专利名称：人参糖肽的制备方法、药物制剂及医药用途的制作方法
技术领域：
本发明公开一种人参糖肽的制备方法、药物制剂，还公开了人参糖肽在治疗多种原因引起的糖尿病及其并发症的新用途，属于中药或天然药物的提取制备技术领域。
背景技术：
目前，人参的分离纯化深加工产品得到人们的广泛研究，如人参皂苷、人参多糖等。本发明涉及的人参糖肽注射液的研制成功是国内首创，是目前我国治疗糖尿病的唯一中药注射剂。该药的药理学研究从生化药理学和分子药理学的水平，阐明了人参糖肽降低血糖的作用机制，同时在国内外首次发现人参糖肽是β-受体激动剂，对人参糖肽降低血糖的作用机理提出了一个较完整的概念，为临床应用人参糖肽治疗糖尿病奠定了分子药理学的基础。
关于人参糖肽治疗糖尿病及其并发症等的报道在本发明完成之前没有报道；人参糖肽具有治疗糖尿病及其并发症的人参糖肽组分，也是首次分离得到，且工艺方法简单、适用，提取的人参糖肽部分活性强、纯度高(50％以上)，是一种适合于产业化生产的新方法。
发明内容
本发明目的之一是提供了一种适合于产业化生产人参糖肽的工艺。
本发明的目的之二是提供了以人参糖肽为药物原料研制的药物制剂。
本发明的目的之三是提供了以活性人参糖肽组分为主要药物或与其它药物组方在预防和治疗糖尿病及其并发症等疾病的用途。
本发明具体解决方案如下 1、人参糖肽的制备 (1)、人参粗糖肽的提取取人参干品粉成粗粉，加6～8倍量50％乙醇回流提取，过滤，药渣再分别用5倍和4.5倍量50％乙醇回流提取，过滤，合并三次滤液，蒸发回流乙醇，在搅拌条件下加4～6倍量的95％乙醇，静置，滤取沉淀，得粗人参糖肽湿品； (2)、人参粗糖肽的精制取粗人参糖肽加蒸馏水，搅拌至溶，0-3℃条件下放置24小时，过滤，除去不溶物，澄明液中加粉末活性碳，室温搅拌，使吸附平衡，静置，滤取澄明液，将滤液浓缩，喷雾干燥或冷冻干燥，得人参糖肽精品。
2、人参糖肽注射剂的制备 按处方量取人参糖肽，氯化钠，用注射用水溶解，溶液通过微孔滤膜至澄明，再和向溶液中加吐温-80，用G4滤球过滤，分装于2ml安瓶中，熔封，灭菌，检查合格后包装即得。
人参糖肽经DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱分离、Sephadex G-150、G-100柱分离纯化得到主要降血脂活性组分PGP-II，PGP-II经SephadexG-100凝胶层析、醋酸纤维薄膜电泳，Con-A-Sepharose 4B，亲和层析证明为均一糖肽。
PGP-II水解后经纤维素薄层层析以及醋酸酯的气相色谱分析，证明主要由由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖四种单糖基组成，其摩尔比为Rha∶Ara∶Gal∶Glc(0.46∶1.61∶1∶2.37)。分子量为6000，肽部分由天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸等16种氨基酸组成。PGP-II的甲基化分析结果表明糖肽中单糖的连接方式主要是(1→4)Glc、(1→4)、(1→6)Gal，(1→4或5)Ara，Ara和Glc为主要末端。分枝点应在Glc的6位，Gal的4或6位，Gal为(1→4)。
本发明的上述方法可用于产业化大量制备具有降血糖等活性的组分。
按药剂学方法，可以将本发明的人参糖肽制备成临床注射剂型作为糖尿病及其并发症等疾病的治疗药物。
