胃癌靶向AFP基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途的制作方法

专利名称：：胃癌靶向AFP基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及表达甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)基因的胃癌的基因治疗药物，具体涉及靶向AFP基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途，属于生物医药
技术领域：
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背景技术：
：早在1970年BourreilleJ等在《PresseMed.》上发表了“胃起源的二级肝癌中甲胎蛋白的存在”一文(BourreilleJ，MetayerP，SaugerF，etal.Existenceofalpha-fetoproteinduringgastric-originsecondarycanceroftheliver.PresseMed.1970Jun6；78(28)1277-8.)，首次报道了一例AFP表达阳性胃癌(alpha-fetoprotein-producinggastriccarcinoma，APGC)。有关APGC的文献报道主要来自日本，APGC发病率国外文献统计占胃癌的5.1％～15％。国内报道发病率比国外低，其原因主要是对该种类型的胃癌缺乏认识，未能常规做病理标本AFP的免疫组化染色所致。这类胃癌虽占少数，但具有明显的侵袭性和恶性生物学行为，其临床病理学特征也与普通型胃癌有较大不同。2002年，KonoK等在《消化外科》上发表了“甲胎蛋白表达阳性胃癌的临床病理学特征”的研究(KonoK，AmemiyaH，SekikawaT.Clinicopathologicfeaturesofgastriccancersproducingalphafetoprotein.DigSurg.2002；19(5)359-65.)，对大量APGC胃癌患者进行研究，发现其淋巴结转移率、浸润深度、临床分期、肝转移率都高于AFP阴性组，胃癌根治切除术后生存率明显低于AFP阴性组，AFP被认为是一个独立的预后因素。了解APGC高侵袭性的分子作用机制对于今后制定出新的诊断治疗方案有着重要的意义。然而，AFP的升高与APGC的高侵袭性之间的关系尚不明确。AFP在胎儿循环中浓度很高，但在出生后不久就急剧下降，到产后第2个月末仅能测出微量AFP，几乎完全被血清白蛋白取代。AFP在胎儿期是必不可少的，它在胎儿的生长过程中发挥着很重要的生理作用，如作为结合、运输配体的工具，AFP能与雌激素相互作用，与脂肪酸、胆红素有很高的亲和力，能有效地结合铜，镍离子等；另外AFP的免疫抑制作用可保护胎儿免受母体免疫攻击。而成人血中AFP含量升高则是发生多种疾病的标志，包括肝细胞癌、某些胃肠道肿瘤及某些生殖系胚胎肿瘤等，然而AFP基因表达的调控及其生物学活性十分复杂，其与这些AFP相关肿瘤发生发展之间的关系尚未完全阐明。近年来人们已意识到甲胎蛋白在肿瘤生长中的调节作用并开始了大量实验研究，尤其是AFP与肿瘤的增殖，凋亡和免疫监视等方面的关系，而AFP基因表达的调控机制也越来越受到人们的关注。1998年发现的RNA干涉技术(RNAi，RNAinterfering)是双链RNA通过降解其同源mRNA来特异沉默相应同源基因表达的一个过程，是一种在动植物中序列特异的转录后基因沉默(PTGS，post-transcriptionalgenesilencing)过程。RNA干扰技术可以在基因转录水平抑制基因的表达，其作用分子-小干扰RNA(siRNA，smallinterferingRNA)因其众多优点已作为一种潜在的治疗肿瘤的方法引起人们的广泛关注。首先是它的高效性，少量的siRNA就可以有效的抑制同源性基因的表达；其次是siRNA有严格的序列特异性，可以特异性的沉默致病基因，而正常基因表达却不受影响。由于体外得到的siRNA进入细胞后容易被降解且产生的RNA干扰效应持续时间短，因此现在研究人员多利用质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。2002年，BrummelkampTR等在《科学》上发表了“一种在哺乳动物细胞内可稳定表达小干扰RNA的系统”的研究(BrummelkampTR，BernardsR，AgamiR.ASystemforStableExpressionofShortInterferingRNAsinMammalianCells[J].Science，2002Apr19，296550-553.)，他们通过构建一种新的载体系统(命名为pSUPER)以在哺乳动物细胞内指导siRNA合成。在RNA聚合酶III启动子H1与作为终止信号的五个胸腺嘧啶(T5)之间插入反向重复序列(对应双链RNA的正义链和反义链)，两个反向重复序列之间夹一长度不定的间隔区，将具有如上结构的pSUPER导入细胞内，转录从G或A开始，在转录终止位点的第二个碱基处终止，这样就合成了一条RNA链，这条RNA链可以通过两端的各19个核苷酸反向互补特性而折叠成具有3’-UU或TT突出末端的发夹样双链结构，形成小发夹RNA(smallhairpinRNAs，shRNAs)，shRNA的作用与siRNA分子类似，可进一步起到基因抑制作用。利用这种自然现象发展起来的RNAi技术能够迅速而简单地制备某个基因功能缺失表型，其快速发展为基因功能研究、基因治疗、药物筛选等领域提供了新技术平台。本发明采用SiRNA相关技术构建了针对AFP基因的3种SiRNAs表达质粒，成功的抑制了AFP基因的表达，并筛选出抑制率最高的一个SiRNA表达质粒，为制备治疗分泌AFP蛋白胃癌的最佳基因药物提供了理论依据。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种胃癌靶向AFP基因的siRNAs表达载体构建、筛选及其用途的方法。本发明以利用RNA干涉技术为主，针对AFP基因的不同靶序列，构建了三个能在哺乳动物细胞中表达shRNA的表达质粒pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP-siRNA1和pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP-siRNA3，其示意图谱见图1，能高效的特异性的抑制AFP基因表达，可用于制备治疗分泌AFP的胃癌的基因药物。