抗结核药组合物和方法

专利名称：抗结核药组合物和方法
技术领域：
本发明涉及治疗由微生物所致疾病、特别是结核的方法和组合物。本发明还涉及具有提高了的抗分枝杆菌活性的方法和组合物，也就是包含新颖的取代的乙二胺化合物的组合物。在某些实施方案中，本发明包括组合物，这些组合物包含取代的乙二胺化合物，进一步包含抗结核药，诸如利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇。

背景技术：
分枝杆菌感染经常表现为诸如结核这类疾病。由分枝杆菌所致人类感染自古以来一直广为传播，并且今天结核仍然是死亡的主导原因。尽管自从十九世纪中叶以来该疾病的发生率有所下降，并且生活标准不断提高，不过分枝杆菌疾病仍然在医疗资源有限的国家中构成发病率和死亡率的主导原因。另外，分枝杆菌疾病能够导致无免疫应答患者的压倒性、传播性疾病。尽管世界上很多健康组织都已付诸努力，不过从未实现分枝杆菌疾病的根除，也不会很快根除。世界人口有近三分之一被复合结核分枝杆菌感染，普遍称之为结核(TB)，每年新增大约八百万病例，并且二至三百万死于TB。结核(TB)是归因于单一病因中的人类最大数量中的死亡原因(Dye等，J.Am.Med.Association，282，677-686，(1999)；和2000 WHO/OMS Press Release)。
在数十年下降之后，TB现在处于上升中。在美国，据信多达一千万名个体被感染。1990年报道有几乎28,000个新增病例，比1989年增加9.4％。从1985年至1990年观察到TB病例增加16％。过度拥挤的生活条件和所分享的空间尤其有助于TB的传播，可以解释在监狱囚犯和美国大城市无家可归者中所观察到的病例增加。全部“获得性免疫缺陷综合征”(AIDS)患者中大约有一半将患上分枝杆菌感染，而TB是一种尤其有毁灭性的并发症。AIDS患者面临更高的形成临床TB的危险，并且抗TB治疗似乎不如在非AIDS患者中那样有效。所以，该感染经常发展为致命的广为传播的疾病。
在困扰AIDS患者的机会感染中逐渐发现除结核分枝杆菌以外的分枝杆菌。来自复合细胞内鸟分枝杆菌(MAC)、尤其第四与第八血清型的生物体在从AIDS患者分离的分枝杆菌中占到68％。发现有庞大数量的MAC(多达每克组织中有1010个耐酸性杆菌)，所以，被感染的AIDS患者的预后较差。
世界卫生组织(WHO)一直鼓励对抗TB，推荐主动性预防，例如″Expanded Program on Immunization″(EPI)，和主动性治疗顺应性，例如″Directly Observed Treatment Short-Course″(DOTS)。就TB的根除而言，诊断、治疗和预防是同等重要的。活动期TB患者的迅速检测将允许早期治疗，由此预期治愈率为约90％。因此，早期诊断是对抗TB的关键。另外，治疗顺应性将不仅确保感染的消除，而且确保耐药性菌株出现的减少。
耐药性结核分枝杆菌的出现是一种极为令人不安的现象。对至少一种标准药物确有耐受性的新增TB病例的速率从早期1980年的10％增加到1991年的23％。对治疗制度的顺应性因此也是消除TB和防止耐药性菌株出现的努力中的决定性因素。新治疗剂的开发同样重要，它们作为疫苗和治疗都是有效的，用于由耐药性分枝杆菌所致疾病。
多重耐药结核(MDR TB)为耐受用于治疗结核的初级药物中的两种或多种的结核形式。在细菌发生抵抗抗生素攻击并且将其效力传播给子代时发生对一种或几种形式的治疗的耐药性。由于细菌的菌株整体将这种能力遗传以抵抗各种治疗作用，所以耐药性可以在人与人之间传播。
世界卫生组织估计全世界有达5千万人可能感染了结核抗性株。此外，全世界每年诊断有300,000个MDR-TB新病例并且79％的MDR-TB病例目前表现出对常用于治疗结核的三种或多种药物的耐药性。
在2003年，疾病控制中心(Centre for Disease control)(CDC)报告在美国有7.7％的结核病例耐受用于治疗结核的第一线药物异烟肼。CDC还报告在美国有1.3％的结核病例耐受异烟肼和利福平。利福平为最常与异烟肼联用的药物。
显然在治疗过程中或之前发生的结核耐药菌株的几率是卫生组织和卫生保健从业人员主要关注的。用于治疗结核的药物包括，但不限于乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素、异烟肼、莫西沙星和利福平。可以对特定的个体制定治疗的确切过程和期限，不过，几种策略为本领域技术人员众所周知的。
尽管已经鉴别了37种类以上分枝杆菌，不过全部人类感染有95％以上都是由六种分枝杆菌所致结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、细胞内鸟分枝杆菌(M.avium intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonae)和麻风分枝杆菌(M.leprae)。人类中最普遍的分枝杆菌疾病是结核(TB)，它主要是由包含结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(M.bovis)或非洲分枝杆菌(M.africanum)所致(Merck Manual 1992)。感染通常由感染性颗粒的吸入所引发，所述颗粒能够到达肺中的末端路径。在被肺泡巨噬细胞吞入后，杆菌能够自由复制，最终破坏吞噬性细胞。继而发生级联效应，其中吞噬性细胞的破坏导致另外的巨噬细胞和淋巴细胞移行至感染部位，它们最终也被消除。疾病在最初阶段因被感染的巨噬细胞移行并定位于淋巴结以及进入血流和其他组织而进一步传播，所述其他组织例如骨髓、脾、肾、骨和中枢神经系统(参见Murray等Medical Microbiology，The C.V.Mosby Company 219-230(1990))。
对分枝杆菌的毒力有贡献的因素尚无清楚的认识。很多研究人员暗示细胞壁与细菌表面的脂质是集落形态和毒力的贡献者。有证据表明，某些分枝杆菌细胞表面上的C-分枝杆菌糖苷脂在促进生物体在巨噬细胞内的存活上是很重要的。海藻糖6，6′-二霉菌酸酯是一种索状因子，在其他分枝杆菌中都有牵连。
集落形态学和毒力的相互关系在鸟分枝杆菌(M.avium)中特别突出。鸟分枝杆菌存在若干不同的集落形式。在常规实验室培养基上生长成透明或粗糙集落的杆菌在组织培养物中的巨噬细胞内是可繁殖的，当注射到易感小鼠中时是有毒力的，对抗生素是有耐受性的。供养在实验室培养基上的粗糙或透明杆菌经常自发地呈现不透明的R集落形态，此时它们在巨噬细胞中不是可繁殖的，在小鼠中是有毒力的，对抗生素是高度易感的。鸟分枝杆菌的透明、粗糙与不透明菌株之间的集落形态学差异几乎是确定的，这是由于包在透明与粗糙生物体表面上的糖脂的存在，所述糖脂充当保护性被膜。这种被膜或包膜主要由C-分枝杆菌糖苷脂组成，它们明显防护有毒力的鸟分枝杆菌生物体不受溶菌酶和抗生素的作用。相反，鸟分枝杆菌的无毒力、不透明形式在它们的表面上具有非常少的C-分枝杆菌糖苷脂。对抗生素的耐受性和对被巨噬细胞杀死的耐受性都已归因于鸟分枝杆菌表面上的糖脂屏障。
分枝杆菌感染的诊断得到病原体的分离和鉴别的确认，不过常规诊断基于唾液涂片、胸X-射线检查(CXR)和临床症状。培养基上分枝杆菌的分离花费长达四至八周。种属鉴别花费另外两周。检测分枝杆菌还有若干其他技术，例如聚合酶链反应(PCR)、结核分枝杆菌直接试验、或扩增结核分枝杆菌直接试验(MTD)、和采用放射性标记的检测测定法。
一种广泛用于检测由结核分枝杆菌所致感染的诊断试验是结核菌素皮试。尽管皮试有大量版本都是可用的，不过通常使用两种结核菌素抗原制备物之一旧结核菌素(OT)或纯化蛋白衍生物(PPD)。将抗原制品经真皮注入皮肤内，或者局部施用，然后利用multiprong接种器侵入性转运至皮肤内(Tine试验)。皮试诊断法存在若干问题。例如，Tine试验不作一般性推荐，因为不能准确控制注射到真皮内层的抗原量(参见Murray等Medical Microbiology，The C.V.Mosby Company219-230(1990))。
尽管结核菌素皮试被广泛使用，不过它们通常需要二至三天才出结果，很多时候结果是不准确的，因为在已经暴露于分枝杆菌但是仍然健康的受试者中有时见到假阳性。另外，误诊的情形也是频繁的，因为阳性结果不仅见于活动期TB患者，而且见于接种过卡介苗(BCG)的个人，和已经被分枝杆菌感染但是尚未形成该疾病的那些人。因此借助结核菌素皮试难以区分活动期TB患者和其他人，例如家庭TB接触。另外，结核菌素试验经常在被除结核分枝杆菌以外的分枝杆菌感染(MOTT)的那些个体中产生交叉反应。因此，利用目前可用的皮试进行诊断经常有误差和不准确。
由药物敏感性生物体所致结核的标准治疗是一种六个月的制度，由两个月的四次给药、继之以四个月的两次给药组成。遍及六个月疗程给予的两种最重要的药物是异烟肼和利福平。尽管该制度是相对简单的，不过它的给药是相当复杂的。在第一期治疗期间经常要求每日摄入八粒或九粒药丸；前景令人堪忧。进而更严重地，患者经常在数周内没有症状，几乎全部都在数月内被治愈。不过，如果没有继续治疗至完成，患者可能经历复发，没有继续治疗至完成的患者的复发率很高。各种形式的患者护理用于促进对疗法的坚持。确保患者服药的最有效方式是采用直接观察疗法，这牵涉健康护理团队成员观察患者服用每剂每种药物。可以在诊所、患者居所或任意获得互相承认的场所提供直接观察疗法。几乎全部患有由药物敏感性生物体所致结核并且完成疗法的患者都将被治愈，复发的危险是非常低的(″EndingNeglectThe Elimination of Tuberculosis in the United States″ed.L.Geiter Committeeon the Elimination of Tuberculosis inthe United States Division of Health Promotion and DiseasePrevention，Institute of Medicine.Unpublished.)。
不过，FDA批准了将三种主要用于治疗结核的药物(异烟肼、利福平和吡嗪酰胺)合并成一种药丸的药物。因此，减少了患者必需要每天服用的药丸的数量并且使得患者仅服用三种药物之一，即产生MDR-TB的常见路径变得不可能，在治疗结核的领域，尤其是在那些结核菌株为耐药性的病例中仍然存在需求。
亟需有效的治疗制度，包括改进了的疫苗接种和治疗方案。作为治疗顺应性问题的结果，目前可用的治疗剂不再始终有效，治疗顺应性问题有助于耐药性分枝杆菌菌株的形成。
此外，本领域中对有效抗传染病的新组合物和方法存在需求。更具体地说，对有效治疗分枝杆菌疾病的新组合物和方法存在需求。
乙胺丁醇(EMB)是一种广泛使用的治疗TB的抗生素，在1988年，结核疗法交付使用了三亿剂以上。

乙胺丁醇 乙胺丁醇是在二十世纪五十年代由Lederle Laboratories开发的，具有低毒性，具有良好的药动学。不过，乙胺丁醇具有相对高的最小抑制浓度(MIC)，约为5μg/ml，并且可能导致视神经炎。因而，日益需要新的和更有效的治疗组合物(例如参见美国专利No.3,176,040、美国专利No.4,262,122、美国专利No.4,006,234、美国专利No.3,931,157、美国专利No.3,931,152、U.S.Re.29,358和

等，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters11(2001)1679-1681)。自从发现乙胺丁醇的有益效果以来，在TB治疗上没有取得什么药理学进展。而且，由于耐药性菌株的联合出现和分枝杆菌疾病的更普遍流行，显然新治疗组合物是对抗结核中的决定性因素。
需要明显有效的治疗制度，包括改进了的疫苗接种和治疗方案。治疗性疫苗是可取的，它将预防结核的发生，因此消除对疗法的需要。尽管目前可用的治疗剂是有效的，例如乙胺丁醇，不过耐药性菌株的出现已经使新的制剂和组合物成为必需，它们比乙胺丁醇更通用。作为治疗顺应性问题的结果，目前可用的治疗剂不再始终有效，引起耐药性分枝杆菌菌株的形成。亟需新的抗结核药，它们提供高度有效的治疗，缩短或者简化结核化疗。


发明内容
本发明包含这样的方法和组合物，其中包含有效治疗传染病的乙二胺化合物。本发明还提供这样的方法和组合物，其中包含具有提高了的抗分枝杆菌活性的取代的乙二胺类，包括具有提高了的抗结核活性的取代的乙二胺类。
本发明涵盖取代的乙二胺类，它们可以从各种胺化合物衍生而来。本发明中，取代的乙二胺类基于下列结构。

取代的乙二胺 本文所述取代的乙二胺化合物是如下合成和筛选活性的。取代的乙二胺的化学文库是在聚苯乙烯固相支持体上制备的，采用裂分和汇合技术。这种技术可以合成不同组取代的乙二胺类。利用体外生物学测定法筛选这些二胺类的抗TB活性，包括高通量筛选(HTS)测定法，基于最近完成的结核分枝杆菌基因序列，和最小抑制浓度(MIC)测定法。
本文所述方法和组合物包含取代的乙二胺类，它们有效对抗由感染性生物体所致疾病，所述生物体包括但不限于细菌和病毒。本发明的一种实施方案提供包含取代的乙二胺类的方法和组合物，它们有效对抗分枝杆菌疾病。本发明的另一种实施方案提供包含取代的乙二胺类的方法和组合物，它们对分枝杆菌疾病具有50μM或更低的MIC。本发明的另一种实施方案包含取代的乙二胺，它们对分枝杆菌疾病具有25μM或更低的MIC。本发明的另一种实施方案包含取代的乙二胺类，它们对分枝杆菌疾病具有12.5μM或更低的MIC。本发明的另一种实施方案包含取代的乙二胺类，它们对分枝杆菌疾病具有5μM或更低的MIC。在本发明的另一种实施方案中，这些方法和组合物包含取代的乙二胺类，它们具有10％或更大的HTS Luc活性。在本发明的另一种实施方案中，这些方法和组合物包含取代的乙二胺类，其中一个胺基团是从伯胺衍生的，其中另一个胺基团是从伯胺或仲胺衍生的。在本发明的另一种实施方案中，这些方法和组合物包含取代的乙二胺类，其中一个胺是从顺式-(-)-桃金娘烷基胺、环辛胺、2，2-二苯基乙胺、3，3-二苯基丙胺、(+)-冰片基胺、1-金刚烷甲胺、(+)-异松蒎基胺或(-)-异松蒎基胺衍生的。
本发明涵盖取代的乙二胺类的各种盐复合物和其他取代的衍生物。本发明还涵盖取代的乙二胺类和它们取代的衍生物的对映体和其他立体异构体。本发明进一步涵盖对动物的治疗，包括但不限于人类。
此外，本发明涵盖组合物，它们包含新颖的取代的乙二胺化合物，进一步包含抗结核药，包括，但不限于利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇及其类似物。
因此，本发明的一个目的是提供方法和组合物，用于治疗和预防由微生物所致疾病。
本发明的另一目的是提供方法和组合物，用于治疗和预防传染病。
本发明的另一目的是提供方法和组合物，用于治疗和预防分枝杆菌疾病，包括但不限于结核。
本发明的另一目的是提供方法和组合物，用于使用包含取代的乙二胺类的组合物治疗和预防传染病。
本发明的另一目的是提供方法和组合物，用于使用包含取代的乙二胺类的组合物治疗和预防分枝杆菌疾病。
本发明的另一目的是提供方法和组合物，用于使用包含取代的乙二胺类的组合物治疗和预防结核。
本发明的另一目的是提供方法和组合物，用于使用包含取代的乙二胺类的组合物治疗和预防结核，其中该二胺具有50μM或以下的MIC。
本发明的另一目的是提供方法和组合物，用于使用包含取代的乙二胺类的组合物治疗和预防结核，其中该二胺具有25μM或以下的MIC。
本发明的另一目的是提供方法和组合物，用于使用包含取代的乙二胺类的组合物治疗和预防结核，其中该二胺具有12.5μM或以下的MIC。
本发明的另一目的是提供方法和组合物，用于使用包含取代的乙二胺类的组合物治疗和预防结核，其中该二胺具有5μM或以下的MIC。
本发明的另一目的是提供方法和组合物，用于使用包含取代的乙二胺的组合物治疗和预防结核，其中该二胺具有10％或更大的HTS Luc活性。
本发明的另一目的是提供方法和组合物，用于使用包含取代的乙二胺类的组合物治疗和预防结核，其中一个胺基团是从伯胺衍生的，另一个胺基团是从伯胺或仲胺衍生的。
本发明的另一目的是提供方法和组合物，用于使用包含取代的乙二胺类的组合物治疗和预防结核，其中一个胺是从顺式-(-)-桃金娘烷基胺、环辛胺、2，2-二苯基乙胺、3，3-二苯基丙胺、(+)-冰片基胺、1-金刚烷甲胺、(+)-异松蒎基胺或(-)-异松蒎基胺衍生的。
本发明的另一目的是提供治疗制剂用组合物，所述制剂用于治疗和预防分枝杆菌疾病。
本发明的另一目的是提供治疗制剂用组合物，所述制剂用于治疗和预防由下列分枝杆菌种所致分枝杆菌疾病，包含结核分枝杆菌复合物、细胞内鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonoe)、麻风分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌(M.microti)、牛分枝杆菌BCG或牛分枝杆菌。
本发明的另一个目的是提供用于治疗或预防传染病的组合物和方法，所述的传染病由偶发分枝杆菌、海分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和白色念珠菌(Candida albicans)导致。
本发明的另一个目的是提供在联合疗法中的一种或多种新化合物，以便提供对分枝杆菌疾病具有活性的协同作用。
本发明的另一个目的是提供组合物，它们包含新颖的取代的乙二胺化合物，进一步包含抗结核药，所述抗结核药包括但不限于利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇及其类似物。
本发明的另一个目的是提供用于传染病的联合疗法，包含取代的乙二胺类和抗结核药。
本发明的另一个目的是提供用于分枝杆菌疾病的联合疗法，包含取代的乙二胺类和抗结核药，所述抗结核药包括但不限于单独或组合的利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇及其类似物。
本发明的另一个目的是提供用于分枝杆菌疾病，诸如结核病的联合疗法，包含取代的乙二胺类和抗结核药，所述抗结核药包括但不限于单独或组合的利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇及其类似物。
本发明的另一个目的是提供用于分枝杆菌疾，诸如结核病的联合疗法，包含取代的乙二胺类，诸如SQ 109、SQ 73或SQ 609；和抗结核药，所述抗结核药包括但不限于单独或组合的利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇及其类似物。
本发明的另一个目的是提供用于分枝杆菌疾，诸如结核病的联合疗法，包含取代的乙二胺类，诸如SQ 109、SQ 73或SQ 609；和抗结核药，所述抗结核药包括但不限于利福平和利福平类似物，诸如利福喷汀、利福拉齐和利福布汀。
本发明的另一个目的是提供一种或多种新化合物与一种药物的联合用药，以便提供对分枝杆菌疾病具有活性的协同作用。
本发明的另一个目的是提供一种或多种新化合物与标准结核药物的联合用药，以便提供对分枝杆菌疾病具有活性的协同作用。
本发明的另一个目的是提供新颖的治疗方法，其中将一种或多种新化合物与至少一种已知的药物联用以便提供协同作用，通过该方法可以治疗或预防传染病。
在回顾下列实施方案的详细说明和待批权利要求之后，本发明的这些与其他目的、特征和优点将变得显而易见。