本发明的药物优选含有1％-99％的人参糖肽和99％-1％的赋形剂(包括其它配伍的药物)，优选含有30％-80％的人参糖肽和70％-20％的药用赋形剂(包括其它配伍用的药物)，最好含有60％-70％的人参糖肽和40％-30％的赋形剂(包括其它配伍用的药物)。
本发明的药物中的辅料是指常规的赋形剂，如溶剂、防腐剂、着色剂等。本发明药物中的其它配伍用的药物，指的是以有效剂量的人参糖肽为一定的药物原料，再配伍其它可允许合用的中药或化学药品。
本发明的人参糖肽药物制剂具有治疗糖尿病及其并发症等疾病，是通过以下的药效实验得到证实。人参糖肽降低血糖和肝糖原的作用 材料和方法 昆明种小鼠，体重18-22g，Wistar大鼠，体重160-180g，白兔，2.5-3.0kg均购自本院动物室。
人参糖肽由本院剂型研究室提供，为淡黄色粉末，用时以生理盐水配成所需浓度，流通蒸气灭菌一小时备用。
血糖测定按邻甲苯胺法，肝糖原测定按碘试剂法。
试验 一、人参糖肽对正常和实验性高血糖动物血糖和肝糖原含量的影响。
(一)、不同给药途径注射人参糖肽对小鼠和白兔血糖及肝糖原含量的影响 雄性小鼠64只，随机分为8组，于3日内，按表1所示剂量每天腹腔或皮下注射人参糖肽一次.对照组注射生理盐水5ml/kg，末次给药后2小时，处死动物，测血糖和肝糖原。结果表明，人参糖肽可明显降低血糖和肝糖原含量。
另取白兔18只，随机分为3组，每组雌雄各半，按表1所示剂量肌肉注射人参糖肽，对照组注射生理盐水0.5ml/kg，6小时后，处死白兔，取血和肝组织，测血糖和肝糖原。结果表明，肌肉注射人参糖肽亦可明显降低白兔血糖和肝糖原含量(见表1) 表1 人参糖肽对小鼠(ip，sc)和白兔(im)血糖和肝糖原的影响 与对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 (二)、人参糖肽一次注射给药后不同时间对小鼠和白兔血糖和肝糖原含量的影响。
雄性小鼠96只随机分为4组，第1和3组分别注射生理盐水5ml/kg，第2和4组注射人参糖肽200mg/kg，按表2所示不同时间，每组断头处死3只小鼠，测血糖和肝糖原，由表2可知，人参糖肽具有明显的降血糖和肝糖原作用。
另取白兔20只，随机分为2组.每组雌雄各半，第1组静脉注射生理盐水0.5ml/kg，第2组静脉注射人参糖肽60mg/kg，分别于注射后1、4和8小时，从耳缘静脉取血测血糖，于末次取血后立即剪头处死动物，取肝测肝糖原，由表2可见，注射人参糖肽后1小时，对血糖无明显影响，但对于注射人参糖肽后4小时血糖开始降低，至给药后8小时，血糖和肝糖原仍明显低于低于对照组(见表2) 表2 人参糖肽一次注射给药后不同时间对小鼠和白兔血糖及肝糖原的影响 与对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，a＝给药后时间(小时) 二、人参糖肽对肾上腺素引起的高血糖的影响； 雄性小鼠48只，随机分成3组，第1和2组皮下注射生理盐水5ml/kg，第3组皮下注射人参糖肽100mg/kg，连续给药7天，待未次给药后20分钟，第1组腹腔注射生理盐水5ml/kg，第2和3组腹腔注射肾上腺素240μg/kg，于注射肾上腺素后2和30分钟。分别将上述3组动物剪头处死8只，取血和肝组织，测血糖，总血脂和肝糖原。结果表明人参糖肽可降低肾上腺素引起的高血糖，并能增强忏上腺素降低肝糖原作用。两者对总血脂均无明显影响。
见表3。
三、人参糖肽对葡萄糖引起高血糖的影响。
