包括泛素连接酶的上调、和肌纤维蛋白的丧失(Furuno et al.，J.Biol.Chem.，2658550-8557，1990)。这些蛋白的崩解可以如下追踪，例如，通过测量3-甲基-组氨酸生产，它是肌动蛋白的特殊组分，且在某些肌肉中，是肌球蛋白的特殊组分(Goodman，Biochem.J，241121-12，1987和Lowell，et al.，Metabolism，351121-112，1986；Stein和Schluter，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.272E688-E696，1997)。肌酸激酶的释放(一种细胞损伤标记)(Jackson，et al.，Neurology，41101 104，1991)也可以是指征。
多发性硬化多发性硬化(MS)是一种特征在于大脑白质的局灶性炎症和自身免疫变性的神经肌肉病。白质变成发炎的，且炎症后跟随着髓磷脂的破坏(形成″病损″，其标志是许多免疫细胞的浸润，尤其是T-细胞淋巴细胞和巨噬细胞。MS可以造成神经冲动传递的减缓或完全阻断，由此导致躯体功能减弱或丧失。MS患者可以具有MS的许多级别之一(例如，复发-缓解型MS，原发进展型MS，继发进展型，和Marburg氏变型MS)。
症状可以包括视觉问题例如模糊或复视，红-绿色失真，或甚至一只眼睛失明，肢体肌无力，协调和平衡问题，肌痉挛状态，肌肉疲劳，感觉异常，短暂的异常感觉例如麻木、刺痛、或″针和尖″感觉，且在最坏的情况下，部分的或完全的瘫痪。约半数MS患者也会经历认知缺损，例如，较差的集中、注意力、记忆和/或判断(参见，例如，US2003-0130357和2003-0092089)。
MS的分子标记包括许多遗传因素，例如，高加索人单体型DRB*1501-DQA1*0102-DQB1*0602(美国申请20030113752)，蛋白酪氨酸磷酸酶受体-C型中的点突变(美国申请20030113752)，野生型SARG-1-蛋白的缺失，存在突变的SARG-1-蛋白，或编码野生型SARG-1的核酸的缺失或突变(参见，例如，美国申请20030113752)和蛋白指示物(例如，脑脊液中的髓磷脂碱性蛋白自身抗体)(参见，例如，美国申请20030092089)。
MS的细胞和动物模型包括慢性MS的转基因小鼠模型(实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE))，例如，如Goverman et al.，Cell.72551-60(1993)所述，和如Brok et al.，Immunol.Rev.，183173-85(2001)所综述的灵长类动物模型。
肌萎缩侧索硬化(ALS；Lou Gehrig氏病)本文所述的化合物可以用于调节ALS。ALS指一类病症，其包含上和下运动神经元。ALS的发病率在老年人中显著增加。这些病症的特征在于显著的病理学异常，包括导致运动神经元死亡的脊髓中的下运动神经元和大脑皮层中的上运动神经元的选择性和进行性变性，这造成在它们控制下的肌肉的弱化和消瘦，导致瘫痪。ALS病症的实例包括经典的ALS(典型地影响下和上运动神经元)，原发性侧索硬化(PLS，典型地仅影响上运动神经元)，进行性延髓性麻痹(PBP或延髓发病，典型地从吞咽、咀嚼和说话困难开始的ALS版本)，进行性肌萎缩(PMA，典型地仅影响下运动神经元)或家族性AL(ALS的遗传版本)，或这些状况的组合(参见，例如，美国申请20020198236和美国申请20030130357)。
通过神经学检查或其它方式，例如MRI，FVC，MUNE等(参见，例如，美国申请20030130357)，可以评价个体的ALS状况。症状包括手、臂、腿的肌无力；吞咽或呼吸困难；颤搐(肌束震颤)和肌肉痉挛；和肢体的减少的使用。本发明包括以有效缓解一种或多种ALS症状的量，施用调节IGF-1/GH轴的试剂，例如，在患有ALS或处于ALS的危险中的个体中。
评价个体的ALS状况的方法可以包括评价″兴奋性氨基酸转运蛋白2型″(EAAT2)蛋白或基因，铜-锌超氧化物歧化酶(SOD1)蛋白或基因，线粒体复合物I活性，多胺(例如putraceine，精胺和亚精胺)的水平，鸟氨酸脱羧酶活性，和编码推定的鸟苷三磷酸酶调节剂的基因(见Nat.Genet.，29(2)166-73(2001))。
用于评价化合物对ALS状态的作用的细胞和动物包括具有改变的SOD基因的小鼠，例如，SOD1-G93A转基因小鼠，其携带可变拷贝数的由内源启动子驱动的人G93A SOD突变，SOD1-G37R转基因小鼠(Wong et al.，Neuron，14(6)1105-16(1995))；SOD1-G85R转基因小鼠(Bruijn et al.，Neuron，18(2)327-38(1997))；表达突变型人SOD1的美丽线虫株(Oeda et al.，Hum Mol Genet.，102013-23(2001))；和表达Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD)中的突变的果蝇(Phillips et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，928574-78(1995)和McCabe，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，928533-34(1995))。
神经病本文所述的化合物可以用于调节神经病。神经病可以包括由影响运动、感觉、感觉运动或自主神经的全身疾病、遗传状况或毒性剂造成的中枢和/或外周神经功能障碍(参见，例如，美国申请20030013771)。
症状可以随神经损伤的原因和受影响的神经的特定类型而异。例如，运动神经病的症状包括执行身体任务的笨拙或肌无力，小量劳力后的疲惫，站立或行走的困难，和神经肌肉反射的弱化或缺失(美国申请20030013771)。自主神经病的症状包括便秘，心律失常和体位低血压反射的弱化(美国申请20030013771)。感觉神经病的症状包括疼痛和麻木；手、腿或脚的麻刺感；和对接触的极度敏感。视网膜病的症状包括视力模糊，视觉的突然丧失，黑斑，和闪光。