本发明的技术方案如下靶向AFP基因的siRNAs表达载体，其特征是，以pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector为载体，针对AFP基因编码区上、中、下游的三段序列，在可特异表达AFP的人胃腺癌细胞株FU97中发挥RNA干扰作用，这三段AFP特异性RNA干涉靶序列分别为①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’，起始于508位；②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’，起始于968位；③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，起始于1474位，是用于与AFP相关的胃癌的治疗性物质，由以下方法制得(1)RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成选择AFP基因编码区的三段序列①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’、②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’、③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，设计并分别体外合成两段互补的寡核苷酸序列，序列如下①AFP寡核苷酸序列1正义链5’gatccGCAGGGAGACATTCATGAACTTCAAGAGAGTTCATGAATGTCTCCCTGTTTTTTACGCGTg3’反义链5’aattcACGCGTAAAAAACAGGGAGACATTCATGAACTCTCTTGAAGTTCATGAATGTCTCCCTGCg3’②AFP寡核苷酸序列2正义链5’gatccGCTGGAACGTGGTCAATGTATTCAAGAGATACATTGACCACGTTCCAGTTTTTTACGCGTg3’反义链5’aattcACGCGTAAAAAACTGGAACGTGGTCAATGTATCTCTTGAATACATTGACCACGTTCCAGCg3’③AFP寡核苷酸序列3正义链5’gatccGGCTGACATTATTATCGGATTCAAGAGATCCGATAATAATGTCAGCCTTTTTTACGCGTg3’反义链5’aattcACGCGTAAAAAAGGCTGACATTATTATCGGATCTCTTGAATCCGATAATAATGTCAGCCg3’(2)将上述合成的寡核苷酸分别与线性载体pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector连接、转化、扩增及质粒的提取首先用TE缓冲液重悬AFP寡核苷酸1/2/3干粉，上下游序列以1∶1混合，95℃30秒，72℃2分钟，37℃2分钟，25℃2分钟完成退火；然后将退火后的双链寡核苷酸与pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选，将单克隆阳性重组子小量扩增，再用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA；(3)质粒的鉴定质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector质粒中。本发明的胃癌靶向AFP基因的有效siRNAs表达载体在制备治疗分泌AFP蛋白的胃癌的基因药物中的应用。为了对AFP基因siRNAs表达质粒对AFP基因的抑制效果及对胃癌细胞的抑制作用进行鉴定，脂质体转染细胞，提取总RNA，收集培养上清，化学发光法和免疫细胞化学法测定AFP蛋白水平的表达，RT-PCR法测定对AFP基因表达的抑制作用，MTT法和AnnexinV/PI双染色法流式细胞术检测抑制AFP基因后对肿瘤细胞生长及凋亡的影响。本发明的针对AFP基因构建的3种siRNAs表达质粒是可用于AFP相关胃癌的治疗物质，其中AFP-siRNA1和AFP-siRNA3抑制胃癌细胞生长并能诱导肿瘤细胞凋亡的效率较高，可用于进一步研究AFP基因的功能及在实验动物体内进行基因治疗研究。本发明的胃癌靶向AFP基因的siRNAs表达载体的制备方法和生物学活性的鉴定主要包括如下内容一、质粒的制备，包括RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成，将上述合成的寡核苷酸分别与线性载体pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector连接、转化、扩增及质粒DNA的提取，质粒的鉴定。二、质粒生物学活性的鉴定，包括质粒的转染、脂质体转染效率的计算、RT-PCR检测AFP基因的表达、化学发光法和免疫细胞化学法测定AFP蛋白水平的表达、MTT法检测抑制AFP基因后肿瘤细胞生长情况及AnnexinV/PI双染色法检测抑制AFP基因后肿瘤细胞凋亡情况。下面详细说明本发明制备方法中各步骤的具体操作方法1.RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成将AFP基因编码序列中的AA二聚体及其下游的19个核苷酸作为潜在的siRNA靶位点，从上、中、下游随机选取三段符合件的靶序列，即不选择5’和3’非编码区及靠近起始密码子区域，也不选择有连续三个或更多T的序列，GC含量在50％左右时最理想等；应用PrimerPremier5.0分析软件检查这21个碱基的寡核苷酸有无二级结构以防错误的退火；将潜在的序列和相应的基因组数据库进行BLAST序列比对，排除那些和其它编码序列同源的序列。为找到具有最佳沉默效果的靶位点，选取三段靶序列，分别为①CAGGGAGACATTCATGAAC，起始于508位，GC含量为47％；②CTGGAACGTGGTCAATGTA，起始于968位，GC含量为47％；③GGCTGACATTATTATCGGA，起始于1474位，GC含量为42％。另外阳性对照(Luciferaseoligonucleotide，荧光素酶寡核苷酸)，阴性对照(Negativeoligonucleotide)由载体试剂盒同时提供。每一正向单链寡核苷酸内，19nt的寡核苷酸以正反向组合，中间以TTCAAGAGA的发夹环序列间隔，使寡核苷酸内部可形成发夹结构，每对寡核苷酸的核心序列反向互补，每对寡核苷酸两端分别带有BamHI和EcoRI酶切位点，如图2所示。