图1代表流程图，显示用于制备取代的乙二胺类的各种固相支持体合成法。
图2(a)-2(ac)提供各种伯胺类的化学结构。
图3(a)-3(f)提供各种无环仲胺类的化学结构。
图4(a)-4(i)提供各种环状仲胺类的化学结构。
图5代表十种取代的乙二胺类的代表性反应集合的流程图。
图6是发光数每秒(LCPS)-浓度图，显示所汇集的取代的乙二胺化合物的HTS Luc测定结果。
图7是LCPS-浓度图，显示个别取代的乙二胺化合物的HTS Luc测定结果。
图8是LCPS-浓度图，显示个别取代的乙二胺化合物的HTS Luc测定结果。
图9是柱状图，提供离散取代的乙二胺类的MIC活性总结。
图10是柱状图，提供离散取代的乙二胺的荧光素酶活性总结，关于3.1μM乙胺丁醇的活性为至少10％。
图11是柱状图，显示选定胺单体在对TB有活性的取代的乙二胺化合物中出现的频率。胺单体以数字编号表示。
图12代表流程图，显示N-香叶草基-N′-(2-金刚烷基)乙烷-1，2-二胺(化合物109)的合成。
图13代表流程图，显示作为盐酸盐的N-(环辛基)-N′-(1R，2R，3R，5S)-(-)-异松蒎基乙烷-1，2-二胺(化合物59)的合成。
图14是一种代表性样本的质谱图，所述样本充分含有所汇集的取代的乙二胺化合物。
图15是化合物109，即N-香叶草基-N1-(2-金刚烷基)乙烷-1，2-二胺的质谱图。
图16是化合物109，即N-香叶草基-N1-(2-金刚烷基)乙烷-1，2-二胺的质子NMR图。
图17是集落形成单位/肺(CFU/肺)研究数据的柱状图，显示不同化合物在数天时间内的CFU/肺生长。
图18是CFU/肺研究数据的柱状图，显示不同化合物在数天时间内的CFU/肺生长。
图19是CFU/肺研究数据的柱状图，显示不同化合物在数天时间内的CFU/肺生长。
图20是损害研究数据的柱状图，显示用不同化合物处理一段时间内可见的损害。
图21提供证明候选药物鉴别的图解。
图22提供用于体内功效测试的化合物。
图23显示化合物73和109的体内研究结果，剂量为1和10mg/kg(脾)。
图24显示化合物73和109的体内研究结果，剂量为1和10mg/kg(肺)。
图25显示化合物59和111的体内研究，剂量为1和10mg/kg(脾)。
图26显示化合物59和111的体内研究，剂量为1和10mg/kg(肺)。
图27显示化合物58、73、109和111在被结核分枝杆菌H 37Rv感染的C57BL.6小鼠中的功效试验结果(脾)。用5×106CFU结核分枝杆菌H37Rv i.v.感染小鼠；在感染后18天开始药物治疗。EC-EC-早期对照，即化疗开始当天小鼠肺中的CFU。小鼠接受1-未治疗的小鼠；2-INH(25mg/kg)；3-EMB(100mg/kg)；4-化合物109(25mg/kg)；4*-化合物109(10mg/kg)；4**-化合物109(0.1mg/kg)；5-化合物58(25mg/kg)；6-化合物73(25mg/kg)；7-化合物111(25mg/kg)。
图28显示化合物58、73、109和111在被结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL.6小鼠中的功效试验结果(肺)。用5×106CFU结核分枝杆菌H37Rvi.v.感染小鼠；在感染后18天开始药物治疗。EC-EC-早期对照，即化疗开始当天小鼠肺中的CFU。小鼠接受1-未治疗的小鼠；2-INH(25mg/kg)；3-EMB(100mg/kg)；4-化合物109(25mg/kg)；4*-化合物109(10mg/kg)；4**-化合物109(0.1mg/kg)；5-化合物58(25mg/kg)；6-化合物73(25mg/kg)；7-化合物111(25mg/kg)。
图29提供供试化合物的LC/MS数据。
图30提供显示供试化合物对小鼠盒式给药的PK研究结果图。口服递送。本研究中，将口服递送的化合物NSC 722039独为化合物37，NSC722040-化合物59，NSC 722041-化合物109。
图31提供供试化合物对小鼠盒式给药的PK研究结果图。腹膜递送。本研究中，将化合物NSC 722039读为化合物37，NSC 722040-化合物59，NSC 722041-化合物109。
图32提供供试化合物对小鼠盒式给药的PK研究结果图。静脉内递送。本研究中，将化合物NSC 722039读为化合物37，NSC 722040-化合物59，NSC 722041-化合物109。
图33提供化合物109在小鼠中的PK研究结果图。
图34109在小鼠中的组织分布(i.v.，3mg/kg)。
图35109在小鼠中的组织分布(p.o.，25mg/kg)。
图36化合物109在小鼠尿中的代谢。
图37在小鼠尿中发现没有109的葡萄糖醛酸化代谢产物。
图38化合物109的结合试验 图39参比化合物的结合试验 图40化合物109的数据总结。
图41方案1乙胺丁醇类似物的100,000种化合物文库在固相支持体上的合成。
图41方案2在固相支持体上合成SQBisAd的尝试。
图42提供经由氨基酸酰化作用制备的代表性目标二胺类的结构。
图43提供表25，总结所合成的二胺主平板数据，用于制备目标20,000种乙胺丁醇类似物文库。
图44提供方案5，显示使用氨基酸作为连接基团合成二胺文库。
图45提供胺单体在EMB类似物的原始100,000种化合物文库中的命中率图解。
图46提供伯胺结构多样性图解。
图47提供表26，列举用在二胺文库制备中的氨基酸。
图48提供在二胺文库合成中作为试剂使用的羰基化合物。
图49提供表27，显示用在二胺文库合成用主平板中的羰基化合物。
图50提供二胺文库的代表性MIC和Lux数据实例。
图51提供烷基化单体在具有抗TB活性的最终二胺产物中的出现率图解。
图52提供代表性96孔去褶合平板的布局。
图53提供化合物命中列表和改性连接基团二胺文库的结构。
图54提供显示利福平、化合物109(SQ109)或异烟肼(INH)体内活性结构的示意图。使用BACTEC系统进行本研究。RIF的MIC为0.2ug/ml，SQ109(化合物109)0.32ug/ml，且INH0.025ug/ml。
图55是显示使用快速模型在小鼠中的体内研究结果的示意图，其中将小鼠体重用作评估药物功效的标记。结果属于快速模型中进行的21天联合疗法研究。使C3H雌性小鼠i.v.感染106CFU结核分枝杆菌H37Rv(Pasteur)。在接种后7天开始化疗并且持续2周(5天/周)。将用单一药物治疗，未感染和感染的未治疗的安慰剂的小鼠用作对照组。Rif，2mg/kg；INH，1mg/kg；EMB，10mg/kg；Moxi，10mg/kg；PZA，50mg/kg。从第0天到第21天监测小鼠体重。
图56A和56B是显示快速模型中使用SQ109(10mg/kg)、利福平(2mg/kg)和SQ109(化合物109)(10mg/kg)-Rif(2mg/kg)联合用药和安慰剂(感染的未治疗的)治疗的H37Rv感染动物的体重(图56A)和死亡率数据(图56B)动力学特征的示意图。使C3H雌性小鼠i.v.感染106CFU结核分枝杆菌H37Rv(Pasteur)。在接种后7天开始化疗并且持续2周(5天/周)。从第0天到化疗结束时(第21天)监测小鼠体重。
图57是显示使用联合用药Rif-EMB治疗的小鼠体重的动力学特征的示意图。使用乙胺丁醇(10mg/kg)、利福平(2mg/kg)和乙胺丁醇(10mg/kg)-Rif(2mg/kg)联合用药和安慰剂治疗H37Rv感染的动物的体重的动力学特征。使C3H雌性小鼠i.v.感染106CFU结核分枝杆菌H37Rv(Pasteur)。在接种后7天开始化疗并且持续2周(5天/周)。从第0天到化疗结束时(第21天)监测小鼠体重。
图58提供显示化合物109与利福平联合用药在慢性结核感染小鼠模型中的体内功效研究的示意图。给C57BL/6雌性小鼠i.v.接种105CFU结核分枝杆菌H37Rv。在感染后3周开始化疗并且持续4周。在疗法结束时，处死小鼠；将在含有0.05％Tween-80的无菌2ml PBS中的肺匀化物以10-倍系列稀释液铺平板于7H10琼脂平皿上，并且在37℃下孵育。在生长3周后计算CFU。使用16组小鼠(6只小鼠/组)。以0，0.1，1和10mg/kg使用化合物109(SQ109)；以0，1，2和20mg/kg使用RIF。
图59表示使用慢性小鼠模型的化合物109与Rif和INH联合用药在多-药物加强期方案中的结果。给C57BL/6雌性小鼠i.v.接种105CFU结核分枝杆菌H37Rv。在感染后3周开始化疗并且持续5周，其中取2，3，4和5周的时间点。在每一时间点时，处死用于测试联合用药的一组小鼠(6只小鼠/组)；将在含有0.05％Tween-80的无菌2ml PBS中的肺匀化物以10-倍系列稀释液铺平板于7H10琼脂平皿上，并且在37℃下孵育。在生长3周后计算CFU。以25mg/kg使用INH，以20mg/kg使用RIF，以10mg/kg使用SQ109(化合物109)，以100mg/kg使用EMB。使用ANOVA检验进行统计学分析通过学生T-检验评估任何差异的显著性，并且将p＜0.05视为具有统计学显著性。3周*-p＝0.001，4周**p＝0.008，，且就5周而言***p＝0.005。
图60提供化合物109的控制特异性结合％的结合测定结果。
图61提供化合物109控制特异性结合抑制％的结合测定结果。
图62提供对SQ-109测试的革兰氏阳性生物体的MIC结果。
图63A和63B提供对SQ-109测试的革兰氏阴性生物体的MIC结果。
图64提供对SQ-109测试的厌氧菌的MIC结果。
图65提供对SQ-109测试的真菌的MIC结果。
图66提供对SQ-109测试的分枝杆菌的MIC结果。
图67提供表40，它显示使用SQ109与INH、STR、EMB或PZA的两-药物组合测试的协同作用商数；和表41，它显示使用SQ109与RIF组合测试的协同作用商数。
图68提供使用利福平(RIF)与SQ109或乙胺丁醇(EMB)联合用药处理的RIFR结核分枝杆菌分离物3185的生长分布图。每天使用BACTEC460系统监测RIFR结核分枝杆菌菌株3185在包含不同浓度的RIF与0.5MIC SQ109(a)或0.5MIC EMB(b)的BACTEC小瓶中的生长指数(GI)。在37℃下孵育小瓶。在本实验的前2天过后每天获得GI读数且直到1∶100接种物对照组小瓶在第8天时达到大于30的ΔGI值为止。RIF，SQ109和EMB在菌株3185中的MIC分别为24mg/L，0.32mg/L，和2.5mg/L。
图69提供使用RIF和SQ109处理的RIFR结核分枝杆菌分离物2482的生长分布图。本实验如图68的图例中所述使用BACTEC 460进行。获得GI读数且直到1∶100接种物对照组小瓶在第7天时达到大于30的ΔGI值为止。RIF和SQ109在菌株2482中的MIC分别为＞100mg/L和0.32mg/L。
图70提供下列研究结果的示意图，其中使C57BL/6小鼠感染结核分枝杆菌H37Rv并且使感染进行21天。在第21天时，用INH(25mg/kg)+RIF(20mg/kg)+PZA(150mg/kg)+EMB(100mg/kg)或INH(25mg/kg)+RIF(20mg/kg)+PZA(150mg/kg)+SQ109(10mg/kg)将小鼠处理8周。
图71提供显示SQ109-Rif联合用药的协同作用的示意图。这种协同作用以两种方式进行SQ109以协同作用方式增强RIF活性和RIF以协同作用方式增强SQ109活性。0.5MIC的SQ109与浓度低至0.1MIC的RIF共同起协同作用。在将0.2MIC SQ109与0.5MIC RIF联用时也观察到了协同作用。有意义的是，两种药物的联合用药低于它们的有效浓度(0.2MIC SQ109+0.25MIC RIF)，这种联合用药表现出加合的相互作用。体外数据显示SQ109-Rif联合用药比INH-Rif联合用药更为有效。
图72提供使用RIF和SQ109处理的RIFR结核分枝杆菌分离物2482的生长分布图。本实验使用BACTEC 460进行。RIF和SQ109在菌株2482中的MIC分别为＞100μg/ml和0.32μg/ml。
图73提供21天时快速模型联合疗法研究的结果。使C3H雌性小鼠i.v.感染在先感染过小鼠的106CFU结核分枝杆菌H37Rv(Pasteur)。接种后7天开始使用抗-TB药物化疗并且持续至第21天。
图74提供SQ109，SQ609和SQ73的结构。
图75提供涉及慢性TB的研究的结果。给C57BL/6雌性小鼠i.v.接种104CFU结核分枝杆菌H37Rv。在感染后4周开始化疗并且持续2周。对每一对照药物和联合用药测试一组小鼠(6只小鼠/组)。在治疗2周后，处死小鼠；将在含有0.05％Tween-80的无菌2ml PBS中的肺匀化物以10-倍系列稀释液铺平板于7H10琼脂平皿上，并且在37℃下孵育。在生长3周后计算CFU。以25mg/kg使用INH，以10和25mg/kg使用SQ109，以10mg/kg使用SQ109；联合用药(图上的“总计”)以10mg/kg使用SQ109；以10mg/kg使用SQ609，以5mg/kg使用SQ73。使用ANOVA检验进行统计学分析通过学生T-检验评估任何差异的显著性，并且将p＜0.05视为具有统计学显著性。
详细描述 参照下列本文包括的具体实施方案的详细说明，可以更容易理解本发明。不过，尽管已经参照其某些实施方案的具体细节描述了本发明，这类细节不应被视为发明范围的限制。本文提到的参考文献的完整文本全文结合在此作为参考，包括2005年6月3日提交的美国专利申请序号11/145,499，2002年5月17日提交的美国专利申请序号10/147,587和2002年5月17日提交的美国临时专利申请序号60/381,220。
分枝杆菌感染、例如导致结核的那些，曾经被认为发生率有所下降，现在已有反弹，并且再次构成严重的健康威胁。结核(TB)是归因于单一病因的最大数量人类死亡的原因，每年有二至三百万患有结核的人死亡。逐渐发现在人群聚集的地区或者不够标准的生活居所，人们易被分枝杆菌感染。无免疫应答个体面临被分枝杆菌感染和死于这类感染的高危险。另外，耐药性分枝杆菌菌株的出现已经引起这类被感染人的治疗问题。
很多被分枝杆菌感染的人要么贫困，要么生活在保健设施不足的地区。作为不同妨碍因素的结果(经济、教育水平等)，这些个体很多不能遵照处方治疗制度。最终，这些和其他个体的持续性非顺应性导致疾病的流行。这种非顺应性经常混杂着耐药性分枝杆菌菌株的出现。以不同分枝杆菌菌株为目标的有效组合物和疫苗是控制日益增加的结核病例数量所必需的。
化疗是结核的标准治疗。目前一些化疗治疗需要联合使用三种或四种药物，每日一次给药达两个月，或者每周两次给药达四至十二个月。表1列举若干标准结核药物制度的治疗方案。
表1 标准TB药物制度的治疗方案 数十年来，现有抗生素的滥用和长期复杂治疗制度的顺应性差已经引起结核分枝杆菌的突变，已经在世界范围内产生耐药性的流行，威胁结核的控制。目前大多数处方药物、包括一线药物，例如异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和链霉素，是于20世纪50年代至70年代开发的。因而，这种结核化疗的早期开发没有自行牵涉结核分枝杆菌基因组序列、最近十年药物发现的革命和全国性药物试验与组合化学的使用。
所以，耐药性结核分枝杆菌菌株和潜伏性结核感染的治疗需要新的抗结核药，它们提供高度有效的治疗，缩短和简化结核化疗。而且，需要这些药物是由低成本的合成法制备的，因为疾病人口决定了成本是一种突出的因素。
本发明提供方法和组合物，包含一类取代的乙二胺化合物，它们有效治疗和预防由包括但不限于细菌在内的微生物所致疾病。确切而言，本发明的方法和组合物有效抑制微生物结核分枝杆菌的生长。本发明的方法和组合物打算用于治疗人类以及其他动物的分枝杆菌感染。例如，本发明特别可用于治疗被牛分枝杆菌感染的牛。
本文所用的术语“结核”包含通常与由分枝杆菌种所致感染有关的疾病状态，所述分枝杆菌种包含结核分枝杆菌复合物。术语“结核”也与由除结核分枝杆菌以外的分枝杆菌(MOTT)所致分枝杆菌感染有关。其他分枝杆菌种包括细胞内鸟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、麻风分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、副结核鸟分枝杆菌、细胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、蟾分枝杆菌、海分枝杆菌或溃疡分枝杆菌。
本发明进一步包含有效治疗传染病的方法和组合物，所述传染病包括，但不限于由细菌、真菌、寄生物和病毒病原体所致那些。这类传染原的实例包括如下葡萄球菌(staphylococcus)、链球菌科(streptococcaceae)、neisseriaaceae、球菌(cocci)、肠杆菌科(enterobacteriaceae)、假单胞菌科(pseudomonadaceae)、弧菌科(vibrionaceae)、弯曲杆菌属(campylobacter)、巴斯德氏菌科(pasteurellaceae)、博德特氏菌属(bordetella)、博德特氏菌属(francisella)、布鲁氏杆菌属(brucella)、军团杆菌科(legionellaceae)、类杆菌科(bacteroidaceae)、革兰氏阴性菌(gram-negative bacilli)、梭菌属(clostridium)、棒杆菌属(corynebacterium)、丙酸菌属(propionibacterium)、革兰氏阳性菌(gram-positive bacilli)、炭疽、放线菌属(actinomyces)、诺卡氏菌属(nocardia)、分枝杆菌属(mycobacterium)、幽门螺杆菌、肺炎链球菌、白色念珠菌、密螺旋体属(treponema)、疏螺旋体属(borrelia)、钩端螺旋体属(leptospira)、枝原体属(mycoplasma)、脲原体属(ureaplasma)、立克次氏体属(rickettsia)、衣原体属(chlamydiae)、全身真菌病、机会真菌病、原生动物、线虫、吸虫、绦虫、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳多空病毒、肝炎病毒、正黏病毒、副黏病毒、冠形病毒，、小RNA病毒、呼肠病毒、披膜病毒、虫媒病毒、本扬病毒科(bunyaviridae)、弹状病毒、人免疫缺陷病毒和逆转录病毒。
本发明进一步提供可用于治疗传染病的方法和组合物，所述传染病包括，但不限于结核、麻风、克罗恩病、获得性免疫缺陷综合征、莱姆病、猫抓病、落基山斑疹热和流感。
本发明的抗感染方法和组合物含有一种或多种取代的乙二胺化合物。确切而言，这些化合物涵盖广泛的取代的乙二胺化合物，具有下列通式
取代的乙二胺 其中“R1NH”通常是从伯胺衍生的，且“R2R3N”通常是从伯胺或仲胺衍生的。本发明的乙二胺是借助模块法制备的，且使用伯胺和仲胺作为结构单元，使胺部分与亚乙基连接基结构单元偶联。代表性伯胺、无环仲胺和环状仲胺分别如图2、3和4中所示。
一般而言，本发明乙二胺化合物的化学部分R1、R2和R3独立地选自H；烷基；芳基；链烯基；炔基；芳烷基；芳烯基；芳炔基；环烷基；环烯基；杂烷基；杂芳基；卤化物；烷氧基；芳氧基；烷硫基；芳硫基；甲硅烷基；甲硅烷氧基；二硫化物基团；脲基；氨基等，包括其直链或支链衍生物、其环状衍生物、其取代的衍生物、其杂原子衍生物、其杂环衍生物、其官能化衍生物、其盐(这类盐包括，但不限于盐酸盐和乙酸盐)、其异构体或其组合。例如，含氮杂环部分包括但不限于吡啶基(从吡啶衍生并且通过环碳键合)、哌啶基(从哌啶衍生并且通过环氮原子或环碳键合)和吡咯烷基(从吡咯烷衍生并且通过环氮原子或环碳键合)。取代或官能化的R1、R2和R3衍生物的实例包括，但不限于含有取代基的部分，所述取代基例如酰基、甲酰基、羟基、酰卤、酰胺、氨基、叠氮基、酸、烷氧基、芳氧基、卤化物、羰基、醚、酯、硫醚、硫酯、腈、烷硫基、芳硫基、磺酸及其盐、硫醇、链烯基、炔基、硝基、亚胺、酰亚胺、烷基、芳基、其组合等。而且，在所述部分的烷基化衍生物的情况下，烷基取代基可以附着于所述化学部分，或者用于通过该烷基取代基与胺氮键合。
本发明的化学部分R1、R2和R3的实例包括，但不限于H；甲基；乙基；丙基；丁基；戊基；己基；庚基；辛基；乙烯基；丙烯基；丁烯基；乙炔基；丙炔基；丁炔基；环丙基；环丁基；环戊基；环己基；环辛基；环丁烯基；环戊烯基；环己烯基；苯基；甲苯基；二甲苯基；苄基；萘基；吡啶基；呋喃基；四氢-1-萘基；哌啶基；吲哚基；二氢吲哚基；吡咯烷基；2-(甲氧基甲基)吡咯烷基；哌嗪基；喹啉基(quinolinyl)；喹啉基(quinolyl)；烷基化1，3-二氧戊环；三嗪基；吗啉基；苯基；吡唑基；二氢茚基；二氢茚酮基；吡唑基；噻二唑基；绕丹宁基；硫内酯基；氧芴基；苯并噻唑基；高哌啶基；噻唑基；奎宁环基；异噁唑烷酮基；其任意异构体、衍生物或取代的类似物、或者任意取代或未取代的种类，例如醇、醚、硫醇、硫醚、叔胺、仲胺、伯胺、酯、硫酯、羧酸、二醇、二酯、丙烯酸、丙烯酸酯、甲硫氨酸乙酯、苄基-1-半胱氨酸乙酯、亚胺、醛、酮、酰胺或二烯。本发明的化学部分R1、R2和R3的进一步实例包括，但不限于下列种类或者下列种类的取代或烷基化衍生物，与胺氮共价键合呋喃、四氢呋喃、吲哚、哌嗪、吡咯烷、吡咯烷酮、吡啶、喹啉、蒽、四氢喹啉、萘、吡唑、咪唑、噻吩、吡咯烷、吗啉等。所述种类或者这些种类的取代或烷基化衍生物的一个特征是它们可以以任意方式与胺氮共价键合，包括通过悬挂的取代基或烷基、通过酌情的杂原子或者通过酌情的环原子，这都可以为本领域普通技术人员所理解。
本发明的化学部分R1、R2和R3还包括，但不限于环状烷烃和环状烯烃，包括桥连和非桥连的环。桥连环的实例包括，但不限于下列基团异松蒎基、冰片基、降冰片基、adamantanetetyl、顺式-(-)-桃金娘烷基、金刚烷基、降金刚烷基、6-氮杂二环[3.2.1]辛烷、外-降冰片烷等。
在本发明的一种实施方案中，NR2R3是从环状仲胺衍生的。本发明的环状化学部分NR2R3的实例包括，但不限于4-苄基哌啶；3-哌啶甲醇；哌啶；色胺；吗啉；4-哌啶子基哌啶；1-哌嗪甲酸乙酯；1-(2-氨乙基)哌嗪；十氢喹啉；1，2，3，4-四氢吡啶并吲哚(在二者胺之一处的反应)；3-氨基-5-苯基吡唑；3-氨基吡唑；1-(2-氟苯基)哌嗪；1-脯氨酸甲酯；组氨醇；1-胡椒基哌嗪；六亚甲基亚胺；4-羟基哌啶；2-哌啶甲醇；1，3，3-三甲基-6-氮杂二环[3.2.1]辛烷；3-吡咯烷醇；1-甲基哌嗪；(S)-(+)-(2-吡咯烷基甲基)吡咯烷；1-甲基高哌嗪；2-乙基哌啶；1，2，3，4-四氢异喹啉；1-(4-脯苯基)哌嗪；d，l-色氨酸甲酯；(15，45)-(-)-2，5-二氮杂二环[2.2.1]庚烷-2-羧酸叔丁酯；六氢异烟酰胺；七亚甲基亚胺；α-甲基色胺；6，7-二甲氧基-1，2，3，4-四氢异喹啉；3-氨基吡咯烷；3，5-二甲基哌啶；2，6-二甲基吗啉；1，4-二氧代-8-氮杂螺[4.5]癸烷；1-羟甲基-6，7-二羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉；1，3，4，5，6，7，8-六氢-2H-吡啶并(1，2-A)嘧啶；1，2，3，4-四氢喹啉；1-(2-甲氧基苯基)哌嗪；1-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)哌嗪；(S)-(+)-2-(氨甲基)吡咯烷；(3S(3a，4Ab)，8Ab)-N-叔丁基-十氢-3-异喹啉酰胺；(R)-环丝氨酸；高哌嗪；2，6-二甲基哌嗪(在二者胺之一处的反应)；亚氨基二苄基；5-甲氧基色氨酸；4，4′-联哌啶；1-(2-羟乙基)哌嗪；4-甲基哌啶；1-组氨酸甲酯；或2-哌啶甲酸甲酯。
R1HN取代基是从伯胺衍生的。R2R3N取代基通常是从伯胺或仲胺衍生的，但是也可以来自于氨基酸或氨基酸前体。氨基酸可以转化为氨基醇。当采用氨基酸作为R2R3N部分的来源时，前体化合物尤其可以选自下列化合物和它们的衍生物d，l-色氨酸甲酯；1-甲硫氨酸乙酯；1-赖氨酸甲酯(经由二者伯胺之一处的反应)；(S)-苄基-1-半胱氨酸乙酯；1-精氨酸甲酯(经由二者伯胺之一处的反应)；1-谷氨酸乙酯；1-组氨酸甲酯；或(3S(3a，4Ab)，8Ab)-N-叔丁基-十氢-3-异喹啉酰胺。
本发明取代的乙二胺化合物的R4部分通常选自H、烷基或芳基，但是R4还可以构成链烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基、环烯基等。R4化学部分的实例包括，但不限于H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、环丁基、环戊基、环己基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、苯基、甲苯基、二甲苯基、苄基、萘基、其直链或支链衍生物、其环状衍生物、其取代的、官能化与杂原子衍生物、其杂环衍生物等。通常，R4选自H、甲基、乙基、丁基或苯基。不过，当R4是“H”时，乙二胺不包含乙胺丁醇。
大多数本文所述乙二胺化合物优选地是利用固相支持体合成法制备的，如图1所示代表性反应方案之一所述。不过，当R4是H时，反应进行不充分，此时R1NH2采用空间位阻胺，或者采用二胺，例如氨基亚烷基吗啉或氨基亚烷基哌啶。当R4是甲基或苯基时，用于R3R2NH的空间位阻胺由于反应部位处的空间位阻而不会充分发挥作用。在这种情况下，竞争性水解反应生成对应的氨基醇，并且酰氨基亚乙基胺类的不完全还原干扰反应方案。其结果是所需二胺产物的生成收率低。
乙二胺的制备优选地分六步完成，使用rink-酸树脂。合成的第一步是通过在四氢呋喃(THF)中用三苯膦和六氯乙烷处理，将rink-酸树脂转化为rink-氯。这步之后，在二氯乙烷中，在Hunig氏碱(EtN(i-Pr)2)的存在下，加入伯胺。第三步是与树脂连接的胺的酰化，利用图1所示两种酰化途径之一。酰化步骤优选地是用下列试剂完成的α-氯乙酰氯、α-溴-α-甲基乙酰溴、α-溴-α-乙基乙酰溴、α-溴-α-丁基乙酰溴或α-氯-α-苯基乙酰氯，各自在吡啶的存在下，在THF中进行。还可以使用本领域技术人员已知的其他酰化试剂，不过，α-溴乙酰卤导致产物收率低，这可能归因于HBr的消去。酰化作用还可以经由肽偶联机理完成，使用α-溴-α-甲基乙酸或α-氯-α-甲基乙酸，在苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷子基磷六氟磷酸盐(PyBrop)和N1N二异丙基乙胺(EtN(i-Pr)2)，在二氯甲烷(DCM)和二甲基甲酰胺(DMF)中进行。仍然还可以使用本领域技术人员已知的其他酰化试剂。酰化步骤优选地进行两次，以达到更好的酰化产物收率。
第二种氮部分的引入优选地是这样实现的，在Hunig氏碱的存在下，在二甲基甲酰胺(DMF)中。中间体胺-酰胺的还原是使用Red-Al进行的(3.4M氢化双(2-甲氧基乙氧基)铝钠的甲苯溶液)。使用10％(体积比)三氟乙酸(TFA)的二氯甲烷(DCM)溶液将最终产物从树脂上裂解下来。蒸发溶剂，借助质谱分析最终二胺产物的TFA盐，并且筛选对结核分枝杆菌的有效性。利用上述固相支持体合成法制备的一些取代的乙二胺类也是利用下述溶液相合成法制备的。
取代的乙二胺文库的生成 图1所示固相支持体合成法优选地用于制备取代的乙二胺文库。固相合成法提供至少三种主要优点(i)减少对色谱工艺的需求，(ii)使用过量试剂驱使反应向高收率进行，和(iii)采用合成大量化合物的裂分和汇合技术。1，2-二胺文库的固相支持体合成法以前是借助短链肽的还原作用完成的(Cuervo等，Peptides 1994Proceedings of theEuropean Peptide Symposium；Maia HSL Ed.，EsomLeiden，1995，465-466)。不过，如本文所述，乙二胺文库是用胺而非简单氨基酸产生的，以便结构单元单体的多样性更大。每种支持体合成的前三步Rink-酸树脂的活化、第一种胺的加入和酰化步骤是在