Guillain-Barr综合征是一类运动神经病，其通常发生在流感-样疾病或其它感染后的2至3周。症状包括上升的无力，其中无力从下肢开始，上升到上肢。脊髓液中蛋白水平的升高而白细胞数目不增加也会发生(美国申请20030083242)。
示例性疾病本文所述化合物适用的其它示例性疾病和定义包括下面的“年龄相关的疾病”或“与年龄有关的疾病”是这样的疾病或病症，在提交本申请时，且在超过100,000人的选定人群中，其在超过60岁的人类个体中的发病率比30-40岁之间的人类个体高至少1.5倍。优选的人群是美国人群。可以通过性别和/或种族限制人群。
“老年疾病”是这样的疾病或病症，在提交本申请时，且在超过100,000人的选定人群中，其发病率在超过70岁的人类个体中是至少70％。在一个实施方案中，老年疾病是癌症或心肺疾病以外的疾病。优选的人群是美国人群。可以通过性别和/或种族限制人群。
具有“年龄相关的易感性因素”的疾病指这样的疾病或病症，其原因由外部介导，但是在提交本申请时，且在美国人群中，在超过60岁的人类个体中其严重性或症状比30-40岁之间的人类个体显著增加。例如，肺炎是由病原体造成，但是该疾病在超过60岁的人中的严重性高于在30-40岁之间的人类个体。
“肿瘤性疾病”是这样的疾病或病症，其特征在于具有自主生长或复制能力的细胞，例如，特征在于增殖性细胞生长的异常状态或状况。“年龄相关的肿瘤性疾病”是也是年龄相关的疾病的肿瘤性疾病。
“非-肿瘤性疾病”是这样的疾病或病症，其特征不在于具有自主生长或复制能力的细胞。“年龄相关的非-肿瘤性疾病”是也是年龄相关的疾病的非肿瘤性疾病。
“神经障碍”是这样的疾病或病症，其特征在于神经元细胞或神经元支持细胞(例如，神经胶质或肌肉)的异常或功能障碍。该疾病或病症可以影响中枢和/或外周神经系统。示例性神经障碍包括神经病，骨骼肌萎缩，和神经变性疾病，例如，至少部分地由多谷氨酰胺聚集造成的神经变性疾病或除至少部分地由多谷氨酰胺聚集造成的以外的神经变性疾病。示例性神经变性疾病包括阿尔茨海默氏病，肌萎缩侧索硬化(ALS)，和帕金森氏病。“年龄相关的神经障碍”是也是年龄相关的疾病的神经障碍。
“心血管疾病”是这样的疾病或病症，其特征在于心血管系统(例如，心脏、肺或血管)的异常或功能障碍。示例性心血管疾病包括心律失常，慢性充血性心力衰竭，缺血性中风，冠状动脉疾病，血压升高(即高血压)，和心肌病。“年龄相关的心血管疾病”是也是年龄相关的疾病的心血管疾病。
“代谢紊乱”是这样的疾病或病症，其特征在于代谢的异常或功能障碍。代谢紊乱的一种类别是葡萄糖或胰岛素代谢的紊乱。“年龄相关的代谢紊乱是也是年龄相关的疾病的代谢紊乱。
“皮肤病学疾病”是这样的疾病或病症，其特征在于皮肤的异常或功能障碍。“皮肤病学的组织状况”指有助于皮肤功能和/或外观(例如，美容外观)的皮肤和任何基础组织(例如，支持组织)。
与某些实施有关的示例性疾病和疾病包括癌症(例如，乳腺癌，结肠直肠癌，CCL，CML，前列腺癌)；骨骼肌萎缩；成年发病型糖尿病；糖尿病性肾病，神经病(例如，感觉神经病，自主神经病，运动神经病，视网膜病)；肥胖症；骨吸收；年龄相关的黄斑变性，ALS，阿尔茨海默氏病，贝尔麻痹，动脉粥样硬化，心血管疾病(例如，心律失常，慢性充血性心力衰竭，缺血性中风，冠状动脉疾病，血压高(即高血压)，和心肌病)，慢性肾衰竭，II型糖尿病，溃疡，白内障，远视眼，肾小球肾炎，Guillan-Barre综合征，出血性中风，短期和长期记忆丧失，类风湿性关节炎，炎性肠病，多发性硬化，SLE，克罗恩病，骨关节炎，帕金森氏病，肺炎，和尿失禁。另外，许多神经变性疾病和与蛋白聚集(例如，除多谷氨酰胺聚集以外)或蛋白错误折叠有关的疾病也可以是年龄相关的。疾病的症状和诊断是医学从业人员熟知的。也可以将组合物施用给正通过对该疾病的其它方法治疗的个体，例如，用化疗(例如，且具有嗜中性白血球减少症，萎缩，恶病质，肾病，神经病)或选择性外科手术治疗的个体。
试剂盒本文所述化合物可以在试剂盒中提供。该试剂盒包括(a)本文所述化合物，例如包含本文所述化合物的组合物，和，任选地(b)信息材料。该信息材料可以是描述性材料、指导性材料、销售材料或其它的材料，其与本文所述方法和/或本文所述化合物在本文所述方法中的应用有关。
对试剂盒的信息材料的形式没有限制。在一个实施方案中，信息材料可包括关于化合物的生产、化合物的分子量、浓度、失效日期、批次或生产地点信息等的信息。在一个实施方案中，信息材料涉及施用化合物的方法。
在一个实施方案中，信息材料可以包括以合适方式施用本文所述化合物以进行本文所述方法的说明，例如，以合适的剂量、剂型或给药模式(例如，本文所述的剂量、剂型或给药模式)。在另一个实施方案中，信息材料可包括将本文所述化合物施用给合适的对象的说明，所述对象例如人，例如患有本文所述疾病或处于本文所述疾病危险中的人。
对试剂盒的信息材料的形式没有限制。在许多情况下，信息材料，例如说明书，是以印刷物提供的，例如，打印的文本、附图和/或照片，例如，标签或印刷页。然而，还可以其它格式提供信息材料，例如盲文、计算机可读材料、视频记录或音频记录。在另一个实施方案中，试剂盒的信息材料是联系信息，例如，实际地址、电子邮件地址、网址或电话号码，试剂盒的使用者可从中获得关于本文所述化合物和/或其在本文所述方法中的应用的实质信息。当然，信息材料还可以以任何组合形式提供。
除了本文所述化合物外，该试剂盒的组合物还可包括其它成分，如溶剂或缓冲剂、稳定剂、防腐剂、矫味剂(例如，苦味拮抗剂或增甜剂)、芳香剂或其它化妆品成分、和/或用于治疗本文所述状况或疾病的第二种试剂。可选择性地，其它成分可包括在试剂盒中，但在与本文所述化合物不同的组合物或容器中。在这类实施方案中，试剂盒可包括关于将本文所述化合物与其它成分相混合、或关于与其它成分一起使用本文所述化合物的说明。