按照以上所述，三个靶序列设计后的寡核苷酸序列如前所述。2.合成的寡核苷酸分别与线性载体pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector连接、转化、扩增及质粒的提取用TE缓冲液重悬AFP寡核苷酸序列1/2/3干粉，上、下游序列以1∶1混合，95℃30秒，72℃2分钟，37℃2分钟，25℃2分钟完成退火。将退火后的双链寡核苷酸与pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector用T4DNA连接酶连接，同时连接试剂盒中提供的阳性对照和阴性对照，用超纯水代替寡核苷酸做空白对照。将连接产物转化入EcoliDH5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选，将单克隆阳性重组子小量扩增，用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA。3.质粒的鉴定质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，送上海英骏生物工程技术服务有限公司进行插入片断测序。上述方法所构建的质粒生物学活性鉴定方法如下1.胃癌细胞培养及质粒的转染FU97培养在含10％胎牛血清的DMEM中，置于37℃，5％CO2培养箱中。转染前24小时，将肿瘤细胞接种在6孔培养板上，每孔约5×105个细胞，使每孔细胞饱和度在转染前达到90％以上，铺板时不使用含抗生素的培养液。种板后24小时，按Lipofectamine2000转染试剂说明书方法，对于6孔板中的每一孔，将质粒DNA(包括实验质粒、对照质粒)和Lipofectamine2000以1(μg)∶2.5(μl)的比例进行转染，并在转染后8-12h于荧光显微镜下直接观察DsRed荧光蛋白的表达，估算转染效率。改变质粒载体和转染剂的比例(质粒DNA∶脂质体分别为2μg∶5μl、4μg∶10μl、8μg∶20μl)以优化转染。2.总RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效应的半定量RT-PCR检测(1)提取总RNA取转染后的胃癌细胞FU97，用PBS漂洗2次，按106-107个细胞加1mlTrizol(Invitrogen)裂解细胞，裂解液转至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入200μl氯仿，剧烈振荡30秒，12000转/分4℃离心5分钟，小心取上清移至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入与上清等体积的异丙醇，室温放置5分钟后12000转/分4℃离心5分钟，小心弃上清，70％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀2次，室温下自然晾干，用ddH2O(含1％DEPC)溶解，下续反应。(2)cDNA的合成和PCR反应使用Takara公司的RT-PCR试剂盒，先按50℃30min，99℃5min，5℃5min的步骤分别合成cDNA，反应总体系为10μl，包括MgCI22μl，10XRTBuffer1μl，dNTPs混合物1μl，RNaseInhibitor0.25μl，AMVReverseTranscriptase0.5μl，OligodT-AdaptorPrimer0.5μl，RNA4.8μl；然后取cDNA1μl在PCR仪(PE5700)中进行扩增，反应条件为94℃2min一个循环，94℃30sec，56℃30sec，72℃1min共30个循环，反应总体系为20μl，包括5XPCRbuffer5μl，灭菌蒸馏水9.875μl，TaKaRaExTaqHS酶0.125μl，AFP上、下游引物各1μl，内参GAPDH上、下游引物各1μl，cDNA1μl。PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR引物序列见表1。表1目的基因PCR引物序列及扩增片段长度3.蛋白水平验正AFP基因表达的变化(1)化学发光法检测培养上清，转染后48小时，应用美国雅培公司的全自动化学发光免疫分析仪及配套的AFP定量检测试剂盒，检测培养上清液中细胞分泌的AFP蛋白含量的变化，计算抑制率，并利用方差分析比较实验组和对照组之间的AFP表达水平有无显著性差异。(2)免疫细胞化学法检测细胞内外蛋白免疫细胞化学法的主要原理是利用荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体(或抗原)，对细胞内的相应抗原(或抗体)进行定性、定位或定量检测，经过化学呈色反应之后，用显微镜进行观察，从而在抗原抗体结合部位确定细胞结构的化学成分或化学性质。我们应用高度灵敏的SP(StreptavidinPeroxidase，过氧化物酶标记的链霉素)免疫细胞化学方法对转染质粒48h后的FU97中AFP表达水平进行检测。先将FU97以约5×105个/ml的细胞密度接种在已铺有无菌盖玻片的6孔板内，37℃，5％CO2下生长24小时后进行转染，转染后48小时取出盖玻片，在室温下用免疫细胞化学试剂盒(中杉金桥)进行实验。4.阳性对照抑制效率的检测购买载体RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector时其试剂盒中同时提供阳性对照(针对荧光素酶基因的寡核苷酸)，即此段寡核苷酸在细胞内表达的shRNA绝对可发挥RNA干扰作用而抑制荧光素酶基因的表达，从而说明所购载体完全适用于RNA干扰技术。转染后48小时，应用荧光素酶检测系统(Promega)检测。5.细胞的增殖活性变化我们采用的是MTT比色法来测定细胞活力，此法原理是MTT易被水溶解，透过细胞膜而进入细胞内，活细胞内的线粒体脱氢酶能将MTT转变为不溶于水的蓝紫色甲替(Formazam)结晶颗粒，此结晶可被酸性异丙醇，SDS，DMSO等有机溶剂溶解，依颜色深浅可通过分光光度计测定出各吸光度值，由于结晶物形成的量与细胞数量及代谢活性成比例，因此吸光度(A)值的大小可反映活细胞的数量及活性，而死亡细胞没有线粒体脱氢酶活性，与MTT不起反应。将FU97细胞接种于96孔培养板中，细胞终密度约为2×104/ml，体积100μl，接种后24小时进行转染。分别培养0h，24h，48h，72h后每孔加入100μlMTT液(5mg/ml)，继续培养4h后，小心弃去上清液，加入100μlDMSO液，震荡，待蓝紫色溶解后，在全自动酶标仪上测定各孔A492。