210合成仪上的10ml试管中进行的，所述合成仪是由ARGONAUT

Inc.，Foster City，California制造的。合成仪在5ml或10ml反应容器中同时处理多达二十种反应，以便迅速合成目标化合物。合成仪提供可编程的温度控制和搅拌，和向反应容器自动递送溶剂。第二种胺的加入、用Red-Al还原和从固体载体上裂解是在96孔化学稳定性平板的2ml小孔中进行的。
在固相支持体合成之前，将如图2、3和4所示第1至288号每种胺溶于DMF，得到一摩尔溶液，在三只96孔平板中有机化(每孔一种胺)，得到这些胺的三种主平板。在支持体合成法的前三步中从每种伯胺和特定R4基团生成个别卤代乙酰基酰胺。然后将个别卤代乙酰基酰胺汇集成十种或三十种为一组。最后将所汇集的树脂在DCM/THF的2∶1混合物中的悬液分配在一只、两只或三只反应平板中，以保证每孔有15-20mg悬液。所用反应平板数是基于可用悬液量的。使每孔所汇集的树脂与来自主平板的对应胺反应。图5提供代表性汇集的流程图。每一反应发生在单独的小孔中，在Hunig氏碱的存在下，在DMF中，在70-75℃下，达16-20小时。将每种所得胺-酰胺用65+w％Red-Al在室温下还原。还原之后，用10％vol.TFA的DCM溶液裂解。蒸发每一反应小孔中的溶剂，并且分析二胺的TFA盐(质谱)，且对结核分枝杆菌进行筛选。对耻垢分枝杆菌(M.smegamatis)筛选一只平板所汇集的二胺。在每只平板中随机选择两行；也就是每只96孔平板选择24份样本，或者选择文库的25％，进行质谱检查。下列实施例提供具体方案和详细方法。
对结核分枝杆菌的筛选 将如上所述制备的所合成的取代的乙二胺类的完整文库(化合物的目标数量为约100,000)在乙胺丁醇(EMB)敏感性Luc测定法中对结核分枝杆菌进行体外筛选。还测定了MI C(最小抑制浓度)。MIC是生长抑制剂、这里是取代的乙二胺的最小浓度，在该浓度下所检查的微生物不存在增殖。筛选是利用高通量筛选(HTS)Luc测定法进行的，重组分枝杆菌含有荧光素酶与EB-诱导性基因的融合启动子(Luc测定法)。下文详细描述Luc测定和MIC测定。这些测定法是本领域技术人员众所周知的。基于这种初步筛选，300+种化合物混合物显示抗TB活性。图6代表荧光素酶报告菌株中的典型测定数据，所述菌株含有Rv0341 EMB-诱导型启动子。图6代表在一只96孔平板一行(D行)中所汇集的化合物混合物的最大发光数每秒百分比(％Max.LCPS)。
反应性小孔的去褶合 结核分枝杆菌筛选揭示了大约300种活性化合物混合物，选择它们进行去褶合。确切而言，选择在HTS Luc测定法中活性大约＜12.5μM的小孔和/或MIC大约＜12.5μM的小孔，总计336个小孔。
在每种活性化合物汇集物中借助每种取代的乙二胺化合物的离散再合成，进行去褶合。在每一活性小孔中所汇集的化合物是单独合成和筛选的。每种活性汇集物中目标二胺化合物的合成是在96孔平板中进行的，使用存档的α-卤代乙酰基酰胺(与树脂连接的卤代乙酰基酰胺)，按照前述反应步骤进行(第二种胺的加入、用Red-Al还原和从固体载体上裂解)。在4℃下贮存存档树脂作为个别化合物。使用96孔平板进行其余合成步骤，如前所述。
对每种去褶合后的化合物进行同一筛选试验、MIC和HTS Luc测定。去褶合化合物的代表性发光数据如图7和8所示。图7和8代表个别化合物的发光数每秒(LCPS)。
筛选结果总结 总之，去褶合筛选结果揭示了约2,000乙二胺化合物具有抗结核分枝杆菌的抑制活性。这些化合物中有150种以上表现等于或低于大约12.5μM的MIC。图9总结了MIC为50μM或以下的全部所合成的离散化合物的MIC数据。图10总结了在每种浓度下表现至少10％活性的全部化合物的Luc测定数据(结果不是累积的)。所得MIC和Luc活性是未纯化样本的，化学收率为大约20％，假定每一反应步骤的收率为80％。在Luc测定法中，32种化合物在1.56μM下表现活性，在MIC测定法中，至少11种化合物具有3.13μM的MIC。
对取代的乙二胺活性贡献最大的前十三种胺如图11所示，每种胺是由它的数字编号所代表的。这些胺包括如下 #112，3-二甲基环己胺 #183，3-二苯基丙胺 #441-金刚烷甲胺 #472，2-二苯基乙胺 #63(S)-2-氨基-1-丁醇 #74.1 (-)-顺式-桃金娘烷基胺 #77.1环辛胺 #78.12-金刚烷胺 #105a(1R，2R，3R，5S)-(-)-异松蒎基胺 #231 2-甲氧基苯乙胺 #255 (S)-环己基乙胺 #266 十一烷基胺 #272 香叶草基胺 其他有助于取代的乙二胺类活性的胺类如表2所示。表2中的化合物根据它们的MIC结果归类。其中一些化合物是在

合成仪上以较大量合成的(2-60mg)，并且经过半制备型C18-柱HPLC纯化，如表3所示。一般而言，表3中每种化合物的最终纯度为至少90％。
在一种实施方案中，本发明包括包含化合物109和化合物73的组合物。
在另一种实施方案中，本发明包括包含化合物109和化合物73和标准结核药物的组合物。
在另一种实施方案中，本发明包括治疗因传染原导致的疾病的方法，包括给予有效量的化合物109。
本发明的另一种实施方案包括治疗因传染原导致的疾病的方法，包括给予有效量的化合物109和化合物73。
在另一种实施方案中，本发明包括治疗因传染原导致的疾病的方法，包括给予有效量的化合物109和化合物73和标准结核药物。
在另一种实施方案中，本发明包括治疗因传染原导致的疾病的方法，包括给予有效量的化合物109和化合物73和药用载体。
表2




















表3 供进一步体外评价的大量合成的化合物











本发明还涉及新的可用于对抗传染病的二胺化合物文库。为了进一步增强在先二胺化合物的结构多样性，已经开发了这样一种合成流程，向两种胺组分之间的桥连基团结合氨基酸。氨基酸的使用可以实现不同的连接要素以及偏光性，参见图42的代表性实例。按照96孔格式、在mmol规模上制备二胺化合物，每孔汇集10种化合物(就大多数平板而言)。表25(图43)总结了合成平板的数据。
反应方案如图44所示。
采用Rink树脂的固相合成 准备二十一只96孔平板。利用六步合成途径，从与用于产生前100,000种化合物文库相似的Rink树脂开始(方案1，图41)，制备目标二胺(方案5，图44)。总之，这些方案的所有步骤都是相似的，其中一步除外(步骤4)，此时发生第二种氨基官能度的生成。在方案1中，经由连接基C1官能的亲核置换向分子中引入第二种胺作为全部合成子，而在方案5中，这是通过现有氨基部分被羰基化合物的修饰。
按照Garigipati方案进行第一种胺与载体的连接。借助在THF中用三苯膦和二氯乙烷处理，将Rink-酸树脂(Novabiochem)转化为Rink-氯。然后在二氯乙烷中，在Hunig氏碱的存在下加入胺N1，加载这种活化的树脂。胺N1包括但不限于烷基和芳基伯胺。从以前在100,000文库制备中用作N1的177种伯胺中，基于乙二胺衍生物(来自以前的～100K文库)的体外活性数据以及结构多样性(图45和46)，在这种方案中仅选择30种。
下一步，在HATU(O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐)和EtN(i-Pr)2的存在下，在DCM/DMF中，在室温下，经由与FMOC-保护的氨基酸的肽偶联作用完成酰化反应。该反应进行两次，以提高产物收率。用于产生这种文库的氨基酸列表如表26(图47)所示。
借助在室温下与哌啶的反应，进行去保护(FMOC基团的除去)。在NaBCNH3的存在下，在室温下，时间72-96小时，借助与各种羰基化合物的还原性烷基化作用，实现氨基的衍生，所述羰基化合物例如醛、酮和羧酸。羰基化合物的选择是这样进行的，以便最终的二胺产物将携带与从以前乙胺丁醇类似物文库产生的化合物相同或相似类型的取代基，以及结构多样性(图48)。所用羰基化合物的完整列表如表27(图49)所示。
在室温下，使用可溶性还原剂65+w％Red-Al进行氨基亚乙基酰胺向对应二胺的还原。利用10％三氟乙酸的二氯甲烷溶液，实现产物从树脂上的裂解，导致二胺TFA盐的生成。
就文库的生成而言，在每管0.1-0.15g树脂的规模上，利用Quest210合成仪进行合成方案的前三步(树脂活化、胺加载和酰化)。在酰化之后，将所生成的树脂彻底洗涤，干燥，然后每十份树脂汇集在一起。在汇集之前将少量每份树脂(～0.05g)存档，以促进再合成和活性成分的去褶合。
FMOC基团的去保护、羰基组分的加入、还原和裂解是在96孔反应组件中进行的，采用Whatman Polyfiltronics的Combiclamps系统或者Robbins Scientific的FlexChem系统。将所汇集的树脂在DCM/THF的2∶1混合物中的悬液均匀分布在一只反应平板中，每孔大约10mg树脂。将96种不同的羰基化合物排列在一只96孔平板模板中，每孔一种羰基化合物加入到十份树脂的每一单独汇集物中，预期每只平板生成960种二胺。按照相同的格式进行还原，裂解，过滤到贮存平板中，然后蒸发TFA，再进行生物测定。
每只平板随机选择两行(16份样本)，占总数的17％，借助电子喷射电离质谱法进行所制备化合物的质量评估。化合物的成功生成基于计算质量的分子离子的出现。根据用于合成的氨基酸，观测预测离子的百分比，因此生成所预测的化合物，从5-60％不等(表25，图43)。基于MS分析，在目标20,000种化合物中，实际生成4,500种二胺。
如上所述，本领域中需要有效性抗传染病的新化合物和方法。更具体地说，对有效治疗分枝杆菌疾病的新化合物和方法存在需求。本发明通过提供有效治疗传染病(包括，但不限于结核)的新颖的组合物和方法满足了现有技术长期渴望的需求。
在一个实施方案中，本发明包括用于治疗传染病的来自表3(化合物1-165)的至少两种化合物。
在另一个实施方案中，本发明包括一种或多种用于治疗传染病的表3(化合物1-165)的一种或多种新化合物与药物的联合用药。
在另一个实施方案中，将包含化合物1-165中的至少一种的组合物与一种或多种治疗结核分枝杆菌的药物联用。
在另一个实施方案中，将包含选自化合物1-165的一种或多种新化合物的组合物与一种或多种药物联用，以便提供作为治疗分枝杆菌疾病的方法中有活性的协同作用。
在一个实施方案中，本发明包括包含表3的一种或多种化合物与至少一种已知的标准结核药物的组合物。
在另一个实施方案中，治疗传染病的方法包括表3中的一种或多种化合物与至少一种已知标准结核药物。尽管不希望受到如下理论的约束，但是认为标准结核药物与包括化合物1-165的至少一种或多种化合物的联合用药产生了导致治疗或预防传染病(包括，但不限于结核)的协同作用。
链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺单独和联用对结核分枝杆菌的杀菌活性由Dickinson等讨论(Am Rev Respir Dis116(4)627-35)使结核分枝杆菌在Tween-清蛋白培养基中的对数期培养物接触浓度范围为可能存在于在治疗患者过程中的血清中的链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺。将这些药物的杀菌活性测定为在4和7天时的存活计数下降。单一药物的活性是链霉素最高且接下来最高的是利福平和异烟肼，而乙胺丁醇仅在4天后开始杀菌。当接触2种药物时，使用链霉素/异烟肼和异烟肼/乙胺丁醇发现了杀菌协同作用；使用链霉素/利福平发现了相加作用；使用异烟肼利福平(isoniazid rifampin)和链霉素/乙胺丁醇发现无差别；并且使用利福平/乙胺丁醇和异烟肼/吡嗪酰胺发现了拮抗作用。当使培养物接触3种药物，异烟肼/利福平和乙胺丁醇时，发现了异烟肼与利福平之间显著的拮抗作用，而添加异烟肼或增加其浓度提高了杀菌活性。如本文所述的包括新乙二胺组合物的联合疗法在本发明之前尚未得到确认。
本发明涵盖联合疗法，它包括如上文所述的新乙二胺组合物与一种或多种抗结核药物，包括，但不限于利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇。本文还包括这类抗结核药的类似物和化学等效物和取代物。例如，本发明涵盖利福平及其类似物，包括，但不限于利福喷汀、利福拉齐和利福布汀的应用。
在另一个实施方案中，本发明包括有效抗偶发分枝杆菌、海分枝杆菌、幽门螺杆菌、肺炎链球菌和白色念珠菌的组合物，它包含至少一种选自化合物1-165的化合物。
在另一个实施方案中，本发明包括有效抗偶发分枝杆菌、海分枝杆菌、幽门螺杆菌、肺炎链球菌和白色念珠菌的组合物，它包含至少一种选自化合物1-165的化合物，可选地合并一种或多种抗结核药，其中所述的抗结核药包括但不限于利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇及其类似物。
制剂 可以利用已知的技术，例如使用药学上可接受的载体，将治疗剂，包括含有本发明取代的乙二胺化合物的组合物制成生理学上可接受的制剂。例如，将取代的乙二胺化合物与药学上可接受的赋形剂合并，制成治疗组合物。
本发明组合物可以以固体、液体或气雾剂的形式给药。固体组合物的实例包括丸剂、霜剂、皂剂和可植入的剂量单元。丸剂可以被口服给药。治疗性霜剂和抗分枝杆菌皂可以被局部给药。可植入的剂量单元可以被局限性给药，例如在肺中，或者可以被植入进行治疗组合物的全身释放，例如皮下方式。液体组合物的实例包括适合于肌内、皮下、静脉内、动脉内注射的制剂和用于局部与眼内给药的制剂。气雾剂的实例包括吸入制剂，用于对肺给药。
本文所用缓释基质的制成材料通常为聚合物，它们可被酶作用或酸/碱水解作用或者溶解作用所降解。一旦插入体内，基质受到酶和体液的作用。缓释基质可取地是从生物相容性材料中选择的，包括但不限于脂质体、聚交酯、聚乙醇酸交酯(乙醇酸的聚合物)、聚交酯-共-乙交酯(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酐、聚(原)酯、多肽、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。优选的生物可降解性基质是聚交酯、聚乙醇酸交酯或聚交酯-共-乙交酯中的一种。
组合物的剂量将依赖于所治疗的病症、所使用的特定组合物和其他临床因素，例如患者的体重与条件和给药的途径。适合的剂量可以是100至0.1mg/kg。更优选的剂量可以是50至0.2mg/kg。更优选的剂量可以是25至0.5mg/kg。片剂或其他介质形式可以含有1至1000mg取代的乙二胺。可以采用与乙胺丁醇或其他抗结核药相似的剂量范围和给药计划。
可以将组合物与其他用于治疗其他与分枝杆菌疾病联合发生的障碍的组合物和工艺联合给药。例如，结核经常作为与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)有关的继发性并发症而发生。接受包括手术、放射或化疗在内的AIDS治疗的患者可以受益于本文所述方法和组合物。
下列具体实施例将阐述发明，应用于取代的乙二胺化合物的确切合成和结核分枝杆菌集落生长的体外与体内抑制。另外，R.Lee et al.J.Comb.Chem 2003，5，172-187的教导全文结合在此作为参考。显然，包括化学工艺上的微小变化在内的其他实施例对本领域技术人员而言将是显而易见的，本发明并不限于这些具体阐述的实施例。
实施例I 生成乙二胺文库 Rink-酸树脂是从

Inc.，San Diego，California得到的。溶剂乙腈、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯乙烯、甲醇和四氢呋喃是从

Milwaukee，Wisconsin购买的，买来即用。所有其他试剂都是从SIGMA-

West Monroe Highland，Illinois购买的。固相合成是在

210合成仪上进行的，来自ARGONAUT

Foster City，California，借助组合化学设备，来自


(Kent，England；Rockland，Massachusetts)和ROBBINS

Sunnyvale，California。溶剂的蒸发是用

AES进行的，来自

Holbrook，NewYork。所有必要的色谱分离都是在WATERS′ALLIANCE HT

Milford，Massachusetts上进行的。分析型薄层色谱是在

硅胶60F254平板上进行的，购自SIGMA-

West Monroe Highland，Illinois。
Rink-酸树脂的活化、第一种胺的加入和酰化步骤是在10ml试管中进行的，使用

210合成仪。第二种胺的加入、用Red-Al还原和从固体载体上裂解是在96深孔(2ml)化学稳定性平板中进行的。
A.Rink-酸树脂的活化 Rink-酸树脂的连接基团覆盖率为每克树脂0.43-0.63mmol。将四至五克这种树脂悬浮在80ml二氯甲烷与四氢呋喃(THF)的2∶1混合物中，分布在十只10ml试管中，每管8ml树脂悬液。将每份悬液过滤，用THF洗涤两次。制备三苯膦(3.80g，14.5mmol)的30ml THF溶液，将3ml这种溶液加入到每只试管中，然后加入3ml六氯乙烷的THF溶液(3.39g/14.3mmol六氯乙烷/30ml THF)。在室温下搅拌六小时后，将每份活化的树脂用THF洗涤两次，用二氯甲烷洗涤两次。
B.第一种胺的加入 向含有活化Rink树脂的每只试管加入3ml二氯乙烷、0.3ml(1.74mmol)N1N-二异丙基乙胺(EtN(iPr)2)和相应的胺(1mmol左右)。如果选定胺在室温下是固体，那么加入它在DMF中的溶液或悬液。向每只试管加入足量二氯乙烷至最终体积8ml。将反应混合物在45℃下加热6-8小时。将树脂过滤，用二氯甲烷与甲醇的2∶1混合物洗涤(1×8ml)，然后用甲醇洗涤(2×8ml)，然后在氩下干燥10分钟。
C.卤代酰氯的酰化 a.用氯乙酰氯酰化.将每份树脂用THF预洗涤(2×8ml)，然后加入THF(8ml)、吡啶(0.3ml，3.67mmol)和氯乙酰氯(0.25ml，2.5mmol)。将反应混合物在45℃下搅拌8小时，然后在室温下搅拌6-8小时。将每份树脂过滤，用二氯甲烷/甲醇的2∶1混合物(1×8ml)、甲醇(2×8ml)和THF(2×8ml)洗涤。利用相同的试剂负载重复酰化，但是反应时间较短，在45℃下4小时和在室温下2小时。然后将每份树脂过滤用二氯甲烷与甲醇的2∶1混合物(1×8ml)、再用甲醇(3×8ml)洗涤。将每份树脂在氩下干燥10分钟。然后将每份树脂转移至小瓶中，在真空干燥器中干燥1小时。
b.用α-苯基-α-氯乙酰氯酰化.利用与用氯乙酰氯酰化所述相同的工艺。使用2.5mmol过量的α-苯基-α-氯乙酰氯，相对于Rink-酸树脂中连接基团的mmol量而言。
c.用α-卤代-α-甲基、α-卤代-α-乙基和α-卤代-α-丁基乙酰溴酰化.使用α-溴丙酰溴(R4＝Me)、α-溴丁酰溴(R4＝Et)与α-溴己酰溴(R4＝Bu)的1∶1∶1混合物(体积比)，得到摩尔比为0.52∶0.56∶0.42(mmol)。如果树脂的原始覆盖率为0.63mmol/g(0.5g树脂每管)，摩尔过量分别为1.65、1.75和1.31，如果树脂的原始覆盖率为0.43mmol/g(0.5g树脂每管)，摩尔过量分别为2.4、2.6和1.9。
d.用α-氯-α-甲基乙酸酰化.将每份树脂用二氯甲烷预洗涤。向每只试管加入3ml PyBrop(0.29g，0.62mmol)的二氯甲烷溶液、α-氯-α-甲基乙酸(0.095g，0.62mmol)的3ml DMF溶液和EtN(iPr)2(0.2ml，1.2mmol)。使每种反应混合物在室温下反应16-18小时。然后将每份树脂过滤，用二氯甲烷(2×8ml)和甲醇(2×8ml)洗涤，重复酰化。然后将每份树脂过滤，用二氯甲烷(2×8ml)、甲醇(3×8ml)洗涤，在氩下干燥约10分钟。将每份树脂转移至小瓶中，在真空干燥器中干燥1小时。
D.第二种胺的加入 将十份或三十份从前三步制备的α-卤代乙酰基酰胺树脂汇集在一起，每种树脂留出0.05-0.10克供必要的去褶合。将所汇集的树脂混合物在100ml二氯甲烷与THF的2∶1混合物中的悬液分布在一只、两只或三只96孔反应平板中。就一只反应平板而言，使用1.7至2.0克树脂。就两只反应平板而言，使用3.0至3.3克树脂，就三只反应平板而言，使用4.7至5.0克树脂。然后将所分布的悬液用一种过滤歧管过滤，这是一种小型轻量级歧管，一般用于从96孔反应平板空间中抽取溶剂和试剂。将反应平板转移至

