灵敏检测分析物的新标记策略的制作方法

专利名称：：灵敏检测分析物的新标记策略的制作方法灵敏检测分析物的新标记策略描述本发明涉及检测分析物例如核酸的方法和试剂。该新的方法和试剂允许简单而灵敏的检测，甚至在复杂生物样品内。发明背景为特定耙序列，例如为单核苷酸多态性的存在、某种基因例如抗性基因的存在或mRNA的存在而对遗传物质的快速分析需要容易使用的、高效而可靠的新工具。主要困难是需要直接检测少量生物样品(如患者血液或植物)内的目的DNA或RNA。这些生物样品仅以;微量提供分析物。为了达到需要的灵敏度，通常需要在分析之前扩增核酸分析物的扩增步骤，或者使用扩增从DNA/RNA分析物直接得到的微量检测信号的检测方法。扩增核酸分析物的方法包括PCR和其他的核酸扩增方案。PCR扩增具有这样的主要优点，即从获自生物材料的不同DNA链集合体中仅扩增目的DNA序列。这是可靠地分析复杂生物样品中单个基因的基础。然而，PCR扩增需要复杂的方法步骤，这些步骤在某些情况下非常不便和昂贵。检测信号的扩增可以通过使指定底物连续转化成有色产物的酶(如辣根过氧化物酶)与分析物结合而实现。DNA金属化是扩增检测信号的另一种方法。与DNA/RNA连接的单个金属粒子(核心)催化更多金属的沉积，这进一步催化金属沉积[l-9。由金属沉积诱导的信号因此以指数方式增加。金属沉积可以以电学方式在分析物访文置于两个电极间时加以检测，或以光学方式(例如用肉眼)检测，因为沉积的金属例如在纸上、凝胶内或试管内产生黑色点。原则上，金属沉积是最灵敏的检测方法，因为少量金属团簇(核心)足以启动金属沉积反应。然而，实践中例如，在电极上、凝胶内或在承载分析物的纸上，例如通过与分析物在空间非常靠近的杂质所致的非特异性金属成核作用限制了此方法的灵敏度。实际上，非特异性金属沉积是为什么没有在寡核苷酸分析中常规使用DNA银染法的主要原因。银染法还受到DNA自身不能形成初始核心的困扰。银染法需要预先修饰。目前选择的方法是使DNA与戊二醛反应，其中所述的戊二醛通过与核碱基上伯胺基的非序列特异性结合而与DNA共价连接[7。若用银盐处理，这种加合物在与DNA结合的同时，使盐的Ag+还原成作为所需的核心起作用的原子银。对成核DNA用银盐和还原剂的进一步处理启动指数型金属沉积。另一种可能是通过Ag+交换在DNA链上的抗衡离子，随后Ag+还原产生Agn成核点。主要缺点是戊二醛也与靠近分析物的杂质或化学物质反应，这又诱导非特异性银沉积。与DNA连接的金属团簇如Au、Pd粒子或Pt-络合物也作为成核点发挥作用以使更多金属沉积，多至构成导电金属丝l-9。此处金属团簇与DNA形成共价键的活性基团连接，或与刚好插入或与DNA/RNA结合的单元连接。所有这些方法标记生物样品内的全部DNA，因而不允许序列特异性标记以及因此不允许序列特异性地分析复杂生物样品内的靶DNA，如单个基因。在[8内描述了通过端粒末端转移酶介导，将胺改性的三磷酸核苦导入引物启动性改性的端粒重复序列内而制备标记的DNA结构域。含胺的端粒用活化的金纳米颗粒N-琥珀酰亚铵基酯官能化以产生金纳米颗粒DNA链。通过沿着DNA的进一步金属沉积对这些纳米颗粒点的扩大实际上导致金属团簇快速生长直至构成以DNA为模板的分子纳米金属丝。然而，胺改性的三磷酸盐引入生长的端粒末端的效率低下并且需要导致成核点分散的三砩酸盐掺入。因此，该方法不允许序列特异性标记。近来也通过复合平版石印方法尝试DNA的位点特异性标记[4。根据该方法，通过RecA结合实现对DNA分子的部分保护。未保护的DNA序列随后用标记这些序列以^更金属化的戊二醛处理。通过DNA结合的醛的作用对银离子的位点特异性还原导致沿着这些区域形成金属丝。然而不可能序列特异性地标记复杂生物样品内的核酸分子。虽然这些文献证实了DNA的新标记策略中的意义，但是为实现标记所涉及的复杂方法阻碍了这些系统用于任何实际应用。具体而言，这些方法不能直接选择性地标记粗制生物样品内的目的DNA或RNA序列。因此本发明的目的是提供简单、高效且特异性检测复杂生物样品内的分冲斤物、特别是核酸的新方法和试剂。发明简述本发明第一方面涉及检测样品内的分析物例如核酸的方法和试剂盒，其中形成待检测分析物与新的醛官能化化合物的締合产物，这允许通过形成标记基团，例如在所述締合产物内的醛基周围的金属沉积物而进行序列特异性检测。更具体地，此方面的实施方案涉及检测样品内分析物的方法，其包括一下步骤(i)提供样品；(ii)使样品与包含至少一个官能团的官能化化合物在所述化合物与待检测分析物形成締合产物的条件下接触，其中所述官能团选自醛基、受保护醛基、醛前体基团或用于导入醛基、受保护醛基或醛前体基团的手柄基团(handlegroup);(iii)根据需要，使手柄基团与包含醛基、受保护醛基或醛前体基团的反应配偶物反应；(iv)根据需要，将受保护醛基和醛前体基团转化成醛基；(v)使具有醛基的所述締合产物与标记试剂在其中标记基团在所述締合产物内的醛基周围形成的条件下接触；和(vi)检测所述标记基团。此第一方面的另一实施方案涉及检测样品内分析物的试剂盒，其包含..(a)官能化化合物，其包含选自醛基、受保护醛基或醛前体基团，或用于导入醛基、受保护醛基或醛前体基团的手柄基团的官能团，(b)任选地，用于包含醛基、受保护醛基或醛前体基团的手柄基团的反应配^f禺物，(c)任选地，能够将受保护醛基和醛前体基团转化成醛基的醛形成试剂，和(d)标记试剂。此第一方面的另一实施方案涉及式(I)化合物A-S-N其中A是选自醛基、受保护醛基或醛前体基团的官能团，S是间隔基或键，优选是共价键，并且N是核酸结构单元或核酸类似物结构单元如核苷性化合物或核苷酸性化合物。在第二方面，本发明涉及用于检测样品内分析物例如核酸的方法和试剂盒，其包括与待检测分析物形成締合产物的点击官能化化合物的用途。序列特异性地导入标记基团通过使点击官能化化合物与包含标记基团或标记前体基团的合适反应配偶物反应而实施。此第二方面的实施方案涉及检测样品内分析物的方法，其包括以下步骤(i)提供样品；(ii)使样品与包含至少一个官能团的官能化化合物在所述化合物与待检测分析物形成締合产物的条件下接触，其中所述官能团是点击反应的第一反应配偶物，(iii)使締合产物与用于点击反应的第二反应配偶物在第一反应配偶物与第二反应配偶物间点击反应发生的条件下接触，其中第二反应配偶物还包含标记基团或标记前体基团，(iv)根据需要，将标记前体基团转化成标记基团，和(V)检测所述标记基团。此第二方面的另一实施方案涉及检测样品内分析物的试剂盒，其包含(a)包含至少一个官能团的官能化化合物，其中所述官能团是用于点击反应的第一反应配偶物，(b)用于点击反应的第二反应配偶物，其中第二反应配偶物还包含标记基团或标记前体基团，和(c)任选地，能够将标记前体基团转化成标记基团的标记形成试剂。此第二方面的另一实施方案涉及式(II)化合物C一S-N其中C是作为点击反应的第一反应配偶物的官能团，s是间隔基或键，优选是共价键，并且N是核酸或核酸类似物结构单元，如核普性化合物或核苷酸性化合物.在第三方面，本发明涉及检测样品内分析物例如核酸的方法和试剂盒，其包括与待检测分析物形成締合产物的光敏剂化合物的用途。优选地，光敏剂基团被序列特异性地导入核酸。光敏剂基团的存在通过照射与光敏介质接触的标记締合产物得以检测，其中光敏剂基团的存在选择性地^1起标记基团在标记介质内的位点特异性形成。此第三方面的实施方案涉及用于检测样品内分析物的方法，其通过形成分析物与包含光敏剂基团的官能化化合物的締合产物并实现能量传递，尤其从光敏剂基团至光敏介质的辐射能传递，其中能量传递引起标记基团在光敏介质内的选择性形成。此第三方面的另一实施方案涉及检测样品内分析物的方法，其包括以下步骤(i)提供样品；(ii)使样品与包含至少一个官能团的官能化化合物在所述化合物与待检测分析物形成締合产物的条件下接触，其中所述官能团选自光敏剂基团或用于导入光敏剂基团的手柄基团；(iii)根据需要，使手柄基团与包含光敏剂基团的反应配偶物反应；(iv)在如此条件下照射与光敏介质接触的所述締合产物，所述条件内；和(V)检测所述标记基团。此第三方面的再一实施方案涉及用于检测样品内分析物的试剂盒，其包含(a)包含至少一个官能团的官能化化合物，其中所述官能团选自光敏剂基团或用于导入光敏剂基团的手柄基团；(b)任选地，用于包含光敏剂基团的手柄基团的反应配偶物，和(c)在光敏剂基团存在下照射时形成标记基团的光敏介质。本发明允许高度灵敏地检测生物样品例如临床样品、环境样品或农业样品内的分析物，例如核酸或核酸结合蛋白，优选的应用包括，但不限于检测遗传变异性例如单核苷酸多态性(SNPs)、杀虫剂或药物抗性、耐受性或不耐性、基因型分型例如检测生物物种或品系、检测基因修饰生物或基因修饰品系或检测病原体或害虫以及诊断疾病例如遗传疾病、变应性疾病、自身免疫性疾病或传染病。其他优选的应用是检测样品内用于商标保护的核酸，其中产品如农产品、食物产品或高价货物和/或这些产品的包装材料以产品特异性信息例如但不限于生产地点、生产日期、经销商等编码，并且其中该信息用如上所述方法检测。优选实施方案的详细描述本发明提供允许以标记基团例如以活性醛基特异性地标记复杂样品内分析物的方法和试剂。在优选的实施方案中，金属沉积，例如银沉积，可以在连接至待检测核酸的醛基上特异性地实施。在另一优选的实施方案中，金属沉积例如银沉积可以通过从光致敏基团(photosensitizinggroup)至光敏^h质(photosensitivemedium)例如相纸的能量传递而特异性地实施。由于特异性标记方法而显著降低背景并获得更高的灵敏度和可靠性。本发明包含分析物的检测。检测可以是定性检测，例如确定待分析样品内的分析物例如特异性核酸序列的存在或不存在。然而，本发明还允许定量检测待分析样品内的分析物，例如核酸序列。定性检测和/或定量检测可以包含根据本领域已知方法对标记基团的确定。待检测分析物优选选自核酸和结合核苷、核苷酸或核酸的分子，例如结合核苦、核苷酸或核酸的蛋白质。更优选地，分析物是可以根据已知技术，特别是杂交技术得到检测的核酸，例如任何类型的核酸。例如，核酸分析物可以选自DNA例如双链DNA或单链DNA、RNA或DNA-RNA杂交体。核酸分析物的具体实例是基因组DNA、mRNA或从其中衍生的产物，例如cDNA。本发明方法可以根据适用于检测样品内分析物、特别是核酸分析物的任何已知试验模式来实施。例如，该方法可以包括检测固定在固体表面如膜(例如Southern印迹法或Northern印迹法中)、芯片、阵列或粒子如珠子上的分析物。此外，检测可以在凝胶内实施，例如在样品于凝胶例如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶内电泳分离后。本方法可以包括检测单种分析物或平行检测多种分析物，例如在芯片或微阵列模式下。在优选的实施方案中，检测包括在含有指示分析物的締合产物的样品存在下照射在其中形成标记基团的光敏介质，其中締合产物包含能够实现能量传递至光敏介质的光敏剂基团。样品可以是可能含有待检测分析物的任何样品。例如，样品可以是生物样品，如农业样品，例如包含植物材料和/或与植物生长、植物材料]i!i藏或加工的地点有关的材料的样品。在另一方面，样品还可以是临床样品如组织样品或体液样品，如血液、血清、血浆等，特别是人源临床样品。其他类型的样品包括，但不限于环境样品、土壤样品、食物样品、法医样品或来自为商标保护而受到测试的高价货物中的样品。因其高灵敏度，本发明方法因而适用于直接检测分析物，无需扩增。根据本发明，可以测定甚至微量例如O.lng或更低、优选0.01ng或更低、更优选1pg或更低、仍更优选0.1pg或更低、甚至更优选0.01pg或更低及最优选0.001pg或更低的分析物例如核酸而无需扩增。特别高的灵敏度可以通过使用非保护的醛基和/或通过使用优化的染色技术而将多个改性的核苷酸引入核酸分子来获得。例如，生物样品内的分析物例如基因的检测可以通过Southern印迹法和本发明方法的组合加以进行，然而应当指出本发明的方法还允许与扩增步骤组合检测核酸，其中所述扩增步骤可以根据已知方案如PCR或其修改如非对称性PCR、实时PCR、反转录PCR等或其他扩增方案如LCR加以实施。在本发明优选的实施方案中，实施了分析物的序列特异性检测，其中例如具有特异性序列的核酸得以与样品内的其他核酸序列区分，或能够结合特异性核酸序列的多肽得以与样品内的其他多肽区分。此类序列特异性检测优选包含序列特异性杂交反应，其中待检测核酸序列通过所述的序列特异性杂交反应与携带标记基团或标记前体基团的化合物联接。然而，应当指出本发明还允许非序列特异性检测核酸，例如检测样品内存在的任何核酸。为了鉴定待检测分析物，可以使样品与醛官能化的、点击官能化的或光敏剂官能化的化合物在其中该化合物与分析物例如核酸的締合产物得以形成的条件下接触。