雄性小鼠144只，随机分为3组，第1和2组皮下注射生理盐水10ml/kg，第3组皮下注射人参糖肽100mg/kg，连续给药7天。末次给药后30分钟，第1组静脉注射生理盐水10ml/kg，第2和3组静脉注射葡萄糖2g/kg，分别于静脉注射后2，30，60，120，240和480分钟将每组动物处死8只，测血糖和肝糖原。由表4可见，连续皮下注射人参糖肽后对葡萄糖引起的高血糖和肝糖原水平的增高均有抑制作用。
见表4 四、人参糖肽对四氧嘧啶引起大鼠高血糖的影响。
将80只雄性大鼠测定一次血糖后，将血糖值低于90mg％或高于130mg％弃之不用。留用大鼠中取12只做正常对照，其余全部大鼠静脉注射四氧嘧啶70mg/kg，注射后第5天，分别测定大鼠血糖一次，筛除血糖低于300mg％和高于450mg％者，将48只高血糖大鼠随机分为4组，从注射第6天开始，正常对照组和四氧嘧啶对照组大鼠每天皮下注射一次生理盐水2ml/kg，另一组高血糖大鼠皮下注射胰岛素1u/kg，其余两组高血糖大鼠分别皮下注射人参糖肽100和200mg/kg，于第8和第11天皮下注射人参糖肽后1小时，取尾静脉血测血糖，然后停止给药，于第17天，取大鼠尾静脉血，测血糖，从第18天再继续给药，至第21天皮下注射人参糖肽后1小时处死大鼠，测血糖和肝糖原。见表5，结果表明连续皮下注射人参糖肽可明显降低四氧嘧啶所引起的高血糖，其降血糖作用随剂量增加而增强，停止给药后，人参糖肽和胰岛素治疗组血糖逐渐升高，再次给药后，人参糖肽义出现降血糖和肝糖原作用，而胰岛素组在使血糖降低时，肝糖原含量升高，从而表明人参糖肽对糖代谢的影响与胰岛素不同。
见表5 五、对四氧嘧啶引起白兔高血糖的影响 将60只白兔从耳缘静脉取血以超微量法测定血糖，将血糖值低于100mg％和高于120mg％者弃之不用，留用白兔中取8只作为正常对照组，其余全部白兔从耳缘静脉注射四氧嘧啶175mg/kg，注射后第4天，采血测血糖，筛除血糖值低于360mg％和高于500mg％者，然后按体重和血糖值匀分4组，每组8只白兔。从注射四氧嘧啶后第5天开始至11天，正常对照组和四氧嘧啶对照组白兔每天肌肉注射生理盐水0.5ml/kg，另一组高血糖白兔肌肉注身胰岛素1U/kg，其余两组高血糖白兔肌肉注射人参糖肽30和60mg/kg，于注射四氧嘧啶后第8和11天，采血测血糖，然后停止给药，于注射四氧嘧啶后14天，再测一次血糖，然后继续给药、至第17天注射药物后1小时采血测血糖，结果表明连续肌肉注射人参糖肽可明显降低四氧嘧啶引起的白兔高血糖，停止给药后，人参糖肽和胰岛素组血糖值都逐渐升高，再次给药后，人参糖肽和胰岛素组均又呈现降血糖作用，在所用剂量下人参糖肽降血糖作用强度略低于胰岛素组，且有明显的显效关系。
见表6 六、对链脲霉素引起小鼠高血糖的影响 雄性小鼠90只全部腹腔注射链脲霉素90mg/kg，腹腔注射第5天取眼眶血以超微量法测血糖，筛除血糖值低于250mg％和高于400mg％者，然后按体重和血糖值匀分6组，每组12只小鼠，另取同批12只正常小鼠作为正常对照组。从注射链脲霉素第5天开始至11天，正常对照组和链脲霉索对照组小鼠每天皮下注射一次生理盐水10ml/kg，另一组高血糖小鼠皮下注射胰岛素5U/kg，其余3组高血糖小鼠分别皮下注射人参糖肽50，100和200mg/kg，于注射链脲霉素后第8天和11天，分别取眼眶血测血糖、然后停止给药，于注射链脲霉素后第14天，再测一次血糖，然后继续给药，至第17天注射药物后1小时，处死小鼠，以超微量法测血糖，结果表明连续皮下注射人参糖肽可明显降低链脲霉素引起的高血糖，且有明显的量效关系，停止给药后，人参糖肽和胰岛素组血糖值都逐渐升高，再次给药后，人参糖肽和胰岛素组均又呈现降血糖作用。