(Huntington，WestVirginia)，加入10％EtN(iPr)2的DMF溶液，每孔0.2ml(每孔0.21mmolEtN(iPr)2)，然后加入来自相应主平板的1.0M适当胺的溶液，每孔0.1ml(每孔0.1mmol胺)。利用

在合成期间容纳96孔反应平板，以便向平板加入试剂，并且适当地密封，使试剂和溶剂在高温下维持数小时。这些夹子由顶盖和底盖组成，带有可变形的、化学稳定性密封垫。它们被设计成在顶盖与底盖之间容纳96孔反应平板。将反应平板密封，在70-75℃烘箱中保持16小时。冷却至室温后，将树脂过滤，用DCM/甲醇的1∶1混合物(1×1ml)、甲醇(2×1ml)洗涤，然后在真空干燥器中干燥2小时。
E.用Red-Al还原 将反应平板置于

中。加入Red-Al(65+w％甲苯溶液)与THF的1∶6混合物，每孔0.6ml(每孔0.28mmol Red-Al)，反应4小时。然后将每份树脂过滤，用THF(2×1ml)和甲醇(3×1ml)洗涤。甲醇的加入应当加以小心。然后将每份树脂在真空下干燥。
F.最终乙二胺化合物的裂解 该步骤是利用裂解歧管进行的，这是一种涂有特氟隆的铝制过滤/收集真空歧管，被设计成将裂解产物从反应平板中回收到收集平板中。歧管的设计确保了来自每孔的滤液流向接收性96孔收集平板的对应小孔。向反应平板(置于该歧管中收集平板顶部)加入TFA、二氯甲烷与甲醇的10∶85∶5混合物(每孔0.5ml混合物)。十五分钟后，将溶液过滤，收集到收集平板上的适当小孔中。重复该工艺。在SPEED

Holbrook，New York上蒸发溶剂，残留样本(TFA盐)无需进一步纯化即可试验。
实施例II 去褶合实施例 借助离散化合物从存档α-卤代乙酰基酰胺树脂的再合成(10份树脂，每份0.05-0.10g)，进行活性小孔的去褶合，所述树脂在汇集之前的酰化步骤结束时被留出备用。为每份树脂指定96孔过滤平板中的离散栏(1或2或3，参见模板)，分为X行(A，B，C等)，其中X是在原始筛选平板中所发现的命中数。向一行中的每一小孔加入选定N2(R3R2NH)胺(0.1mmol)、DMF(180ml)和EtNiPr2(20ml)第一种选定胺加入到“A”行树脂中，第二种胺加入到“B”行树脂中，第三种胺加入到“C”行树脂中，等等。代表性96孔过滤平板的布局如表4所示。
借助离散化合物从存档α-卤代乙酰基酰胺树脂的再合成(10份树脂，每份0.05-0.10g)，进行活性小孔的去褶合，所述树脂在汇集之前的酰化步骤结束时被留出备用。为每份树脂指定96孔过滤平板中的离散栏(1或2或3，参见模板)，分为X行(A，B，C等)，其中X是在原始筛选平板中所发现的命中数。向一行中的每一小孔加入选定N2(R3R2NH)胺(0.1mmol)、DMF(180ml)和EtNiPr2(20ml)第一种选定胺加入到“A”行树脂中，第二种胺加入到“B”行树脂中，第三种胺加入到“C”行树脂中，等等。代表性96孔过滤平板的布局如表4所示。
将反应平板密封，在70-75℃烘箱中保持16小时。冷却至室温后，将树脂过滤，用DCM与甲醇的1∶1混合物(1×1ml)、甲醇(2×1ml)洗涤，在真空干燥器中干燥2小时。按照原始合成方案步骤5和6进行还原和裂解。用ESI-MS(电子喷射电离质谱)分析裂解产物小孔，以保证活性成分的同一性，在相同的Luc和MIC测定法中试验。
表4 代表性96孔过滤平板的布局 实施例III 利用

210合成仪固相合成选定取代的乙二胺化合物 利用上述实施例I所述固相方案成规模地合成选定取代的乙二胺化合物。这里，从Rink-酸树脂的活化到最终产物的裂解的所有反应步骤都是仅用

仪器进行的，它允许二十种平行反应的同时合成。所有粗样本的纯化都是用HPLC进行的，得到所需产物的纯度大于90％。表3列举取代的乙二胺的规模。这里，描述一种活性化合物N-香叶草基-N′-(2-金刚烷基)乙烷-1，2-二胺的合成作为实例。
N-香叶草基-N′-(2-金刚烷基)乙烷-1，2-二胺(化合物109)的制备如图12所述。

化合物109 1.Rink-酸树脂的活化。Rink-C1树脂的合成。将覆盖率(连接基)为0.43至0.63mmol/g的Rink-酸树脂(0.8g，0.5mmol)置于

210合成仪的一只10ml试管，用THF洗涤两次。加入三苯膦(0.380g，1.45mmol)的THF(3ml)溶液，继之以加入六氯乙烷(0.4g，1.43mmol)的THF(3ml)溶液。加入THF至试管容量(大约2ml)。6小时后，将树脂过滤，用THF(2×8ml)和二氯甲烷(2×8ml)洗涤。
2.第一种胺的加入。与树脂连接的香叶草基胺的合成。向含有活化树脂的试管加入3ml二氯乙烷、EtN(iPr)2(0.3ml，1.74mmol)和香叶草基胺(0.230g，1.5mmol)。加入二氯乙烷至体积8ml。反应在45℃下进行8小时，在室温下进行6-8小时。将加载有香叶草基胺的树脂过滤，用二氯甲烷与甲醇的2∶1混合物洗涤(1×8ml)，然后用甲醇洗涤(2×8ml)，在氩下吸干10分钟。
3.用氯乙酰氯酰化。与树脂连接的N-香叶草基-α-氯乙酰胺的合成。将树脂用THF预洗涤(2×8ml)。向试管加入8ml THF、吡啶(0.3ml，3.67mmol)和氯乙酰氯(0.2ml，2.5mmol)，在45℃下搅拌8小时，在室温(RT)下搅拌6-8小时。反应完全后，将树脂过滤，用二氯甲烷与甲醇的2∶1混合物(1×8ml)、甲醇(2×8ml)洗涤，利用相同的试剂加载重复酰化，但是反应时间较短45℃下4小时和室温下2小时。最后，将加载有α-氯乙酰胺的树脂过滤，用二氯甲烷与甲醇的2∶1混合物(1×8ml)、甲醇(3×8ml)洗涤，在氩下吸干15分钟。
4.第二种胺的加入。与树脂连接的N-香叶草基-N′-(2-金刚烷基)乙酰胺的合成。向含有树脂的试管加入DMF(3ml)和EtN(iPr)2(0.6ml，4.4mmol)，继之以加入2-金刚烷胺盐酸盐(2.0g，1.1mmol)的DMF(4ml)悬液，在70-75℃下搅拌16小时。冷却至室温后，将树脂过滤，用DCM与甲醇的1∶1混合物(1×8ml)、甲醇(2×8ml)洗涤，在氩下吸干15分钟。
5.用Red-Al还原。与树脂连接的N-香叶草基-N′-(2-金刚烷基)乙烷-1，2-二胺的合成。在试管中，将所得树脂悬浮在无水THF(3ml)中，搅拌15分钟。加入商业上可得到的Red-Al(65+w％甲苯溶液)(2.0ml，6.4mmol)，继之以加入2-3ml无水THF(充满试管容量)。使混合物反应4小时。反应后，将树脂过滤，用THF(1×8ml)、THF与甲醇的1∶1混合物(1×8ml)(MeOH的加入应当加以小心)、甲醇(3×8ml)洗涤，然后干燥。
6.从树脂上裂解和纯化。N-香叶草基-N′-(2-金刚烷基)乙烷-1，2-二胺乙酸盐的合成。就这最后一步合成而言，向含有树脂的试管加入TFA与二氯甲烷的10∶90混合物，将所形成的浅红色悬液搅拌30分钟。加入MeOH(0.5ml)后，将无色悬液过滤，将滤液收集在适当的试管中。重复该工艺，在

上蒸发溶剂。将一半量粗的N-香叶草基-N′-(2-金刚烷基)乙烷-1，2-二胺(三氟乙酸盐的形式)用HPLC纯化，采用下列条件柱C18，流速4ml/min，运行30min，梯度开始于5％AcOH/MeOH(100％)、终止于乙腈(100％)。得到27mg N-香叶草基-N′-(2-金刚烷基)乙烷-1，2-二胺二乙酸盐，收率24％，NMR纯度98％。
实施例IV 活性化合物的代表性溶液相合成 作为盐酸盐的N-(环辛基)-N′-(1R，2R，3R，5S)-(-)-异松蒎基乙烷-1，2-二胺(化合物59)的制备如图13所述。

化合物59 溴代环辛基乙酰胺。在0℃下，向环辛胺(3.3g，0.026mol)与吡啶(2.42g，0.031mmol)在无水THF(80ml)中的混合物经由注射器滴加溴乙酰溴(5.78g，0.029mol)。借助冰浴维持反应温度。使反应混合物逐渐温热至室温，在室温下搅拌1小时。过滤除去沉淀，用乙醚洗涤(1×30ml)，将滤液在旋转蒸发器上浓缩至干。溴代环辛基乙酰胺直接进行第二步无需另外的纯化。
N-(环辛基)-N′-(1R，2R，3R，5S)-(-)-异松蒎基-1-羰基乙烷-1，2-二胺。向溴代环辛基乙酰胺的DMF(60ml)溶液加入Hunig氏碱(4.64g，0.036mol)和(1R，2R，3R，5S)-(-)-异松蒎基胺(4.5g，0.029mol)，将反应混合物在80℃下搅拌16小时。冷却至室温后，将反应混合物用150ml乙醚稀释，用1M NaOH溶液洗涤(2×50ml)。将有机层用盐水洗涤(1×50ml)，经MgSO4干燥，在旋转蒸发器上浓缩至干。残余物(11.04g)为褐色的油，经过

(Isco，Lincoln，Nebraska，USA)纯化，采用商业上可从

(Biotage，Inc.ofDyax Corp，Va，USA)得到的硅胶药筒和下列移动相梯度运行30min，开始于DCM 100％、终止于DCM∶MeOH∶NH4OH混合物(600∶400∶10)。得到终产物(7.29g)，为褐色的油；收率76％，纯度90％。
N-(环辛基)-N′-(1R，2R，3R，5S)-(-)-异松蒎基乙烷-1，2-二胺。向来自前一步的酰胺的无水THF(160ml)溶液经由注射器滴加商业上可得到的(SIGMA-

)Red-Al，为65wt％THF溶液(28ml，0.09mol)。将反应混合物在回流下搅拌20小时。冷却至室温后，将反应混合物倒入1.5M NaOH(200ml)中，用乙醚萃取(2×100ml)。将有机层用盐水洗涤(1×100ml)，经MgSO4干燥，在旋转蒸发器上蒸发至干，得到7.2g粗产物，为褐色的油。利用与前一步相同的设备和条件进行粗产物的色谱纯化，得到3.5g二胺。将二胺用2.0M HCl的乙醚溶液(25ml)处理，在冰箱中保存过夜。生成暗黄色固体(4.2g)，滤出，从MeOH和乙醚中重结晶，得到1.5g二胺，为HCl盐(纯度大于98％，NMR和MS可用)，总收率19％。
实施例V 质谱分析 质谱数据是借助电子喷射电离技术得到的，采用带有自动进样器的PERKIN

API-300，TQMS，由

Toronto，Canada制造。
A.取代的乙二胺的文库 质谱充当监测乙二胺文库反应结果的手段。在每只反应平板上随机选择两行(24份样本)进行质谱，每孔汇集10种或30种化合物，共计大约28,000种化合物。因而，如果合成了每孔十种化合物，每孔的质谱应当含有十种信号，与每种化合物的适当分子离子有关。特定信号的存在与否表明特定合成的可行性。基于各种胺的质谱数据和反应性的一般分析，估计在112,000种化合物中生成了67,000种化合物。
图14是一个样本小孔的代表性质谱图形。代表性乙二胺化合物的质谱如图15所示、下表5至8列举代表性反应小孔的质谱数据范例，每孔含有十种取代的乙二胺。
表5 代表性乙二胺的质谱数据范例(每孔十种化合物) 表6 所合成的乙二胺的质谱数据


表7 所合成的乙二胺的质谱数据，R4＝H和Me

表8 所合成的乙二胺的质谱数据，R4＝H和Me

实施例VI 1H NMR光谱 质子NMR数据是在

核磁共振光谱计(Palto Alto，California)上记录的，频率500MHz。
将代表性取代的乙二胺用HPLC纯化，用质子NMR分析。代表性质子NMR图形如图16所示。一些代表性命中化合物的NMR和MS数据如下所示。
化合物6. N2-(1-金刚烷基甲基)-N1-(3，3-二苯基丙基)丙-1，2-二胺。55mg，36％收率。1H NMRδ7.28-7.15(m，5H)，3.95(t，J＝7.9Hz，1H)，2.94(br s 4H)，2.71(dd，J＝7.6，9.8Hz，2H)，2.41(s，2H)，2.32(dd，J＝7.6，7.9Hz，2H)，2.16(s)，2.08-1.98(m，4H)，1.72(m，6H)，1.62(m，6H)，1.51(d，J＝2.4Hz，3H)。质谱(ESI)m/z(MH)+417。
化合物7. N-(3，3-二苯基丙基)-N’-(1-金刚烷基甲基)乙-1，2-二胺。28mg，22％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.12(m，10H)；3.95(t，J＝7.6Hz，1H)；2.91(d，J＝1.2Hz，4H)；2.70(dd，J＝7.6和1.2Hz，2H)；2.40(d，J＝1.3Hz，2H)；2.32(q，J＝8.0Hz，2H)；1.98(brd，J＝1.7Hz，4H)；1.72(d，J＝12.2Hz，4H)；1.62(d，m？J＝12.2Hz，4H)；1.51(br s，6H)。质谱(ES I)m/z(MH)+403.6。
化合物10. N-(-)-顺式-桃金娘烷基-N’-(3，3-二苯基丙基)乙-1，2-二胺。14mg，11％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.10(m，10H)；3.95(m，1H)；2.92-2.83(m，4H)；AB2.80(d，J＝7Hz，1H)；2.76(d，J＝8Hz，1H)；；2.65(dd，J＝9.6和7.6Hz，2H)；2.42-2.20(m，4H)，2.29(d，J＝8Hz，2H)，1.90(m，8H)；1.42(m，1H)；1.19(m，2H)；1.17(s，3H)；0.95(s，3H)；，1.00-0.8(m，2H)。质谱(ESI)m/z(MH)+391.3。
化合物14. N-(3，3-二苯基丙基)-N’-外-(2-降冰片基)乙-1，2-二胺。17mg，16％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.15(m，10H)；3.95(t，J＝7.9Hz，1H)；2.86(dd，J＝11.5和1.5Hz，4H)；2.73(dd，J＝8.0和3.3Hz，1H)；2.64(t，J＝7.6Hz，2H)；2.29(t，J＝7.5Hz，2H)，2.31-2.26(m，2H)2.30 1.96(s，3H)；1.63(ddd，J＝13.1，7.9和2.5Hz，1H)；1.60-1.50(m，1H)；1.50-1.43(m，2H)；1.30(dq，J＝4.0和13.5Hz，1H)，(1H，m)，1.20(dd，J＝10.4和1.1Hz，1H)，1.11(dd，J＝2.0，和8.5Hz，1H)，1.08(dd，J＝2.5，和8.5Hz，1H)，1.10(dq，J＝8.3和2.1，2H)。质谱(ESI)m/z(MH)+349.1。
化合物21. N-(3，3-二苯基丙基)-N’-(1S)-(1-乙基环己烷)乙-1，2-二胺。5mg，4％收率。质谱(ESI)m/z(MH)+365.5。
化合物32. N-(2，2-二苯基乙基)-N’