醛-官能化化合物包含如此官能团，其可以是醛基、受保护醛基、醛前体基团(即可以转化成醛基但不明显不利地影响检测方法的基团)或用于导入醛基、受保护醛基或醛前体基团的手柄基团。官能化化合物可以包含单个官能团或多个官能团。例如，官能化化合物可以与包含多个例如2、3、4、5、6、7、8或更多个如上所述官能团的树状聚物部分(dendrimericmoiety)偶联。树状聚物部分可以通过已知技术合成。优选地，树状聚物部分通过例如实施例5中所述的点击反应合成。官能团与能够与分析物形成締合产物的化合物连接。化合物可以是核苷性化合物或核苦酸性化合物，例如核普或核苷类似物，或核苷酸或核苷酸类似物，或包含至少一种官能化化合物的低聚物或聚合物，例如核酸或核酸类似物。核苷性化合物或核苷酸性化合物是例如能够通过化学方法或酶方法被引入核酸或核酸类似物的核香或核苷酸类似物，或核苷酸或核苷酸类似物。产生的核酸或核酸类似物应当能够与分析物形成締合产物，例如核酸杂交体。优选地，化合物包含碱基部分，例如核碱基或能够与核碱基形成碱基对的其他杂环碱基部分，和主链部分，例如包含在核苷或核苷酸内的糖部分和任选磷酸酯部分，或者在核苦或核苷酸类似物内的不同主链部分。功能性核苷性化合物的优选实例示于图1，其中核碱基是7-dN-G、C、7-dN-A或T并且R是官能团。优选地，官能团与碱基部分例如与核碱基连接。然而，官能团还可以连接至主链部分，例如糖基、磷酸酯基或在核苷或核苷酸类似物的例子中连接至改性的糖基、改性的磷酸酯基或肽主链部分等。优选地，官能团经直接的键或经间隔基与化合物共价地连接。如果连接经间隔基实现时，官能团可以连接至脂族基团或环脂族基团、芳基或杂芳环基、烯基和/或炔基。更优选地，官能团可以连接至芳基或杂芳环基或连接至炔基。特别优选的趁基把包括芳族醛基或脂族醛基，如苯曱醛，或醛糖如丙糖、四糖、戊糖或己糖如葡萄糖或甘露糖内的醛基。官能团可以是游离醛基。官能团还可以是受保护的醛基，即可以在测定条件下转化成醛基的基团。优选的受保护醛基是可以通过用酸例如有机酸或无机酸处理而转化成游离醛基的缩醛基或半缩醛基，缩醛基或半缩醛基的优选实例是与多元醇如丙二醇或1，2-乙基二醇形成的缩醛基，或在糖内或在糖相关化合物如醛糖例如葡萄糖或半乳糖内的半缩醛基。受保护醛基的其他实例是在用酸处理时产生醛基的亚氨基(例如=NH基)、在用汞盐处理时产生醛基的硫缩醛基或二硫缩醛基(例如C(SR)2基，其中R可以是烷基自由基)、在用酸处理时产生醛基的肟基(例如-NOH基)、在用酸处理时产生醛基的腙基(例如-N-NHR基，其中R可以是烷基自由基)，和例如用酸水解时产生醛基的咪唑啉酮基或咪唑烷基或苯并噻喳基或二氢苯并噻喳基。包含游离醛基或受保护醛基的官能化化合物的具体实例和制备此类化合物的方法示于图2、3a、3c、7、8、9d和9e。官能团还可以是醛前体基团，即可以转化成醛基而不明显不利地影响核酸检测方法的基团。优选的醛前体基团可以选自还原时产生醛基的羧酸及包括腈的羧酸衍生物以及氧化时产生醛基的伯醇。在不同的实施方案中，官能团可以是光敏剂基团，即能够实现能量传递例如光能传递至光敏介质即照相介质如相纸的基团。光敏剂基团可以选自已知的荧光标记基团和/或染料标记基团，如基于花青的二氢-引咮基、喹啉基；例如商业可获得的荧光基团，如Cy5或Cy5.5。光敏剂基团的具体实例示于图22。官能团还可以是手柄基团，即用于通过与合适的反应配偶物即包含下述基团之一的化合物发生反应而导入醛基、受保护趁基或醛前体基团的基团，或导入光敏剂基团的基团。在优选的实施方案中，手柄基团选自点击官能化的基团，即可以与合适的反应配偶物在如此环化加成反应内发生反应的基团，在所述环化加成反应中在点击官能团与反应配偶物之间形成环键例如杂环键，并且其中反应配偶物包含醛基或受保护醛基或光敏剂基团。如此点击反应的特别优选实例是叠氮基与炔基间导致1,2,3-三唑环形成的(3+2)环化加成。因此，醛基可以通过进行叠氮手柄基团或炔手柄基团与对应的反应配偶物(即包含互补的炔基或叠氮基及额外包含酪、受保护醛基或醛基前体的反应配偶物)的点击反应而生成。然而，在本发明的另一实施方案中，点击官能化的反应配偶物还可以含有不同的标记基团或标记前体基团，如焚光标记基团或光敏剂基团。点击反应的特别优选实施方案包含铜催化的在叠氮基与炔基间的(3+2)环化加成。作为叠氮化物/炔环化加成结果的1,2,3-三唑的不可逆形成是正交性的(orthogonal),需要的化学基团因缺少自然存在的叠氮化物和炔而是小体积的(以对生物分子环境干扰最小的方式引入)和选择性的。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>其中Ri和R2是有机游离基。点击官能化化合物的具体实例和制备此类化合物的方法示于图3b，9a-c和10。点击官能化化合物的反应配偶物的具体实例示于图11和12。官能团，例如醛官能化基或点击官能化的基团或光敏剂官能化的基接。优选地，核碱基选自胞嘧吱核苷、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺噤呤、鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、肌苷和黄嘌呤。官能团优选与嘧咬核碱基的第5或第6、更优选与第5位连接，或与嘌呤核碱基的第7位或第8位、更优选与第7位连接，尤其当需要用酶向核酸内引入时。官能团可以例如经直接的键或间隔基例如具有至多达20个原子链长度的间隔基与化合物共价地连接。间隔基可以是任选含有杂原子如O、S和/或N的柔性间隔基，例如基于亚烷基的间隔基，或至少部分刚性的间隔基，例如包含选自烯基、炔基、环状基团(尤其是芳基或杂芳环基，还可以是环脂族基团)及其组合的至少一种刚性基团的间隔基。若官能化化合物包含如此的点击官能化基团，即其是用于点击反应的第一反应配偶物并随后与用于点击反应的第二反应配偶物发生反应，则优选官能团经直接的键、柔性间隔基或部分刚性的间隔基连接，其中柔性间隔基可以例如具有至多达6个原子、更特别地至多达4个原子的链长度，并且其中部分刚性的间隔基优选具有至多达20个原子，例如至多达10个原子的链长度并包含如上定义的至少一种刚性基团，尤其炔基和至少一种柔性基团例如亚烷基。另一方面，若官能团是醛基或受保护醛基或醛前体基团连接，则优选经如上定义的部分刚性间隔基或具有2个至10个原子链长度的至少部分刚性间隔基连接。优选含刚性基团间隔基例如部分刚性间隔基的结构，以致刚性基团直接与核碱基连接。部分刚性间隔基的优选实例示于图15a和b。官能化化合物能够形成其与待检测分析物的締合产物。另一方面，官能化化合物可以选自可以被引入核酸或核酸类似物的化合物，即核酸结构单元或核酸类似物结构单元。此类化合物的优选实例是核苷酸或核苷酸类似物，例如醛官能化的核苷酸或核苷酸类似物、点击官能化的核苷酸或核苷酸类似物，或光敏剂官能化的核苦酸或核苷酸类似物。在另一方面，官能化化合物可以选自核酸或核酸类似物，例如醛官能化的核酸或核酸类似物、点击官能化的核酸或类似物，或光敏剂官能化的核酸或类似物。本发明的术语"核苷酸"特别涉及核糖核苷酸、2，-脱氧核糖核苷酸或2'，3'-二脱氧核糖核苷酸。核苷酸类似物可以选自糖-或主链改性的的核苷酸，尤其来自可以以酶方式引入核酸的核苷酸类似物。在优选的糖-改性的核苷酸中，核糖的2'-OH或H-基团由选自OR、R、卣基、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团替换，其中R是d-C6烷基、烯基或炔基并且卣基是F、Cl、Br或I。核糖本身可以由其他5元或6元碳环基或杂环基如环戊烷或环己烯基替换。在优选的主链改性的核苷酸中，磷酸(三)酯基可以由改性的基团，例如由硫代磷酸酯基或H-膦酸酯基替换。其他的优选核苦酸类似物包括用于合成核酸类似物如吗啉代核酸、肽核酸或锁核酸的结构单元。醛基官能化、点击官能化或光敏剂官能化的核酸可以是寡核苷酸，例如具有至多达30个核苷酸(或核苷酸类似物)结构单元长度的核酸或具有超过30个核苷酸(或核苷酸类似物)结构单元长度的多核苷酸。优选地，核酸和核酸类似物能够与分析物特异性结合，例如能够在测定条件下与核酸分析物杂交。最小长度优选是12个并且更优选是14个核苷酸(或核苷酸类似物)的结构单元。官能化的核酸结构单元或核酸类似物结构单元可以通过化学合成的标准技术和/或通过酶法引入核酸。化学合成例如可以使用作为标准合成方案中结构单元的改性的亚膦酰胺核苷通过标准亚膦酰胺化学法进行。其他类型用于化学合成的优选结构单元包括H-膦酸酯或砩酸三酯改性的核苷。在另一方面，改性的核苷酸可以通过酶学方法引入核酸。令人惊讶发现醛官能化或点击官能化的三磷酸核苷被核酸合成酶如DNA聚合酶、RNA聚合酶，逆转录酶或端粒酶接受作为酶底物。例如，发现改性的的三磷酸核苷被常引物延伸和扩增方法的DNA聚合酶(如实施例7内所述的热稳定性DNA聚合酶如Taq聚合酶、Vent聚合酶、Pfx聚合酶、Pwo聚合酶或Therminator聚合酶)接受。酶接受改性的三磷酸盐，同时未丧失保真度并且允许基于模板的至核酸如DNA和RNA内的引入。本发明方法提供检测分析物的多种实施方案。例如，可以提供以酶法引入核酸分子的官能化核酸结构单元例如核苷酸或核普酸类似物以及适宜酶，其中所述的核酸分子与分析物形成締合产物。在本发明中，可以采用单一类型的官能化核苷酸或多种不同类型的官能化核苷酸。备选地或额外地，官能化的核酸或核酸类似物已经可以存在，其可以例如通过化学合成或酶合成制备，并例如通过杂交与待检测分析物特异性地结合。在优选的实施方案中，本发明方法包含引物延伸反应，其任选与后续的核酸扩增步骤如PCR组合。例如，可以提供在测定条件下与待检测核酸分析物或其互补物杂交的至少一种引物分子。随后延伸已结合的引物，其中得到了指示待检测核酸分析物的存在和/或其量的可检测的延伸产物。根据该实施方案，用于引入延伸产物的官能化的引物和/或官能化的核苷酸或核苷酸类似物可以使用。备选地和/或额外地，本发明方法可以包含与待检测核酸分析物或其互补物在测定条件下杂交的官能化杂交探针的用途，其中杂交产物的形成指示待检测核酸分析物的存在和/或其量。本发明的检测方法可以通过任何已知的核酸检测方案实施，例如包括利用固体支持物。例如，可以提供与能够同待检测分析物杂交的捕获探针结合的固体支持物，例如芯片或阵列或特定材料如珠子。固相结合性核酸分析物可以通过使用官能化杂交探针并随后检测已结合的杂交探针，例如用金属化剂检测，其中所述的官能化杂交探针在与捕获探针所杂交部分不同的序列部分内与核酸分析物杂交。该方法特别适用于农业领域和临床领域内的诊断性应用，例如用于检测来自植物例如基因修饰植物的DNA和/或mRNA、来自病原体或植物害虫等的DNA。在具体实施方案中，检测可以包括使分析物以及包含光敏剂基团的官能化化合物的締合产物与光敏介质接触，例如通过点样、移液等将在其中締合产物可以在光敏介质上存在的样品或样品等分试样转移。在照射时，发生光敏剂基团至光敏介质的能量传递，以致标记基团如金属(例如银)晶核在光敏剂基团存在下在光敏介质内形成，而在光敏剂基团不存在下则不形成。根据需要，可以使标记基团接受显影方法例如根据照相技术的化学显影法或光化学显影法处理。光敏介质可以是能够形成标记基团例如金属晶核的任何固体支持物或任何支持材料。优选地，光敏介质是感光介质，如感光纸或在支持材料上的感光乳剂或感光凝胶。更优选地，光敏介质是照相介质如相纸。照射在如此条件例如照射光波长和/或强度下实施，其中标记基团的选择性形成在光敏剂基团存在下发生。优选地，照射以红外光和/或以长波长可见光进行，这取决于介质灵敏度。对于可见光，照射波长可以是例如500nm或更长，520nm或更长，540nm或更长，560nm或更长，580nm或更长，或对于红外光，其是700nm至10|iim。本发明的重要方面是检测遗传变异性，例如单核苷酸多态性(SNP)。基因组，例如人基因组，含有平均频率至多达0.1%的核苷酸序列变异。因此，这些变异性为鉴定对复杂疾病易感性有贡献的遗传因子提供了优良标记[16，17。虽然存在类型广泛的可用于检测SNP的技术，大部分的这些方法费时、需要大量仪器并需要PCR扩增[18。然而，本发明方法便宜而又灵活，足以满足低通量、中度通量和高通量筛选需要，同时具有高速、高灵敏度和高效率。存在仅选择性标记完全匹配链或错配链从而允许使用本发明方法检测SNP的数种可能。例如，检测例如在SNP内的核酸匹配或错配，可以包含使用在测定条件下因其互补性而与待检测核酸分析物杂交的官能化杂交探针，并使杂交产物接受如此处理方法处理，在所述处理方法中含有至少一个错配的杂交产物被分解并且未分解杂交产物的存在指示具有对杂交探针的完全互补性(即无错配)序列的核酸的存在和/或其量。