本文所述化合物可以以任何形式提供，例如，液体、干燥的或冷冻干燥形式。优选地，本文所述化合物是基本上纯的和/或无菌的。当在液体溶液中提供本文所述化合物时，液体溶液优选地是水溶液，优选无菌水溶液。当以干燥形式提供本文所述化合物时，通常通过加入合适溶剂进行重配。溶剂，例如，无菌的水或缓冲液可任选提供在试剂盒中。
该试剂盒可包括一个或多个容器，用于容纳含本文所述化合物的组合物。在一些实施方案中，试剂盒包含用于组合物和信息材料的分开的容器、分隔物或隔室。例如，可将组合物装在瓶、小瓶或注射器中，且可将信息材料装在塑料插套或小包中。在其它实施方案中，将试剂盒的分开的组件装在单一的未分开的容器中。例如，将组合物装在瓶、小瓶或注射器中，其已经贴有标签形式的信息材料。在一些实施方案中，试剂盒包括多个(例如，一包)单个的容器，每个容器含有一个或多个单位剂型(例如，本文所述剂型)的本文所述化合物。例如，试剂盒包括多个注射器、安瓿、箔袋、或泡罩包装，每个含有单个单位剂量的本文所述化合物。试剂盒的容器可以是气密的、防水的(例如，对于水分的变化或蒸发而言是不透的)、和/或不透光的。
试剂盒任选地包括适于施用组合物的装置，例如，注射器、吸入器、吸量管、镊子、量匙、滴管(例如，眼用滴管)、拭子(例如，棉签或木签)、或任何这类递送装置。在一个优选的实施方案中，该装置是医用植入装置，例如包装供手术插入。
遗传学信息可以得到SIRT1遗传信息，例如，通过评价来自对象(例如，如下所述)的遗传物质(例如，DNA或RNA)。遗传信息指关于在一个或多个核苷酸处的核酸序列含量的任何指示。遗传信息可以包括，例如，关于特定多态性(例如，一种或多种核苷酸变异)的存在与否的指示。示例性多态性包括单核苷酸多态性(SNP)，限制位点或限制片段长度，插入，倒位，缺失，重复(例如，三核苷酸重复，逆转录病毒重复)，等。
在表2中列出了示例性的SIRT1 SNP。
表2示例性的SIRT1 SNP
可以以多种方式数字地记录或交流遗传信息。典型的表示包括一位或多位，或文本字符串。例如，使用2位，可以描述双等位基因标记。在一个实施方案中，第一位表示是否存在第一个等位基因(例如，次要等位基因)，且第二位表示是否存在另一个等位基因(例如，主要等位基因)。就多等位基因的标记而言，例如，其中可能存在超过2个等位基因，可以使用附加位以及其它形式的编码(例如，二进位的，十六进制的文本，例如，ASCII或Unicode，等)。在有些实施方案中，遗传信息描述单体型，例如，在同一染色体上的多个多态性。但是，在许多实施方案中，遗传信息是非相的(unphased)。
根据关于SIRT1的遗传信息，可以作出关于是否施用本文所述化合物的决定。例如，施用本文所述化合物的方法可以包括，评价来自对象的核酸，得到关于SIRT1或另一种sirtuin的遗传信息，并施用本文所述化合物。
数据库本发明也提供数据库，其将关于或鉴别一种或多种本文所述化合物的信息与关于患者的参数相关联，例如，待治疗本文疾病的患者。参数可以是普通参数，例如，血压，中心体温等，或与特定疾病或病症有关的参数(例如，如本文所述)。
实施例在下面的所有实施例中，根据它们在表1中的指定(即示例的化合物)提及化合物。
实施例1HeLa细胞凋亡测定使用来自Roche Applied Science的细胞死亡检测ELISA plus试剂盒，评价下述示例性化合物对HeLa细胞的细胞凋亡测定的作用。
实施例2试剂列表
设备列表
一次性用品列表
标准试剂制剂
实施例3为了确定化合物8是否会抑制哺乳动物酶，用构建体转染293T细胞，所述构建体设计成表达与谷胱甘肽-S-转移酶相融合的人SIRT1，以允许从细胞提取物快速纯化。在裂解后，将细胞提取物与谷胱甘肽-琼脂糖珠子一起温育，然后在裂解缓冲液中洗涤几次，最后在SIRT1酶测定缓冲液中洗涤一次。在有一系列浓度的化合物8存在下，将结合了GST-SIRT1的珠子加给Fleur-de-lys测定(Biomol)。从图2a可以看出，化合物8对哺乳动物SIRT1的EC50值可与对重组细菌生产的人酶得到的值相比。
从图2B可以看出，在依托泊苷处理后，化合物8进入细胞并增加p53乙酰化(在赖氨酸382处)。在图2B所述的实验中，在有或没有SIRT1抑制剂(化合物8或烟酰胺)存在下，用20uM依托泊苷(一种DNA损伤剂)处理NCI-H460细胞，并通过蛋白印迹，观察乙酰化的p53(在赖氨酸382处)的量。与单独的DMSO相比，化合物8能显著增加p53乙酰化，且1uM和10uM同样有效。
实施例4测试了化合物8的对映体，其中每种对映体具有大于90％对映体过量的纯度，以确定单一对映体是否比对映体的混合物更有效。在有20uM依托泊苷存在下，用化合物8(+)和8(-)处理NCI-H460细胞6小时，随后裂解，并使用Ab-6(Oncogene Science)进行p53的免疫沉淀。用识别p53的乙酰化的赖氨酸382的抗体(Cell Signaling)，探测提取物。图3表明，化合物8存在有活性的和无活性的对映体。更具体地，在有依托泊苷存在下，无活性的对映体化合物8(+)不会导致增强的p53乙酰化，而化合物8(-)会导致p53蛋白的乙酰化的显著增加和稳定化。
实施例5在图4所示的下面实验的结果中，我们证实了化合物的增强p53乙酰化的能力与它对SIRT1的体外效力有关。以1uM浓度，将一系列的结构上类似的化合物加给细胞。只有以小于1uM的IC50抑制SIRT1的那些化合物增强了p53乙酰化，而具有大于1uM的IC50的化合物不会。
实施例6图5所述的实验证实，在依赖于SIRT1活性的酵母沉默测定中，化合物8的无活性对映体化合物8(+)对细胞生长没有作用，而有活性的对映体8(-)会抑制SIRT1，并允许表达URA3，其在5-氟尿嘧啶存在下会阻断生长。将SL8c株(在端粒处的URA)用于基于酵母的测定来筛选化合物。使细胞在-URA培养基中生长，选择去沉默的细胞。次日，在含有2％葡萄糖的新鲜YPD中，1∶20稀释细胞，然后生长5小时。然后，在SD和SD+0.1％5FOA培养基中，将细胞稀释至OD＝0.01。然后，在10ul SD或SD+0.1％5FOA培养基中，系列稀释化合物。将140μl细胞吸量到96孔平板中，并在30℃生长18-24小时。