(+)-冰片基乙-1，2-二胺。58mg，48％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.10(m，10H)；4.18(t，J＝6.8Hz，1H)；3.34(d，J＝7.6Hz，2H)；3.02(m，4H)；2.95-2.90(m，1H)；2.15-2.08(m，1H)；1.94(m，1H)；1.72-1.65(m，2H)；1.48-1.30(m，2H)；1.27-1.10(m，2H)；1.06(dd，J＝13.6和4.1Hz，1H)；0.82(s，3H)；0.81(s，3H)；0.78(s，3H)。质谱(ESI)m/z(MH)+377.2 化合物34. N-(2，2-二苯基乙基)-N’-(1-金刚烷基甲基)乙-1，2-二胺。6.8mg，6％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.15(m，10H)；4.15(t，J＝7.6Hz，1H)；3.24(dd，J＝7.9和1.2Hz，2H)；2.79(t，J＝6.5Hz，2H)；2.74(t，J＝6.0Hz，m，2H)；1.95(m，8H)；1.69(d，J＝12.5Hz，4H)；1.59(d，J＝11.9Hz，4H)；1.40和1.39(br s，3H)；质谱(ESI)m/z(MH)+389.0。
化合物37. N-(2，2-二苯基乙基)-N’-(-)-顺式-桃金娘烷基乙-1，2-二胺。54mg，38％收率。1H NMRδ7.31-7.18(m，10H)，4.13(t，J＝7.6Hz，1H)，3.26(d，J＝7.6Hz，2H)，2.86(dd，J＝4.3，8.0Hz，4H)，2.76(dd，J＝7.6，12.2Hz，2H)，2.37(ddd，J＝1.8，9.0，12.5Hz，1H)，2.12(dq，J＝1.8，7.6Hz，1H)，1.98(br s，2H)，1.98-1.84(m，4H)，1.39(ddd，J＝2.4，4.0，6.1Hz，1H)，1.18(s，3H)，0.95(s，3H)，0.91(d，J＝10.0Hz，1H)质谱(ESI)m/z(MH)+377.2。
化合物38. N-(-)-顺式-桃金娘烷基-N’-(2，2-二苯基乙基)丙-1，2-二胺。39mg，30％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.15(m，10H)；4.13(t，J＝8.0Hz，1H)；AB3.28(d，J＝7.5Hz，1H)；3.24(d，J＝7.5Hz，1H)，3.26(d，J＝6.1Hz，2H)；2.96(m，1H)；2.88-2.75(m，2H)；2.71(ddd，J＝4.5，9.0，13.0Hz，1H)，2.58(ddd，J＝7.0，10.0，14.0Hz，1H)；2.35(m，1H)；2.21(m，1H)；2.00-1.80(m，6H)；1.40-1.20(m，1H)；1.17(s，3H)；；0.93(s，3H)；0.89(dd，J＝9.7和4.2Hz，1H)。质谱(ESI)m/z(MH)+391.0。
化合物40. N-(2，2-二苯基乙基)-N’-(1R，2R，3R，5S)-(-)-异松蒎基乙-1，2-二胺。33mg，23％收率。1H NMRδ7.31-7.18(m，10H)，4.13(t，J＝7.5Hz，1H)，3.27(d，J＝8.0Hz，2H)，3.14(d t，J＝6.0，10Hz，1H)，(4H)，2.36(qd，J＝2.0，6.0Hz，1H)，2.34(dt，J＝2.0，10Hz，1H)，2.07-1.96(m，3H)，1.82(d t，J＝2.0，6.0Hz，1H)，1.71(ddd，J＝2.5，5.5，13.5Hz，1H)，1.22(s，3H)，1.09(d，J＝7.0Hz，3H)，0.96(d，J＝10.5Hz，1H)，0.91(s，3H)。质谱(ESI)m/z(MH)+377.3。
化合物47. N-(-)-顺式-桃金娘烷基-N’-(1R，2R，3R，5S)-(-)-异松蒎基乙-1，2-二胺。42mg，33％收率。1H NMRδ3.35-3.20(m，6H)，2.93(dd，J＝4.6，2.0Hz，2H)，2.45-2.33(m，4H)，2.17(s，3H)，2.06(五重峰，J＝7.0Hz，1H)，2.0-1.9(m，6H)，1.90(dd，J＝2.1，5.2Hz，1H)，1.87(dt，J＝1.8，4.6Hz，1H)，1.51(ddd，J＝4.6，10.0，13.0Hz，1H)，1.23(s，3H)，1.19(s，3H)，1.12(d，J＝8Hz，3H)，1.03(d，J＝10.3Hz，1H)，0.98(s，3H)，0.94(d，J＝9.8Hz，1H)，0.94(s，3H)。质谱(ESI)m/z(MH)+333.6。
化合物52. N-(3，3-二苯基丙基)-N’-环辛基乙-1，2-二胺。20mg，18％收率。1H NMR(500MHz)δ7.30-7.10(m，10H)；3.96(t，J＝7.9Hz，1H)；3.00(m，1H)；2.90(dd，J1＝J2＝5.5Hz，2H)；2.84(dd，J1＝J2＝5.0Hz，2H)；2.61(t，J＝7.3Hz，2H)，2.27(q，J＝7.6Hz，2H)；1.83(m，2H)；1.74(m，2H)；1.65-1.40(m，10H)。
化合物55. N-(1-金刚烷基甲基)-N’-环辛基乙-1，2-二胺。6.7mg，6％收率。1H NMR(500MHz)δ3.08-3.02(m，1H)，3.02-2.98(m，2H)；2.97-2.92(m，2H)；2.36(s，2H)；1.98(m，2H)；1.93-1.86(m，2H)；1.80-1.50(m，19H)。
化合物57. N-(-)-顺式-桃金娘烷基-N’-(环辛基)乙-1，2-二胺。18mg，18％收率。1H NMR(500MHz)δ3.05-2.95(m，4H)；AB2.76(d，J＝7.5Hz，1H)，2.23(d，J＝8.0Hz，1H)；2.76(dd，J＝11.6和7.3Hz，1H)；2.73(dd，J＝11.9和8.2Hz，1H)；2.40-2.34(m，1H)；2.28(五重峰，J＝8.0Hz，，1H)；1.97(s，3H)；2.00-1.84(m，6H)；1.80-1.70(m，2H)；1.68-1.38(m，11H)；1.18(s，3H)；0.97(s，3H)；0.92(d，J＝9.8Hz，1H)。质谱(ESI)m/z(MH)+307.5。
化合物58. N-(2-金刚烷基)-N’-环辛基乙-1，2-二胺。25mg，23％收率。1HNMRδ3.06(m，1H)，3.00(t，J＝6.1Hz，2H)，2.93(t，J＝5，5Hz，2H)，2.83(br s，1H)，1.96(s，3H)，1.92-1.80(m，10H)，1.80-1.50(m，20H)。质谱(ESI)m/z(MH)+305.1。
化合物59. N-(环辛基)-N’-(1R，2R，3R，5S)-(-)-异松蒎基乙-1，2-二胺。
15mg，14％收率。1H NMR(400MHz)δ3.47(d t，J＝6.0，10.0Hz，1H)，3.40-3.28(m，7H)，2.44(tq，J＝2.0，10.0Hz，1H)，2.36(dtd，J＝2.0，6.0，10.0Hz，1H)，2.09(dq，J＝2.0，7.2Hz，1H)，2.00-1.90(m，3H)，1.88-1.78(m，2H)，1.78-1.63(m，4H)，1.65-1.30(m，8H)，1.18(d，J＝6.0Hz，3H)，1.16(s，3H)，1.17(d，J＝7.2Hz，1H)，0.90(s，3H)。质谱(ESI)m/z(MH)+307.4。
化合物62. N-(-)-顺式-桃金娘烷基-N’-(1S)-(1-乙基环己烷)乙-1，2-二胺。48mg，46％收率。1H NMR(500MHz)δ3.06-3.00(m，1H)；2.98-2.95(m，2H)；2.92-2.84(m，1H)；2.79(dd，J＝11.9和7.0Hz，1H)；2.75(dd，J＝11.9和7.9Hz，1H)；2.73(m，1H)；2.39(m，1H)；2.28(五重峰，J＝8.5Hz，1H)；2.00-1.86(m，6H)；1.82-1.76(m，2H)；1.68(m，2H)；1.54-1.42(m，2H)；1.32-1.10(m，6H)；1.19(s，3H)；1.13(d，J＝6.7Hz，3H)；1.07(dd，J＝12和3Hz，2H)；1.02(dd，J＝12和3Hz，2H)；0.98(s，3H)；0.93(d，J＝9.7Hz，1H)。质谱(ESI)m/z(MH)+306.9。
化合物65. N-反式-(2-苯基环丙基)-N’-(1-金刚烷基)乙-1，2-二胺。18mg，16％收率。质谱(ESI)m/z(MH)+311.3。
化合物66. N-(3，3-二苯基丙基)-N’-(1R，2R，3R，5S)-(-)-异松蒎基乙-1，2-二胺。2mg，2％收率。1H NMR(500MHz)δ7.26(m，10H)；3.96(t，J＝7.6Hz，1H)；3.09(m，1H)；2.92(m，1H)；2.84(m，2H)；2.62(m，2H)；2.35(m，4H)；1.97(s，3H)；1.82(m，1H)；1.68(m，1H)；1.21(s，3H)；1.12(d，J＝7.3Hz；3H)；1.01(m，1H)；0.92(s，3H)。质谱(ESI)m/z(MH)+391.4。
化合物73. N-(2-金刚烷基)-N’-[2-(2-甲氧基苯基)乙基]乙-1，2-二胺。21mg，19％收率。1H NMRδ7.22(dd，J＝8.2，7.3Hz，1H)，7.14(d，J＝7.3Hz，1H)，6.89(d，J＝7.1，Hz，1H)，6.87(d，J＝8.2，Hz，1H)，3.81(s，3H)，3.06(t，J＝7.1Hz，2H)，3.06(m，2H)，3.01(m，2H)，2.93(t，J＝7.1，2H)，1.95(br s，2H)，1.90-1.80(m，7H)，1.78-1.66(m，6H)，1.59(d，J＝2.5Hz，2H)。质谱(ESI)m/z(MH)+329.4。
化合物78. N-2-金刚烷基-N’-2，3-二氢-1H-茚-2-基-乙-1，2-二胺。4.3mg，3％收率。1H NMRδ7.20(dd，J＝4.9，8.5Hz，2H)，7.14(dd，J＝5.5，2.1Hz，2H)，3.71(五重峰，J＝6.1Hz，2H)，3.19(dd，J＝5.8，15.9Hz，2H)，3.13(br.s，1H)，3.05(m，4H)，2.86(dd，J＝4.8，15.8Hz，2H)，2.08(m，2H)，2.00(m，6H)，1.96-1.88(m，4H)，1.88-1.80(m，3H)，1.74(m，4H)，1.68-1.60(m，2H)。质谱(ESI)m/z(MH)+303.4。
化合物109. N-香叶草基-N’-(2-金刚烷基)乙-1，2-二胺。27mg，24％收率。1HNMR(400MHz)δ5.40(t，J＝7.2Hz，1H)，4.78(br s，2H)，3.64(d，J＝7.6Hz，2H)，3.34(m，2H)，2.07(m，2H)，2.08-1.95(m，4H)，1.95-1.85(m，4H)，1.82(m，2H)，1.88-1.70(m，4H)，1.70-1.62(m，3H)，1.67(s，3H)，1.56(s，3H)，1.50(s，3H)。质谱(ESI)m/z(MH)+307.4。
化合物111. N-香叶草基-N’-(2-乙基哌啶)乙-1，2-二胺。44mg，42％收率。1HNMR(500MHz)δ5.22(t，J＝6.1Hz，1H)；5.04(m，1H)，3.52(d，J＝7.3Hz，2H)；3.05-2.85(m，4H)；2.66(m，1H)；2.44(m，2H)；2.08(m，4H)；1.80-1.50(m，2H)；1.70(s，3H)；1.65(s，3H)；1.58(s，3H)；1.50-1.35(m，2H)，0.89(t，J＝7.3，3H)。质谱(ESI)m/z(MH)+293.4。
化合物116. N-香叶草基-N’-烯丙基-N’-(环戊基)乙-1，2-二胺。45mg，42％收率。1H NMRδ5.86(ddd，J＝10.0，16.1，6.7Hz，1H)，5.28(d，J＝15.9Hz，1H)，5.25(d，J＝8.7Hz，1H)，5.23(t，J＝7.3Hz，1H)，5.30(m，1H)，3.59(d，J＝7.3Hz，2H)，3.28(br d，J＝6.4Hz，2H)，3.16(五重峰，J＝8.2Hz，1H)，3.02(m，2H)，2.95-2.86(m，2H)，1.88-1.80(m，4H)，1.70(s，3H)，1.74-1.66(m，3H)，1.65(s，3H)，1.58(s，3H)，1.56-1.50(2H)，1.50-1.40(m，2H)。质谱(ESI)m/z(MH)+305.3。
化合物117. N香叶草基-N’-二苯基甲基乙-1，2-二胺。24mg，20％收率。1HNMR(500MHz)δ7.40(d，J＝7.2Hz，4H)；7.29(t，J＝7.3Hz，4H)；7.21(t，J＝7.0Hz，2H)；5.15(t，J＝7.5，1H)；5.01(m，1H)；4.89(br s，1H)；3.42(d，J＝7.0Hz，2H)；3.00-2.78 2.93(m，4H)；2.20-2.00 2.17(m，4H)；1.63(s，3H)；1.59(s，3H)；1.56(s，3H)。质谱(ESI)m/z(MH)+363.3。
化合物125. N，N’-双-(-)-顺式-桃金娘烷基丙-1，2-二胺。82mg，70％收率。1H NMR(500MHz)δ3.62(m，1H)；3.18(dd，J＝13.7和3.7Hz，1H)；3.05(dt，J＝11.5和7.5Hz，1H)；3.06-2.92(m，2H)；2.86(dt，J＝12.2和7.3Hz，1H)；2.40(m，4H)；2.06-1.84(m，10H)；1.56-1.46(m，2H)；1.37和1.36(两个d，J＝6.7和J＝7.0Hz，3H)；1.20(s，3H)；1.19(m，3H)，0.99和0.98(两个s，3H)Hz，H)；0.97(s，3H)；0.94(两个d，J＝10.1Hz，2H)。质谱(ESI)m/z(MH)+346.9。
化合物151. N-[2-(2-甲氧基)苯基乙基]-N’-(1R，2R，3R，5S)-(-)-异松蒎基-乙-1，2-二胺。67mg，60％收率。1H NMR(500MHz)δ7.23(t，J＝5.8Hz，1H)；7.13(dd，J＝5.8和1.8Hz，1H)；6.88(m，2H)；3.81(s，3H)；3.13(m，1H)；3.1-3.0(m，3H)；3.01(t，J＝7.0Hz，2H)；2.89(t，J＝7.0Hz，2H)；2.42-2.35(m，2H)；2.00(m，3H)；1.82(dt，J＝6.0和2.0Hz，1H)；1.72(ddd，J＝2.5，5.5，13.5Hz，1H)；1.22(s，3H)1.13(d，J＝7.3Hz，3H)。0.99(d，J＝10.1Hz，1H)；0.93(s，3H)。质谱(ESI)m/z(MH)+331.5。
N-2-(2-甲氧基苯基)乙基-N’-烯丙基-N’-环戊基-乙-1，2-二胺。8mg，7％收率。1H NMRδ7.26(dd，J＝7.3，8.5，1H)，7.18(d，J＝7.2Hz，1H)，6.91(m，2H)，5.61ddd，(J＝6.7，17.0，9.4Hz，1H)，5.13(d，J＝15.3Hz，1H)，5.10(d，J＝9.2Hz，1H)，3.83(s，3H)，3.13(dd，J＝7.0，6.7Hz，2H)，3.10(d，J＝6.7Hz，1H)，3.00(d，J＝7.3Hz，1H)，3.05-2.90(m，2H)，2.97(dd，J＝8.2，6.1Hz，2H)，2.75(t，J＝6.1Hz，2H)，1.73(m，2H)，1.62(m，2H)，1.50(m，2H)，1.22(m，2H)。质谱(ESI)m/z(MH)+311.4。
N2-(3-苯基丙基)-N1-[2-(4-氟苯基)乙基]-1-苯基乙-1，2-二胺。23mg，19％收率。1H NMRδ7.35(d，J＝7.6Hz，2H)，7.34(quart，J＝7.Hz，1H)，7.26(d，J＝6.4Hz，3H)，7.23(d，J＝7.6Hz，2H)，7.17(dd，J＝7.3，6.4Hz，1H)，7.12(d，J＝7.0Hz，2H)，3.21(m，1H)，3.03(ddd，J＝4.2，8.0，12.8Hz，4H)，2.86(t，J＝8.0Hz，2H)，2.85-2.79(m，J＝12.Hz，2H)，2.74-2.64(m，4H)，2.61(t，J＝7.7Hz，2H)，1.96(五重峰，J＝7.6Hz，2H)。质谱(ESI)m/z(MH)+377.3。
实施例VII 结核分枝杆菌Rv0341p Lucs药物响应 使用含有荧光素酶与Rv0341 EMB-诱导性启动子的融合启动子的重组结核分枝杆菌，利用高通量筛选测定法试验本文所述取代的乙二胺对结核分枝杆菌的活性。这种测定法快速、可靠地鉴别化合物混合物和/或个别化合物的抗分枝杆菌活性。在这种测定法中，当试验活性化合物或活性化合物混合物对抗分枝杆菌的活性时，生物发光增加。在这种测定法期间，假定每种未纯化取代的乙二胺的理论收率为100％，比较每份样本与商业上可得到的乙胺丁醇(99.0％纯度)的活性。结果以LCPS和基于3.1μM EMB活性而言的％Max LCPS表示。
按照下列工艺分析取代的乙二胺。将二胺在Speed Vacuum中干燥至浓度大约6.3mmol每孔。然后将每种二胺或二胺混合物重新悬浮或溶解在200μl甲醇中，二胺浓度为31.5mM。将二胺溶液在7H9肉汤培养基中稀释至浓度为200μM(将31.5mM储备溶液按1∶15.75稀释，继之以1∶10稀释；每次稀释在7H9肉汤培养基中)。下面，将50μl经过稀释的二胺溶液加入到不透明的96孔平板一行十二个小孔的第一个小孔中。将25μl 7H9肉汤培养基加入到该行其余小孔中(#2-12)。“孔1”中的二胺溶液如下进行系列稀释将25μl从“孔1”转移至“孔2”，重复将25μl从“孔2”转移至“孔3”，等等，直至“孔11”。在“孔11”中，额外的25μl溶液弃去。使用“孔12”作为生长对照，以评估报告菌株的背景活性。然后盖上平板，在37℃下孵育24小时。在分析前不久，制备下列底物含有50mM HEPES pH 7.0和0.4％Triton X-100的缓冲溶液。然后，将0.25ml 1M DTT和14μl 10mg/ml荧光素的DMSO溶液加入到5ml缓冲溶液中。在孵育期开始后不久将这种最终溶液(50μl)加入到每一十二个小孔中。在加入荧光素底物后20分钟，利用

(Downers，Grove，Illinois)NXT发光计测量每孔发光(55/孔)。
图6-8显示利用96孔文库平板12个小孔(1行)的系列稀释液所得含有Rv0341 EMB-诱导性启动子的荧光素酶报告菌株的典型测定数据。图10显示具有至少10％荧光素酶活性的取代的乙二胺数，基于3.1μM乙胺丁醇活性而言。
图6代表含有Rv0341 EMB-诱导性启动子的荧光素酶报告菌株的典型测定数据。数据代表从96孔文库一行(D行)化合物混合物的HTS Luc测定法所得数值。D行受到若干系列稀释。化合物混合物在该测定法中的有效性是这样测量的，测定发光的强度，再与3.1μM乙胺丁醇(100％强度，99％纯度)比较。图6中的每一曲线代表一个小孔或者十种化合物。结果以最大发光数每秒百分比(％Max.LCPS)表示。在筛选期间，假定每种未纯化化合物的理论化学收率为100％。给出单一化合物的浓度。基于这种初步筛选，300+化合物混合物显示抗TB活性。
实施例VIII 代表性MIC实验 最小抑制浓度(MIC)是生长抑制剂、这里是取代的乙二胺的浓度，在该浓度下不存在接种细胞的增殖。利用微量稀释法测定取代的乙二胺能够体外抑制结核分枝杆菌生长的MIC。在代表性MIC实验中，将细菌、即结核分枝杆菌H37Rv菌株(M.tb)在7H9培养基中培养至600nm下的密度为0.2OD(光密度)。然后将细菌培养物按1∶100稀释在7H9肉汤培养基中。在7H9培养基中分别制备异烟肼和乙胺丁醇的32μg/ml储备溶液。在水中分别制备异烟肼和乙胺丁醇的3.2mg/ml溶液。然后将溶液过滤，按1∶100稀释在7H9培养基中。每种药物都是从Sigma购买的，是“仅供实验室使用”级。在甲醇中制备每种取代的乙二胺的10mM溶液。下面，将100μl 7H9培养基加入到96孔平板的每一小孔中(A至H行×1至12栏)。向C至H行第一小孔加入另外80μl 7H9培养基。将异烟肼溶液100μl加入到孔A1中，将乙胺丁醇溶液100μl加入到孔B1中。将六种取代的乙二胺各20μl分别加入到孔C1至H1中(栏1)。跨越每行进行每种取代的乙二胺和异烟肼与乙胺丁醇对照的系列稀释。例如，混合并且转移100μl前一孔至下一连续孔，进行跨行C1-C12的系列稀释。在“栏12”的每一小孔中，弃去100μl最终稀释液。下面，将100μl经过稀释的M.tb H37Rv菌株加入到每孔中。然后盖上96孔平板，在37℃下孵育10天。利用反转平板读数器读取平板的细菌生长或者不生长。测定MIC，为取代的乙二胺抑制可见的M.tb生长的最低浓度。
代表性平板布局如表9所示，列出每孔中的浓度。表10列举选定化合物的MIC和LD50数据。LD50是取代的乙二胺杀死50％细胞(M.tb的H37Rv菌株)的浓度。表11列举纯化取代的乙二胺的MIC数据，与乙胺丁醇(EMB)对比。图9显示在各种浓度水平下具有MIC活性的取代的乙二胺化合物的数量。
表9 基于栏1-12每一小孔中的浓度(μM) 药物 表10 选定化合物的选择性指数 上述工艺也用于检查成批的化合物(每孔10种化合物)。将所合成的取代的乙二胺批次在速度真空机(Speed Vacuum)中干燥，然后重新悬浮在DMSO或无菌水中，浓度为2.5mg/ml。
表11 纯化样本的MIC数据 平板设置 实施例IX 取代的乙二胺对抗耐药性患者种群的次级筛选和评价 对一些取代的乙二胺化合物进行次级筛选，以检查它们对抗三种临床耐受性MDR患者分离物的活性。MDR菌株TN576被归入W1菌株(STPR，INHR，RIFR，EMBR，ETHR，KANR，CAPR)，菌株TN587被归入W菌株(STPR，INHR，RIFR，EMBR，KANR)，第三种菌株TN3086被归入W1菌株(STPR，INHR，RIFR，EMBR，KANR)。每种MDR菌株对乙胺丁醇都是高度耐受性的，MIC值超过12.5-25μM。测定下列取代的乙二胺MP116、MP117、RL241、化合物#59和#109对全部三种患者分离物的MIC。