用于分解含有错配的杂交产物的处理可以包含错配消化处理，即利用依赖错配的存在而切割杂交产物的错配检测酶。适用于如此错配消化处理的酶包括错配-糖基化酶，如那些由基因hMSH2和hMLHl和MutS、MutL和MutH编码的酶。其他蛋白质是MutY和Mig.Mthl。Mig.Mthl将T从TG错配中切除，MutY将AG错配中的A切除并且酶TDG将TG错配中的T切除。备选地或额外地，含有错配的杂交产物可以通过差异性杂交处理加以分解，包括调节杂交条件(例如就温度、盐浓度方面)和/或用氯化二甲铵洗涤，其中含有错配的杂交产物被分解而完全互补性杂交产物保持稳定。在另一实施方案中，错配例如SNP可以通过酶催化的选择性引物延伸进行测定。为此目的，提供如此引物，其中引物的3'端直接定位在模板分析物内的有效错配位点上游。当与模板内紧邻碱基互补的核苷酸存在时，引物延伸才可以发生。通过选择单一类型的官能化核苷酸并确定它是否引入至引物内，可以确定有效错配位点内的碱基。标记基团。标记基团优选选自形成金属沉积物的基团基，例如醛官能化基团，选自荧光基团或形成荧光的基团或选自氧化还原活性基团。金属沉积物的形成需要用金属化剂，例如包含选自Ag、Au、Bi、Cu、Pd或Pt的金属原子和/或金属离子的试剂处理醛基，其中所述的金属原子和/或金属离子可以例如因还原作用而被选择性沉积在醛基周围。优选地，金属化剂包含Ag+盐如银氨络合物，即土伦试剂。金属化剂的其他优选实例是Cu(N03)/I2,铂三联吡啶络合物如[Pt(吡啶)ClCl、Pd(OAc)2或KAuCl4。此外，官能化基团还可以起到连接其他标记基团如荧光标记基团的手柄作用。例如，具有氨基的标记化合物可以在还原剂如氰基硼氬化钠存在下通过还原性氨基化与醛基偶联。备选地，腙或將的形成可以用来提供标记基团。标记基团的检测可以根据已知方法实施。例如，金属沉积可以通过光学方法或电学方法定性和/或定量地测定。在优选的实施方案中，固体表面上的金属沉积可以通过对电学参数例如导电率的测量而测定。焚光标记基团可以通过已知的荧光测量方法例如经合适光源(如激光)激发并检测发射的荧光得到定性或定量测定。在另一实施方案，本发明包含检测在分析物与官能化化合物的締合产物内的光敏剂基团存在下，在光敏介质内位点特异性形成的标记基团。光敏剂基团优选选自荧光基团或发光基团。光敏剂基团可以直接地或经手柄例如通过如上详述的点击反应而引入締合产物。光敏介质包含在照射时在光敏剂基团存在下形成可检测标记基团如金属晶核的基团，可检测标的记基团可以根据标准照相技术例如通过化学显影或光化学显影技术进行显影。本发明还涉及用于检测样品内如此分析物例如核酸分析物的试剂盒，其中所述分析物包含已经与如上所述的至少一种官能团结合的官能化化合物。通常，该试剂盒可以包含式(III)化合物F画S誦N其中F是如上所述的任意官能团，例如如式(I)内定义的基团A,如式(II)内定义的团C和/或光敏剂基团；S是间隔基或键，优选是共价键，并且N是核酸结构单元，或核酸类似物结构单元如核苷性化合物或核苷酸性化合物。试剂盒可以任选含有醛基形成试剂或用于点击反应的第二配偶物以及标记试剂或标记形成试剂，或光敏介质。试剂盒优选用于如上所述的方法中。此外，本发明涉及如上所述的式(I)的醛官能化化合物或式(II)的点击官能化化合物。官能化化合物可以是用于化学方式或酶方式合成核酸或核酸类似物的结构单元或其前体。优选地，化合物是三磷酸核苷，尤其是核糖、2，-脱氧核糖或2'-,3'-二脱氧核糖三磷酸核苷或其可以用酶引入核酸的类似物。此外，化合物可以是用于化学方式合成核酸或核酸类似物如肽核酸、吗啉代核酸或锁核酸的结构单元。为此目的，亚膦酰胺核苷、H-膦酸酯、磷酸三酯或受Fmoc和/或Boc保护的核碱基氨基酸是合适的。本发明还涉及已经在其中引入式(I)和/或式(II)中至少一种化合物的核酸分子或核酸类似物分子。该分子可以是选自DNA和RNA或核酸类似物的核酸，例如选自如上详述的肽核酸、吗啉代核酸或锁核酸。此外，本发明涉及合成核酸分子或核酸类似物分子的方法，其包括将包含化合物(I)和/或(II)的至少一种核苷酸结构单元或核苷酸类似物结构单元引入核酸分子或核酸类似物分子。该方法可以包括化学合成和/或酶合成。此外，本发明涉及如上所述的核酸分子或核酸分子的金属化产物，其中所述金属化产物通过用如上详述的金属化剂处理含有核酸的醛官能化化合物而得到。此外，本发明涉及如上所述核酸分子或核酸类似物分子与如上所述分析物的締合产物。优选地，締合产物是具有互补性核酸的杂交产物。在优选的实施方案中，本发明的方法和试剂盒适用于农业应用。例如，本发明适用于检测来自植物、植物病原体或植物害虫如病毒、细菌、真菌或昆虫的核酸。另外，本发明适用于检测遗传变异性，例如植物或植物部分、植物病原体或植物害虫如昆虫内的SNP。其他应用是检测或监测除草剂、杀真菌剂或杀虫剂的抗性、耐受性或不耐性，例如在生物或生物群落中真菌、昆虫或植物内的抗性、耐受性或不耐性。本发明还适用于快速基因型分型，例如用于快速检测和/或区分真菌、昆虫或植物的物种或品系。此外，检测和/或区分基因修饰生物的品系，例如真菌、昆虫或植物的生物或品系是可能的因本发明的高灵敏度，早期诊断病原体是可能的，即在病原体存在的最初征兆可见之前进行诊断。这对于诊断大豆锈菌(Phakosorapachyrizi)或其他病原体例如小麦白粉菌(Blumeriagraminis)，小麦壳针孢(Septoriatritici)或卵菌纲(Oomycetes)或仅在其可以肉眼识别之前检测到其存在才有可能控制的其他病原体是特别重要的。此外，本发明适用于医学、诊断学和法医应用，例如在人类医学或兽医中，例如用于检测来自病原体如人类病原体或家畜或宠物动物的病原体内的核酸。此外，优选的应用包括检测遗传变异性，例如人类中的SNP,或检测药物抗性、耐受性或不耐性或变态反应。此外，本发明适用于基因型分型，特别是人的基因型分型以便测定与诱病或增加的疾病风险有关的突变、变态反应和不耐性。本发明还可以用于检测基因修饰生物或基因修饰品系、细菌或病毒的基因修饰生物或基因修饰品系及基因修饰家畜动物等。本发明特别适用于快速诊断疾病，例如遗传疾病、变应性疾病、自身免疫性疾病或传染病。此夕卜，本发明适用于检测基因的功能和/或表达，例如用于研究目的。另一实施方案是本方法用于商标保护的用途，例如用于检测编码在可以进行标记的产品内的特定信息，所述产品例如是高价值货物例，如植物保护产品、药物、化妆品和精细化学品(例如维生素和氨基酸)以及饮料产品、燃料产品例如汽油和柴油、消费类电子产品。此外，这些产品和其他产品的包装材料可以进行标记。信息由已经引入产品和/或引入产品的包装材料内的核酸或核酸类似物编码。信息可以涉及制造商身份、涉及生产地点、生产日期和/或经销商。借助本发明，可以实施快速检测产品的特异性数据。样品可以从产品的等分试样中制备，该等分试样随后与能够检测样品内由存在的编码信息的核酸的一种或数种序列特异性官能化杂交探针接触。本发明还适用于营养领域。例如在饲料领域中，动物营养物例如玉米以更大量的防腐剂如丙酸作补充。通过应用本发明方法，可以减少防腐剂的添加。此外，本发明方法的基因组分析允许预测个体的特定营养物利用能力(营养基因组学)。另一优选的实施方案涉及外遗传(印igenetics)领域。该实施方案特别涉及DNA的分析，例如就胞嘧咬碱基的甲基化方面分析基因组DNA。在此实施方案中，DNA可以用胞嘧啶-特异性试剂例如肼和/或羟胺(hydroxylamine)处理。借助该处理，胞嘧咬或甲基胞嘧咬残基的选择性反应发生。例如，用羟胺处理导致选择性修饰胞嘧啶残基。优选地，试剂以亚化学量的量添加以便获得部分修饰，例如胞嘧啶残基的部分修饰。随后，对处理的DNA分析，例如通过引物延伸反应，使用至少一种如上所述的改性的核酸结构单元例如dU和/或dC碱基进行分析。优选使用点击改性的减基，例如炔改性的碱基。引物延伸反应因该反应在改性的dC或5-曱基-dC碱基处中断而产生特征性测序梯(参考图26)。另一优选实施方案涉及报道核酸分子对光敏介质例如相纸或任何其他感光介质的应用。优选地，报道分子携带光敏剂基团和猝灭剂基团。在分析物不存在下，光敏剂基团被猝灭。例如，报道分子可以具有如此的发夹结构，其具有在空间上彼此接近的在分子末端上或接近分子末端的光敏剂和摔灭剂基团。当报道分子以发夹结构存在时，光敏剂基团被猝灭0艮据已知的分子信标技术)。因此具有完整发夹结构的报道分子不能够在光线照射到光敏剂介质时发生致敏。在分析物存在下，发夹结构被石皮坏。分析物可以是互补的核酸链，或是切割发夹结构的酶，或与发夹结构结合并因而破坏该结构的蛋白质。光敏剂基团与猝灭剂基团分开并因而能够发生光敏化作用。在此情况下，光线的照射导致照相介质的致敏并因而导致分析物的检测(参考图27)。在该实施方案中，本发明涉及检测样品内分析物的方法，其包括步骤(i)提供样品，(ii)提供包含光敏剂基团或用于导入光敏剂基团的手柄基团及猝灭剂基团的报道分子，其中待检测分析物在待检测分析物不存在下被猝灭，(iii)使样品与报道分子在其中光敏剂基团的猝灭在分析物存在下被至少部分减弱或终止的条件下接触，(iv)根据需要，使手柄基团与包含光敏剂基团的反应配偶物反应，(V)在如此条件下照射与光敏介质接触的所述报道分子，其中标记基内,和(vi)检测所述标记基团另外，该实施方案涉及检测样品内分析物的试剂盒，其包含(a)报道分子，其包含光敏剂基团或用于导入光敏剂基团的手柄基团和醉灭剂基团，其中光敏剂基团在待检测分析物不存在下被猝灭，(b)任选地，针对包含光敏剂基团的手柄基团的反应配偶物，和(c)在照射未猝灭的光敏剂基团时形成标记基团的光敏介质。该方法的优选方面为如上所述的试剂盒并且优选应用。本发明通过如下附图和实施例进一步说明。附图描述图l:官能团(R)例如醛官能化基团在不同核碱基7-dN-G、C、7-dN-A和T上的用于酶法引入标记基团至寡核苷酸内的优选连接位点。图2:合成用于固相合成核酸的醛官能化核苷结构单元的示意图。图3a:合成用于酶法合成核酸的缩醛(受保护醛)官能化三磷酸核苷的示意图。图3b:用于DNA内高效点击化学的炔官能化三砩酸核苷的实例，其中n优选是0-4。图3c:受保护醛官能化的三磷酸盐的实例。图3内所示化合物适用于向DNA内的高效PCR引入。图4:通过土伦试剂与醛改性的碱基接触进行金属化反应的结果(1)作为参考的糖溶液，(2)具有一个经醛改性的基团的DNA,(3)具有两个醛基的DNA和(4)未改性的DNA。图5:(I)以Ag(a)或使用标准荧光染料(b)染色的引物延伸产物I.la:引物延伸内的醛改性的TTP。Lib:引物延伸内的缩醛改性的TTP。L3a;未改性的DNA。银染仅在泳道1和2内是阳性。Llb-3b为相同的凝胶，但是用荧光染料非特异性染色。(II)用荧光染料(a)或用Ag(b)染色的2142bpPCR产物H2a:PCR内的缩醛改性的TTP。M:标准参照物；IIlb:PCR内的醛改性的TTP,2:PCR内的缩醛改性的TTP，H3b:未改性的DNA。图6:含有单个醛官能团人工DNA分子的稀释系列结果。通过银染法检测。图7:具有携带缩醛(受保护醛)官能团的不同核碱基的核苷实例，其中所述核苷可以转化成用于化学合成核酸的相应亚膦酰胺、H-膦酸酯或三酯，或转化成用于酶法引入核酸的5'-三磷酸盐。图8:醛改性的带荧光标签的DNA或PNA的衍生化，其作为对经还原性氨化作用的金属化的替代。图9:炔改性的(a,b)、叠氮化物-改性的(c)和受保护醛改性的(d，e)核苷单体和核苷酸单体，其中n优选是0-4。图10:炔官能化的核苷三磷酸盐和核苷酸三磷酸盐的合成示意图。图11:包含受保护醛基的叠氮化物官能化树状聚物的合成示意图。图12:用于与炔修饰或叠氮化物改性的核苷酸或核酸起点击反应的具有标记基团或标记前体基团的叠氮化物衍生物和炔叠氮化物衍生物实例。图13:上部分含改性的g2的寡核苷酸(图9b)和作为点击配偶物(partner)的叠氮荧光黄进行的点击反应的MALDI-TOF分析(m:495)。下部分单体2和叠氮荧光素改性的DNA的点击反应的凝胶电泳。Al:荧光图像，泳道l:点击反应前的原材料；2、3:原始反应混合物；4:在点击条件下的叠氮化物；A2:用SYBR绿染色的相同凝胶。Bl:泳道l、2:原始反应混合物；3:原材料；B2相同凝胶，但用SYBR绿染色。图14:用于将叠氮香豆素导入DNA的点击反应产生荧光产物(右反应管)。图15:炔改性的亚膦酰胺(a)、炔改性的核苷(b)和叠氮化物改性的半乳糖(c)。图16:PCR分析法，使用200pM的8、dATP、dCTP和dGTP、0.05pg来自酿酒酵母499(S.cerevisiae499)的基因组DNA、含镁的10x聚合酶緩冲液、0.3加]\1每种引物和1.2511聚合酶。