见表7 表3 人参糖肽对肾上腺素引起的高血糖的影响 与模型对照组比较*P＜0.05；***P＜0.001， 与肾上腺素组比较×P＜0.05，××P＜0.01 a＝注射肾上腺素后时间(分钟) 表4 人参糖肽对葡萄糖引起高血糖的影响 与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与葡萄糖组比较×P＜0.05，××P＜0.01，×××P＜0.0 表5 人参糖肽对四氧嘧啶引起大鼠高血糖的影响 与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，与四氧嘧啶组比较×P＜0.05，××P＜0.01，×××P＜0.00 表6 人参糖肽对四氧嘧啶引起白兔高血糖的影响 与对照组比较×××P＜0.001 与四氧嘧啶组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001表7 人参糖肽对链脲霉素引起小鼠高血糖的影响 与对照组比较×P＜0.05，××P＜0.01，×××P＜0.001 与链脲霉素组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 七、对去肾上腺大鼠血糖和肝糖原含量的影响。
将24只去肾上腺雄性大鼠随机分为3组，另取8只正常大鼠为正常对照组，按表8所示剂量静脉注射一次人参糖肽，正常对照组和病理对照组静脉注射生理盐水2ml/Lg，给药后2小时，断头处死动物，测血糖和肝糖原.结果表明人参糖肽对摘除双侧肾上腺大鼠的血糖和肝糖原含量仍具有明显的降低作用，其作用随剂量增加而增强。
表8 人参糖肽对去肾上腺大鼠血糖和肝糖原含量的影响 与去肾上腺组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001 讨论 上述实验结果表明，人参糖肽sc，iv，ip和im对小鼠和白兔正常血糖及小鼠，大鼠和白兔的各种实验性高血糖均具有降低作用，其在使血糖降低时，肝糖原含量亦降低，表明其作用与胰岛素不同，后者在使血糖降低时，使肝糖原含量增加。由于人参糖肽对去肾上腺大鼠仍不失其降低血糖和肝糖原作用。从而表明其降低肝糖原作用并不依赖于肾上腺素，人参糖肽能增强肾上腺素降低肝糖原作用，也充分证实了这一点。由此可见，人参糖肽很可能是人参中降血糖作用的主要有效成份。
本发明的药理学研究从生化药理学和分子药理学的水平，阐明了人参糖肽降低血糖的作用机制，同时在国内外首次发现人参糖肽是β-受体激动剂，对人参糖肽降低血糖的作用机理提出了一个较完整的概念，为临床应用人参糖肽治疗糖尿病奠定了分子药理学的基础。
具体实施例方式 通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1 人参糖肽的制备 (1)、人参粗糖肽的提取取人参干品1kg，粉成粗粉，加7倍量50％乙醇回流提取3小时，过滤，药渣再分别用5倍和4.5倍量50％乙醇回流提取2小时，过滤，合并三次滤液，蒸发回流乙醇至800ml，在搅拌条件下加95％乙醇4000ml，静置，滤取沉淀，得粗人参糖肽湿品。
(2)、人参粗糖肽的精制取1项所得粗糖肽加蒸馏水1000ml，搅拌至溶，置0-3℃冰箱中放置24小时，过滤，除去不溶物，澄明液中加粉末活性碳30g，室温搅拌20分钟，使吸附平衡，静置，滤取澄明液，将滤液浓缩到400ml，喷雾干燥或冷冻干燥，得白色或微黄色人参糖肽精品。即可供配制注射液用。