实施例7化合物8会抑制其它细胞中的SIRT1酶。在有20uM依托泊苷(TOPO)存在下，用化合物8处理细胞系U2OS和MCF7细胞系6小时，然后裂解，并用缀合到琼脂糖珠子上的p53 Ab-6进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE分析样品，并用识别p53的乙酰化的赖氨酸382的抗体进行免疫印迹。图6所示的结果证实，化合物8能抑制多种细胞系中的SIRT1，对P53乙酰化具有类似作用。
实施例8为了评估化合物8对p53乙酰化的影响是否导致p53功能的变化，进行实验来测量在DNA损伤后的细胞存活。在有或没有SIRT1抑制剂存在下，用不同浓度的依托泊苷损伤NCI-H460细胞。如图7所示，在该测定中，化合物8自身并不显著调节p53功能。
实施例9在有一系列浓度的依托泊苷和1uM化合物8存在下，以800个/孔的密度，将细胞平板接种在96孔cytostar平板中。以24小时间隔，测量胸苷掺入。如图9所示，该实验证实，在依托泊苷处理的同时、之前和之后加入化合物的条件下，依托泊苷和化合物8之间对NCI-H460细胞的生长特征没有协同作用。
实施例10在有或没有化合物8存在下，使HEK293细胞血清饥饿24小时，然后裂解，并免疫印迹分析p27蛋白。从图9可以看出，用化合物8处理细胞，会导致对血清饥饿-介导的细胞周期抑制剂p27的上调的废除。提出的对该结果的解释是，SIRT1-介导的脱乙酰作用导致FOXO1-介导的p27转录的失活，且化合物8的添加逆转该作用。
实施例11用GFP-hSIRT2同种型1(绿色)转染HeLa细胞。在转染后36小时，加入1μM TSA和DMSO或50μM化合物8。次日早晨，固定细胞，透化处理，并对乙酰化的微管蛋白染色(红色)。在用DMSO处理的细胞中，在表达SIRT2的细胞中存在非常少的乙酰化的微管蛋白，在用化合物8处理的细胞中，微管蛋白被更高度地乙酰化，表明阻断了SIRT2的作用。
使用蛋白印迹分析，也可以观察化合物的作用。用eGFP(对照)或小鼠SIRT2同种型1(mSIRT2)转染293T细胞。加入TSA，以增加乙酰化的微管蛋白的量，同时加入DMSO或下面列出的化合物至10μM。
操作描述步骤描述1制备待测定的孔数所需量的2x底物。每孔需要5ul2分配5ul 2x底物到实验孔中3分配1ul实验化合物到实验孔中分配1ul化合物溶剂/稀释剂到阳性对照孔中分配Iul 1mM烟酰胺到50％抑制孔中分配1ul 10mM烟酰胺到100％抑制孔中4分配4ul测定缓冲液到阴性对照孔(无酶对照)中5制备待测定的孔数所需量的酶。每孔需要4ul酶混合物6分配4ul酶混合物到实验孔和阳性对照孔中7盖好并在37℃温育45分钟8在使用前30分钟内，制备所测定的孔数所需量的1x显色剂/终止试剂9分配10ul 1x显色剂/终止试剂到所有孔中10 在室温温育至少15分钟11 在荧光平板读数器中读数，激发＝350-380nm，发射＝440-46012 底物中的Fluor de Lys具有内在荧光，在对数据进行任何计算之前，需要将它作为背景减去。从阴性对照孔中可以发现这些值。
附录1使用Fluor de Lys脱乙酰基的标准品，制备标准曲线1通过制备标准品的1uM稀释液，确定要与上述测定组合使用的脱乙酰基的标准品的浓度范围。混合10ul的1uM稀释液与10ul显色剂，在与读出测定相同的波长和灵敏度设置进行读数。使用AFU(任意的荧光单位)/uM的估计值，确定要在标准曲线中测试的浓度范围。
2在测定缓冲液中，制备Fluor de Lys脱乙酰基的标准品的系列稀释液，其跨目标浓度范围3吸量10ul测定缓冲液至‘0’孔4吸量10ul标准品稀释液到孔中5吸量10ul显色剂到孔中，并在室温温育15分钟6在上述波长读出平板7绘制荧光信号(y)对Fluor de Lys脱乙酰基的标准品的浓度(x)的关系图，并确定斜率作为AFU/uM测试显色剂反应的抑制剂的方案1从标准曲线中，选择在测定中产生相当于阳性对照的荧光信号的脱乙酰基的标准品的浓度(例如5uM)2分配5ul 2x脱乙酰基的标准品(例如10uM)3分配1ul化合物，4ul测定缓冲液4分配10ul显色剂5在室温温育15分钟(或与筛选中相同的时间)，并在与筛选相同的设置读数实施例12合成2-氯-5，6，7，8，9，10-六氢环庚三烯并[b]吲哚-6-甲酰胺制备3-溴-2-氧代环庚烷甲酸甲酯将2-氧代-1-环庚烷甲酸甲酯(50g，294mmol)溶于四氯化碳(200mL)，并冷却至0℃。经约30分钟，通过加液漏斗加入溴(46.8g，294mmol)。然后去除冷却浴，使反应升温到室温。在氮气下，在室温搅拌反应4天。4天后，将溶液倒入含水(1L)的分液漏斗。用水洗涤有机相，并经硫酸钠干燥。真空去除溶剂，得到(72.4g，291mmol，99％粗产率)。不经进一步纯化，进一步使用该物质。
制备2-氯-5，6，7，8，9，10-六氢环庚三烯并[b]吲哚-6-甲酸甲酯将3-溴-2-氧代环庚烷甲酸甲酯(16.8g，67.4mmol)和4-氯苯胺(18.4g，98％，2.13当量，143.6mmol)加入具有温度计、氮气进口和机械搅拌机的烧瓶。随着混合物的温度超过140℃，发生相对快速的放热和剧烈的气体放出。立即用水冷却反应。将反应混合物溶于DCM(200mL)。将物质转入分液漏斗，并用水(2×50mL)、3HCl(3×50mL)、水(2×50mL)、盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并真空去除溶剂。将粗残余物应用于Biotage，并用9/1庚烷/乙酸乙酯洗脱，得到灰白色固体状的产物10g(53％)，不经进一步纯化，将它用于下一反应。
制备2-氯-5，6，7，8，9，10-六氢环庚三烯并[b]吲哚-6-甲酰胺将2-氯-5，6，7，8，9，10-六氢环庚三烯并[b]吲哚-6-甲酸甲酯(10g，36mmol)溶于在甲醇(350mL)中的7N氨，并转入Parr压力反应器。简单地吹洗反应容器，用氮气替代所有的空气。然后在90℃加热反应48小时。将反应冷却至室温，真空去除溶剂，将粗残余物应用于Biotage，并梯度洗脱(1/1庚烷/乙酸乙酯至0/1庚烷/乙酸乙酯)，得到灰白色泡沫状的产物，将其与DCM一起研磨，得到灰白色固体状的纯产物2g(21％)。