泳道l)Vent、2)Vent(excT)、3)Pwo、4)来自Roche的Taq(exo),5)Therminator、6)来自Promega的Taq以及7)标记。图17:PCR扩增2142bpDNA,用改性的三磷酸盐1或8(图10)替换dTTP。使用琼脂糖凝胶(2%)并用溴化乙啶染色。运行总共35个PCR循环，每一温育持续45秒。泳道1)NEB2-对数DNA梯(0.1-10.0kb)、泳道2)阴性对照(无dTTP)、泳道3)替换dTTP的底物(1)、泳道4)替换dTTP的底物(8)以及泳道5)阳性对照(使用dTTP)。图18:酶消化引入三磷酸盐8的PCR片段(MS聚物)(图10)的HPLC色谱图；(b)酶消化引入dTTP的PCR片段；(c)核苷7(图10)。图19:引入三磷酸盐1和2随后"在凝胶上，，点击作用并银染的318bpPCR片段稀释系列。(a)在TBE-尿素PAAG凝胶上电泳引入l(泳道l7.0ng、泳道23.5ng、泳道31.3ng、泳道40.7ng)和2(泳道57.0ng、泳道63.5ng、泳道7L3ng、泳道80.7ng)的PCR片段稀释系列。凝胶用叠氮化物3"在凝胶上"点击处理并随后银染。(b)通过(i)选择性银染方法(作为每个(a))和通过(ii)SYBR绿II(泳道l7ng、泳道23.5ng、泳道31.3ng、'》^道40.9ng、'》^道50.5ng、'》K道60.3ng)比较'性检测引入2的PCR片段稀释系列。(c)在TBE-尿素PAAG凝胶上电泳引入2(泳道l7ng、泳道23.5ng、泳if31.3ng、泳道40.9ng、泳道50.5ng、泳道60.3ng)和2(泳道l7.0ng、泳道23.5ng、泳道31.3ng、泳道40.7ng)的PCR片段系列稀释。凝胶用醛改性的叠氮化物4"在凝胶上"点击处理并随后银染。(d)在TBE-尿素PAAG凝胶上电泳的引入2(泳道17ng、泳道23.5ng、泳道31.3ng、泳道40.9ng、泳道50.5ng、泳道60.3ng)的PCR片段稀释系列。凝胶用醛改性的叠氮化物5"在凝胶上"点击处理并随后4艮染。图20:天然DNA(a)和醛改性的DNA(b)在接触银染条件后的AFM照相，和醛改性的DNA银染后不感光(c)、在感光2分钟后(d)和在两次2分钟感光后(e)的AFM照相。图21:使用黑白照相法原理的分析物(例如DNA分析物)检测方法的示意图。DNA分析物在序列选择性引物存在下的初始扩增产生以致敏剂标记的耙序列(S)。在照射并随后照相感光后，可以检测到光敏介质(例如相纸)上的分析物。图22:花青染料(l)、(2)和(3)的描述。使用(a)l、(b)2和(c)3的花青染料的稀释系列，利用配备520nm截光片的顶置投影灯照射10秒钟，或使用(d)1、(e)2和f(3)的花青染料的稀释系列用红外线灯照射5分钟。斑点实验与如下稀释度对应斑点l:lxl(T"mol.、斑点2:1x1012mol"斑点3:3x1013mol、斑点4:1x10-13mol、斑点5:3x10"mol、斑点6:1xl(T14mol、斑点7:3x10-15mol、斑点8:1x1015mol、斑点9:3x1016mol、斑点10:lxlO"mo1。图23:均为50nmol.的寡脱氧核糖核苷酸ODN-l[5'-GCGATTCGTTCGTCGC-3'、ODN隱2[5'-CGCGAATGAACAGCGC-3，和ODN-3[5'-GCGACCGATTCGC-3'的斑点试验，其中使用(a)高能照射和截光片(520nm)及(b)利用红外线灯延长膝光时间(5分钟)的低能照射持续。图24:花青染料Cy5和Cy5.5的描述。系留至ODN的花青染料的稀释系列，其中使用(a)ODN國4[5'國Cy5-GCGCTGTTCATTCGCG-3';(b)ODN-5[5'-Cy5.5画GCGCTGTTCATTCGCG-3'，利用配备520nm截光片的顶置投影灯照射10秒钟，或使用(c)ODN-4;(d)ODN-5，用红外线灯照射5分钟。斑点实验与如下稀释度对应斑点l:lxl0-"mo1.、斑点2:3xl012mol.、斑点3:1x1012mol、斑点4:3x1013mol、斑点5:lxl(T13mol、斑点6:3x1014mol、斑点7:1xl(T14mol、斑点8:3x1015mol.图25:"点击并照相"方法学过程的示意图。目的序列例如目的基因用炔改性的三磷酸盐(dl^TP)和基因选择性引物经PCR特异性地选择并扩增。这些炔官能团可以用产生光致敏DNA杂交体的适宜光敏剂(S)经点击化学进行标记。照射在感光纸上的样品并随后感光将提供超灵敏及超特异性检测基因的新方法。图26:通过胞嘧啶特异性化学修饰而鉴定DNA内甲基化模式的方法的示意图。DNA分析物与胞嘧啶(或甲基胞嗜啶)特异性修饰剂(例如羟胺)(优选处于亚化学量的量)反应，以产生经部分改性的胞嘧啶残基(C"。进行了用炔基改性的碱基的引物延伸反应。该反应在改性的胞嗜咬残基处终止，产生具有特征性长度的延伸产物"梯"。在分离引物延伸产物(例如在凝胶上)后，实施了用叠氮化物改性的标记基团例如修饰糖的点击反应并随后检测该标记基团(例如经银染)。DNA样品的甲基化模式可以通过比较来自甲基化DNA样品的延伸产物与来自已经接受相同处理的非曱基化DNA样品的延伸产物而确定。图27:在光敏介质上的分子信标检测方法的示意图。提供了具有荧光基团(F)和猝灭基团(Q)的报道分子。在分析物不存在时，报道分子具有发夹结构并且荧光被猝灭。在分析物存在时，猝灭基团从荧光基团中被移走，该荧光基团则变成非猝灭端(F"。样品在照相介质如相纸或其他感光材料存在下受到照射并显影。实施例实施例1醛改性的核苷和核苷酸的合成具有醛改性的核碱基的核苷和三磷酸核苷由适宜改性的核苷合成，其中所述适宜改性的核苷携带离去基团，如I，所述离去基团如图1中所示优选在嘧咬碱基例如T、U和C的第5位或在噤呤碱基例如7-desazaG、7-desazaA、G和A第7位上。在这些位置上的全部修饰均从DNA大沟中突出。如图2中所示，首先经Sonogashira介导的炔基化[20，随后与适宜的官能团反应而实施醛改性的T(U)亚膦酰胺核苷的合成。持续保护作为缩醛基的醛功能。缩醛保护基团可以用酸处理去除。可以通过化学合成将改性的亚膦酰胺核苦引入核酸。实施了如图3a中所示的合成缩醛改性的三磷酸核苷。其他炔(用于点击反应)、缩醛和半缩醛改性的三磷酸核苷在图3b显示。可以通过酶合成将改性的改性的三磷酸核苷引入核酸。基于Pd的C-C形成反应如Sonogashira/Suzuki[20的用途提供了合成具有携带不同醛基、不同改性的核碱基的醛修饰核苷和醛修饰核苷酸的一般合成方法。此外，可以合成具有不同立体特性、电特性和功能特性的醛基。实施例2将醛改性的核苷和核苷酸引入寡核苷酸2.1通过化学合成引入通过常规固相合成法实现引入缩醛/醛改性的亚膦酰胺核苷[21。如表1中所述制备含有一个或多个缩醛/醛改性的核碱基的数种DNA寡核苦酸。缩醛基的脱保护产生醛改性的DNA寡核苷酸。测试寡核苷酸与互补性DNA条带形成碱基对以得到双链DNA分子的能力。发现双链体稳定性降低的原因在于存在的醛基少。每个修饰仅降低双链解链温度大约2。C。不过，这种大小的去稳定化对于预期应用是完全可接受的。表l:通过固相合成法合成的寡脱氧核苷酸。Tm[°C1T^T^T"^"^^"T^TTTPT^T^2TTTTTTXXTTTTT<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>(未改性的对照56.5)(未改性的对照53.7)2.2通过酶学方法引入缩醛改性的三磷酸盐单体根据图3制备。合成三磷酸盐的选择性最强的方法是按照Ludwig和Eckstein[11,12的方法。该方法具有轻度酸性，因此得到醛-和缩醛-TTP的混合物，其可以根据需要通过HPLC分离[13。用缩醛三磷酸盐和醛三磷酸盐以及多种不同DNA聚合酶开展研究。这些研究表明全部聚合酶均接受改性的三磷酸盐作为底物并且选择性地引入改性的碱基。另外，多重引入证明未带来问题。如下聚合酶在引物延伸研究和PCR中测试。实验使用缩醛受保护的胸苷及去保护的醛官能化胸苷进行。引入延伸PCR<formula>formulaseeoriginaldocumentpage38</formula>我们还开展TPP替换为人工三磷酸盐(缩醛和醛)的PCR研究。PCR实验表明改性的g可以引入2400碱基对长度的完整基因，这证实我们可以产生特异标记的具有成百个醛f汴生性成核点的基因。实施例3检测标记的寡核苷酸和基因在醛基上沉积金属的优选方法基于土伦试验[14。R-CHO+2Ag[NH3OH—R-COONH4++2Ag(s)+H20+NH3在该反应中，银氨络合物由醛还原。当醛浓度高时，可以见到在反应试管内壁上的固体4艮膜。含有醛的核苷和化学合成的醛修饰核酸均可以在显示醛功能的银染试验内检测到(图4)。未标记的DNA条带则在相同条件下产生清楚的阴性结果，表明选择性导入特异性DNA序列的醛允许选择性检测这些改性序列。通过银染检测醛改性的核酸还在凝胶上实施。DNA内的搭基足够还原凝胶内的银离子。该方法在DNA上所形成的种子可以显影直至可以在凝胶上看见沉积的银产生的清晰黑色条带。这通过分别来自引物延伸反应和来自PCR(分别是图5(1)和(II))的醛修饰核酸的染色得到证实。如图5中所示，含有修饰核苷的DNA只被银染而未改性的DNA保持不被染色。这对于延伸的引物及对PCR产物也是如此。染色方法基于SliverXpress试剂盒(Invitrogen)，但是使用更浓的土伦溶液。染色还可能按照其他方法进行。实施例4灵敏度的测定为测定检测方法的灵敏度，进行稀释实验(图6)。发现用标准Ag染试剂盒染色醛官能化的DNA比用溴化乙啶染色灵敏至少5倍(~0.5ng长度50bp的DNA)。甚至用粗略的目测也获得这种非常明显的灵敏度。实施例5叠氮化物修饰和炔改性的核苷和核苷酸的合成具有叠氮化物修饰和炔改性的碱基的核苷和三磷酸核苷基本如实施例1中所述合成。5.1炔改性的核苷酸的合成用于合成炔改性的三磷酸核苷的详细反应方案示于图10。如前述进行核苦(1)及其对应三磷酸盐(2)的制备[23，24。向完全脱气的在DMF(3mL)内的3(1.00g，1.72mmol.)、[3IPd(PPh3)4(0.198g，0.172mmol.)和Cul(0.065g,0.344mmol.)的溶液添加脱气的N，N-二异丙基乙胺(1.5mL，8.59mmol.),并在室温搅拌反应混合物10分钟。将脱气的DMF(lmL)内的4-戊炔-l-醇(320jiL，3.44mmol.)的溶液经1小时逐滴添加至反应混合物内。在完成添加后，反应混合物在室温搅拌过夜。在真空浓缩后，粗制混合物用乙酸乙酯(200mL)稀释并且有机层用盐水(3x50mL)随后用水(50mL)洗涤。干燥(MgS04)有机层、过滤并真空浓缩。采用梯度乙酸乙:异己烷(l:l)及乙酸乙酯:异己烷(2:l)的闪式柱色镨(Si02)洗脱，产生作为淡黄色泡沫的4(0.7卯g，86%)。iH匪R(CDC,3,300MHz):50.01(s,3H,OSiCW3)，0,00(s,3H，OSiCW3),0.05(s'3H,OSiCW3),0，07(S,3H,OSiCW3),0,81(s，6H,OSifCW3)3),0.85(s,6H,OSifCW^),1.74(m'2H，CH2-CW2CH2-OH),1.95(m,1H,W-2|3),2.20(m,1H,〃-2a),2.42(t，2H，J=6.0Hz,CsC-CW2CHr),3.67(dd,1H,J-".4，2.1(CDCI3,75.5MHz):55.4(SiCH3)，-5.3(SiCH3)，-4.8(SiCH3),4,6(S跳),16.7(CSC-CH线)，18,0(SiC(CH拟18.5(SiC(CH3)3)，26.1(SiC(CH3)3),26.4(S，'C(CH3)3),31.5(CHrCH2~CH2-OH),42.3(C-2')，61.9(CH2-CH2CH:rOH)'63.3(C-5'),72.4(CSC),72.7(C-3，)，86.0(C-1'),88.7(D4'),95.0(CSC),100.9(C-5),101.0(CsC),141.9(C-6),149.6(02>，162.4(C~4》.对C26H46N2Na06Si2561.279M+Nal+计算的HRMS(ESI，十ve)是561.2803。二氯甲烷(5mL)中的4(0.300g，0.56mmol.)的搅拌溶液经5分钟，室温氮气氛下逐滴添加至二氯甲烷(5mL)中的Dess-Martin过碘烷(0.378g，0.89mmol.)溶液。反应混合物搅拌2小时，随后用饱和疏代石克酸钠溶液(10mL)终止。粗制混合物随后用二氯甲烷(200mL)洗涤并且有才几层用盐水(2x30mL)和水(2x30mL)洗涤。