化合物MP 116

RL241(化合物37)
化合物59
化合物109 本研究所得结果如表12-13所示。表14根据它的耐受性表征每种MDR菌株。
表12 取代的乙二胺类对抗耐药性患者分离物的筛选(MIC值μg/ml) WT＝M.tb的野生型 EMB为2HCl盐 RL241为2HCl盐 表13 取代的乙二胺类对抗耐药性患者分离物的筛选(MIC值μg/ml) 化合物#59为2HCl盐 化合物#109为2CF3COOH盐 表14 每种MDR菌株的耐药性 R＝耐受的 S＝易感的 STP＝链霉素 INH＝异烟肼 Rif＝利福平 Emb＝乙胺丁醇 Eth＝乙硫异烟胺 Kan＝卡那霉素 Cip＝环丙沙星 Cap＝卷曲霉素 Cyc＝环丝氨酸 实施例X 体内动物研究 在药物发现周期的最终阶段，利用动物模型评估一些取代的乙二胺化合物在代表性人疾病状态系统中的抗微生物功效。体内试验方法牵涉经由气雾剂接种六周龄C57BL/6小鼠，所述气雾剂含有大约200个集落形成单位的结核分枝杆菌H37Rv。
A.CFU肺研究 在接种后，检查用结核分枝杆菌H37Rv气雾化治疗过的小鼠达10至12周。将药物(取代的乙二胺类)经由食管插管给药(管饲法)7天/周，开始于感染后14天或21天。每组五只小鼠，借助可见的集落数测定肺中的细菌负载，间隔大约一周。直接比较供试药物与一线抗结核药异烟肼和二线药物乙胺丁醇。异烟肼和乙胺丁醇的试验浓度分别为25mg/kg和100mg/kg。取代的乙二胺化合物37、化合物59和化合物109各自在1mg/kg和10mg/kg下进行试验。图17至19代表三次独立的CFU肺研究所得数据。在每项研究中，在不同时间间隔内(天数)测定可回收和可培养的集落形成单位(CFU)数。
B.损害研究 联合CFU/肺研究测定化合物59和化合物109防止由细菌负荷引起总体病变形成的能力。借助肺表面上可见的损伤量化确定总体病变。检查量化是CFU测定的良好替代，直接与细菌负荷相关，取决于实际集落形成单位。首先肉眼检查损伤，然后对肺进行加工和平板接种，供CFU量化。损伤研究证明药物防止疾病病变形成的能力。图20代表损害研究所得数据。对应的CFU结果如图19所示。
C.毒性研究 利用剂量扩大研究评估毒性。本研究利用C57BL/6小鼠进行，每种候选药物十只。每两天一次，向小鼠给以递增浓度的药物，监测有害后果。给药安排是50、100、200、400、600、800和1000mg/kg。上限1000mg/kg是基于剂量扩大的目标和药物在递送载体中的溶解度。化合物37在100mg/kg下对小鼠有毒性。化合物59和化合物109分别在1000mg/kg和800mg/kg下被小鼠所耐受。
应当理解，上文仅涉及本发明的优选实施方式，可以进行大量修饰或变化而不背离发明的精神和范围。本文提到的每份参考文献的完整文本都全文结合在此作为参考。
实施例XI 符合要求的化合物的体外毒性和选择性指数 利用本领域技术人员熟知的方法，在采用猴肾细胞(Vero)和人宫颈癌细胞(HeLa)的体外毒性模型中试验26种化合物(包括37、59和109)。本毒性试验所得数据和MIC数据用于计算选择性指数(SI)，即IC50∶MIC之比(表15)。选择性指数从1.76至16.67不等。化合物109具有最佳选择性指数。
表15 代表性化合物的体外数据 实施例XII 乙胺丁醇类似物的体内功效 选择化合物58、59、73、109和111在小鼠TB模型中进行体内功效研究。化合物58和59在它们的分子中都有相同的环辛基片段；化合物58、73和109都有金刚烷基部分，109和111都有香叶草基碎片(图22)。
在这些研究中，使8周龄同系繁殖雌性小鼠C57BL/6静脉内感染结核分枝杆菌。感染后3周开始药物治疗(提供了详细方案)。药物是通过管饲法口服给药的。在三个时间点处死小鼠(感染后15、30和45天)，测定脾和肺中的CFU(图23和24)。这些研究证明，化合物109在1和10mg/kg剂量下具有等于乙胺丁醇在100mg/kg下的活性。
材料和方法 小鼠从Charles River(Raleigh，NC)购买8周龄雌性C57BL/6小鼠，喂养在BIOCAL，Inc.(Rockville，MD)的BSL-2设施中，在感染前适应至少4天。
分枝杆菌将经过冷冻和融化的结核分枝杆菌H37Rv Pasteur样本加入到含有0.5％BSA和0.05％吐温80的5ml 7H10肉汤培养基中，在37℃下培育1周，然后将1ml加入到25ml培养基中(在2周期间第2代)。将培养物洗涤两次，重新悬浮在含有0.5％BSA和0.05％吐温80的PBS中，等量分配，冷冻在-80℃下。为了测定培养物的CFU，使等分试样融化，将10倍稀释液平板接种在琼脂7H9上，20天后计算CFU数。
感染将冷却的培养物样本融化，稀释至浓度约106CFU/ml。向侧尾静脉内注射相当剂量结核分枝杆菌H37Rv的0.2ml PBS溶液，使小鼠感染。
抗微生物药INH、EMB、乙胺丁醇类似物。
药物治疗方案用化合物治疗小鼠开始于感染后20天。将化合物溶于10％乙醇水溶液，通过管饲法给药(0.2ml每只小鼠)。每周给以5天疗法，持续四周或六周。在化疗开始后两周、四周和六周，处死小鼠(每组6只小鼠)，除去肺和脾，在含有0.05％吐温80的无菌2ml PBS中均质化。将均质化物的系列稀释液平板接种在7H10琼脂平皿上，在37℃下培育。三周后计算CFU数。
统计学分析为了分析器官中的CFU结果，进行ANOVA试验；借助斯氏检验估计差异的显著性，p＜0.05被视为统计学显著的。
结果 新化合物的体内活性这些化合物的活性列在图21-24中。在图21(脾)和22(肺)所列实验中，使小鼠感染5×105CFU结核分枝杆菌H37Rv，在感染后20天开始化疗。将小鼠用INH(25mg/kg)、EMB(100mg/kg)、化合物73和109(均为1mg/kg和10mg/kg)治疗。结果表明在脾中，化合物73和109具有等于100mg/kg EMB的活性(图21)。在脾中，在1mg/kg或10mg/kg这些化合物的活性之间不存在统计学差异。在肺中，10mg/kg化合物109在4和6周后比100mg/kg EMB更有效。在肺中，在1mg/kg与10mg/kg化合物109之间显示有统计学充分的差异(图22)。在脾和肺中INH都是最有活性的药物。
使用较高的感染剂量，在较短的模型中也试验了化合物73和109(图23和24)。使小鼠感染5×106CFU结核分枝杆菌H37Rv，在感染后15天开始化疗。将小鼠用INH(25mg/kg)、EMB(100mg/kg)、化合物109(0.1mg/kg，10mg/kg和25mg/kg)、58、73和111(均为25mg/kg)治疗。将小鼠治疗4周。在脾和肺中，10mg/kg和25mg/kg化合物109都具有等于100mg/kg EMB的活性，在0.1mg/kg浓度下的活性最小，但是与未治疗对照的差异明显，出现在治疗4周之后(图23和24)。检测了化合物73(25mg/kg)与109(25mg/kg)之间在统计学上充分的差异。在肺中，没有检测到这些化合物活性之间的显著性差异。化合物58和111在脾和肺中都有体内活性；不过，化合物73和109是优选的。这些实验的结果表明，化合物73和109在低浓度下显示等于100mg/kg EMB的活性，在有些情况下化合物109显示较高活性。
化合物111和59的试验是在感染有5×105CFU结核分枝杆菌H37Rv的B6小鼠中进行的，在感染后20天开始化疗(图25和26)。两种化合物在10mg/kg浓度下都显示与100mg/kg EMB相当的抗结核活性。
在所有实验中，INH显示比EMB和其他化合物更高的活性，在4-6周化疗期间减少器官中的细菌负荷达2-3个对数；新化合物与EMB(100mg/kg)相似，减少细菌负荷达1.0-2.0个对数。在所研究的化合物中，73和109是最优选的，因为减少器官中分枝杆菌的能力最高和它的毒性与药理动力学参数。
实施例XIII 体内毒性 小鼠初步剂量加速研究已经表明，化合物109在高达800mg/kg的剂量下、化合物59在高达1000mg/kg的剂量下能够被良好耐受。化合物37在100mg/kg的剂量下是致命的(ClifBarry，NIAID，未公布的结果)。
化合物109主要以二盐酸盐的形式在五种不同剂量下使用，37仅以盐酸盐形式在两种剂量下使用。
利用管饲法，向小鼠给以一次化合物，浓度为100、300或1000mg/kg。每剂每种化合物由一组3只小鼠组成。在实验持续期间每天监测小鼠两次。处死药物给药后一周仍存活的小鼠；无菌摘除关键器官，观察异常和药物毒性的迹象。MTD(mg/kg)是导致没有致死/组织异常的最高剂量。
方法 1.小鼠的治疗利用管饲法向C57BL/6雌性小鼠(6-8周龄)给以一次化合物，浓度为100、300或1000mg/kg。将化合物溶于适当浓度乙醇在蒸馏水中的溶液，给药体积为0.2ml每只小鼠。
2.小鼠的观察在给药后4和6小时观察小鼠，然后每日观察两次达一周。在整个研究期间密切监测小鼠的存活和体重。
3.药物毒性的评估表现任何异常表象或行为迹象的小鼠或者在其他小鼠没有存活至第7天的组中剩下的小鼠将被处死，用于药物毒性的评估。无菌摘除并观测关键器官；从肝、心和肾提取组织，置于10％福尔马林溶液中。将这些经过固定的组织制作切片，检查由药物毒性所导致的异常。
这些研究表明，化合物109的最大耐受剂量为600mg/kg(表16)。观察到器官没有可见的改变。800mg/kg剂量是致命的在每组3只小鼠中，两只动物在3天内死亡(表17)。化合物37在100和300mg/kg剂量下被良好耐受。观察到器官没有可见的改变。进行另外的实验，以评价化合物37的最大耐受剂量和体内功效。
表16 化合物109和37在小鼠中最大耐受剂量的测定
表17 化合物109和37在小鼠中最大耐受剂量的测定
实施例XIV 化合物37、59和109的药动学研究 首先，开发了用于化合物测定的分析方法，以便进行全部PK实验，参见图29。这里是实验的简要说明(1)向血浆中供试化合物掺入，加入10μl特非那定或血浆样本(200μl)；(2)加入ACN(2ml)，使蛋白质沉淀出来，在2,500r pm下自旋；(3)蒸发上清液至干；(4)加入200μl稀释溶剂甲醇(含有0.1％三氟乙酸)∶乙酸铵(80/20)；(5)涡旋，自旋，使用上清液；(6)在Sciex API 3000上进行LC/MS/MS。
使用1和15mg/ml浓度进行化合物在血浆中的生物稳定性研究。将化合物在37℃下培育1、2、3和6小时(表18)。另外，发现所有供试化合物在24℃、pH 2与7.4的血浆中长达24小时都是稳定的。
表18 供试化合物在血浆中的生物稳定性 利用盒式给药进行化合物37、59和109在小鼠中的试点PK研究将全部三种类似物都一起配制在盐水中，浓度1.5mg/ml，对小鼠同时给药，剂量为口服25mg/kg、腹膜方式6mg/kg和静脉内方式。发现15和7.5mg/kg剂量导致小鼠死亡，3.75mg/kg在给药后立即出现昏睡，但是在几分钟后出现正常表象；3mg/kg显示没有不良反应，因此用作静脉内剂量。所得数据列在图30、31和32中(在NCI′指数化NSC下研究供试化合物)，总结在表19中。
表19 供试化合物37、59和109在对小鼠盒式给药后的PK参数；N/A＝不可检测 所进行的药动学研究表明，化合物59(NCI指数为NSC 722040)具有相当差的PK图形(AUC，Cmax)，放弃这种化合物的进一步试验。基于初步毒性数据，也排除化合物37的候选可能。因此，选择化合物109(NCI指数为NSC 722041)供进一步的PK分析。
已经显示化合物SQ 109在静脉内(i.v.)或口服(p.o.)给药时达到并且超过它的血浆最小杀菌浓度MBC(313ng/ml)，半衰期为5.2小时，总廓清率小于肝血流(图33，表20)。
表20 化合物109的药动学参数 在p.o.给药时它的口服生物利用度仅为3.8％，但是这被解释为它的独特组织分布模式。组织分布研究已经证明，SQ109主要分布于肺和脾(图34和35)，这对特征性表现为肺疾病的感染是非常有利的。
利用超速离心法，发现化合物109的血浆蛋白结合是浓度依赖性的，从15％(20ng/ml)至74％(200ng/ml)至48％(2000ng/ml)不等。i.v.给药(3mg/kg)后，该化合物分布在血浆与红细胞之间，比例为70.6∶29.4。
对该化合物在体内的命运知之甚少，因为化合物在排泄(尿和粪便)后的总量不超过递送剂量的3％(表21)。
表21 化合物109在单次给药后累积排泄在小鼠尿和粪便中的量
最初鉴别化合物109在尿中的代谢产物的尝试没有提供分解产物的证据，见图36。例如，没有证据表明在化合物给药后前24小时内在小鼠尿中有共轭代谢产物(M+521)的生成，见图37。共轭代谢产物是典型的代谢途径N-葡萄糖醛酸化产物，由与葡萄糖醛酸的反应所生成(D.A.Williams and T.L.Lemke in Foye′s Principals of MedicinalChemistry，5th Ed.，p.202)。
实施例XV 化合物109的体外药动学研究 化合物109的体外药理学和早期ADMET(吸收、分布、代谢、排泄、毒性)研究根据服务协议承包给CEREP(15318NE 95th Street，Redmond，WA 98052，USA，www.cerep.com，tel 425 895 8666)，包括对30种标准受体进行试验(参见CEREP表22和23，图38和39，五种CYP450酶、hERG(K+通道)、水溶性、所预测的肠渗透性和代谢稳定性(数据列在图40表24(a-m)中)。
实施例XVI 双(2-金刚烷基)乙二胺，SQBisAd
化合物SQBisAd 具有最佳选择性指数的化合物、例如109、58、73、78(表15)和体内数据良好的化合物都共有相同的金刚烷碎片(图20)。考察了仅具有这种碎片(在亚乙基连接基两侧)的化合物。在乙胺丁醇类似物的目标100,000化合物文库的制备期间，证实有70,000种化合物生成，30,000种失败了。最初没有检测这种特定的化合物，也许因为它的合成收率非常低或者因为它由于空间因素从未被制成。
在用于文库制备的合成方案1(图41)中，第二步中的空间位阻胺罕有得到产物。分析大量原始平板的MS数据可以说明，2-金刚烷胺在用作R1NH2时很少得到所需产物，这可以解释为空间位阻反应部位在合成方案2步骤2或步骤3中的存在(图41)。
化合物SQBisAd可以借助“湿化学”制备，利用同一途径，见流程3(图41)，根据文献记载2-金刚烷胺(使用商业上可得到的盐酸盐)当用于第1和2步时的确生成产物。由于对称性，这种化合物可以借助替代途径合成。我们已经使用氰基硼氢化钠进行乙二胺与2-金刚烷酮的还原性烷基化，而制备了SQBisAd。终产物(无需另外的纯化)证明MIC(最小抑制浓度)等于或好于化合物109。
实施例VIII 生成具有改性连接基的二胺文库 一般方法所有试剂都是从Sigma-Aldrich购买的。Rink-酸树脂是从NovaBiochem，Inc.购买的。溶剂乙腈、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯乙烯、甲醇和四氢呋喃是从Aldrich购买的，买来即用。固相合成是在Quest 210合成仪(Argonaut Technologies)和组合化学设备(Whatman Polyfiltronics and Robbins Scientific)上进行的。溶剂的蒸发是用SpeedVac AES(Savant)进行的。质谱数据是借助电子喷射电离技术在带有自动进样器的Perkin Elmer/Sciex，API-300，TQMS上获得的。
Rink-树脂的活化、胺的加入和酰化步骤是用Quest 210合成仪的10ml试管进行的。FMOC基团的除去、与羰基化合物的还原性烷基化反应、用Red-Al还原和从固体载体上裂解是在96深孔(2ml)化学稳定性平板中进行的。
步骤1.Rink-酸树脂的活化 将Rink-酸树脂(覆盖率为0.43-0.63mmol/g)，6g(至多3.78mmol)在80ml二氯甲烷与THF的2∶1混合物中的悬液分配在20只试管中，每管4ml，过滤，用THF洗涤两次。加入三苯膦(5.7g，21.75mmol)的40ml THF溶液，2ml/管，继之以加入六氯乙烷(5.09g，21.45mmol)的20ml THF溶液，1ml/管。6小时后，将树脂用THF(2×4ml)和二氯甲烷(2×4ml)洗涤。
步骤2.第一种胺的加入 向每只试管加入3ml二氯乙烷、EtNiPr2(0.2ml，1.15mmol)和相应的胺(1mmol)(当所选择的胺是固体时，加入它在DMF中的溶液或悬液)。向每只试管加入二氯乙烷至充满容量4ml。反应在45℃下进行8小时，在室温下进行6-8小时。将树脂过滤，用二氯甲烷与甲醇的2∶1混合物洗涤(1×4ml)，然后用甲醇洗涤(2×4ml)，吸干。
步骤3.用Fmoc保护的氨基酸酰化 将树脂用二氯甲烷预洗涤(2×4ml)。向每只试管加入2ml二氯甲烷、HATU(2mol过量于所加载的树脂，0.14g，0.39mmol，溶于1ml DMF)和0.47mmol(2.5mol过量于所加载的树脂)氨基酸的1ml DMF溶液，在45℃下搅拌8小时，在室温下搅拌6-8小时。16小时后将树脂过滤，用DMF与二氯甲烷的1∶1混合物(1×3ml)、二氯甲烷(1×3ml)洗涤，用等量试剂重复酰化。最后，将树脂过滤，用DMF与二氯甲烷的1∶1混合物(1×3ml)和甲醇(3×3ml)洗涤，吸干(在Quest上)30分钟，转移至小瓶中(每瓶一份树脂)，在真空干燥器中干燥1小时。该步骤之后利用MS光谱对全部树脂进行质量控制。
步骤4.氨基的烷基化 去保护。将十份从前三步制备的树脂汇集在一起，在每一小瓶中各留下大约0.05g供所有必要的去褶合。将树脂混合物(2.0-2.5g)在100ml二氯甲烷与THF的2∶1混合物中的悬液分配在两个96孔过滤平板中，利用过滤歧管过滤。将发应平板转移至Combiclamps，加入0.2ml20％哌啶的DMF溶液以除去Fmoc保护基团，留置10分钟。10分钟后，将平板过滤，用0.2ml DMF洗涤，用0.2ml 20％哌啶的DMF溶液重复去保护，留置20分钟。然后将平板过滤，用DMF(每孔0.2ml)和二氯甲烷(每孔2×0.5ml)洗涤。
与羰基化合物反应。向反应平板A行每孔加入0.1ml二氯甲烷、0.08ml来自主平板的1.0M适当酸的DMF溶液、0.05ml PyBrop的DMF溶液(0.015g，0.03mmol，2.5mol过量于所加载的树脂)和0.05mlEtNiPr2的二氯甲烷溶液(0.022ml，0.13mmol，10mol过量于所加载的树脂)。向B至H行每孔加入0.1ml THF、0.160ml来自主平板的1.0M适当醛或酮的DMF溶液，反应30分钟。30分钟后，加入0.075ml(0.075mmol)1.0M NaBCNH3溶液。将反应平板密封，在室温下保持72小时。最后，将树脂过滤，用THF、DCM(1×1ml)、甲醇(2×1ml)洗涤，在真空干燥器中干燥2小时。
步骤5.用Red-Al还原 将反应平板置于Combiclamps中。加入Red-Al(65+w％甲苯溶液)与THF的1∶6混合物，每孔0.6ml(每孔0.28mmol Red-Al)，反应4小时。反应完成后，将树脂过滤，用THF(2×1ml)、甲醇(3×1ml)洗涤，在过滤歧管中干燥。
步骤6.裂解 利用裂解歧管进行该步骤。向反应平板(置于这种歧管中收集平板顶部)加入TFA、二氯甲烷与甲醇的10∶85∶5混合物，每孔0.5ml。15分钟后，将溶液过滤，收集在收集平板的适当小孔中。重复该工艺。在Speedvac上蒸发溶剂，残留样本准备供试验之用。
去褶合实施例 借助离散化合物从存档a-卤代乙酰基酰胺树脂的再合成(10份树脂，每份0.05-0.10g)，进行活性小孔的去褶合，所述树脂在汇集之前的酰化步骤结束时被留出备用。为每份树脂指定96孔过滤平板中的离散栏(1或2或3等)，分为X行(A，B，C等)，其中X是在原始筛选平板中所发现的命中数。向一行中的每一小孔加入选定羰基化合物(命中者)以及其他所需试剂第一种选定羰基化合物加入到“A”行树脂中，第二种羰基化合物加入到“B”行树脂中，第三种羰基化合物加入到“C”行树脂中，等等。代表性96孔去褶合平板的布局如表28、图52所示。
将反应平板密封，在室温下保持72小时。最后，将树脂过滤，用THF、DCM(1×1ml)、甲醇(2×1ml)洗涤，在真空干燥器中干燥2小时。按照合成方案步骤5和6进行还原和裂解。用ESI-MS(电子喷射电离质谱)分析裂解产物小孔，以保证活性成分的同一性，在MIC测定法中试验。下文提供ESI-MS数据总结。表30、图53提供化合物的命中与结构的列表。
化合物673 N2-[(2-甲氧基-1-萘基)甲基]-3-苯基-N1-(3-苯基丙基)丙-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+439.2 化合物674 N2-[2-(苄氧基)乙基]-N1-(3，3-二苯基丙基)-4-(甲硫基)丁-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+463.4。
化合物675 N1-(3，3-二苯基丙基)-4-(甲硫基)-N2-(3-苯基丙基)丁-1，2，-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+447.2 化合物676 N2-(环己基甲基)-N1-(3，3-二苯基丙基)-4-(甲硫基)丁-1，2，-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+425.1 化合物677 N1-(3，3-二苯基丙基)-N2-(2-乙氧基苄基)-4-(甲硫基)丁-1，2，-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+463.1 化合物678 N2-[2-(苄氧基)乙基]-N1-[(6，6-二甲基双环[3.1.1]庚-2-基)甲基]-4-(甲硫基)丁-1，2，-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+405.3 化合物679 N1-[(6，6-二甲基双环[3.1.1]庚-2-基)甲基]-4-(甲硫基)-N2-(3-苯基丙基)丁-1，2，-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+389.5 化合物680 N2-(2-氯-4-氟苄基)-4-甲基-N1-(4-甲基苄基)戊-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+363.3，365.5；(MCH3CN)403.3，405.3。
化合物681. N2-[2-(苄氧基)乙基]-N1-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-甲基戊-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+385.1。
化合物682. N2-[3-(4-氯苯氧基)苄基]-N1-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-甲基戊-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+467.1，469.2。
化合物683. N2-(4-异丙基苄基)-N1-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-甲基戊-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+383.3 化合物684. N1-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]-4-甲基-N2-[(2E)-3-苯基丙-2-烯基]戊-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+367.3；[M-(CH2CH＝CHPh)2H]+251。
化合物685 N2-[2-(苄氧基)乙基]-4-甲基-N1-(3-苯基丙基)戊-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+369.1。
化合物686. N2-(2-氯-4-氟苄基)-4-甲基-N1-(3-苯基丙基)戊-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+377.2，378.9。
化合物687. N2-[3-(4-氯苯氧基)苄基]-4-甲基-N1-(3-苯基丙基)戊-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+451.1，453.3。
化合物688. N2-(4-异丙基苄基)-4-甲基-N1-(3-苯基丙基)戊-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+367.3。
化合物689 4-甲基-N2-[(2E)-3-苯基丙-2-烯基]-N1-(3-苯基丙基)戊-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+351.2。
化合物690 N2-(2-乙氧基苄基)-4-甲基-N1-(3-苯基丙基)戊-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+369.1。
化合物691. N2-十氢萘-2-基-N1-[2-(4-氟苯基)乙基]-3-噻吩-3-基丙-1，2-二胺。质谱(ESI)m/z(MH)+415.3。
实施例XIX 利福平与化合物109或异烟肼的体外活性 化合物109作为单个化合物在体外和体内均显示出对结核分枝杆菌的有效杀伤。在此处是提供多药物制度的实施例以便评价表3的化合物在与标准结核药物联用时对体外抑制细菌生长和小鼠结核模型的作用。选择利福平、化合物109和异烟肼用于体外活性(图54)。使用BACTEC生长动力学进行本研究。RIF的MIC为0.2ug/ml，SQ109(化合物109)为0.32ug/ml且INH为0.025ug/ml。这些研究证实化合物109与利福平联用在本研究期限内抑制生长指数。甚至在化合物109的MIC浓度为1/10th和1/20th MIC时也获得了Rif和化合物109的生长抑制作用。显然，Rif与化合物109的联合用药优于单独的Rif或Rif和INH。化合物109在0.5MIC下与低至0.1MIC RIF联用时抑制了99％以上的结核分枝杆菌(H37Rv)接种物生长。x/y商数值为0.29，这显示协同的药物作用。在将0.5MIC RIF与0.05，0.1和0.2MICSQ109联用时也观察到了这种协同作用，其中相应的x/y商数值分别为0.32，0.16，0.4。结果表明RIF和SQ109的联合用药对结核分枝杆菌的生长抑制作用的协同作用活性。
实施例XX 化合物109与标准结核药物的体内活性 其中感染动物体重减轻为结核病发展指示剂的TB快速体内模型用于提高的新化合物和组合疗法。选择利福平、INH、EMB、PZA、Moxi(标准结核药物)和化合物109用于小鼠体内研究(图55)。这些研究证实化合物109与一种或多种标准结核药物联用调节小鼠体重并且为药物功效的指示剂。在本研究中，利福平和化合物109或INH和化合物109达到了与未感染对照组相差无几的体重。相反，Moxi和化合物109或EMB和化合物109导致体重接近安慰剂治疗的对照组。显然，利福平和化合物109的联合用药优于单独的利福平或INH。
实施例XXI 快速模型，化合物109与标准结核药物相比的体内活性 在本实施例中，选择利福平和化合物109用于小鼠体内研究(图56A和图56B)。在本研究中，利福平和化合物109达到了与未感染对照组相差无几的体重。相反，单独的化合物109或利福平在化疗过程中导致体重接近安慰剂治疗的对照组。显然，利福平与化合物109的联合用药优于单独的利福平或化合物109。
实施例XXII 联合疗法的体内活性 口服给予的10mg/kg的SQ109(化合物109)和2mg/kg的RIF的联合疗法在预防感染小鼠体重减轻方面比以相同剂量给予单一药物疗法更为有效(图57)。通过3周的化疗，接受RIF+SQ109联合疗法的6只小鼠的平均体重为24.3克并且与24.5g的未感染的对照组无差异。通过比较发现，接受相应剂量的单独SQ109或RIF的小鼠分别具有21.3g和19.7g的平均体重未使用药物治疗的感染小鼠的平均体重为17g。
实施例XXIII 联合疗法的体内活性(标准慢性模型) 通过使用标准慢性结核小鼠模型证实联合疗法的体内增强的活性(图58)。在慢性TB模型中的4周疗法过程中，SQ109通过自身将肺中的CFU从8.1log10CFU(对照组未治疗的动物)降至6.6log10CFU；RIF(20mg/kg)通过自身将CFU降至5.8log10；但SQ109+RIF的联合用药(以分别为10和20mg/kg的其最有效剂量)将CFU降至4.8log10，额外的log10CFU低于任一单独的药物。INH+RIF+SQ109的联合用药(在25，20和10mg/kg下)在第3周时获得了与INH+RIF+EMB(在25，20和100mg/kg下)在第4周时相同的CFU，比标准药物组合早1周(图59)。截止到第4周时，SQ109组合因一半的log10(3.2log10CFU)而比EMB联合疗法(3.7log10CFU)更有效。CFU下降的差异具有统计学显著性。化合物109在与单独的RIF或RIF+INH联用时也强化了对TB中结核分枝杆菌的体内杀伤；基于这些结果，提出了化合物109与RIF的协同作用活性，从而提示它可以取代使用3-种或4-种药物组合的TB疗法的加强期中的乙胺丁醇。此外，化合物SQ 109在与RIF在持续期联用时可以提供额外的有益作用，因为其自身具有有效活性。此外，由于作用方式不同于RIF，所以这方面有助于RIF脱离耐药性生物体，同时提供协同的增强活性。
实施例XXIV 化合物109的体外药代动力学研究 在用于安卓全药理学和早期ADMET的体外测试(Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion，Toxicity)中，将化合物109的研究与CEREP(15318NE 95th Street，Redmond，WA，98052，USAwww.cerep.com)签定服务合约并且包括评价结合一组27种标准受体和三种转运蛋白的抑制(参见图60(表31)和图61(表32))，所述的受体和转运蛋白包括腺苷受体(A1和A2A)；肾上腺素能受体(α1，α2，β1)；血管紧张素II受体(AT1)；苯二氮