已经描述了本发明的多种实施方案。然而，应当理解，可以进行多种改进，而不脱离本发明的精神和范围。其它实施方案在权利要求书中。
序列表<110>Elixir Pharmaceuticals，Inc.
<120>治疗疾病的方法<130>13407-092WO1<140>US 11/077,664<141>2005-03-11<150>US 10/940,269<151>2004-09-13<160>7<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>747<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Ala Asp Glu Ala Ala Leu Ala Leu Gln Pro Gly Gly Ser Pro Ser1 5 10 15Ala Ala Gly Ala Asp Arg Glu Ala Ala Ser Ser Pro Ala Gly Glu Pro20 25 30Leu Arg Lys Arg Pro Arg Arg Asp Gly Pro Gly Leu Glu Arg Ser Pro35 40 45Gly Glu Pro Gly Gly Ala Ala Pro Glu Arg Glu Val Pro Ala Ala Ala50 55 60Arg Gly Cys Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Leu Trp Arg Glu Ala Glu65 70 75 80Ala Glu Ala Ala Ala Ala Gly Gly Glu Gln Glu Ala Gln Ala Thr Ala85 90 95Ala Ala Gly Glu Gly AsP Asn Gly Pro Gly Leu Gln Gly Pro Ser Arg100 105 110Glu Pro Pro Leu Ala Asp Asn Leu Tyr Asp Glu Asp Asp Asp Asp Glu115 120 125Gly Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ile Gly Tyr Arg Asp130 135 140Asn Leu Leu Phe Gly Asp Glu Ile Ile Thr Asn Gly Phe His Ser Cys145 150 155 160Glu Ser Asp Glu Glu Asp Arg Ala Ser His Ala Ser Ser Ser Asp Trp165 170 175Thr Pro Arg Pro Arg Ile Gly Pro Tyr Thr Phe Val Gln Gln His Leu180 185 190Met Ile Gly Thr Asp Pro Arg Thr Ile Leu Lys Asp Leu Leu Pro Glu195 200 205Thr Ile Pro Pro Pro Glu Leu Asp Asp Met Thr Leu Trp Gln Ile Val210 215 220Ile Asn Ile Leu Ser Glu Pro Pro Lys Arg Lys Lys Arg Lys Asp Ile225 230 235 240Asn Thr Ile Glu Asp Ala Val Lys Leu Leu Gln Glu Cys Lys Lys Ile245 250 255Ile Val Leu Thr Gly Ala Gly Val Ser Val Ser Cys Gly Ile Pro Asp260 265 270
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<211>389<212>PRT<213>智人<400>2Met Ala Glu Pro Asp Pro Ser His Pro Leu Glu Thr Gln Ala Gly Lys1 5 10 15Val Gln Glu Ala Gln Asp Ser Asp Ser Asp Ser Glu Gly Gly Ala Ala20 25 30Gly Gly Glu Ala Asp Met Asp Phe Leu Arg Asn Leu Phe Ser Gln Thr35 40 45Leu Ser Leu Gly Ser Gln Lys Glu Arg Leu Leu Asp Glu Leu Thr Leu50 55 60Glu Gly Val Ala Arg Tyr Met Gln Ser Glu Arg Cys Arg Arg Val Ile65 70 75 80Cys Leu Val Gly Ala Gly Ile Ser Thr Ser Ala Gly Ile Pro Asp Phe85 90 95Arg Ser Pro Ser Thr Gly Leu Tyr Asp Asn Leu Glu Lys Tyr His Leu100 105 110Pro Tyr Pro Glu Ala Ile Phe Glu Ile Ser Tyr Phe Lys Lys His Pro115 120 125Glu Pro Phe Phe Ala Leu Ala Lys Glu Leu Tyr Pro Gly Gln Phe Lys130 135 140Pro Thr Ile Cys His Tyr Phe Met Arg Leu Leu Lys Asp Lys Gly Leu145 150 155 160Leu Leu Arg Cys Tyr Thr Gln Asn Ile Asp Thr Leu Glu Arg Ile Ala165 170 175Gly Leu