有才几层随后经干燥(MgS04)、过滤并真空浓缩。采用异己烷中的35%乙酸乙酯的柱色谱(闪式二氧化硅)洗脱产生作为淡黄色泡沫的5(0.193g，65%)。NMR(CDC13，600MHz):60,07(s，3H，OSiCH3)，O.OO(s，3H，OSiCH3)，0.05(s，3H，OSiCH3)，0.06(s,3H，OSiCH3)，0.81(s，6H，OSi(CH3)3)，0.85(s，6H,OSi(CH3)3),1.95(m，lH，H國2卩)，2.21(m,1H，H-2a)，2.61(t，2H，J=7.2Hz,-CH2CH2-)，2.67(t，2H，J=7.2Hz,-CH2CH2-)，3.68d(d,1H，J=11.4，2.4Hz，H-5，)，3,81(dd，1H,J=11.4，2.4Hz,H-5，)，3.89(m，1H，H-4，)，4.32(m，1H，H-3，)，6.20(dd，1H，J=7.2，6Hz，H國l，)，7.84(s，1H，H-6),8.99(bs，lH，N-H)，9.72(s，1H，CHO)。13C匪R(CDC13，150.8MHz):83.8(SiCH3)，-3.7(SiCH3)，-3.1(SiCH3),-2.9(SiCH3),14.4(OC-CH2CH2),19.7(SiC(CH3)3)，20.1(SiC(CH3)3)，27.4(SiC(CH3)3)，27.7(SiC(CH3)3)，43.7(C-2，)，44.1(CH2-CH2-CHO),64.6(C画5')，74.0(C-3，和C三C),87.5(C画l，)，卯.0(C誦4，)，94.3(C三C),101.9(C-5)，143.8(C-6)，150.9(C-2)，163.7(C画4)，201.6(CHO).对C26H44N2Na06Si2559.2635[M+Na]+计算的HRMS(ESI，+ve)是559.2634。向无水甲醇(20mL)中的5(0'530g，1.00mmol.)和K2C03(0.269g，1.98mmol.)的'溶液在室温氮气氛下添加无水甲醇(5mL)的l-重氮-2-氧代-丙基-膦酸二甲酯(0.261g，1.19mmol.)的溶液。反应混合物在室温搅拌过夜、过滤并真空浓缩。粗制混合物溶解于乙酸乙酯(200mL)内并且有才几层用盐水(2x30mL)和水(2x30mL)洗涤、经干燥(MgS04)并真空浓缩。采用异己烷中的20%乙酸乙酯的柱色镨(闪式二氧化硅)洗脱产生作为无色泡沫的6(0.290g，55%)。^NMR(CDC13，600Mhz):SO.OO(s，3H，OSiCH3)，0.01(s，3H，OSiCH3)，0.06(s，3H，OSiCH3),0.07(s,3H，OSiCH3)，0.82(s,6H，OSi(CH3)3)，0.86(s，6H，OSi(CH3)3)，1.93(m,1H，H-2(5),1.95(s，1H，C三C画H),2.22(m,1H，H國2a)，2.39(dt,2H，J=8.4，2.4Hz，-CH2CH2-)，2.55(t，2H，J=8.4Hz，-CH2CH2-)，3.68(dd，1H，J=11.4:2.4Hz，H-5,),3.81(d,1H，J=11.4，2.4Hz,H醒5，)，3.89(m，1H，H-4,)，4.33(m,1H，H國3，)，6.20(dd，1H，J=7.8，6Hz，H-l,),7.85(s，1H，H國6)，8.33(bs，1H，N國H)。13CNMR(CDC13，150.8MHz):S7.0(SiCH3)，-6,9(SiCH3)，-6.4(SiCH3)，-6.2(SiCH3)，16.5(OC-CH2CH2),16.9(CeC-CH2CH2)，17.0(SiC(CH3)3)，18.2(SiC(CH3)3),24.2(SiC(CH3)3),24.5(SiC(CH3)3)，40.4(02，)，61.4(C-5,)，67.9(C三C-H)，70.8(C-3，)，70.9(C三C)，80.9(C三C)，84.1(C國l，)，86.8(C國4，)，91.2(C三C)，98.7(C-5),140.6(C-6)，147.5(C-2)，159.9(C-4)。对C27H43N205Si2+H533.28670[M+H]+计算的HRMS(FAB，十ve)是533.26009。向THF(5mL)中的6(0.270，0.51mmol.)的冷却溶液(0。C)在氮气氛下添加TBAF(1.0M，1.52mL，1.52mmol.)。反应混合物搅拌3小时，用冰醋酸(l.OmL)终止并真空浓缩。采用乙酸乙酯中的10%甲醇的柱色镨(闪式二氧化硅)洗脱产生作为无色油的7(0.ir7g，82%)。NMR(d6-DMSO，400MHz):81.88(s，1H，OC-H)，2.07(m,2H，H-2，)，2.36(dt2H，J=7.2，2.4Hz，-CH2CH2-)，2.54(t，2H，J=6.8Hz，-CI^CHr),3.53(dd，1H，J=12.0，4.0Hz，H-5，)，3.58(dd，1H，J=12.0，4.0Hz，H誦5')，3.76(m,lH，H-4'),4.19(m，1H，H國3，)，5.07(bs，1H，O-H)，5,23(bs，1H，O-H)，6.08(t,lH，J=6.4Hz，H-l，)，8.11(s,1H，H國6)，11.55(bs，1H，N画H)。13C匪R(CDC13，150.8MHz):S17.6(OC-CH2CH2),18.9(C^C-CH2CH2),39.5(C國2，)，60.7(C-5，)，70.0(C-3，)，73.7(C三C曙H)，75.1(OC),84.6(C画l，)，87.3(C-4,)，89.1(C三C)，93.0(C三C)，100.2(C國5)，144.7(C誦6),151.0(C國2),163.2(C画4)。对C15H16N205+Na[M+Na+327.28771计算的HRMS(FAB，+ve)是327.09635。对C15H16N205+AcO-[M+AcO丁363.1198计算的HRMS(FT-ICRMS-)是363.1221,对C15H15N2Os-[M303.1计算的MS-MS是303.1。向磷酸三甲酯(2mL)中的of7(0.060g,0.197mmol.)和1，8-双(二甲氨基)萘(质子海绵，0.068g,0.316mmol.)的冷却溶液(O'C)在氮气氛下经5分钟逐滴添加磷酰氯(22，0.237mmol.)。反应混合物在0。C搅拌3小时，将在无水DMF(2.0mL)中的焦磷酸三丁基铵(0.080g，0.237mmol.)的溶液添加至反应混合物并搅拌l分钟，随后用碳酸氩三乙基铵(l.OM，20mL，pH-8.5)终止。反应混合物搅拌2小时并过夜冻干。RP-HPLC纯化(0-50%0.1M乙酸三乙基铵—20:80H2O:MeCN具有0.1M乙酸三乙基铵梯度，经45分钟，流速是每分钟5mL)产生作为三乙基铵盐的8(17.7min.)。31P醒R(D20，81MHz):822.4(t,1P，J=19.8Hz，P-卩)，10.5(d,1P，J=20.3Hz，P-a)，-9.7(d,1P,J=19.8Hz，P國力。MALDI曙TOF(ATT基线，阴性模式)2M+2H]2，M+2H。5.2树状聚物的叠氮化物官能化点击反应配偶物的合成合成含有多个半缩醛基(受保护醛基)的叠氮化物官能化的树状聚物的具体反应方案示于图11。Cn(I)催化的三唑络合物连接反应的一般方法向THF:H20(3:1，40mL)中的9(7.31g，0.0256mol.)、10(3.00g，0.0128mol.)的溶液添加在1120(3mL)中的CuS04(0.103g，0.641mmol.)的溶液，随后添加固体抗坏血酸钠(0.253g，1.28mmol.)。反应混合物在室温搅拌过夜。混悬液用H20(50mL)稀释，冷却至0。C并用浓缩的NH4OH(5mL)处理10分钟。反应混合物用二氯甲烷(500mL)稀释并且有机层用盐水(2x50mL),随后用H2O(2x50mL)洗涤。保留有机层、干燥(MgS04)并真空浓缩。采用1:1乙酸乙酯:石油溶剂油的柱色谱(闪式二氧化珪)洗脱产生9(2.76g)、作为无色泡沫的单点击产物(ll，3.94g)以及12(4.92g，48%)。单点击产物(ll)随后与一当量的9反应以在检杏『wnfk，，n、6^吾".17善日矛.堂沐一岳站L1HMMR(CDCI3,600MHz):51.29(s,6H,OCW3),1.35(s，6H，C-CW3》，1.38(s,6H，C-CW3),1,49(s,6H,C-CW3》，4.19(m,4H,WW5，)，4.32(dd,2H'J-4.8'2.4Hz,W2'),4.46(dd,2H,J-14.4，8,4Hz'W6"),4.50(s'2H,-CWr),4.62(m,2H,W3')，4.64(m，2H,W6'》,5.18(s，4H,-CWr),5,51(d,2H,J=4.8Hz,W1，)，6,59(t,1H,J=1.8Hz，Ar-H)，6.64(d,2H;J=1.8Hz,Ar-H),7.79(s'2H'C=CH-).13CMMR(GDCI3，150.8Mhz):524.4(C-CH3),24.7《CCH3),25.9(C-CH3》，26.0(OCH3),46.1(CH2》，50,6(-CH67H6")'62.2(Ar-CH2-),67,0(OH4，)，70.1(CH2'),70.5(CH3，)，70,9(CH5'》，96.0(CH1，)，淮O(Ar-CH),107.9,109.1,"0.0,124.0(C=CH)，139.6,143.4，160.0.EShMSm/z80M+H+,13(1.53g，1.88mmol.)与10(0.220g，0.94mmoL)^M"在CuS04(0.008g，0.047mmoL)和^WL^^钠(0.019g，0.094mmoL)下的A^产^Eiif沐色语(闪式Si02;乙酸乙酯:曱醇9:1)后作为无色泡沫的14(1.65g，95%)。&NMR(CDC13，柳OMHz):51,26(s,12H,C-C线》，1.27《s，6H,C-CW3}，1.34(s,12H,C-C仏)，1.35(s,12H,C-CW3》，1.48(s，6H,C-GW3),4,19(m,8H,W4丽)，4.32(m,4H，W2》，4.46(m,4H,W6"),4.47(s,2H，-CWr》，4,62(m,4H,W3，),4*64(m,4H，W6')，5.12(s,8H,-CW2-),5,15(s,4H,-CWr),5.40(s,4H,-CW2-),5,49(bd,4H,J=4.8Hz,/■/1'》,6.50(m,4H,Ar-H),6.55(m'2H,Ar-H),6.58(m,1H'Ar-H),6'61(m,2H,Ar-H),7.59(s，2H，C=CH-》，7.78(s,4H,C-CH-).13CNMR(CDCb,150.8MHz):524.4(C-CH3》,24,9《C-CH3)，25.9(C-CH3)f26.0(C-CH3),45.9(CH2-),50.4(-CH67H6"),53.9(Ar-CH2-),61.8(Ar-CH2-》，61.9(Ar國Ot),67.0(CH4'),70.1(CH2'》，70.5《CH3'》，71.1(CH5'),96.1(CH1'),101.6,101.7，107.2,108.0'109,0，109,9,122.9,124.2,136,7,140.0，143.2，144.1，159.5，160.0.MALDI國TOF(ATT，阳性才莫式)m/z1859[M+H+。将树状氯化物转化成叠氮化物的一般方法向丙酮水(4:1,100mL)中的12(4.84g,6.01mmol.)的溶液添加NaN3(0.586g，9.01mmol.)并在氮气氛下加热回流3小时。反应混合物用乙酸乙酯(600mL)稀释并且有机层用盐水(2x50mL)、随后是水(2x50mL)洗涤。保留有机层、干燥(MgS04)并真空浓缩以产生作为白色无定形固体的13(4.72g，97%)。NMR((16-丙酮，400MHz):81.28(s,6H，C-CH3)，1.35(s，6H，C-CH3)，1.36(s，6H，C-CH3)，1.44(s，6H，C-CH3),4.30(dd，2H，J=3.6，2.0Hz，H6V6")，4.32(dd，2H，J=3.2，1.6Hz，H5，)，4.36(dd，2H，J=7,6，1.6Hz，H4，)，4.39(dd，2H，J=4.8，2.4Hz，H2，),4.61(d，2H，J=3.6Hz，H6，/6")，4.64(s，2H，-CH2)，4.70(dd，2H，J=7.6，2.4Hz，H3，)，5.20(s，4H，画CH2画)，5.47(d，2H，J=4.8Hz，Hl，)，6.73(m，3H，ArH)，8.07(s,2H，C-C國H)。