抑制率＝(1-实验组A值平均值/对照组A值平均值)×100％。每个时间点测定3孔求平均值，以时间为横轴，以抑制率为纵轴绘制曲线。6.细胞凋亡水平的变化我们采用的是AnnexinV/PI双染色法来检测细胞的凋亡。细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面，而膜联蛋自V(AnnexinV)是一种Ca2+依赖，对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可通过识别细胞膜表面的PS从而识别凋亡细胞，但PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中，两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了，所以需同时用碘化丙啶(PI)来染细胞膜破损的细胞，这样AnnexinV-FITC阳性而PI阴性的就是早期凋亡细胞。PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，只能结合细胞膜有损伤的细胞的DNA，在细胞凋亡晚期，细胞膜裂解损毁，同坏死细胞一样，AnnexinV-FITC和PI染色同时阳性。通过比较实验组和空白对照组的PI，可确定是否有凋亡晚期的细胞。具体方法如下，在转染48h后，按以下步骤应用AnnexinV-FITC和PI双染色法检测该肿瘤细胞被抑制后的凋亡情况先用胰酶消化下待测细胞，用4℃预冷的PBS洗细胞两次，用250μl1X结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×106/ml；取100μl的细胞悬液加入一个5ml流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和10μl20μg/ml的PI溶液；混匀后于室温避光孵育15分钟；在反应管中加400μlPBS，上流式细胞仪(FACSCalibur)分析。所构建质粒及生物活性的鉴定结果如下1.质粒DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图3示，与Marker的条带比较可见质粒DNA位于9416bp和6557bp之间，已知构建好的质粒大小约为6740bp左右；另外比较②至⑦的条带亮度和面积可看出质粒之间的浓度大小和紫外分光光度计的结果相符。2.紫外分光光度计检测结果如表2所示各质粒浓度如下，结果与电泳图相符。另外各质粒的A260/A280之比中，个别比值稍低于1.75，说明有少量蛋白质污染。表2紫外分光光度计检测所提质粒DNA的浓度和纯度3.测序结果通过测序(图4)验证了插入序列与我们合成的寡核苷酸序列完全符合，说明我们成功构建了pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP1/2/34.转染率计算结果转染后11-12h左右，在荧光显微镜下观察DsRed红色荧光蛋白的表达，取三个视野分别在光镜下计细胞总数，在荧光镜下计表达特异红色荧光的细胞数以计算质粒的转染率(转染率＝同一视野下发荧光的细胞/同一视野下所有细胞％)。为了优化转染效率，用不同比例的质粒载体和脂质体进行转染(见表3)，以4μg∶10μl下转染效率较高，且脂质体对细胞的毒性较小，为质粒和转染剂的合适比例(如图5)。当脂质体体积更大时(8μg∶20μl)，对细胞的毒性较大，细胞形态不佳(如图7)。5.RT-PCR结果转染后48小时，RT-PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果如图9所示，各组均可见AFP基因的特异性条带(275bp)和内参GAPDH主带(500bp)，与空白对照的条带比较可发现pDonorVector-AFP2的亮度变化不明显，说明此质粒对AFP基因的抑制不明显；而pDonorVector-AFP1和pDonorVector-AFP3的AFP条带亮度较弱，说明此二质粒抑制AFP的效率较高。6.化学发光法检测培养上清中AFP的结果转染后48小时，取FU97培养上清检测细胞分泌的AFP蛋白含量的变化，实验重复五次，取平均值。计算实验组的抑制率，抑制率＝(1-实验组平均值/空白对照平均值)×100％，得出pDonorVector-AFP1作用后抑制率为36.46％，pDonorVector-AFP3为32.84％；而pDonorVector-AFP2抑制率最低，为11.77％。另外利用方差分析，将实验组三组和空白对照组的AFP表达水平进行两两比较，认为实验组三组与空白对照组之间的AFP水平均不同(P＜0.01)，pDonorVector-AFP1组和pDonorVector-AFP3组作用后的AFP水平与pDonorVector-AFP2组之间均不同(P＜0.01)，但pDonorVector-AFP1组和pDonorVector-AFP3组之间的AFP水平没有显著性差异(P＞0.05)。7.免疫细胞化学法检测结果转染后48小时，AFP的免疫细胞化学结果见图10、11。棕黄色颗粒沉着代表甲胎蛋白表达阳性，如图10所示转染后48h，空白对照组FU97细胞中的AFP表达较多，多数细胞均有棕黄色颗粒沉着，而如图11所示实验组FU97细胞中仅个别细胞有棕黄色颗粒沉着。8.阳、阴性对照抑制效率的检测结果转染后48小时，检测阳性对照质粒和阴性对照质粒中荧光素酶基因表达结果如图12、13所示，阳性对照质粒作用后荧光素酶的Intensity(a.u.)为182.066，阴性对照质粒作用后荧光素酶的Intensity(a.u.)为932.074，抑制率＝(1-182.066/932.074)×100％＝80.47％。此结果说明阳性对照质粒很好的发挥了RNA干扰作用，有效抑制了荧光素酶基因的表达，即所购载体完全适用于RNA干扰技术。9.MTT结果抑制曲线如图14，可见pDonorVector-AFP1的抑制作用最明显，而pDonorVector-AFP2的抑制率最低。10.流式凋亡结果转染后48h，AnnexinV/PI双染色法检测FU97凋亡结果如图15。实验组与空白对照组比较可见，AnnexinV-FITC表达率很低，即未在转染后48小时发现明显早期凋亡细胞；但PI的表达率有升高，pDonorVector-AFP1/2/3的％Gated分别为46.69％、42.79％、38.48％，而空白对照为23.31％，说明排除坏死细胞外，有相当一部分为晚期凋亡细胞，且pDonorVector-AFP1作用后诱导的晚期凋亡细胞最多。