Glu Gln Glu Asp Leu Val Glu Ala His Gly Thr Phe Tyr Thr180 185 190Ser His Cys Val Ser Ala Ser Cys Arg His Glu Tyr Pro Leu Ser Trp195 200 205Met Lys Glu Lys Ile Phe Ser Glu Val Thr Pro Lys Cys Glu Asp Cys210 215 220Gln Ser Leu Val Lys Pro Asp Ile Val Phe Phe Gly Glu Ser Leu Pro225 230 235 240Ala Arg Phe Phe Ser Cys Met Gln Ser Asp Phe Leu Lys Val Asp Leu245 250 255Leu Leu Val Met Gly Thr Ser Leu Gln Val Gln Pro Phe Ala Ser Leu260 265 270Ile Ser Lys Ala Pro Leu Ser Thr Pro Arg Leu Leu Ile Asn Lys Glu275 280 285Lys Ala Gly Gln Ser Asp Pro Phe Leu Gly Met Ile Met Gly Leu Gly290 295 300Gly Gly Met Asp Phe Asp Ser Lys Lys Ala Tyr Arg Asp Val Ala Trp305 310 315 320Leu Gly Glu Cys Asp Gln Gly Cys Leu Ala Leu Ala Glu Leu Leu Gly325 330 335Trp Lys Lys Glu Leu Glu Asp Leu Val Arg Arg Glu His Ala Ser Ile340 345 350Asp Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Asn Pro Ser Thr Ser Ala Ser355 360 365Pro Lys Lys Ser Pro Pro Pro Ala Lys Asp Glu Ala Arg Thr Thr Glu370 375 380Arg Glu Lys Pro Gln385<210>3<211>399<212>PRT<213>智人
<400>3Met Ala Phe Trp Gly Trp Arg Ala Ala Ala Ala Leu Arg Leu Trp Gly1 5 10 15Arg Val Val Glu Arg Val Glu Ala Gly Gly Gly Val Gly Pro Phe Gln20 25 30Ala Cys Gly Cys Arg Leu Val Leu Gly Gly Arg Asp Asp Val Ser Ala35 40 45Gly Leu Arg Gly Ser His Gly Ala Arg Gly Glu Pro Leu Asp Pro Ala50 55 60Arg Pro Leu Gln Arg Pro Pro Arg Pro Glu Val Pro Arg Ala Phe Arg65 70 75 80Arg Gln Pro Arg Ala Ala Ala Pro Ser Phe Phe Phe Ser Ser Ile Lys85 90 95Gly Gly Arg Arg Ser Ile Ser Phe Ser Val Gly Ala Ser Ser Val Val100 105 110Gly Ser Gly Gly Ser Ser Asp Lys Gly Lys Leu Ser Leu Gln Asp Val115 120 125Ala Glu Leu Ile Arg Ala Arg Ala Cys Gln Arg Val Val Val Met Val130 135 140Gly Ala Gly Ile Ser Thr Pro Ser Gly Ile Pro Asp Phe Arg Ser Pro145 150 155 160Gly Ser Gly Leu Tyr Ser Asn Leu Gln Gln Tyr Asp Leu Pro Tyr Pro165 170 175Glu Ala Ile Phe Glu Leu Pro Phe Phe Phe His Asn Pro Lys Pro Phe180 185 190Phe Thr Leu Ala Lys Glu Leu Tyr Pro Gly Asn Tyr Lys Pro Asn Val195 200 205Thr His Tyr Phe Leu Arg Leu Leu His Asp Lys Gly Leu Leu Leu Arg210 215 220Leu Tyr Thr Gln Asn Ile Asp Gly Leu Glu Arg Val Ser Gly Ile Pro225 230 235 240Ala Ser Lys Leu Val Glu Ala His Gly Thr Phe Ala Ser Ala Thr Cys245 250 255Thr Val Cys Gln Arg Pro Phe Pro Gly Glu Asp Ile Arg Ala Asp Val260 265 270Met Ala Asp Arg Val Pro Arg Cys Pro Val Cys Thr Gly Val Val Lys275 280 285Pro Asp Ile Val Phe Phe Gly Glu Pro Leu Pro Gln Arg Phe Leu Leu290 295 300His Val Val Asp Phe Pro Met Ala Asp Leu Leu Leu Ile Leu Gly Thr305 310 315 320Ser Leu Glu Val Glu Pro Phe Ala Ser Leu Thr Glu Ala Val Arg Ser325 330 335Ser