13CNMR((16-丙酮，150.8MHz):525.7(C-CH3),26.1(C-CH3)，27.2(C-CH3)，27.4(C-CH3)，47.6(CH2-)，52.0(-CH6，/H6")，63.4(Ar-CH2-)，68.8(CH4，)，72.0(CH2')，72.5(CH3，)，72.9(CH5，)，98.2(CHl，)，1033(Ar-CH)，109.9(Ar-CH)，110.4，111.2，126.3(C=CH)，141.9，144.8，161.8.对C37H49N9012Na834.3398[M+Na+计算的HRMS(ESI，十ve)是834.3404。14(1.51g，0.81mmol.)与NaN3(0.079g,1.22mmol.)的反应产生作为白色无定形固体的15(1.45g，96%)。NMR(CDC13,600MHz):61,27(s,12H'C-CWa),1,34(s，12H'OCW3),1.37(s,12H，C-C仏》，1.48(s，12H,C-CW3),4.19(m,8H，画阔，4.24《s,2H,-CW;r),4.32(m,4H,W2'),4.46(dd,4H,J=13.8,8.4Hz,W6"),4.62(m,4H,W3'),4.64(m,4H,W6'),5.12(s,4H，5-18(s,8H，>0/"/2-),5.43(s,4H'5.49(bd,4H,J=4.8Hz,W1')，6.50(m,2H,Ar-H),6.55(m,4H，Ar-H),6.58《m，1H,Ar-H》，6.60(m,2H,Ar-H),7.78(s,2H,OCH-),7,79(s,4H,C-CH-).13CNMR(GDCI3,150.8MHz):524.4(C-CH3),24.8(C-CH3),25.8(C-CH3》，25.9(C-CH3),45.9(CH2-)，50.4(-CH67H6")，54.6(Ar-CH;r)，62.0(Ar-OV),62,1(Ar-CH2-),67.1(CH4'),70.3(CH2'),70.7《CH3')，711(CH5，)，96.2(CH1'),101.7,1C31,8'107,4,107,7,109.0,109.9，124.0,124.2,137.8,143.1,143.4，144.1，159.7，159.9。对C87H110N21O26Na1886.7829[M+Na+H+计算的HRMS(ESI，十ve)是1887.7862。树状异亚丙基脱保护的一般方法在氮气氛下向TFA:水(1:1;10mL)的混合物添加13(0.020g，24.7inmol.)。反应混合物加热至S0。C,4小时，随后真空浓缩。将水(加mL)添加至混合物并且含水层用DCM(3x20mL)洗涤数次，保留并过夜冻干以产生作为淡黄色泡沫的16(0.015g，63%)。MALDI-TOF(ATT，P日性才莫式)m/zM+H+。15(1.40g，0.75mmol.)与TFA:水(1:1;20mL)的反应产生作为淡黄色无定形固体的17(1.05g，卯％)。MALDI-TOF(ATT，阳性模式)m/z1545[M+H+。实施例6叠氮化物改性的和炔改性的核苷和核香酸向核酸的引入叠氮化物改性的和炔改性的核苷和核苷酸通过基本如实施例2所述的化学合成或酶合成得以高效引入核酸。得到的修饰核酸可以是根据所需的应用例如通过荧光标记或金属沉积受到特异性标记。这种标记策略是快速的并且代表检测核酸、核酸序列l基因的极其灵敏的方法，甚至无需PCR扩增。在第一实验中，为研究点击反应在DNA构造内的性能，制备核苷l和2(图9a和b)并通过标准固相合成方案引入寡核苦酸。点击反应的效率使用节基叠氮、CuS04、还原剂(抗坏血酸盐或TCEP)和稳定铜(I)的配体进行研究。这些结果汇总于表2内。与具有柔性炔2的寡核苷酸相比，包含刚性碱基l的寡核苷酸总是导致较低的点击产物产率。温度(10至40。C)不影响点击反应的产率。点击反应的效率随后作为显示用于检测的适用特性的叠氮化物类型的函数进行分析(图12)。叠氮荧光黄是极其灵敏的荧光标记(荧光量子产生几乎均一)，而叠氮香豆素提供点击标记的证据，原因在于荧光在三唑形成时^L激发[19。表2:4吏用节基叠氮、CuS04和TCEP的点击反应的总结<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>与包含利用苄基叠氮的实验相一致，包含刚性炔的寡脱氧核苷酸提供较低的点击转化产率。相反，根据HPLC和MALDI-TOF,含有柔性炔的寡核苷酸则提供几乎定量的转化。还可能直接在凝胶上标记DNA。含有改性的核碱基的DNA通过凝胶电泳与其他DNA链分开并且凝胶随后用叠氮荧光黄和Cu(I)处理以进行点击。凝胶的洗涤去除留凝胶中在已染色DNA内的多余荧光黄(图13)。从这些实验，可以明确推断含有炔改性的碱基的DNA可以用荧光黄选择性地进行标记。CYBR绿非特异性地对DNA染色并且因此也标记在点击反应前的未改性的DNA,如A2的泳道1和B2的泳道3所示(图13)。荧光黄是单体和在点击DNA后均强烈发荧光的分子。因此在与荧光黄进行点击反应后，必需洗涤凝胶以便去除留在已染色DNA内的多余荧光黄。香豆素是另一种发荧光分子，然而它作为单体不发荧光。它仅在点击反应后才发射荧光，此时叠氮化物转化成为三唑。香豆素的荧光仅在点击后才有效发射，如以下反应管内的实验中所见到(图14)。类似的实验可以在凝胶上进行。在另一实验中，用引入核苷2(图15)的寡脱氧核苷酸(ODN)研究点击反应的效率。该核苷2^f吏用对应的亚膦酰胺l(图15)经标准固相合成方案被引入寡核苷酸。包含单个或多个炔报*团的寡核苷酸示于表3.表3<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>点击方法包括依次添加叠氮化物3(图15)(DMSO溶液，10mM,50当量)、CuS(V配体[29络合物(DMSO溶液，0.05M，20当量)和TCEP(水溶液，0.1M，40当量)溶液至相应ODN的0.2mM溶液。反应混合物在室温下过夜振荡。样品随后通过膜来脱盐并且它们的质量通过MALDI-TOF(HPA基线)测定。实施例7用改性的dNTP对DNA模板的PCR扩增7.1PCR扩增来自酵母的poliiPCR实验采用的模板和引物正向引物5'-GATTTGGGCCGGATTTGTTTC反向引物3-TTTTATGCTATCTCTGATACCCTTG模板酵母的318bp序列(Rad30的nt483-800):GGGCCGGATTTGTTTCAATATGCTAATGTTTGATAATGAGTACGAGCTTACAC3(3CGACTTGAAACTGAAAGATGCATTAAGCAATATTCGTGAGGCTTTTATAC3GGGGCAACTAT(3ATATAMTTCCCATCTACCTCTTATACCCGAAAAGATAAAGTCTCTGAAGTTTGAAGGCGATGTTTTCAATCCAGAGGGCAGAGATCTGATCACAGATTGGGACGATGTAATACTTGCACTA(3GATCTCAG織TGCAAGGGTATCAGAGATAGCATAAAA(3ATATTGTCGGTTATACTACTTCGTGTGGTTTGTCTAGCAC该318bp模板含有59.75%[A+T]和40.25%[C+G]。使用PCR反应评估一系列市售热稳定型聚合酶引入改性的脱氧尿苷三磷酸盐2和8(图10)的能力。所用DNA聚合酶是Pwo和Taq(exo)DNA聚合酶(Roche)Vent、Vent(exo)、therminator聚合酶沐自NewEnglandBiolabs)Taq(promega)。代表性PCR反应含有0.05|iig酿酒酵母基因组YPH499或0.5照DNA模板(pDestl7-Pokta酵母[1-1889)、0.3mM每种正向引物和反向引物、1.25U聚合酶和含镁的10x聚合酶緩冲液、200jiM的每种未改性的dNTP(dATP、dCTP和dGTP;NEB)和200|nM改性的dUTP。天然三磷酸盐(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)用作对照。反应在50pL总体积内完成。PCR实验在EppendorfMastecyclerPersonal上进行.为扩增，使用热启动(94'C2分钟)，随后10个扩增循环(94。C15秒、53°C30秒、72°C45秒)、25个循环(94。C15秒、56。C30秒、42°C45秒)并最后在72。C温育2分钟。PCR产物在用溴化乙啶染色的2%琼脂糖凝胶上分析(图16)。PCR产物在QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)上纯化并用于银染、测序或消化。PCR反应的产物通过含有溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶电泳分离。产物用紫外光产物CCD照相机记录。7.2PCR扩增来自人的polH代表性PCR反应含有0.5照DNA模板(pDestl7-plH人[1-2142])、0.3mM每种正向引物和反向引物、1.25Upwo聚合酶和含镁的10x聚合酶緩冲液、200|iiM的每种未改性的dNTP(dATP、dCTP和dGTP;NEB)和200jiM改性的dUTP。天然三砩酸盐(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)用作对照。反应在50pL总体积内完成。PCR实验在EppendorfMastecyclerPersonal上进行。为扩增，使用热启动(在94°C2分钟)，随后10个扩增循环(94。C15秒、53。C30秒、72。C210秒)、30个循环(94。C15秒、56。C30秒、72°C45秒)并最后在72。C温育7分钟。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上用溴化乙啶染色分析(图16)。PCR产物在QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)上纯化并用于消化或测序。PCR反应的产物通过含有溴化乙啶的1%琼脂糖凝胶电泳分离。产物用紫外光产物CCD照相机记录。结果示于图17。对于检查，添加6的0.1MHC1并使探针离心(每分钟6000转/分钟，5分钟)。消化通过HPLC进行分析(interchimInterchromUptisphere3HDO柱(150x2.1mm)，緩冲液A:H20中的2mMTEA/HOAc;緩沖液B:2mMTEA/HOAcH20:MeCN1:4;0—30分钟；0%—30%B;30—32分钟；30%—100%B;32—36分钟；100%B;36—38分钟；100%—0%B;38—60分钟；0%B;流速每分钟0.2mL)(图18)。使用相同条件，通过共注射、UV和FT-ICR-HPLC-MS-MS确定不同的峰。7.3酶消化引入炔-介导的核苷酸的PCR片段(318mer)为进行酶消化，将含有改性的核苷酸8的318bpDNA模板(图10)(在lOOpL水的大约IO照)在10pL緩冲液A(300mM乙酸铵、lOOmMCaCl2、1mMZnS04，pH5.7)、22单位核酸酶PI(Penicilinumcitrium)和0.05单位小牛脾磷酸二酯酶I1内温育。样品在37。C振荡3小时。消化通过添加12緩冲液B(500mMTris-HCl，1mMEDTA)、10单位碱性磷酸酶(CIP)和0.1单位蛇毒磷酸二酯酶I(Crotalusadamanteusvenom)完成。样品在37。C再振荡3小时。7.4糖叠氮化物与改性的dsDNA在聚丙烯酰胺凝胶上的Cu(I)催化三唑络合物连接反应的一般方法全部点击实验在包含替代dTTP的2或8(图IO)的318bpPCR片段上进行。在5%聚丙烯酰胺凝胶上分离改性的PCR片段，随后将每一凝胶置于包含1:1MeOH:H20(25mL)的浴器内。将糖叠氮化物(O.lM，3mL)溶液添加至浴器内，随后添加CuS04(0.1M，600jiL)溶液及最后添加TCEP(0.1M，1.2mL)溶液。在室温下温和振荡这些溶液过夜。7.5银染与双链DNA连接的糖叠氮化物的一般方法倾去点击溶液并且每块凝胶用l:lMeOH:H20(3x50mL,每次洗涤10分钟)洗涤，随后用H20(3x50mL，每次洗涤10分钟)洗涤。每块凝胶随后与土伦试剂*(40mL)温育30分钟。在随后用H20(3x50mL，每次洗涤10分钟)洗涤后，凝胶用包含100mLH20、柠檬酸(l。