本发明的优良效果如下本发明在近几年国内外RNA干涉研究的工作基础上，针对AFP基因，利用RNA干扰技术结合基因重组技术成功构建了U6启动子驱动的3种siRNAs表达质粒，并通过在AFP阳性的胃癌细胞株FU97中表达AFP特异性发夹状siRNAs分子，特异性的抑制了AFP基因的表达，并筛选出抑制率最高的一种SiRNA表达质粒，以达到特异性、有效阻断AFP表达及治疗胃癌的目的。(1)本发明构建的3种AFP特异性siRNAs表达质粒可有效抑制AFP基因的表达。主要有如下优点①本质粒可在大肠杆菌DH5α中大量扩增，即可不断获得表达siRNAs的载体；②针对AFP编码区上、中、下游分别设计了RNA干扰的靶位点，从而找到了对AFP基因抑制效率较高的位点；③安全性高，无插入突变危险，亦无免疫毒性反应。(2)本发明构建、筛选的AFP特异性siRNAs表达质粒针对AFP基因，抑制效果明显。本发明的针对AFP基因的siRNAs表达质粒是可用于AFP相关胃癌的治疗物质，能显著抑制肿瘤细胞生长并能诱导其凋亡，可进一步研究AFP基因的功能及在实验动物体内进行基因治疗研究。图1质粒pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector示意图。图2shRNA寡核苷酸序列的设计。图3质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图，①λ-HindIIIdigestDNAMarker，②空白对照质粒，③阴性对照质粒，④阳性对照质粒(pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-Luciferase)，⑤pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP3，⑥pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP2，⑦pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP1。图4插入的AFPoligonucleotide1/2/3测序图。图5质粒载体∶脂质体＝2μg∶5μl时肿瘤细胞中DsRed红色荧光蛋白的表达。图6质粒载体∶脂质体＝4μg∶10μl时肿瘤细胞中DsRed红色荧光蛋白的表达。图7质粒载体∶脂质体＝8μg∶20μl时肿瘤细胞中DsRed红色荧光蛋白的表达。图8正常对照细胞，无红色荧光表达。图9RT-PCR产物图，①DNAMarkerDL2000，②空白对照，③pDonorVector-AFP3，④pDonorVector-AFP2，⑤pDonorVector-AFP1。图10转染后48h，免疫细胞化学法检测空白对照组FU97的AFP表达。图11转染后48h，免疫细胞化学法检测实验组FU97的AFP表达。图12转染后48小时，阳性对照质粒作用后FU97中荧光素酶的表达Wavelength(nm)＝527.76，Int.(a.u.)＝182.066。图13转染后48小时，阴性对照质粒作用后FU97中荧光素酶的表达Wavelength(nm)＝562.56，Int.(a.u.)＝932.074。图14MTT法测定转染不同质粒后对FU97生长的抑制。图15-18为转染后48h，AnnexinV/PI双染色法检测FU97凋亡情况。图15，Z为空白对照，图16、17、18中1/2/3分别对应pDonorVector-AFP1/2/3。具体实施方式下面结合实例对本发明作进一步说明，但不仅限于此。一.主要试剂1.载体RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector购自Clontech公司2.T4DNA连接酶和RT-PCR试剂盒购自Takara公司3.质粒小量提取试剂盒QIAprepSpinMiniprepKit购自QIAGEN公司4.AFP特异性PCR引物合成、AFP特异性siRNA寡核苷酸链合成和DNA序列测定由上海英骏生物工程技术服务有限公司完成5.转染试剂Lipofectamine2000Reagent和TRzolReagent购自Invitrogen公司6.荧光素酶检测系统购自Promega公司7.鼠抗人α甲胎蛋白单克隆抗体、免疫组化染色试剂盒和浓缩型DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司8.凋亡试剂AnnexinVFITCKit购自晶美生物工程有限公司二.主要仪器1.紫外分光光度计(GeneQuantPro)AmershamBiosciences2.凝胶成像系统(ChemilmagerTM4400)AlphaInnotech3.生物安全柜(Hfsafel200)上海力申科学仪器公司4.二氧化碳培养箱(HF90)上海力申科学仪器公司5.荧光显微镜(ECLIPSETE2000-S)Nikon6.CCD(penguinl50CL)美国pixera公司7.台式冷冻离心机(TGL-16G)上海安亭科学仪器厂8.PCR仪(PE5700)ABI9.全自动化学发光免疫分析仪(AbbottAXSYMSYSTEM)美国雅培公司10.流式细胞仪(FACSCalibur)BECTONDICKINSON11.荧光光谱仪(VARIANCARYEclipse)美国VARIAN公司12.全自动酶标仪(MultiskanMk3)ThermoLabsystems三.质粒的制备方法及其生物学活性鉴定1.RNA干涉靶序列的选择及插入模板的设计与合成1.1选择靶序列选取AFP基因的三段靶序列，分别为①CAGGGAGACATTCATGAAC，起始于508位，GC含量为47％；②CTGGAACGTGGTCAATGTA，起始于968位，GC含量为47％；③GGCTGACATTATTATCGGA，起始于1474位，GC含量为42％。另外阳性对照(Luciferaseoligonucleotide，荧光素酶寡核苷酸)，阴性对照(Negativeoligonucleotide)由载体试剂盒同时提供。1.2设计寡核苷酸每一正向单链寡核苷酸内，19nt的寡核苷酸以正反向组合，中间以TTCAAGAGA的发夹环序列间隔，使寡核苷酸内部可形成发夹结构，每对寡核苷酸的核心序列反向互补，每对寡核苷酸两端分别带有BamHI和EcoRI酶切位点，如图2所示。