类受体(BZD)；缓激肽受体(B2)；缩胆囊素受体(CCK1)；多巴胺受体(D1，D2S)；内皮缩血管肽受体(ETA)；GABA受体(GABA)；谷氨酸受体(NMDA)；组胺受体(H1中枢)；黑皮质素受体(MC4)；毒蕈碱性受体(M，非-选择性)；神经激肽受体(NK1)；神经肽Y受体(Y)；烟碱性受体(神经元，α-BGTX-不敏感性)；阿片剂受体(非-选择性阿片剂)；孤肽受体(ORL1)；苯环利定受体(PCP)；5-羟色胺受体(5-HT)；σ受体(σ非-选择性)；类固醇受体(糖皮质类固醇受体，GR)；和NE、DA和5-HT转运蛋白。
将结合所述受体的特异性配体定义为在有过量未标记的配体存在下测定的总结合与非特异性结合之差。在10μM下测试化合物109(SQ109)并且将结果表示为占控制特异性结合的百分比(表31)或表示为占在有SQ109存在下获得的控制特异性结合抑制(表32)的百分比。
简言之，可以对D1和D2S多巴胺受体观察到大于50％的抑制作用(51％和73％)。类似地，对黑皮质素MC4受体观察到了极为显著的抑制作用(90％)，已知它可发挥对食物摄取的显著影响。此外，对毒蕈碱性M受体观察到了极为显著的抑制作用(96％)。
观察到控制疼痛，免疫应答和功能并且与吗啡和海洛因作用相关的阿片剂受体显示出对控制特异性结合的58％的抑制。已经证实在抗抑郁作用中起重要作用的σ受体也表现出高度抑制(106％)。
去甲肾上腺素NE转运蛋白在抑郁症的病理生理学中起重要作用并且在抗抑郁药的作用机制中观察到了对控制特异性结合具有87％的抑制作用。观察到另一种转运蛋白，即与物质滥用和注意力不集中的过度反应症(ADHD)相关的多巴胺DA转运蛋白显示出63％的抑制作用。还观察到了涉及几种疾病状态病因学的5-羟色胺5-HT转运蛋白对控制特异性结合具有95％的抑制作用，其中所述的疾病状态包括，但不限于精神病，例如抑郁症、焦虑、精神分裂症、进食障碍疾患、偏头痛、强迫性精神失调和惊恐性障碍。尽管不希望受到如下理论约束，但是认为包含Ph-乙二胺组成部分的化合物，包括，但不限于化合物73也共有(分享)CNS活性。
实施例XXV 活性测试谱-需氧和厌氧菌 对有代表性的一组通常遇到的临床微生物，包括机会病原体、靶病原体和正常人菌群测试化合物109。通过对需氧和厌氧菌、真菌和分枝杆菌集合进行抗微生物敏感性测试评价化合物109的活性谱。使用合适的NCCLS(National Committee for Clinical LaboratoryStandards)推荐的标准方法和质量控制菌株建立所有生物体的MIC。
化合物109显示出对革兰氏阳性需氧菌的活性。特别地，化合物109(SQ-109)表现出对肺炎链球菌的最佳活性，其中MICs在4-8ug/ml。所有供试肠球菌(enterococci)种类的MICs在16-64ug/ml，而所有供试葡萄球菌(Staphylococci)的MICs在16-32ug/ml(图62，表33)。
化合物109显示出对革兰氏阴性需氧菌的活性。SQ-109表现出对所有供试肠杆菌科(enterobacteriaceae)有限的活性，其中MICs在32-＞64ug/ml，在非肠杆菌科中观察到稍低的MICs(16-＞64ug/ml)。供试流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)分离物的MICs在1-32ug/ml。SQ-109在对幽门螺杆菌测试时表现出最佳活性，其中所有三种供试菌株的MIC均为4ug/ml(图63A和图63B(表34))。
化合物109显示出对厌氧菌的活性。SQ-109对厌氧菌疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)和艰难梭菌(Clostridium difficile)的MICs在16-64ug/ml(参见图64，表35)。
实施例XXVI 活性测试谱-真菌 对有代表性的一组通常遇到的临床微生物，包括机会病原体、靶病原体和正常人菌群测试化合物109。通过进行推荐的肉汤微稀释法评价化合物109的活性谱。酵母NCCLS M27-A2，2003；和霉菌NCCLSM38-A，2003。
SQ-109对白色念珠菌表现出良好的活性，其中MICs在4-8ug/ml。另外，供试的三种烟曲霉(Aspergillus fumigatus)分离物的霉菌MICs均为16ug/ml(图65，表36)。
实施例XXVII 活性谱测试-分枝杆菌 对有代表性的一组通常遇到的临床微生物，包括机会病原体、靶病原体和正常人菌群测试化合物109。通过使用BACTEC 460TB系统(Becton Dickinson，Cockeysville，MD，USA)，按照制造商的说明完成化合物109的活性谱。使用为测试缓慢生长的分枝杆菌种类推荐的琼脂比例法测定MOTT的MICs，而使用推荐的肉汤微稀释法(NCCLSM24-A，2003)完成较为快速生长的分枝杆菌的MICs。
SQ-109在对结核分枝杆菌[MTB](0.25-0.5ug/ml)，牛分枝杆菌(0.25ug/ml)和牛分枝杆菌BCG(0.5ug/ml)测试时表现出极为良好的活性。在测试的抗性MTB株，SQ-109对INH-抗性MTB菌株具有的MIC为0.25ug/ml，且对EMB-抗性株的MIC为0.5ug/ml(表37)。
SQ-109对非TB的分枝杆菌(MOTT)表现出较低的活性，其中对三种供试海分枝杆菌菌株的MIC均为8ug/ml，对测试的三种堪萨斯分枝杆菌的MIC均为16ug/ml，且对检验的三种鸟分枝杆菌(M.avium)分离物(MAC)的MICs在8-32ug/ml(表38)。
SQ-109对较为快速生长的偶发分枝杆菌表现出良好的活性，其中对所有测试的菌株的MIC均为1ug/ml并且对龟分枝杆菌类(龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌(M.abscessus))中的更多抗性成员具有较低的活性，其中对三种供试菌株的MIC均为16ug/ml(图66，表39)。
实施例XXV-XXVII的结果显示了对MTB复合物(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG)、偶发分枝杆菌、海分枝杆菌、幽门螺杆菌、肺炎链球菌和白色念珠菌中的分枝杆菌属的几个种类表现出最佳抑制活性。还发现SQ-109对结核分枝杆菌的敏感性和抗性株具有等效活性。
实施例XXVII SQ109与第一线抗结核药在体外的协同相互作用 概述 本研究的目的在于测定SQ109与现存的抗结核药物在体外的相互作用并且评价其在改善联合用药对结核分枝杆菌的活性方面的潜能。
在体外使用BACTEC 460系统测试两种-药物组合在低于其最小抑制浓度(MIC)的不同浓度下对结核分枝杆菌的生长抑制作用。基于从使用单一抗生素或使用两种抗生素联合疗法处理的培养物的生长指数以数字方式衍生的商数值评估药物浓度。
SQ109在0.5其MIC下与0.5MIC异烟肼和低至0.1MIC利福平一起表现出抑制结核分枝杆菌生长的强协同作用活性。在SQ109与链霉素之间观察到加合的作用，但使用SQ109与乙胺丁醇或吡嗪酰胺的联合用药既无协同作用，又无加合的作用。使用利福平-抗性(RIFR)结核分枝杆菌菌株也证实了SQ109与利福平之间的协同作用，SQ109降低了利福平对这些药物抗性株的MIC。
SQ109以协同作用方式与异烟肼和利福平，即最重要的第一线TB药物中的两种发生相互作用。
材料和方法 抗微生物药异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇购自Sigma-Aldrich.St.Louis，MO。使用蒸馏水和去离子水制备10mg/mL的异烟肼、链霉素和乙胺丁醇的储备溶液10mg/mL，通过过滤灭菌并且冷冻储存在-80℃下。制备在甲醇中的1或10mg/mL利福平储备溶液并且储存在-80℃下。吡嗪酰胺作为重制药物试剂盒购自BectonDickinson，Cockeysville，MD并且按照制造商的说明书制备储备溶液。制备在甲醇中的SQ109的1mg/mL储备溶液并且储存在-80℃下。
结核分枝杆菌菌株 结核分枝杆菌菌株H37Rv为用于上述记录我们的文库中的化合物活性的研究中采用的相同菌株。在本研究中使用的单RIFR结核分枝杆菌菌株分离物获自Department of Health and Mental Hygiene，Central Laboratory，State of Maryland。在国家实验室预先测定菌株3185和2482的药物敏感性特征并且此后在Sequella证实。两种菌株对0.1mg/L异烟肼，2.5mg/L乙胺丁醇和2mg/L链霉素均有敏感性。利福平MIC对菌株3185而言为24mg/L且对菌株2482而言＞100mg/L。并未测定与利福平抗性相关的rpoB突变性质。
将补充了10％OADC(Difco)的Media Middlebrook 7H11琼脂(Difco，Becton Dickinson)用于使结核分枝杆菌生长为BACTEC接种物。将BACTEC 7H12B培养基(Becton Dickinson)用于所有药物组合实验，但除去吡嗪酰胺+SQ109在PZA Test Medium(BectonDickinson)中评价这种联合用药。
将药物对结核分枝杆菌生长BACTEC 460系统(Becton Dickinson)的作用的评价用于测定每种单个药物的MIC并且研究药物在体外对结核分枝杆菌生长的联合作用。使结核分枝杆菌H37Rv或RIFR结核分枝杆菌分离物生长在7H11琼脂平板上。通过将菌环量转入包含稀释流体和玻璃珠的加盖玻璃试管并且涡旋以破碎团块制备来自4-6周龄平板的细菌接种物。将在1McFarland Standard的不含团块的结核分枝杆菌悬浮液接种入包含不同组合的测试药物(SQ109、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素)的Middlebrook 7H12培养基。通过测定细菌在培养基中消耗14C标记的棕榈酸后释放的14CO2，每天监测表示为生长指数或GI的杆菌生长。为了测定吡嗪酰胺和SQ109的联合作用，我们使用专用的来自Becton Dickinson的吡嗪酰胺测试培养基。在每次实验中均包括无药物的对照组，包括未稀释和按照1∶100稀释的细菌接种物，以便监测细菌生长。当1∶100接种小瓶的GI值达到30或30以上时，衍生了所有测试小瓶的最新的GI与在先的读数之间的GI值的差ΔGI。将指定药物的MIC定义为最低浓度，此时，药物小瓶的ΔGI低于1∶100对照组的ΔGI。所有实验均在5-8天内完成。
数据分析使用上述技术9，基于GI值评价药物组合的作用。将协同作用定义为x/y＜1/z，其中x为含有药物组合的测试小瓶的GI，y为组合中单一药物的最低GI，且z为联用药物的数量。就两种药物组合而言，＜0.5的商数表示协同作用，商数为1表示无相互作用，商数＞2表示拮抗作用，而商数＜0.75且＞0.5表示加合作用。
结果 SQ109体外的抗微生物活性对实验室菌株H37Rv结核分枝杆菌我们预先通过微量-肉汤稀释测定SQ109MIC为0.2μM(0.11mg/L)或通过BACTEC测定为0.63μM(0.35mg/L)3。近来完成了对不超过30种结核分枝杆菌临床分离物(药物敏感性和药物抗性，包括EMBR菌株)的SQ109MIC测定，发现这些临床分离物的敏感性无法与H37Rv区分(MIC范围0.16-0.64mg/L)。SQ109的这些体外活性提示它对药物敏感性和药物抗性结核分枝杆菌，包括对母体药效团乙胺丁醇具有耐药性的菌株，具有等效活性。
SQ109与异烟肼，链霉素、乙胺丁醇，和吡嗪酰胺的相互作用 使用棋盘滴定，其中研究两种抗生素单独和组合方式的系列稀释液在所有可能的浓度下对细菌生长抑制的作用，可以以代数方式测定两种抗生素之间的相互作用。可以将两种组合方式的抗生素之间的相互作用描述为协同作用，加合作用，无作用或拮抗作用。为了将实验数据翻译成药物-药物相互作用的类型，将商数x/y(其中x为两种抗生素组合时获得的数据，而y为以相同浓度分别测试时具有两种活性剂的较低值的数据)。如果x/y值等于1，那么将其解释为组合中的药物之一无活性。如果对两种药物组合而言x/y小于0.5，那么其含义为两种药物在联用时比单独使用它们时更有效，从而提示了协同作用。如果x/y值落入0.5-0.75，那么在两种药物之间可能存在加合作用，从而提示了它们之间弱的强化作用。如果x/y值大于2，那么提示两种药物之间的相互拮抗作用。x/y之间的范围大于1且小于2为从无作用到拮抗作用之间的过渡区。通过应用公布的和另外验证的简单代数学，我们可以评价两种组合的药物在体外测定系统中可能的结果。
为了确定在未来人体功效试验中可能包括SQ109的最佳药物组合，我们分析了SQ109与目前用于治疗TB患者的抗生素之间的相互作用。每种药物的MIC为抑制99％细菌接种物生长的最低浓度，因此，显然必须在低于MIC水平的单个药物浓度下对所观察到的作用评价协同作用，加合作用或拮抗作用。表40(图67)对SQ109与异烟肼、链霉素乙胺丁醇和吡嗪酰胺的组合在低于其MIC值的药物浓度下列举了各单个药物的MIC以及商数值(参见数据分析，材料和方法中的定义)。将用于组合中的药物各自的浓度表示为MIC值的分数。该表仅包括观察到协同作用或加合作用时的组合。对未观察到作用的药物组合而言，仅列举出了获自具有在实验中测试的最高次佳剂量的组合的商数。SQ109在两种药物以0.5MIC使用时表现出与异烟肼的协同作用并且在与链霉素联用时表现出加合作用。SQ109与乙胺丁醇或吡嗪酰胺未表现出任何正向相互作用(加合或协同作用)，不过，与乙胺丁醇的组合处于加合作用的边缘。使用在本研究中测试的任意两种药物的组合均未观察到拮抗作用。
SQ109与利福平的相互作用 当SQ109与利福平联用时，我们观察到了两种药物之间显著的协同作用，正如平均商数值所示(表41，图67)。这种协同作用以两种方式起作用SQ109以协同作用方式增强利福平的活性，而利福平以协同作用方式增强SQ109的活性。SQ109在0.5MIC下表现出与低至0.1MIC浓度下的利福平的协同作用。在0.2MIC SQ109与0.5MIC利福平联用时也观察到了协同作用。有意义的是，与低于0.5MIC的两种药物浓度的组合(0.2MIC SQ109+0.25MIC利福平)表现出加合相互作用。
SQ109和利福平在RIFR结核分枝杆菌中的相互作用。为了检验SQ109与利福平之间的协同相互作用是否也有利于抑制药物抗性结核分枝杆菌菌株，我们评价了与RIFR结核分枝杆菌临床分离物的药物相互作用。利福平对RIFR结核分枝杆菌分离物3185和2482的MIC分别为24mg/L和＞100mg/L，远高于药物敏感性结核分枝杆菌H37Rv的平均MIC(0.17mg/L，表41图)。RIFR表型不会影响SQ109对这些菌株的MIC对两者的MIC均为0.32mg/L，与对RIFs结核分枝杆菌H37Rv测定的值相同。图68表示在有0.5MIC SQ109(a)或0.5MIC乙胺丁醇(b)存在下测试对利福平的敏感性时菌株3185的GI分布型。RIFR杆菌在0.6MIC利福平存在下生长充分(16mg/L，高于对结核分枝杆菌H37Rv测定的平均MIC 90-倍以上)。添加0.5MIC SQ109(0.16mg/L)到利福平-处理的RIFR细菌中抑制了99％以上的生长。利福平在有SQ109存在下对RIFR结核分枝杆菌生长的剂量依赖性抑制作用随利福平在测试小瓶中的浓度的降低而下降。利福平在16，12和8mg/L下的x/y商数分别为0.35，0.40和0.48，表示了SQ109与利福平之间的协同相互作用。在6和4mg/L利福平下观察到了加合的相互作用(x/y分别＝0.55和0.64)。这种协同作用在0.5MIC乙胺丁醇(不同的二胺抗生素)与利福平联用时未观察到(图68(b))。
使用不同的RIFR结核分枝杆菌菌株2482重复使用RIFR菌株3185的实验，其利福平抗性甚至更显著MIC＞100mg/L。正如图68中所示，细菌在有100mg/L利福平存在下适当生长。添加0.5MIC SQ109到该培养物中抑制了99％以上的生长。利福平在100，50，和25mg/L下的x/y商数分别为0.33，0.39和0.497，表示了SQ109与利福平之间的协同相互作用。在12.5和6.25mg/L利福平下观察到了加合相互作用(x/y分别＝0.62和0.71)。此外，在0.25MIC SQ109(0.08mg/L)和100mg/L利福平下也观察到了加合作用(x/y＝0.66)。此外，0.5MIC乙胺丁醇未表现出与利福平对菌株2482的任何加合或协同作用活性(数据未显示)。在这两种情况中，观察到SQ109与利福平之间的协同作用时的与MIC的浓度比，与对RIFs菌株获得的值相似，其含义是这种协同相互作用不依赖于药物的敏感性状态。这些结果强烈提示SQ109与利福平之间的协同作用对这种药物组合的特异性，并且增强的药物相互作用抑制了RIFs和RIFR菌株中的结核分枝杆菌功能。
讨论 多-药物疗法对治愈TB感染是必需的并且避免了耐药性细菌的出现。任何新的抗-TB药物候选物需要评价联合用药的相互作用以便优化单个药物的活性并且避免药物拮抗作用。在本研究中，我们报告了我们有关SQ109(新的二胺抗结核药候选物)与常用抗-TB药物在体外的相互作用的发现。我们使用生长抑制在这些研究中可以测定的可能的相互作用包括拮抗作用，协同作用，加合作用或完全无作用。我们未发现SQ109与5种在本研究中供试的第一线TB药物中任意种之间的拮抗相互作用。[SQ109+乙胺丁醇]或[SQ109+吡嗪酰胺]的联合用药未表现出相互作用，无论是正向作用还是反向作用，并且这些联合用药对结核分枝杆菌的作用与使用单一药物治疗获得的那些结果相差无几。未观察到SQ109与链霉素之间在某些浓度下的加合相互作用，也未观察到协同作用。相反，SQ109表现出与两种不同第一线药物的协同作用异烟肼和利福平。SQ109与利福平之间的协同相互作用特别有意义并且十分有效在各药物极的低浓度下0.1MIC利福平+0.5MIC SQ109获得的对结核分枝杆菌的抑制作用在99％以上。在本文中所述的体外协同作用结果与体内研究一致(Nikonenko，等，准备中)，所述的体内研究证实，在SQ109与利福平和异烟肼联用时在感染了结核分枝杆菌的实验动物中的药物协同作用。这些体内结果通过含SQ109的药物组合与含乙胺丁醇的类似组合的比较显示了增强的杀菌活性和较快的结核分枝杆菌消除作用。在这两种研究中提供的体外和体内数据共同可以指导我们获得用于治疗活动性TB疾病的未来SQ109临床试验中最有效的药物组合设计。
有意义的是，在本研究中的数据还证实SQ109完全对RIFR结核分枝杆菌临床分离物具有活性。这一结果与获自30种以上药物敏感性和药物抗性结核分枝杆菌的研究的近期结果一致，其中菌株具有相同的SQ109MIC(范围0.16-0.64mg/L)，从而提示对本化合物不存在耐受性。在对RIFR分离物测试时也观察到了SQ109与利福平之间的协同作用。在0.5MIC下，SQ109能够以剂量依赖性方式提高利福平对抗性生物体的活性。使用0.5MIC乙胺丁醇未观察到这一活性，从而提示了SQ109与利福平之间的特异性相互作用可能导致所述的观察结果。尽管这一观察结果不一定有直接的临床相关性，但是它指出了SQ109与其母体药效团乙胺丁醇之间的另外差异，并且可能为揭示出SQ109对结核分枝杆菌的作用的有意义的实验模型。
对利福平与SQ109对结核分枝杆菌的显著协同作用的确定解释尚未得到。据推定，尽管不希望受到下列理论约束，但是协同相互作用可能因药物作用中的差异所致。尽管SQ109的精确靶标未知，但是它确实影响分枝杆菌细胞壁合成。可能是SQ109对分枝杆菌细胞壁的作用导致渗透性增加所致，从而使得利福平更易于进入细菌。经证实细胞壁抑制剂(诸如乙胺丁醇)的次级抑制浓度提高了克拉霉素对结核分枝杆菌的杀菌活性，据推定是通过减少药物进入的渗透屏障所致。然而，细胞壁抑制剂乙胺丁醇在与利福平联用时在用于我们使用RIFsH37Rv或RIFR结核分枝杆菌临床分离物(图68)或其他药物敏感性菌株的实验时未表现出任何协同作用，从而恰好提示了对分枝杆菌细胞壁结构的任何作用不一定提供利福平与其他药物的协同相互作用。此外，已知利福平因其亲脂性而可快速透入分枝杆菌疏水性细胞壁。作为结果，SQ109对细胞壁渗透性的作用可能并非是在体外观察到的利福平与SQ109之间的协同作用的唯一贡献者。
还可能的情况是SQ109的目前未知的主要靶标在转录水平上受到紧密调节。利福平为DNA转录的抑制剂。由于不同基因的mRNA转录物在半衰期上有差异，所以抑制转录可能对那些具有半衰期短于那些具有长半衰期的转录物具有显著作用。因此，利福平甚至在次佳浓度下治疗也可以发挥出对短寿命mRNA靶标对SQ109活性的水平的显著作用。然而，这种推定与两种药物之间的协同作用不受结核分枝杆菌菌株RIFR表型影响这一观察结果不一致。这提示利福平的其他作用(并非其仅仅作为抗生素起作用)贡献了其与SQ109之间的协同相互作用。利福平抗生素活性可以确定为贡献因素，但可能并非决定与SQ109的有意义的相互作用的唯一因素，这一结果由有关RIFR菌株的MIC数据提示。当利福平的MIC在RIFR中比在RIFs菌株中变得更高时，显示与相同量的SQ109的协同作用的利福平浓度也较高，不过，以MIC的分数表示的联合用药在菌株研究之间类似。无论完整地评价利福平的作用，对SQ109活性的转录抑制需要鉴定SQ109靶标，这是我们实验室中正在进行的工作。
利福平对利福平与SQ109之间的药物协同相互作用的另一种可能的作用在于利福平作为细胞色素P450(CYP)有效诱导物的作用。CYP为涉及广泛NADPH/NADH-依赖性反应的含血红素的酶的超家族，并且它们在化合物，诸如固醇类、胆固醇类和脂肪酸类的生物合成以及异生素和活性物质解毒中起中心作用。利福平为人肝细胞以及外周血淋巴细胞中各种CYP的有效诱导物。
结核分枝杆菌完整基因组揭示了至少20种CYP，但这些基因的确切功能仍然需要阐明。类似于其哺乳动物负体(ounter part)，利福平诱导分枝杆菌CYP。Ramachandran和Gurumurthy测定了存在于提取自利福平-处理的耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌的细菌膜级分中的CYP活性。在两种情况中，在处理的级分中的CYP活性均比未处理的对照组升高并且CYP活性的提高具有统计学显著性。他们平行地发现异烟肼在其处理的级分中不会诱导CYP活性。利福平在结核分枝杆菌中诱导CYP的能力可以贡献其与SQ109之间的协同作用。在这种情况中，CYP实际上可以通过在结核分枝杆菌内产生SQ109氧化代谢物活化SQ109，而并非使活性化合物失活。
近期对SQ109代谢获得的数据显示SQ109在与人肝微粒体一起孵育后快速代谢仅8％SQ109在40分钟孵育后保留。分析通过微粒体作用产生的SQ109代谢物揭示出基于分子量的4种化学基团。这些基团中的两种包含氧化代谢物。此外，本研究发现SQ109被人CYP2D6和CYP2C19代谢成这些代谢物。基于SQ109被CYP快速代谢这一发现，可能的情况是其抗分枝杆菌活性可以来源于其代谢物之一。可以想像SQ109为前体药物并且需要通过结核分枝杆菌CYP活化。我们推测当SQ109与利福平联用时，后者诱导分枝杆菌内的某些CYP活性。升高的CYP活性更有效地活化了SQ109前体药物，从而产生了两种药物的明显的协同作用活性。实际上，使用SQ109+利福平的联合用药观察到的增强的活性可以更为有效，并且可能是SQ109活性代谢物的有效活性而非利福平自身的活性增强。
SQ109具有极窄的谱它对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG具有活性，但对耻垢分枝杆菌和鸟分枝杆菌的活性非常低(未公布数据)。通过比较存在于不同分枝杆菌基因组中的推定的CYP可读框，Kelly等证实存在几种唯一存在于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌中的CYP。这些CYP为可能导致结核分枝杆菌内SQ109转化成活性代谢物的作用物的强有力的候选物，并且它们为正在进行的研究中的受试者。
实施例XXIX 多药物研究 本实验研究动物模型化实验中的加强期疗法过程中异烟肼(INH)+利福平(RIF)+吡嗪酰胺(PZA)+SQ109(INH/RIF/PZA/SQ109)在消除肺中的结核分枝杆菌中与标准DOTS INH+RIF+PZA+乙胺丁醇(EMB)(INH/RIF/PZA/EMB)相比的功效(参见图70)。
优选的II期研究为前瞻性的，多中心，双盲，随机化，安慰剂对照的SQ109临床研究，将其设计为 ■在达0-50mg/天(TBD)SQ109与INH/RIF/PZA的两个(2)月口服给药过程中确定SQ109在具有阳性痰培养物的男性和女性结核病志愿者患者中的安全性和耐受性(主要目的)； ■评价SQ109在截止到2个月或2个月内将患者转化成痰培养物阴性的最低剂量(主要目的)。
进行动物(小鼠)实验以便增加SQ109剂量，同时保持INH/RIF/PZA在标准DOTS剂量下以便模拟本研究的设计并且预期可能的人体剂量。
还进行了预先的INH，RIF&PZA药物相互作用研究，包括小鼠中的ADME和体外药物相互作用(微粒体)。
交替多剂量(5天)EBA研究 交替II期多剂量研究为Dennis Mitchison为新TB药物研发提出并且由Stephen Gillespie(London)进行的‘早期杀菌试验(EarlyBactericidal Assay)(EBA)’研究，并且在这些研究中，将抗生素单一疗法进行短期时间，同时监测痰中的细菌数量。这些研究能够测定单一抗生素减少痰中的细菌的最低有效剂量并且可以扩展SQ109的安全性；然而，这些研究不能为联合疗法提供有效数据。就可预测的未来而言，预计用至少具有不同作用方式的3种药物治疗结核病。
交替多剂量(5天)EBA研究可以随机化的开放式的SQ109临床研究，设计它是为了基于SQ109的EBA测定SQ109在具有肺结核的患者中的临床功效，并且进一步评价其安全性。EBA研究提供了评价潜在活性剂在研究药物单一疗法的短期中治疗结核病中的临床功效的快速和经济的方式(3-14天，通常为5天)。
对约100位患者(参见下文的标准)每天口服给予一次SQ109(n＝40)或6-mg/kg INH(n＝10)，持续5天。在研究期后跟随的是6个月的标准治疗方案。基于其他研究确定用于本研究的SQ109剂量，诸如可以采用的具有良好PK参数且无有害副作用的最高药物用量，还考虑到了使用实验室动物的功效研究中获得的治疗剂量(30mg/m2)。
登记包括的标准 年龄在18-60岁的成年男性或女性。
新近诊断的肺结核初步发作。
胸部X-光片和临床发现与结核一致。
痰涂片阳性患者适合于登记。结核的诊断还必须得到培养物的证实。随后将发现AFB涂片阳性患者不具有TB(即那些无结核分支杆菌疾病的患者)和那些无培养物证实的患者从本研究中排除。
登记排除标准 妊娠或人乳喂养 HIV-感染 在先结核病史或在先结核治疗史 最初胸部X-光片上有结核空洞(取进入研究14天内) 接触具有已知药物抗性结核的人 具有药物抗性结核的患者(耐受INH，RIF，PZA或EMB) 接受长期类固醇或其他免疫抑制药的患者 肺外结核 在治疗前2天(基线)和研究2和5天后采集痰和血。同时评价血液和生物化学参数。如所述的测定CFU计数/毫升(Jindani A，Dor éCJ，Mitchison DA，American Journal of Respiratory和CriticalCare Medicine 2003 Vol 167.pp.1348-1354)。根据公式对每位患者计算EBA(log CFU/ml第0天-log CFU/ml第5天)/5并且报告为平均值±标准偏差(SD)。正如几位作者推荐的，我们将EBA定义为前5天治疗过程中每天中log10CFU/毫升痰的下降。
实施例XXX SQ109与INH，SM，EMB和PZA在体外的相互作用 为了确定包括用于未来人体功效试验中的SQ109的最佳药物组合，我们分析了SQ109与目前用于治疗TB患者的抗生素之间的相互作用。每种药物的MIC为杀伤或抑制99％细菌接种物生长的最低浓度。显然必须在低于观察到作用的MIC水平的各药物浓度下评价联合用药的协同作用，加合作用或拮抗作用。表41中列举了每种单个药物的MIC以及SQ109与在低于其MIC值的药物浓度下的INH，STR，EMB和PZA的联合用药的商数值。将用于联合用药的药物各自的浓度表示为MIC值的分数。一般而言，在联合用药的商数值不超过0.5时观察到协同作用，在该商数值在0.5-0.75范围内观察到加合作用。