/。，250jiL)和甲醛(35。/o,80-200jiL)的的显影液显影。取决于曱醛浓度，显影过程可以持续2分钟至20分钟。土伦试剂的制备向80mLH20添加AgNO3(0.5M，5mL)，随后添加NaOH(3.0M，1.0mL)及最后添加NH4OH(l:l浓度NH4OH:H20，2.2mL)。结论所提出的本发明包括新而模块式的方法，其用于通过高效引入改性的三磷酸盐而位点特异性地标记核酸。这些改性的三磷酸盐包含才艮据使用者需要可以进一步进行官能化、标记或染色的基团。可以预测RNA标记可以通过这些方法以及分别使用RNA聚合酶和反转率得以实现。因而，可以实施早期而高效地检测宿主内的病毒基因组。所报道的新的核酸标记方法是简单、高效、灵敏及高度选择性的。实施例8使用照相方法检测核酸黑白照相法是已知最灵敏的化学方法之一。相纸上所捕获的光子启动在后续显影过程中催化进一步银沉积的微小银核心形成[22。这产生在105(Ag+化学还原)和10"(Ag+光化学还原)之间的信号扩增因子，其与使用PCR所得的扩增因子相似。我们开发了利用系留至核酸的光敏作用染料的灵敏方法，其能够使用户以亚亳微孩傳尔灵敏度高效地检测特定基因(图21)。这种新方法简单(可以使用常规照相材料)、快速(检测以分钟计算)、高效(仅需要每个生物分子有一个光敏作用分子)和灵敏(目前未优化的灵敏度水平是1(T14-l(T15mol)。这种方法学与基因特异性生物化学工具如引物延伸和PCR技术的联合提供检测核酸和其他分析物的新而高效的方法。研究了众多荧光花青二氢吲哚(1和2)和会啉染料衍生物(3)在照相法中作为光敏剂发挥作用的能力(图22)。1-3的可见最大可见吸收分别是546nm,646nm和607nm。可以轻易检测到低至3xl(T14mol(30fmol)的二氢吲咮染料(1)，而(2)的检测限度大约是"!3fmol(图2h和221))。发现检测喹啉花青染料(3)比检测二氢吲哚染料(图22c)更灵敏(检测限度(Ufmo1)。背景雾可能在用强光照射时出现，然而背景雾可以通过使用低强度红外光源加以抑制，尽管灵敏度某种程度较低(图22d-f)。使用未改性的寡脱氧核糖核苷酸(ODN-l、ODN-2、ODN-3)的对照实验(图23)在高能照射时在50nmo1水平上产生少量背景阴性照相反应(即3个数量级差异)。若照设用红外线灯持续5分钟进行，则可以完全抑制阴性背景水平(图23b)。总之，未改性的DNA未产生染色。随后测试了市售染料Cy5(kax-646nm，ODN-4)和Cy5.5(、ax=646nm，ODN-5)系留的ODN的系列稀释(图16)。发现ODN-4的检测限度是lOOfmol，而Cy5.5ODN-5检测的灵敏度比前者高出因子IO(检测限度10fmo1)。因此，即便与其非系留的对照相比，用花青染料缀合的ODN观察到灵敏度轻微下降(图24)，该结果清楚地表明光敏剂缀合的生物分子如ODN的照相术可以可以用作高灵敏度分析工具。光敏感染料，例如化合物4或5还可以通过点击化学导入核酸(图25)。结论照相方法学可以与光敏化的染料-核酸偶联以产生分析物例如核酸检测的快速、筒单、高效及灵敏的方法。光敏剂基团的合适实例是如图22中所示基于喹啉的花青染料(例如3)或二氢吲哚染料(例如1或2),它们提供至少lOfmol(1)，1fmol(2)或0.1fmol(3)的灵敏度。可以分别在lOOftnol和lOfmol水平上检测到系留至寡脱氧核糖核苷酸的基于二氢吲哚的染料，如Cy5和Cy5.5。文献1E.Braun,Y.Eichen,U,Sivan,G.B節-Yoseph,Waft/馆1,,39f,775.〖2Mertlg，L.C.Ciacchi，R.Seidel,W,Pompe,A.DeVita,Ate打oLeffe/s2002,2,841.3丄Richter,户/iys/ca￡2卯3,，6,157.4K.Keren,M.Kmeger,R.Gilad,G.Ben-Yoseph,U.Sivan,E.Bratm，Sd柳ce2002,297,72.问F.Patolsky,Y.Weizm節n,O,Uoubashevsk't,I.Willner,>Angfew.C/i纖/打t￡d.2002，化2323.问E.Katz,I.WiMner，AngewanoPteChem/e-/nfema〖/o/a/Ed附o/r2004,43，6042.[7K.Keren,R.S.Berman,E.Braun,WanoLetters2004,4,323*问Y,Wdzrnan，F*Patolsky,I.Popov,I.W川ner,Wa打oLe付em2004,4,787.9C.F.Monson,A.T.WoooHey,A/anoLeffers2003，3,359.10〗S.Brakmann，S.Lobermann,A/sfe鹏打dteChem/e-/"tematfo/a/E鄉on加01,银1427.11jK.Burgess,D.Cook,C/柳fca/fev胁s2000,柳，2047.汇12丄Ludwig,F,Eckstein,Jot//na/ofOrgam'cCftemfef/y1991,56,1777,13jA.Roychowdhury,H.Illangkoon,C.L.Hendrickson,S,A.Benner，Or,/GLeffefs2004,6,489.14|B.Tol，讓，Cft柳，Sen1882,线1635.15JH.C.Kolb,M.G.Finn,K.B.Sharptess,A打gew.C/ieni-//ita/.2001,40,2004,岡B.W.Kirk,亂Feinsod,R.Favls，R.M,K晷man，F.Barany,Wuc/efcAc/dsRes.2002，30,3295.17]X.-b.Zhong,R.ReynoWs，丄R,Kfdd,K.K.Kidd，R.Jenison，R.A.Marter,D.C.Ward,PAWS2003,f00,11559.,A.C.Syvanen,WatRev,2001,2,930.19〗K.Sivak師ar,F.Xte，B.M.Cash,S.Long,H.N.Barnhill，Q.Wang,Organ/cHefferis2004，6,4603.〖20丄D.Kahl,M.MLGr柳nberg,丄Am.Chem.Sotx1999,121，598>604.〖21〗R.Micura,Angew.Chm.Int.Ed.2002,41813》，2265-2269.22T.H.James,iniAd/a打ces//rPtotocft柳fe&yVol.13(Eds.D,H,Volman,K.Go幅ck，G,Hammond),JohnWiley&SonsN柳York,1986，p,329ff.[23]P.丄Barr,A.S.Jones,P.Serafinowsld，R.T.Walker,J.Cftem.Soa,户e生Tlra/is.1,1978,f化1263.24〗L.Otvos，丄Szecsi,丄Sagi,T.Kovacs，Wuc/e/eAc/cteSy/np.Ser.糊7'线125,25K.Fujimoto,S.Mateuda,N.Tafcahashl,I,Salto,丄At.Chern.Soc.2000,f22,5646.26〗F,MorisVaras,X.H.Qian,C.H.Wong,J.Am.C力em,Soc.19袋6,m7647.[27]D,C.M.Kong，M,vonltzstein,Carfo^ydratefesea/icft1卵7，305，323.28〗D,Graham,丄A.Parkinson,T.Brown,丄C/je/n.Soc.,Pe/W"7>ans.f,19卵'1131-1138.[29Q.Wang,T.R.Chan,R.Hllgraf,V.V.Fok,n,K.B.Sharptess，M.G.Finn,丄舰CA柳.Soc.2003，f25,3192-3193,权利要求1.检测样品内分析物的方法，其包括步骤(i)提供样品；(ii)使样品与包含至少一个官能团的官能化化合物在其中所述化合物与待检测分析物形成缔合产物的条件下接触，其中所述官能团选自醛基、受保护醛基、醛前体基团，或用于导入醛基、受保护醛基或醛前体基团的手柄基团；(iii)根据需要，使手柄基团与包含醛基、受保护醛基或醛前体基团的反应配偶物反应；(iv)根据需要，将受保护醛基和醛前体基团转化成醛基；(v)在标记基团在所述缔合产物内的醛基周围形成的条件下，使具有醛基的所述缔合产物与标记试剂接触；和(vi)检测所述的标记基团。2.权利要求l所述的方法，其包括定性检测。3.权利要求1或2所述的方法，其包括定量检测。4.权利要求l-3中任一项所述的方法，其中分析物选自核酸，以及结合核苷、核苷酸或核酸的分子。5.权利要求l-4中任一项所述的方法，其中待检测分析物是选自DNA和RNA的核酸。6.权利要求l-5中任一项所述的方法，其中样品是生物样品。7.权利要求6所述的方法，其中样品是农业样品或营养样品。8.权利要求6所述的方法，其中样品是临床样品。9.权利要求l-8中任一项所述的方法，其中检测直接实施，无需扩增。10.权利要求l-8中任一项所述的方法，其中检测与扩增步骤组合实施。11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中实施对核酸分析物的序列特异性检测。12.权利要求ll所述的方法，其中所述締合产物的形成包含序列特异性杂交反应。13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中官能化化合物包含(i)脂族或环脂族醛基、受保护的脂族或环脂族醛基，或者脂族或环脂族醛前体基团；(ii)芳族或杂芳族醛基，或者芳族或杂芳族醛前体基团；和/或(iii)炔醛基、受保护的炔醛基或者炔醛前体基团。14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中受保护的醛基选自缩醛基、半缩醛基例如糖或糖相关化合物内的半缩醛基、硫代或二硫缩醛基、咪唑啉酮基和苯并瘗哇基。15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中醛前体基团选自羧酸及羧酸衍生物如腈和伯醇。16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其中手柄基团选自叠氮基和炔基。17.权利要求16所述的方法，其中所述叠氮基或炔基通过进行点击反应与包含醛基、受保护醛基或醛前体基团的反应配偶物反应。18.权利要求1-17中任一项所述的方法，其中官能团与核苷性化合物或核苷酸性化合物，或其寡聚物或聚合物的核碱基连接。19.权利要求18所述的方法，其中核碱基选自天然存在的和非天然存在的嘌呤碱基和嘧咬威基。20.权利要求19所述的方法，其中官能团与嘧啶核碱基的第5位和第6位、优选第5位，或与嘌呤核碱基的第7位和第8位、优选第7位连接。21.权利要求l-20中任一项所述的方法，其中官能团经直接的键或间隔基与化合物连接。22.权利要求21所述的方法，其中所述间隔基是柔性间隔基，或至少部分刚性的间隔基。23.权利要求22所述的方法，其中间隔基包含选自烯基、炔基、环状基团特别是芳基和芳杂环基及其组合中的至少一种基团。24.权利要求l-23中任一项所述的方法，其中所述官能化化合物选自(i)官能化的核酸结构单元或核酸类似物结构单元；和/或(ii)官能化的核酸或核酸类似物。25.权利要求24所述的方法，其中所述締合产物的形成包含将所述官能化结构单元引入核酸分子或核酸类似物分子。26.权利要求25所述的方法，其中所述官能化的核苷酸或核苷酸类似物用酶引入核酸分子。27.权利要求25所述的方法，其中所述締合产物的形成包含将所述官能化的核酸或核酸类似物与待检测分析物结合。28.权利要求27所述的方法，其中所述结合包含与核酸分析物的杂交。29.权利要求24-28中任一项所述的方法，其包括任选与核酸扩增反应组合的引物延伸反应。30.权利要求29所述的方法，其包括提供在测定条件下与待检测核酸分析物或其互补物杂交的至少一种引物分子；和延伸所述引物，其中将至少一种官能化的核苷酸或核苷酸类似物引入延伸产物。31.权利要求29或30所述的方法，其包括提供在测定条件下与待检测核酸分析物或其互补物杂交的至少一种官能化的引物分子；延伸所述引物分子，其中形成延长的引物分子。32.权利要求28-31中任一项所述的方法，其包括提供在测定条件下与待检测核酸分析物或其互补物杂交的官能化杂交探针，其中形成了杂交产物。33.权利要求26-32中任一项所述的方法，其包括提供在测定条件下与待检测核酸分析物或其互补物杂交的官能化杂交探针；和使杂交产物接受含有至少一个错配的杂交产物溶解的处理，其中未溶解的杂交产物的存在指示具有与杂交探针完全互补序列的核酸的存在和/或其量。