实施例2 人参糖肽注射剂的制备 按处方量取人参糖肽5g，氯化钠17g，用2000ml注射用水溶解，溶液通过微孔滤膜至澄明，再和向溶液中加吐温-80 8g，用G4滤球过滤，分装于2ml安瓶中，熔封，灭菌，检查合格后包装即得。
其它项目应符合中华人民共和国药典2000版注射液项目有关要求。
实施例3 人参糖肽的制备 (1)、人参粗糖肽的提取取人参干品1kg，粉成粗粉，加8倍量50％乙醇回流提取3小时，过滤，药渣再分别用5倍和4.5倍量50％乙醇回流提取2小时，过滤，合并三次滤液，蒸发回流乙醇至800ml，在搅拌条件下加95％乙醇4000ml，静置，滤取沉淀，得粗人参糖肽湿品。 (2)、人参粗糖肽的精制取粗糖肽加蒸馏水1000ml，搅拌至溶，置0-3℃冰箱中放置24小时，过滤，除去不溶物，澄明液中加粉末活性碳30g，室温搅拌20分钟，使吸附平衡，静置，滤取澄明液，将滤液浓缩到400ml，喷雾干燥或冷冻干燥，得白色或微黄色人参糖肽精品。即可供配制注射液用。
实施例4 人参糖肽注射剂的制备 按处方量取人参糖肽，氯化钠，用注射用水溶解，溶液通过微孔滤膜至澄明，再和向溶液中加吐温-80，用G4滤球过滤，分装于2ml安瓶中，熔封，灭菌，检查合格后包装即得。
其它项目应符合中华人民共和国药典2000版注射液项目有关要求。
权利要求
1、一种人参糖肽，分子量为6000，肽部分由天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸16种氨基酸组成；PGP-II的甲基化分析结果表明糖肽中单糖的连接方式主要是(1→4)Glc、(1→4)、(1→6)Gal，(1→4或5)Ara，Ara和Glc为主要末端；分枝点应在Glc的6位，Gal的4或6位，Gal为(1→4)。
2、人参糖肽的制备方法，包括以下步骤
(1)、人参粗糖肽的提取取人参干品粉成粗粉，加6～8倍量50％乙醇回流提取，过滤，药渣再分别用5倍和4.5倍量50％乙醇回流提取，过滤，合并三次滤液，蒸发回流乙醇，在搅拌条件下加4～6倍量的95％乙醇，静置，滤取沉淀，得粗人参糖肽湿品；
(2)、人参粗糖肽的精制取粗人参糖肽加蒸馏水，搅拌至溶，0-3℃条件下放置24小时，过滤，除去不溶物，澄明液中加粉末活性碳，室温搅拌，使吸附平衡，静置，滤取澄明液，将滤液浓缩，喷雾干燥或冷冻干燥，得人参糖肽精品。
3、人参糖肽注射剂的制备
按处方量取人参糖肽，氯化钠，用注射用水溶解，溶液通过微孔滤膜至澄明，再和向溶液中加吐温-80，用G4滤球过滤，分装于2ml安瓶中，熔封，灭菌，检查合格后包装即得。
4、人参糖肽药物制剂，其特征在于含有治疗有效剂量的人参糖肽以及一种或多种药学上的赋形剂，或其它药物。
5、人参糖肽在制备预防和治疗糖尿病及其并发症疾病药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种人参糖肽的制备方法和药物制剂，同时也公开了人参糖肽的医药的新用途。本发明以人参为原料，利用不同分子量的物质在不同浓度的乙醇中溶解度不同的原理，采用50％乙醇回流提取，80％乙醇沉淀的方法，得到人参糖肽粗品，同时控制其分子量的大致范围，再通过冷藏、脱色及超滤技术，除去杂质，得到精制的人参糖肽。该人参糖肽经配液、灌封、灭菌、包装等工序，生产出人参糖肽注射液。其药物制剂可用于预防和治疗糖尿病及其并发症等疾病。
文档编号C07K1/00GK1931874SQ20061001723
公开日2007年3月21日 申请日期2006年10月11日 优先权日2006年10月11日
发明者杨明, 赵全成, 冯辉 申请人:吉林省中医中药研究院