按照以上所述，三个靶序列设计后的寡核苷酸序列如下AFP寡核苷酸序列15’gatccGCAGGGAGACATTCATGAACTTCAAGAGAGTTCATGAATGTCTCCCTGTTTTTTACGCGTg3’，5’aattcACGCGTAAAAAACAGGGAGACATTCATGAACTCTCTTGAAGTTCATGAATGTCTCCCTGCg3’；AFP寡核苷酸序列25’gatccGCTGGAACGTGGTCAATGTATTCAAGAGATACATTGACCACGTTCCAGTTTTTTACGCGTg3’，5’aattcACGCGTAAAAAACTGGAACGTGGTCAATGTATCTCTTGAATACATTGACCACGTTCCAGCg3’；AFP寡核苷酸序列35’gatccGGCTGACATTATTATCGGATTCAAGAGATCCGATAATAATGTCAGCCTTTTTTACGCGTg3’，5’aattcACGCGTAAAAAAGGCTGACATTATTATCGGATCTCTTGAATCCGATAATAATGTCAGCCg3’。2.构建pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP-siRNA载体2.1退火用TE缓冲液(10mMTris-HCI，1mMEDTA，Ph8.0)重悬AFP的寡核苷酸干粉至浓度为100μM，上下游序列以1∶1混合，95℃30sec，72℃2min，37℃2min，25℃2min完成退火。取其中1μl退火后的双链寡核苷酸用TE缓冲液稀释成100μl，即浓度为0.5μM，下续反应。其余的放-20℃保存。2.2连接AFP的双链寡核苷酸1/2/3分别与pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector(载体图谱见图1)，用T4DNA连接酶连接，同时连接试剂盒中提供的阳性对照(针对荧光素酶基因的寡核苷酸)和阴性对照，空白对照(超纯水代替寡核苷酸)。室温放置3小时以进行连接。反应结束后取2μl进行下面实验，其余的保存在-20℃。2.3转化取制备好的E.coliDH5α感受态细胞6管(50μl/每Ep管)，冰上融化10min，分别加入各连接产物2μl混匀，冰上放置30min，每隔5min轻轻摇动Ep管，42℃水浴中放置60-70sec，勿晃动；迅速取出置于冰中，静置1-2min，每管加500μl的LB液，37℃振摇(约170转)1小时左右，取不同体积菌液(80-150μl)涂布于含氨苄青霉素(终浓度为100g/ml)的LB平板上，37℃培养12-16小时。2.4阳性重组子小量扩增与分离纯化挑选上述含氨苄的LB平板中的单个克隆，种在5ml含氨苄青霉素(终浓度为100g/ml)的LB液中，37℃振摇(约170转)14-16小时左右。每组都分别挑选5个克隆。实验组各取1ml菌液送上海英骏生物工程技术服务有限公司进行插入片断测序。另用甘油保存余下菌液，置-80℃备用。取出测序结果正确的菌种，划线接种在含氨苄的LB平板上，37℃孵育14-16小时。挑单个菌落接种在4ml含氨苄的LB液体培养基中，37℃振摇(约170转)14-16小时左右。取约3ml菌液按QIAprepSpinMiniprepKit(QIAGEN)说明书提取质粒。3.质粒DNA的检测3.1琼脂糖凝胶电泳分析配制0.8％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭)，取1μ1质粒DNA进行电泳，检测提取的质粒DNA。3.2紫外分光光度计分析取1μl质粒DNA用69μl超纯水稀释，在紫外分光光度计(GeneQuantPro)下检测A260nm和A280nm处的吸光值，以测定质粒DNA的浓度和纯度。4.胃癌细胞培养及质粒的转染FU97培养在含10％胎牛血清的DMEM中，置于37℃，5％CO2培养箱中。转染前24小时，将肿瘤细胞接种在6孔培养板上，每孔约5×105个细胞，使每孔细胞饱和度在转染前达到90％以上，铺板时不使用含抗生素的培养液。种板后24小时，按Lipofectamine2000转染试剂说明书方法，对于6孔板中的每一孔，将质粒DNA(包括实验质粒、对照质粒)和Lipofectamine2000以1(μg)∶2.5(μl)的比例进行转染，并在转染后8-12h于荧光显微镜下直接观察DsRed荧光蛋白的表达，估算转染效率。改变质粒载体和转染剂的比例(质粒DNA∶脂质体分别为2μg∶5μl、4μg∶10μl、8μg∶20μl)以优化转染。5.总RNA的提取、cDNA的合成及RNA干涉效应的半定量RT-PCR检测5.1提取总RNA取转染后的胃癌细胞FU97，用PBS漂洗2次，按106-107个细胞加1mlTrizol(Invitrogen)裂解细胞，裂解液转至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入200μl氯仿，剧烈振荡30秒，12000转/分4℃离心5分钟，小心取上清移至1.5ml大小RNase-free的Ep管，加入与上清等体积的异丙醇，室温放置5分钟后12000转/分4℃离心5分钟，小心弃上清，70％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀2次，室温下自然晾干，用ddH2O(含1％DEPC)溶解，下续反应。5.2cDNA的合成和PCR反应使用Takara公司的RT-PCR试剂盒，先按50℃30min，99℃5min，5℃5min的步骤分别合成cDNA，反应总体系为10μl，包括MgCI22μl，10XRTBuffer1μl，dNTPs混合物1μl，RNaseInhibitor0.25μl，AMVReverseTranscriptase0.5μl，OligodT-AdaptorPrimer0.5μl，RNA4.8μl；然后取cDNA1μl在PCR仪(PE5700)中进行扩增，反应条件为94℃2min一个循环，94℃30sec，56℃30sec，72℃1min共30个循环，反应总体系为20μl，包括5XPCRbuffer5μl，灭菌蒸馏水9.875μl，TaKaRaExTaqHS酶0.125μl，AFP上、下游引物各1μl，内参GAPDH上、下游引物各1μl，cDNA1μl。PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR引物序列见表1。6.化学发光法检测培养上清转染后48小时，应用美国雅培公司的全自动化学发光免疫分析仪及配套的AFP定量检测试剂盒，检测培养上清液中细胞分泌的AFP蛋白含量的变化，计算抑制率，并利用方差分析比较实验组和对照组之间的AFP表达水平有无显著性差异。