Val Pro Arg Leu Leu Ile Asn Arg Asp Leu Val Gly Pro Leu Ala340 345 350Trp His Pro Arg Ser Arg Asp Val Ala Gln Leu Gly Asp Val Val His355 360 365Gly Val Glu Ser Leu Val Glu Leu Leu Gly Trp Thr Glu Glu Met Arg370 375 380Asp Leu Val Gln Arg Glu Thr Gly Lys Leu Asp Gly Pro Asp Lys385 390 395<210>4<211>314<212>PRT<213>智人<400>4Met Lys Met Ser Phe Ala Leu Thr Phe Arg Ser Ala Lys Gly Arg Trp1 5 10 15
Ile Ala Asn Pro Ser Gln Pro Cys Ser Lys Ala Ser Ile Gly Leu Phe20 25 30Val Pro Ala Ser Pro Pro Leu Asp Pro Glu Lys Val Lys Glu Leu Gln35 40 45Arg Phe Ile Thr Leu Ser Lys Arg Leu Leu Val Met Thr Gly Ala Gly50 55 60Ile Ser Thr Glu Ser Gly Ile Pro Asp Tyr Arg Ser Glu Lys Val Gly65 70 75 80Leu Tyr Ala Arg Thr Asp Arg Arg Pro Ile Gln His Gly Asp Phe Val85 90 95Arg Ser Ala Pro Ile Arg Gln Arg Tyr Trp Ala Arg Asn Phe Val Gly100 105 110Trp Pro Gln Phe Ser Ser His Gln Pro Asn Pro Ala His Trp Ala Leu115 120 125Ser Thr Trp Glu Lys Leu Gly Lys Leu Tyr Trp Leu Val Thr Gln Asn130 135 140Val Asp Ala Leu His Thr Lys Ala Gly Ser Arg Arg Leu Thr Glu Leu145 150 155 160His Gly Cys Met Asp Arg Val Leu Cys Leu Asp Cys Gly Glu Gln Thr165 170 175Pro Arg Gly Val Leu Gln Glu Arg Phe Gln Val Leu Asn Pro Thr Trp180 185 190Ser Ala Glu Ala His Gly Leu Ala Pro Asp Gly Asp Val Phe Leu Ser195 200 205Glu Glu Gln Val Arg Ser Phe Gln Val Pro Thr Cys Val Gln Cys Gly210 215 220Gly His Leu Lys Pro Asp Val Val Phe Phe Gly Asp Thr Val Asn Pro225 230 235 240Asp Lys Val Asp Phe Val His Lys Arg Val Lys Glu Ala Asp Ser Leu245 250 255Leu Val Val Gly Ser Ser Leu Gln Val Tyr Ser Gly Tyr Arg Phe Ile260 265 270Leu Thr Ala Trp Glu Lys Lys Leu Pro Ile Ala Ile Leu Asn Ile Gly275 280 285Pro Thr Arg Ser Asp Asp Leu Ala Cys Leu Lys Leu Asn Ser Arg Cys290 295 300Gly Glu Leu Leu Pro Leu Ile Asp Pro Cys305 310<210>5<211>310<212>PRT<213>智人<400>5Met Arg Pro Leu Gln Ile Val Pro Ser Arg Leu Ile Ser Gln Leu Tyr1 5 10 15Cys Gly Leu Lys Pro Pro Ala Ser Thr Arg Asn Gln Ile Cys Leu Lys20 25 30Met Ala Arg Pro Ser Ser Ser Met Ala Asp Phe Arg Lys Phe Phe Ala35 40 45Lys Ala Lys His Ile Val Ile Ile Ser Gly Ala Gly Val Ser Ala Glu50 55 60Ser Gly Val Pro Thr Phe Arg Gly Ala Gly Gly Tyr Trp Arg Lys Trp65 70 75 80Gln Ala Gln Asp Leu Ala Thr Pro Leu Ala Phe Ala His Asn Pro Ser85 90 95Arg Val Trp Glu Phe Tyr His Tyr Arg Arg Glu Val Met Gly Ser Lys100 105 110Glu Pro Asn Ala Gly His Arg Ala Ile Ala Glu Cys Glu Thr Arg Leu115 120 125
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权利要求