34.权利要求33所述的方法，其中所述处理包含错配消化处理。35.权利要求34所述的方法，其中错配消化处理包含使杂交产物与错配-糖基化酶接触。36.权利要求33所述的方法，其中所述处理包含差异性杂交处理。37.权利要求l-36中任一项所述的方法，其中所述标记试剂包含荧光活性基团或氧化还原活性基团。38.权利要求l-37中任一项所述的方法，其中所述标记试剂包含金属基团。39.权利要求l-38中任一项所述的方法，其中所述基团选自可以选择性沉积在所述締合产物内的醛基周围的金属原子和/或金属离子，如Ag、Au、Bi、Cu、Pd、Pt。40.权利要求38或39所述的方法，其中所述标记试剂包含银氨络合物。41.权利要求l-40中任一项所述的方法，其中检测通过光学方法实施。42.权利要求1-41中任一项所述的方法，其中检测通过电学方法实施。43.权利要求l-42中任一项所述的方法，其包括平行检测多种核酸。44.权利要求l-43中任一项所述的方法，其中检测在固体表面上实施，例如在孩支阵列芯片上。45.检测样品内分析物的试剂盒，其包含(a)官能化化合物，其包含选自醛基、受保护醛基或醛前体基团，或者用于导入醛基、受保护醛基或醛前体基团的手柄基团的官能团；(b)任选用于包含趁基、受保护醛基或醛前体基团的手柄基团的反应配4禺物；(c)任选能够将受保护醛基和醛前体基团转化成醛基的醛形成试剂；和(d)标记试剂。46.权利要求45的试剂盒在权利要求l-44中任一项所述方法中的用途。47.式(I)化合物A-S-N其中A是选自醛基、受保护醛基或醛前体基团的官能团，S是间隔基或键，和N是核酸结构单元或核酸类似物结构单元如核苷性化合物或核苷酸性化合物。48.权利要求47所述的化合物，其中受保护醛基选自缩醛基、半缩醛基、硫代和二硫缩醛基、咪唑啉酮基和苯并噢哇基。49.权利要求47所述的化合物，其中醛前体基团选自羧酸及羧酸衍生物如腈和伯醇。50.权利要求47-49中任一项所述的化合物，其中官能团与核碱基连接。51.权利要求50所述的化合物，其中核碱基选自天然存在的和非天然存在的嘌呤碱基和嘧咬碱基52.权利要求50或51所述的化合物，其中核碱基选自腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、鸟噤呤、7-脱氮鸟噤呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、肌苷和黄嘌呤。53.权利要求51或52所述的化合物，其中官能团与嗜吱核碱基的第5位和第6位、优选第5位，或与噤呤核碱基的第7位和第8位、优选第7位连接。54.权利要求47-53中任一项所述的化合物，其中所述间隔基是至少部分刚性的间隔基。55.权利要求54所述的化合物，其中间隔基包含选自烯基、炔基、环状基团，特别是芳基和芳杂环基及其组合中的至少一种基团。56.权利要求47-55中任一项所述的化合物，其是用于化学合成或酶合成核酸或核酸类似物的结构单元，或其前体。57.权利要求47-56中任一项所述的化合物，其是三磷酸核苷，尤其是核糖、2'-脱氧核糖或2'，3'-二脱氧核糖三磷酸核苷或亚膦酰胺核苷、H-膦酸酯或磷酸三酯。58.权利要求46-56中任一项所述的化合物，其是用于合成肽核酸、吗啉代核酸或锁核酸的结构单元。59.核酸分子或核酸类似物分子，其中已引入至少一种根据权利要求47-58中任一项所述的式(I)化合物。60.权利要求59所述的分子，其是选自DNA和RNA的核酸，或是选自肽核酸、吗啉代核酸或锁核酸的核酸类似物。61.合成核酸分子或核酸类似物分子的方法，其包括将包含权利要求47-58中任一项所述化合物(1)的至少一种核苷酸结构单元或核苷酸类似物结构单元引入核酸分子或核酸类似物分子。62.权利要求61所述的方法，其包括化学合成和/或酶合成。63.权利要求59或60所述的核酸分子或核酸类似物分子的金属化产物。64.权利要求59或60所述的核酸类似物分子或者权利要求63所述的金属化产物与分析物的締合产物。65.权利要求64所述的产物，其是具有互补性核酸的杂交产物。66.检测样品内核酸的方法，其包括步骤(i)提供样品；(ii)使样品与包含至少一个官能团的官能化化合物在所述化合物与待检测核酸或其互补物形成締合产物的条件下接触，其中所述官能团是点击反应的第一反应配偶物；(iii)使締合产物与点击反应的第二反应配偶物在第一反应配偶物与第二反应配偶物间的点击反应发生的条件下接触，其中第二反应配偶物还包含标记基团或标记前体基团；(iv)根据需要，将标记前体基团转化成标记基团；和(v)检测所述标记基团。67.权利要求66所述的方法，其包括在权利要求2-12及18-44中任一项页所定义的特征。68.权利要求66或67所述的方法，其中官能团选自叠氮基或炔基。69.权利要求66-68中任一项所述的方法，其中点击反应包含(3+2)环化力口成。70.^5L利要求69所述的方法，其中5-元杂环通过点击反应形成。71.权利要求66-68中任一项所述的方法，其中第二反应配偶物包含如此标记基团，其选自光学可检测的标记基团，特别是荧光标记基团，或选自氧化还原活性的标记基团。72.权利要求66-71中任一项所述的方法，其中第二反应配偶物包含选自醛基、受保护醛基及醛前体基团的标记前体基团。73.权利要求72所述的方法，其中标记前体基团至标记基团的转化包含在醛基周围形成金属沉积。74.检测样品内分析物的试剂盒，其包含(a)官能化化合物，其包含点击反应的第一反应配偶物的至少一个官能团，(b)点击反应的第二反应配偶物，其中第二反应配偶物还包含标记基团或标记前体基团，和(c)任选能够将标记前体基团转化成标记基团的标记形成试剂。75.权利要求74的试剂盒在权利要求66-73中任一项所述方法中的用途。76.式(II)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中C是点击反应的第一反应配偶物的官能团，s是间隔基或键，和N是核酸结构单元或核酸类似物结构单元如核苦性化合物或核苷酸性化合物。77.权利要求76所述的化合物，其具有如在权利要求50-58中任一项所定义的特征。78.权利要求76或77所述的化合物，其中官能团经具有链长度至多达IO个原子的间隔基与核碱基连接。79.权利要求78所述的化合物，其中链长度至多达3个原子。80.核酸分子或核酸类似物分子，其中已引入根据权利要求76-79中任一项所述的至少一种式(II)化合物。81.权利要求80所述的核酸分子或核酸类似物分子，其是选自DNA和RNA的核酸，或是选自肽核酸、吗啉代核酸或锁核酸的核酸类似物分子。82.合成核酸分子或核酸类似物分子的方法，其中包括将包含权利要求76-79中任一项所述化合物(II)的核苷酸结构单元或核苷酸类似物结构单元引入核酸分子或核酸类似物分子。83.权利要求82所述的方法，其包括化学合成和/或酶合成。84.权利要求82或83所述的方法，其还包括使核酸分子或核酸类似物分子与化合物(II)的第二反应配偶物接触，并进行第一反应配偶物与第二反应配偶物之间的点击反应。85.权利要求82或83所述的核酸分子或核酸类似物分子与分析物的缔合产物。86.权利要求85所述的产物，其是具有互补性核酸的杂交产物。87.检测样品内分析物的方法，其包括步骤(i)提供样品；(ii)使样品与包含至少一个官能团的官能化化合物在所述化合物与待检测分析物形成締合产物的条件下接触，其中所述官能团选自光敏剂基团或用于导入光敏剂基团的手柄基团；(iii)根据需要，使手柄基团与包含光敏剂基团的反应配偶物反应；(iv)在所述締合产物的光敏剂基团存在时，在所述光敏介质内形成标记基团的条件下，照射与光敏介质接触的所述締合产物；和(v)检测所述标记基团。88.权利要求87所述的方法，其包括如在权利要求2-12和16-44中任一项所定义的特征。89.权利要求87或88所述的方法，其中光敏剂基团选自荧光染料团。90.权利要求89所述的方法，其中光敏剂基团选自基于花青的二氢P引咮基，以及奎啉基。91.权利要求87-90中任一项所迷的方法，其中光敏介质包含能够形成金属晶核的金属原子或离子。92.权利要求91所述的方法，其中金属是Ag。93.权利要求87-92中任一项所述的方法，其中光敏介质是感光纸如相纸或在支持材料上的感光乳剂或感光凝胶。94.权利要求87-93中任一项所述的方法，其中照射步骤(iv)用长波长可见光和/或用红外光进行。95.检测样品内分析物的试剂盒，其包含(a)官能化化合物，其包含选自光敏剂基团或用于导入光敏剂基团的手柄基团的至少一个官能团；(b)任选包含光敏剂基团的手柄基团的反应配偶物，和(c)在光敏剂基团存在下，照射时形成标记基团的光敏介质。96.权利要求95的试剂盒在权利要求87-94中任一项所述的方法中的用途。97.权利要求1-44、66-73或87-94中任一项所述方法，或权利要求45、74或95所述试剂盒用于农业应用的用途。98.权利要求97所述的用途，其用于检测来自植物、植物病原体或植物害虫如昆虫的核酸。99.权利要求97或98所述的用途，其用于检测遗传变异性，例如在植物、植物病原体或植物害虫内的SNP。100.权利要求97-99中任一项所述的用途，其用于检测或监测除草剂、杀真菌剂或杀虫剂抗性、耐受性或不耐性，例如真菌、昆虫或植物内的杀虫剂抗性、耐受性或不耐性。101.权利要求97-100中任一项所述的用途，其用于基因型分型，例如用于检测和/或区分真菌、昆虫或植物的物种和品系。102.权利要求97-101中任一项所述的用途，其用于检测和/或区分基因修饰生物或基因修饰品系，例如真菌、昆虫或植物的基因修饰生物或基因修饰品系。103.权利要求1-44、66-73或87-94中任一项所述方法，或权利要求45、74或95所述试剂盒的用途，其用于医学、诊断和法医应用。104.;f又利要求103所述方法在人类医学或兽医中的用途。105.权利要求104所述的用途，其用于检测来自病原体例如人类病原体的核酸。106.权利要求103-105中任一项所述的用途，其用于检测遗传变异性，例如人类中的SNP。107.权利要求103-106中任一项所述的用途，其用于检测药物抗性、耐受性或不耐性，或者变态反应。108.权利要求103-107中任一项所述的用途，其用于基因型分型。109.权利要求103-108中任一项所述的用途，其用于检测基因修饰生物或基因修饰品系，例如细菌或病毒的基因修饰生物或基因修饰品系。110.权利要求103-109中任一项所述的用途，其用于诊断疾病，例如遗传疾病、变应性疾病、自身免疫性疾病或传染病。111.权利要求1-44、66-73或87-94中任一项所述方法，或权利要求45、74或95所述试剂盒的用途，其用于检测基因的功能和/或表达。112.权利要求1-44、66-73或87-94中任一项所述方法，或权利要求45、74或95所述试剂盒的用途，其用于商标保护。113.权利要求112所述的用途，其用于检测产物内所编码的特定信息。114.权利要求1-44、66-73或87-94中任一项所述方法，或权利要求45、74或95所述的试剂盒的用途，其用于营养性应用，尤其是在铜料领域内。115.权利要求1-44、66-73或87-94中任一项所述方法，或权利要求45、74或95所述试剂盒的用途，其用于外遗传分析。116.权利要求115所述的用途，其用于DNA曱基化模式的分析。117.检测样品内分析物的方法，其包括步骤(i)提供样品；(ii)提供包含光敏剂基团或用于导入光敏剂基团的手柄基团以及猝灭剂基团的报道分子，其中光敏剂基团在待检测分析物不存在时伴灭；(iii)使样品与报道分子在光敏剂基团的猝灭在分析物存在时至少部分减弱或终止的条件下接触；(iv)根据需要，使手柄基团与包含光敏剂基团的反应配偶物反应；(v)在标记基团在所述报道分子内未袢灭的光敏剂基团存在时形成于所述光敏介质内的条件下，照射与光敏介质接触的所述报道分子；和(vi)检测所述标记基团。118.检测样品内分析物的试剂盒，其包含(a)包含光敏剂基团或用于导入光敏剂基团的手柄基团以及猝灭剂基团的报道分子，其中光敏剂基团在待检测分析物不存在时猝灭；(b)任选包含光敏剂基团的手柄基团的反应配偶物；和(c)在照射未猝灭的光敏剂基团时形成标记基团的光敏介质。全文摘要本发明涉及用于检测分析物例如核酸的方法和试剂。该新的方法和试剂允许简单而灵敏的检测，甚至在复杂生物样品内也是如此。文档编号C07H19/20GK101238141SQ200680015157公开日2008年8月6日申请日期2006年4月28日优先权日2005年5月2日发明者A·施沃格勒尔,G·A·伯雷,J·吉尔里奇,M·R·莫菲德,T·卡雷尔申请人:巴斯福股份公司