7.免疫细胞化学法检测细胞内外蛋白应用免疫细胞化学方法对转染质粒48h后的FU97中AFP表达水平进行检测。先将FU97以约5×105个/ml的细胞密度接种在已铺有无菌盖玻片的6孔板内，37℃，5％CO2下生长24小时后进行转染，转染后48小时取出盖玻片，在室温下用免疫细胞化学试剂盒(中杉金桥)进行实验。8.阳性对照抑制效率的检测购买载体RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector时其试剂盒中同时提供阳性对照(针对荧光素酶基因的寡核苷酸)，即此段寡核苷酸在细胞内表达的shRNA绝对可发挥RNA干扰作用而抑制荧光素酶基因的表达，从而说明所购载体完全适用于RNA干扰技术。转染后48小时，应用荧光素酶检测系统(Promega)检测。9.细胞的增殖活性变化我们采用的是MTT比色法来测定细胞活力，将FU97细胞接种于96孔培养板中，细胞终密度约为2×104/ml，体积100μl，接种后24小时进行转染。分别培养0h，24h，48h，72h后每孔加入100μlMTT液(5mg/ml)，继续培养4h后，小心弃去上清液，加入100μlDMSO液，震荡，待蓝紫色溶解后，在全自动酶标仪上测定各孔A492。抑制率＝(1-实验组A值平均值/对照组A值平均值)×100％。每个时间点测定3孔求平均值，以时间为横轴，以抑制率为纵轴绘制曲线。10.细胞凋亡水平的变化在转染48h后，按以下步骤应用AnnexinV-FITC和PI双染色法检测该肿瘤细胞被抑制后的凋亡情况先用胰酶消化下待测细胞，用4℃预冷的PBS洗细胞两次，用250μl1X结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×106/ml；取100μl的细胞悬液加入一个5ml流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和10μl20μg/ml的PI溶液；混匀后于室温避光孵育15分钟；在反应管中加400μlPBS，上流式细胞仪(FACSCalibur)分析。四.结果1.质粒DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图3示，与Marker的条带比较可见质粒DNA位于9416bp和6557bp之间，已知构建好的质粒大小约为6740bp左右；另外比较②至⑦的条带亮度和面积可看出质粒之间的浓度大小和紫外分光光度计的结果相符。2.紫外分光光度计检测结果如表2所示各质粒浓度如下，结果与电泳图相符。另外各质粒的A260/A280之比中，个别比值稍低于1.75，说明有少量蛋白质污染。3.测序结果通过测序(图4)验证了插入序列与我们合成的寡核苷酸序列完全符合，说明我们成功构建了pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector-AFP1/2/34.转染率计算结果转染后11-12h左右，在荧光显微镜下观察DsRed红色荧光蛋白的表达，取三个视野分别在光镜下计细胞总数，在荧光镜下计表达特异红色荧光的细胞数以计算质粒的转染率(转染率＝同一视野下发荧光的细胞/同一视野下所有细胞％)。为了优化转染效率，用不同比例的质粒载体和脂质体进行转染(见表3)，以4μg∶10μl下转染效率较高，且脂质体对细胞的毒性较小，为质粒和转染剂的合适比例(图5)。当脂质体体积更大时(8μg∶20μl)，对细胞的毒性较大，细胞形态不佳(图7)。表3质粒载体和脂质体不同比例下的转染效率5.RT-PCR结果转染后48小时，RT-PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果如图9所示，各组均可见AFP基因的特异性条带(275bp)和内参GAPDH主带(500bp)，与空白对照的条带比较可发现pDonorVector-AFP2的亮度变化不明显，说明此质粒对AFP基因的抑制不明显；而pDonorVector-AFP1和pDonorVector-AFP3的AFP条带亮度较弱，说明此二质粒抑制AFP的效率较高。6.化学发光法检测培养上清中AFP的结果转染后48小时，取FU97培养上清检测细胞分泌的AFP蛋白含量的变化，实验重复五次，取平均值。计算实验组的抑制率，抑制率＝(1-实验组平均值/空白对照平均值)×100％，得出pDonorVector-AFP1作用后抑制率为36.46％，pDonorVector-AFP3为32.84％；而pDonorVector-AFP2抑制率最低，为11.77％。另外利用方差分析，将实验组三组和空白对照组的AFP表达水平进行两两比较，认为实验组三组与空白对照组之间的AFP水平均不同(P＜0.01)，pDonorVector-AFP1组和pDonorVector-AFP3组作用后的AFP水平与pDonorVector-AFP2组之间均不同(P＜0.01)，但pDonorVector-AFP1组和pDonorVector-AFP3组之间的AFP水平没有显著性差异(P＞0.05)。7.免疫细胞化学法检测结果转染后48小时，AFP的免疫细胞化学结果见图10、11。棕黄色颗粒沉着代表甲胎蛋白表达阳性，如图10所示转染后48h，空白对照组FU97细胞中的AFP表达较多，多数细胞均有棕黄色颗粒沉着，而如图11所示实验组FU97细胞中仅个别细胞有棕黄色颗粒沉着。8.阳、阴性对照抑制效率的检测结果转染后48小时，检测阳性对照质粒和阴性对照质粒中荧光素酶基因表达结果如图12、13所示，阳性对照质粒作用后荧光素酶的Intensity(a.u.)为182.066，阴性对照质粒作用后荧光素酶的Intensity(a.u.)为932.074，抑制率＝(1-182.066/932.074)×100％＝80.47％。此结果说明阳性对照质粒很好的发挥了RNA干扰作用，有效抑制了荧光素酶基因的表达，即所购载体完全适用于RNA干扰技术。9.MTT结果抑制曲线如图14，可见pDonorVector-AFP1的抑制作用最明显，而pDonorVector-AFP2的抑制率最低。10.流式凋亡结果转染后48h，AnnexinV/PI双染色法检测FU97凋亡结果如图15。实验组与空白对照组比较可见，AnnexinV-FITC表达率很低，即未在转染后48小时发现明显早期凋亡细胞；但PI的表达率有升高，pDonorVector-AFP1/2/3的％Gated分别为46.69％、42.79％、38.48％，而空白对照为23.31％，说明排除坏死细胞外，有相当一部分为晚期凋亡细胞，且pDonorVector-AFP1作用后诱导的晚期凋亡细胞最多。