1.治疗或预防疾病的方法，该方法包括向对象施用有效量的具有式(I)的化合物 其中，R1和R2与它们结合的碳一起，形成C5-C10环烷基，C5-C10杂环基，C5-C10环烯基，C5-C10杂环烯基，C6-C10芳基，或C6-C10杂芳基，它们中的每一个可以任选地被1-5个R5取代；或R1是H，S-烷基，或S-芳基，且R2是酰氨基烷基，其中氮被烷基、芳基或芳基烷基取代，它们中的每一个任选地进一步被烷基、卤素、羟基或烷氧基取代；R3和R4与它们结合的碳一起，形成C5-C10环烷基，C5-C10杂环基，C5-C10环烯基，C5-C10杂环烯基，C6-C10芳基，或C6-C10杂芳基，它们中的每一个任选地被1-5个R6取代；每个R5和R6独立地是卤素，羟基，C1-C10烷基，C1-C6卤代烷基，C1-C10烷氧基，C1-C6卤代烷氧基，C6-C10芳基，C5-C10杂芳基，C7-C12芳烷基，C7-C12杂芳烷基，C3-C8杂环基，C2-C12链烯基，C2-C12炔基，C5-C10环烯基，C5-C10杂环烯基，羧基，羧酸盐(酯)，氰基，硝基，氨基，C1-C6烷基氨基，C1-C6二烷基氨基，巯基，SO3H，硫酸盐(酯)，S(O)NH2，S(O)2NH2，磷酸盐(酯)，C1-C4亚烷二氧基，氧代，酰基，氨基羰基，C1-C6烷基氨基羰基，C1-C6二烷基氨基羰基，C1-C10烷氧基羰基，C1-C10硫代烷氧基羰基，肼基羰基，C1-C6烷基肼基羰基，C1-C6二烷基肼基羰基，羟基氨基羰基；烷氧基氨基羰基；或R5或R6之一和R7形成含有4-6个碳、1-3个氮、0-2个氧和0-2个硫的环状基团，其任选地被氧或C1-C6烷基取代；X是NR7，O，或S；Y是NR7’，O或S；----代表任选的双键；R7和R7’各自独立地是氢，C1-C6烷基，C7-C12芳基烷基，C7-C12杂芳基烷基；或R7与R5或R6之一形成含有4-6个碳、1-3个氮、0-2个氧和0-2个硫的环状基团，其任选地被氧或C1-C6烷基取代；和n是0或1。
2.权利要求1的方法，其中R1和R2与它们结合的碳一起，形成C5-C10环烷基，C5-C10杂环基，C5-C10环烯基，C5-C10杂环烯基，C6-C10芳基，或C6-C10杂芳基，它们中的每一个可以任选地被1-5个R5取代。
3.权利要求1的方法，其中R1和R2与它们结合的碳一起，形成C5-C10环烯基。
4.权利要求3的方法，其中R1和R2被R5取代。
5.权利要求4的方法，其中R5是被取代基取代的C1-C6烷基或被取代基取代的氨基羰基。
6.权利要求5的方法，其中取代基是氨基取代基或氨基羰基。
7.权利要求1的方法，其中R3和R4与它们结合的碳一起，形成C6-C10芳基。
8.权利要求5的方法，其中R3和R4被R6取代。
9.权利要求6的方法，其中R6是卤素或C1-C6烷基。
10.权利要求1的方法，其中n是0。
11.权利要求1的方法，其中X是NR7。
12.权利要求1的方法，其中n是0，且X是NR7。
13.权利要求1的方法，其具有下面的式(X) 式(X)。
14.权利要求13的方法，其中R6是卤素或C1-C6烷基。
15.权利要求13的方法，其中R5是氨基羰基。
16.权利要求13的方法，其具有下面的式(XI) 式(XI)。
17.权利要求16的方法，其中R6是卤素或烷基。
18.权利要求16的方法，其中R5是氨基羰基。
19.权利要求16的方法，其中R6是卤素或烷基，且其中R5是氨基羰基。
20.权利要求13的方法，其中化合物是6-氯-2，3，4，9-四氢-1H-咔唑-1-甲酸酰胺。
21.权利要求20的方法，其中化合物包含超过60％对映体过量的具有-14.1旋光度(c＝0.33 DCM)的对映体。
22.权利要求21的方法，其中化合物包含超过90％对映体过量的具有-14.1旋光度(c＝0.33 DCM)的对映体。
23.权利要求1的化合物，其中相对于非-SirT1 sirtuin，化合物优先抑制SirT1。
24.权利要求1的化合物，其中化合物对SirT1具有至少5倍优先。
25.权利要求1的化合物，其中化合物对SirT1具有小于约1μM的Ki。
26.权利要求1的方法，其中疾病是肿瘤性疾病。
27.权利要求26的方法，其中肿瘤性疾病是癌症。
28.权利要求1的方法，其中疾病是神经变性疾病。
29.权利要求28的方法，其中神经变性疾病是阿尔茨海默氏病或帕金森氏病。
30.权利要求1的方法，其中疾病是脂肪细胞相关的疾病。
31.权利要求30的方法，其中化合物的施用会增强对象中的脂肪形成。
32.权利要求1的方法，其中疾病是糖尿病。
33.权利要求32的方法，其中对象具有I型糖尿病。
34.权利要求32的方法，其中对象具有II型糖尿病。
35.权利要求1的方法，其中对象被鉴别为处于糖尿病的危险中。
36.权利要求35的方法，其中已经通过葡萄糖耐量降低，将患者鉴别为处于糖尿病的危险中。
37.权利要求35的方法，其中已经通过空腹高血糖症，将患者鉴别为处于糖尿病的危险中。
38.权利要求1的方法，其中疾病是代谢综合征。
39.权利要求38的方法，其中对象具有致动脉粥样化的血脂障碍。
40.权利要求38的方法，其中对象是肥胖的。
41.权利要求38的方法，其中对象具有胰岛素抵抗或受损的葡萄糖耐受不良。
42.权利要求38的方法，其中对象具有高血压。
43.具有式(XI)的化合物， 其中R6是卤素或C1-C6烷基，且p是0，1，或2；且其中，化合物具有与具有-14.1的旋光度(c＝0.33 DCM)的6-氯-2，3，4，9-四氢-1H-咔唑-1-甲酸酰胺的立体异构体相同的相对立体化学。
44.权利要求43的化合物，其中R6是氯或甲基。
45.权利要求43的化合物，其中p是1。
46.具有-14.1的旋光度(c＝0.33 DCM)的6-氯-2，3，4，9-四氢-1H-咔唑-1-甲酸酰胺的立体异构体。
全文摘要
在此描述了式(I)的化合物和通过施用式(I)化合物治疗疾病的方法。疾病的实例包括肿瘤性疾病，脂肪细胞相关疾病，神经变性疾病，和代谢紊乱。
文档编号C07D209/82GK101035527SQ200580033718
公开日2007年9月12日 申请日期2005年9月13日 优先权日2004年9月13日
发明者A·纳佩尔, P·迪斯特法诺, R·科特斯, J·黑克森, T·麦克多诺, L·J·胡勃, J·M·所罗门, R·J·托马斯, J-F·庞斯 申请人:伊利舍医药品公司