表41.在与INH，SM，EMB或PZA MIC的两种药物组合中测试的SQ109的协同作用商数INH0.05μg/ml，SM0.25μg/ml，EMB1.25μg/ml，PZA100μg/ml，SQ1090.32μg/ml或0.64μg/ml。
可以将这种协同作用实验的结果概括如下 ●SQ109与INH在两种药物以1/2 MIC使用时表现出体外协同作用。
●SQ109与EMB无相互作用并且与SM仅有加合相互作用。
●SQ109在所有浓度下与1/2 MIC RIF均表现出显著协同作用并且在1/2 MIC SQ109下具有较低浓度的RIF。
●SQ109与测试的4种药物中的任意种在所有剂量组合下均无拮抗相互作用。
当SQ109与RIF联用时，我们观察到两种药物之间的显著协同作用，正如根据平均商数值表示的(表41和图71)。
实施例XXXI SQ109和RIF在RIFR结核分枝杆菌中的相互作用 为了检验SQ109与RIF之间的协同相互作用是否也有利于杀伤药物抗性结核分枝杆菌菌株，我们评价了药物与RIFR结核分枝杆菌临床分离物的药物相互作用。对RIFR结核分枝杆菌分离物3185和2482的RIF MIC分别为24μg/ml和＞100μg/ml，远高于药物敏感性结核分枝杆菌H37Rv的平均MIC(0.17μg/ml)。RIFR表型不会影响SQ109对这些菌株的MIC对两种菌株的MIC均为0.32μg/ml，该值与对RIFs结核分枝杆菌H37Rv测定的结果相同。我们已经发现(图72)对两种菌株而言，观察到SQ109与RIF之间协同作用时的浓度与MIC比与对RIFs菌株获得的那些结果类似，其含义是这种协同相互作用不依赖于药物敏感性状态。这些结果强烈提示SQ109与RIF之间的协同作用对这种药物组合而言为特异性的并且增强的相互作用可以杀伤RIFs和RIFR菌株中的结核分枝杆菌功能。在0.5MIC EMB与RIF联用时未观察到协同作用。
图72提供了用RIF和SQ109处理的RIFR结核分枝杆菌分离物2482的生长分布型。使用BACTEC 460进行本实验。RIF和SQ109在菌株2482中的MIC分别为＞100μg/ml和0.32μg/ml。
联合疗法；在小鼠中的研究 我们已经进行了体内研究，其中测试了SQ109在与其他抗-TB药物联用时的功效利福平，异烟肼，乙胺丁醇，吡嗪酰胺，莫西沙星。首先，在快速小鼠模型(由Sequella科学家Dr.Boris Nikonenko研发)中研究联合用药的有效性，该模型能够基于防止感染动物体重减轻的能力，快速和以足够的精确度预测药物功效，所述的体重减轻为TB严重性的体征之一。
简言之，给小鼠iv接种106CFU烈性结核分枝杆菌H37Rv以便发生快速和进行性的TB病。在接种后7天开始化疗并且持续10天。将实验单一药物(SQ109，Rif，INH，EMB，PZA和Moxi)治疗的小鼠以及未感染的动物和感染的未治疗的安慰剂治疗的动物用作对照组。在该模型中，所有标准药物均以低于其最有效的剂量实验以便观察效果(当以其治疗剂量使用时，药物治疗的小鼠未发生体重减轻)以2mg/kg研究Rif，以1mg/kg研究INH，以10mg/kg研究EMB，以10mg/kg研究Moxi，以50mg/kg研究PZA。从0时开始监测所有组中小鼠的体重。截止到第10天时，感染的安慰剂对照组小鼠开始发生体重减轻；截止到第20天时，该组中的小鼠的体重减少了25％以上。
第21天的结果(图73)表明SQ109与利福平和INH联用可增强活性。SQ109-Rif联合用药完全防止了化疗期过程中的体重减轻。此外，SQ109-Rif联合用药显著延长了化疗窗后的治疗效果，图73。在SQ109-乙胺丁醇联合用药中未观察到效果，对SQ109-PZA而言获得的适度改善可以归因于单独的SQ109功效。对SQ109-Moxi联合用药证实了拮抗作用，这一结果与在体外获得的结果相反。在Rif-EMB联合用药中未观察到改善。图73提供了第21天的快速模型联合疗法研究。使C3H雌性小鼠i.v.感染106CFU预先传播给小鼠的结核分枝杆菌H37Rv(Pasteur)。在接种后7天，开始使用抗-TB药物化疗并且持续至第21天。
实施例XXXII 作为联合用药供试的Sequella的药物候选物SQ109，SQ609和SQ73的体内功效 作为我们尝试研发用于结核治疗的新方案的组成部分，我们在慢性TB感染小鼠模型中研究了SQ109(10mg/kg)与Sequella的潜在药物候选物-二哌啶SQ609(10mg/kg)和1，2-乙二胺SQ73(5mg/kg)的联合用药，图75。
以下列剂量使用所述的化合物SQ109，10mg/kg；SQ609，10mg/kg，SQ73，5mg/kg；总每日剂量之和25mg/kg。将该药物组合的活性与在本研究中以25mg/kg用作对照组的最有效的抗-TB药物之一异烟肼(INH)的功效进行比较。
使小鼠感染低剂量的结核分枝杆菌H37Rv并且在感染后4周开始化疗并且持续2周。
在本研究中，SQ609-SQ109-SQ73联合用药表现出与INH在其最有效剂量下类似的活性。
图75提供了慢性TB研究结果。给C57BL/6雌性小鼠i.v.接种104CFU结核分枝杆菌H37Rv。在感染后4周开始化疗并且持续2周。对一组小鼠(6只小鼠/组)测试每种对照组药物和所述的联合用药。治疗2周后，处死小鼠；将在含有0.05％Tween-80的无菌的2ml PBS中的肺匀化物以10-倍连续稀释液铺平板于7H10琼脂平皿上并且在37℃下孵育。在生长3周后计算CFU。以25mg/kg使用INH，以10和25mg/kg使用SQ109，以10mg/kg使用SQ609；联合用药(图上的“总和”)以10mg/kg使用SQ109，以10mg/kg使用SQ609，以5mg/kg使用SQ73。使用ANOVA检验进行统计学分析通过学生T-检验评估任何差异的显著性并且将p＜0.05视为具有统计学显著性。
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权利要求
1.组合物，包含下式的取代的乙二胺化合物
其中R4选自H、烷基、芳基、杂原子取代的烷基与芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳炔基、环烷基、环烯基；
且其中R1、R2和R3独立地选自H、烷基、芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基、环烯基、杂烷基、杂芳基、卤化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基；或者
其中R1选自H、烷基、芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基、环烯基、杂烷基、杂芳基、卤化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基，且NR2R3是从环状仲胺衍生的，
该组合物进一步包含抗微生物药、抗菌药、抗真菌药、抗寄生物药、抗病毒药。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述的抗菌药包括抗结核药。
3.权利要求3所述的组合物，其中所述的抗结核药包括利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇。
4.权利要求1所述的组合物，其中取代的乙二胺的NHR1或NR2R3具有如下化学结构
5.权利要求4所述的组合物，其中取代的乙二胺化合物选自
6.权利要求1所述的组合物，其中取代的乙二胺的NHR1或NR2R3具有如下化学结构
7.权利要求6所述的组合物，其中取代的乙二胺化合物选自
8.权利要求1所述的组合物，其中取代的乙二胺的NHR1或NR2R3具有如下化学结构
9.权利要求8所述的组合物，其中取代的乙二胺化合物选自
10.权利要求1所述的组合物，其中取代的乙二胺的NHR1或NR2R3具有如下化学结构
11.权利要求10所述的组合物，其中取代的乙二胺化合物选自
12.权利要求11所述的组合物，其中取代的乙二胺化合物为
13.权利要求1所述的组合物，其中取代的乙二胺化合物选自
14.制备下式的取代的乙二胺化合物的方法
其中R4选自H、烷基、芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳炔基、环烷基、环烯基；
且其中R1、R2和R3独立地选自H、烷基、芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基、环烯基、杂烷基、杂芳基、卤化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基；或
其中R1选自H、烷基、芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基、环烯基、杂烷基、杂芳基、卤化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基，且NR2R2是从环状仲胺衍生的；
该方法包括将含有羟基的固相支持体树脂在碱的存在下用供卤试剂活化，生成含有卤代基团的固相支持体树脂；
将卤代基团用最初的伯胺置换，生成含有胺基团的固相支持体树脂；
将胺基团在碱性化合物的存在下用卤代酰卤酰化，或者在碱的存在下用卤代酰基酸酰化，生成含有α-卤代乙酰基酰胺基团的固相支持体树脂；
将α-卤代乙酰基酰胺类的α-卤代基团用仲胺或随后的伯胺置换，生成含有α-胺酰亚胺基团的固相支持体树脂；
将α-胺酰亚胺基团上的羰基部分用还原剂还原，生成含有被两个碳原子隔开的两个胺基团的固相支持体树脂；
在酸的存在下从固相支持体树脂上裂解被两个碳原子隔开的胺基团，生成取代的乙二胺化合物。
15.权利要求12所述的方法，其中最初的伯胺为R1NH2。
16.权利要求12所述的方法，其中仲或随后的伯胺为R2R3HN。
17.治疗由传染原所致疾病的方法，包括给予有效量的包含下式的取代的乙二胺化合物的组合物
其中R4选自H、烷基、芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳炔基、环烷基、环烯基；
且其中R1、R2和R3独立地选自H、烷基、芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基、环烯基、杂烷基、杂芳基、卤化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基；或
其中R1选自H、烷基、芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基、环烯基、杂烷基、杂芳基、卤化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基，且NR2R2是从环状仲胺衍生的；
该组合物进一步包含抗微生物药、抗菌药、抗真菌药、抗寄生物药、抗病毒药。
18.权利要求17所述的组合物，其中所述的抗菌药为抗结核药。
19.权利要求17所述的组合物，其中所述的抗结核药包括利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇。
20.权利要求17所述的方法，其中所述的传染原包括细菌、真菌、寄生物或病毒病原体。
21.权利要求20所述的方法，其中所述的细菌病原体包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、细胞内鸟分枝杆菌(M.avium-intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansarii)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、鸟副结核分枝杆菌(M.avium paratuberculosis)、细胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、蟾分枝杆菌(M.xenopi)、海分枝杆菌(M.marinum)或溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)。
22.权利要求17所述的方法，其中所述的疾病包括结核或克罗恩病。
23.权利要求17所述的方法，其中取代的乙二胺化合物为
24.权利要求23所述的方法，进一步包含药用载体。
25.组合物，包含取代的乙二胺化合物，该化合物包括
26.制备下式的取代的乙二胺化合物的方法
其中R4选自H、烷基、芳基、杂原子取代的烷基和芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳炔基、环烷基、环烯基；
且其中R1、R2和R3独立地选自H、烷基、芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基、环烯基、杂烷基、杂芳基、卤化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基；
该方法包括将含有羟基的固相支持体树脂在碱的存在下用供卤试剂活化，生成含有卤代基团的固相支持体树脂；
将卤代基团用最初的伯胺置换，生成含有胺基团的固相支持体树脂；
将胺基团在偶联试剂和碱的存在下用FMOC保护的氨基酸酰化，继之以除去FMOC保护基团，生成含有α-氨基乙酰胺基团的固相支持体树脂；
将α-氨基乙酰胺基团的α-氨基用羰基化合物修饰，生成含有对应的α-氨基乙酰胺基团衍生物的固相支持体树脂；
将酰胺基团上的羰基部分用还原剂还原，生成含有被两个碳原子隔开的两个胺基团的固相支持体树脂；并且
在酸的存在下从固相支持体树脂上裂解被两个碳原子隔开的胺基团，生成取代的乙二胺化合物。
27.治疗传染病的方法，包括给予药学上有效量的权利要求25中所述的组合物。
28.组合物，包含下式对称取代的乙二胺化合物
其中R4选自H、烷基、芳基、杂原子取代的烷基和芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳炔基、环烷基、环烯基；
且其中R1、R2和R3独立地选自H、烷基、芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基、环烯基、杂烷基、杂芳基、卤化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基；或
其中R1选自H、烷基、芳基、链烯基、炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、环烷基、环烯基、杂烷基、杂芳基、卤化物、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、甲硅烷基、甲硅烷氧基、氨基，且NR2R2是从环状仲胺衍生的；
该组合物进一步包含抗微生物药、抗菌药、抗真菌药、抗寄生物药或抗病毒药。
29.权利要求28所述的组合物，其中所述的抗菌药包括抗结核药。
30.权利要求29所述的组合物，其中所述的抗结核药包括利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、莫西沙星和乙胺丁醇。
全文摘要
用于治疗由传染原导致的疾病，特别是结核的方法和组合物。特别地，提供了用于治疗传染性疾病的方法和包含取代的乙二胺类的组合物。在一个实施方案中，这些方法和组合物用于治疗分枝杆菌感染，包括，但不限于结核。在某些实施方案中，本发明包括组合物，这些组合物包含新颖的取代的乙二胺化合物，进一步包含抗结核药，诸如利福平、异烟肼、吡嗪酰胺和乙胺丁醇。
文档编号C07C211/00GK101636376SQ200680031468
公开日2010年1月27日 申请日期2006年7月3日 优先权日2005年7月1日
发明者M·N·普罗托波波娃, L·恩克, B·尼克南科, P·陈 申请人:赛奎拉公司