序列表<110>汪运山<120>胃癌靶向AFP基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途<160>9<170>PatentIn3.1<210>1<211>19<212>DNA5’-cagggagacattcatgaac-3’19<210>2<211>19<212>DNA5’-ctggaacgtggtcaatgta-3’19<210>3<211>19<212>DNA5’-ggctgacattattatcgga-3’19<210>4<211>66<212>DNA5’gatccgcagggagacattcatgaacttcaagagagttcatgaatgtctccctgtttttta60cgcgtg3’66<210>5<211>66<212>DNA5’aattcacgcgtaaaaaacagggagacattcatgaactctcttgaagttcatgaatgtctc60cctgcg3’66<210>6<211>66<212>DNA5’gatccgctggaacgtggtcaatgtattcaagagatacattgaccacgttccagtttttta60cgcgtg3’66<210>7<211>66<212>DNA5’aattcacgcgtaaaaaactggaacgtggtcaatgtatctcttgaatacattgaccacgtt60ccagcg3’66<210>8<211>65<212>DNA5’gatccggctgacattattatcggattcaagagatccgataataatgtcagccttttttac60gcgtg3’65<210>9<211>65<212>DNA5’aattcacgcgtaaaaaaggctgacattattatcggatctcttgaatccgataataatgtc60agccg3’6权利要求1.靶向AFP基因的siRNAs表达载体，其特征是，以pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector为载体，针对甲胎蛋白(AFP)基因编码区上、中、下游的三段序列，在可特异表达AFP的人胃腺癌细胞株FU97中发挥RNA干扰作用，这三段AFP特异性RNA干涉靶序列分别为①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’，起始于508位；②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’，起始于968位；③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，起始于1474位，是用于与AFP相关的胃癌的治疗性物质，由以下方法制得(1)RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成选择AFP基因编码区的三段序列①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’、②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’、③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，设计并分别体外合成两段互补的寡核苷酸序列，序列如下①AFP寡核苷酸序列1正义链5’gatccGCAGGGAGACATTCATGAACTTCAAGAGAGTTCATGAATGTCTCCCTGTTTTTTACGCGTg3’反义链5’aattcACGCGTAAAAAACAGGGAGACATTCATGAACTCTCTTGAAGTTCATGAATGTCTCCCTGCg3’②AFP寡核苷酸序列2正义链5’gatccGCTGGAACGTGGTCAATGTATTCAAGAGATACATTGACCACGTTCCAGTTTTTTACGCGTg3’反义链5’aattcACGCGTAAAAAACTGGAACGTGGTCAATGTATCTCTTGAATACATTGACCACGTTCCAGCg3’③AFP寡核苷酸序列3正义链5’gatccGGCTGACATTATTATCGGATTCAAGAGATCCGATAATAATGTCAGCCTTTTTTACGCGTg3’反义链5’aattcACGCGTAAAAAAGGCTGACATTATTATCGGATCTCTTGAATCCGATAATAATGTCAGCCg3’(2)将上述合成的寡核苷酸分别与线性载体pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector连接、转化、扩增及质粒的提取首先用TE缓冲液重悬AFP寡核苷酸1/2/3干粉，上下游序列以1∶1混合，95℃30秒，72℃2分钟，37℃2分钟，25℃2分钟完成退火；然后将退火后的双链寡核苷酸与pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选，将单克隆阳性重组子小量扩增，再用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA；(3)质粒的鉴定质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pSIREN-DNR-DsRed-ExpressDonorVector质粒中。2.权利要求1的胃癌靶向AFP基因的有效siRNAs表达载体在制备治疗分泌AFP蛋白的胃癌的基因药物中的应用。全文摘要一种胃癌靶向AFP基因的siRNAs表达载体构建、筛选及其用途。本发明以利用RNA干涉技术为主，针对AFP基因的不同靶序列，构建了三个能在哺乳动物细胞中表达shRNA的表达质粒pSIREN－DNR－DsRed－ExpressDonorVector－AFP－siRNAl、pSIREN－DNR－DsRed－ExpressDonorVector－AFP－siRNA2和pSIREN－DNR－DsRed－ExpressDonorVector－AFP－siRNA3，能高效的特异性的抑制AFP基因表达，可用于制备治疗分泌AFP的胃癌的基因药物。文档编号C07H21/00GK1940074SQ200610069659公开日2007年4月4日申请日期2006年8月7日优先权日2006年8月7日发明者汪运山,胡安拉,马晓丽,朱之炜,肖东杰,孙善会,郏雁飞,周芳申请人:汪运山