专利名称：蛋白质药物中内毒素的一步去除方法
技术领域：
本发明属于医药制备领域中的蛋白质纯化技术，尤其涉及蛋白质药物中内毒素的一步去 除方法。
背景技术：
细菌毒素一般可分为两类， 一类为外毒素(Exotoxin),它是一种毒性蛋白质，是细菌 在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质；另一类为内毒素(Endotoxin),是革兰氏阴性菌细 胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物。
细菌内毒素在细菌生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞上 时，才表现出其毒性，其化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒 杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等)及其它微生物(如衣原体、立克次氏体、螺旋体等)的细胞 壁层的脂多糖中，主要是由0-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。
含内毒素或被内毒素污染的制剂进入人体循环系统能引起多种变态反应。如高烧、寒战、 甚至体克。因此药典对直接进入血液的产品中内毒素的含量作了严格的限定。
随着生物技术的发展，越来越多的重组蛋白质药物被开发利用，由于大多数重组蛋白质 药物由革兰氏阴性菌如大肠杆菌表达，在纯化蛋白之前必须先将菌种破壁，以释放蛋白，细 胞壁内的脂多糖也大量释放到缓冲液中，易造成内毒素的污染。同时在生产过程中因原辅材 料，生产环境以及个人操作等因素也会造成内毒素污染。
由于内毒素的性质极不均一 (结构上类似表面活性剂，分子量从几千至数千万不等)， 在高温、强酸、强碱下都颇稳定，传统的各种柱层析方法只能去除或灭活部分内毒素，但难 以将内毒素一次性去除。并且各种重组蛋白的纯化分离步骤各不相同，对内毒素含量的要求 也有差异，所以很难找到一种通用的去除内毒素的方法。
在生物制药行业通常采用以下方法进行内毒素的去除,但这些方法都存在着一定缺陷
1、 阴离子交换层析能够从DNA和碱性蛋白中去除内毒素，但是由于内毒素的不均一 性，如高分子量，结构近似脂膜或脂囊的内毒素，电荷不暴露在外，则无法与阴离子交换层 析介质结合。
2、 亲和层析特别是免疫吸附剂在亲和层析中的运用，使得生物大分子的纯化变得简 单，但缺点是费用昂贵。
3、 凝胶过滤层析利用分子筛可以有效去除内毒素，但其处理量小，处理时间较长。
4、 反相层析反相层析介质可吸附内毒素的类脂A区。但反相层析所用的有机试剂，
可能影响到蛋白质的活性，所以不常被用于下游纯化。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种简单高效、符合大生产要求的 一步去除蛋白质药物中内毒素的方法，该方法既能保证蛋白质药物中内毒素浓度达到药典的 规定，又能高效的回收蛋白质药物。
本发明方法是利用内毒素的等电点通常比较低，在PH〉2时带负电荷，不结合阳离子 交换层析介质的原理来设计的。利用阳离子交换层析，通过调整平衡缓冲液和洗脱缓冲液的条件，使蛋白质药物结合在层析介质上,而内毒素大部分得到洗脱。待内毒素被充分洗脱后， 使用高盐、高pH的缓冲液或蛋白质药物原来的纯化洗脱条件洗脱回收蛋白质药物。
本发明所述蛋白质药物中内毒素的一步去除方法，步骤如下
(1) 用浓度为5mmol/L-100mmol/L、 pH值为4. 0-7. 0的平衡缓冲液对阳离子层析柱进 行平衡，至基线；
(2) 取蛋白质药物的原液上样后，再用该平衡缓冲液平衡，至基线；
(3) 用浓度为10mmol/L-100mmol/L、 pH值为5. 0-9. 0的洗脱缓冲液对上样后的阳离子 交换层析柱洗脱8-9个柱体积，至内毒素被充分洗脱；
(4) 用含有0.3mol/L-0.5mol/L盐的、pH为5. 0-9. 0的洗脱缓冲液或蛋白质药物原纯 化步骤的洗脱缓冲液对步骤(3)洗脱后的阳离子交换层析柱进行洗脱，至蛋白质药物被充 分洗脱，收集洗脱峰，得蛋白质药物的原液。
上述步骤(1)或(2)所述平衡缓冲液可根据蛋白质药物的不同进行选择，常用的是乙 酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，浓度优选 10mraol/L-70mraol/L、 pH值优选4. 0-6. 0。
其中所述平衡缓冲液进一步优选乙酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，浓度进一步优选为 20mmol/L-50mmol/L、 pH值进一步优选为4. 0-5. 0。
上述蛋白质药物中内毒素的一步去除方法中，所述阳离子交换层析柱的层析介质是琼脂 糖凝胶(S印harose)类或聚苯乙烯(Source)类；配基是羧甲基(CM)、磺丙基(SP)或磺 甲基(S)。
所述阳离子交换层析柱的层析介质进一步优选是SP S印harose F. F， SP S印harose H. P， SP S印harose B. B， CM S印harose F. F， CM S印harose CL-6B， S0URCE30-S之一。 其中，所述阳离子交换层析柱的层析介质最优选是SP S印harose F.F层析介质。 上述步骤(3)所述洗脱缓冲液可根据蛋白质药物的不同进行选择，常用的洗脱缓冲液 是乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，浓度优选为20mmol/L-70mmol/L， pH 值优选为5. 2-8. 0。
其中所述洗脱缓冲液进一步优选乙酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，浓度进一步优选为 30mmol/L-50誦ol/L， pH值进一步优选为5. 5-7. 5。
利用本发明方法，在步骤(3)所述的洗脱缓冲:液的作用下，内毒素和蛋白质药物由于 等电点的不同而得到充分分离，方法简单，内毒素^除完全，目的蛋白丢失率低。步骤(4) 中根据蛋白质药物的不同，选择适当的洗脱缓冲液实现了回收蛋白质药物的目的。蛋白质药 物经过步骤(4)的处理后，得到的蛋白质药物回收率可高达90%以上，回收的蛋白质药物 的原液中内毒素的浓度降低到< 10EU/ml，达到药典规定(< 10EU/ml)的生产要求；且一次 性处理量大，可用于任何重组蛋白质药物的生产过程，为蛋白质药物的大规模生产提供了技
术基础o *
现有技术中蛋白回收率一般在70%-90%之间，本发明的蛋白回收率高达90%以上。本发 明内毒素实际上可以完全去除，而现有技术内毒素去除率一般在50°/。-90%之间。因此与现有 技术相比，本发明的优良效果是本发明工艺设计合理，工艺过程简单，易于控制，便于操 作；蛋白质药物的回收率高， 一次性处理蛋白量大，工艺稳定性强，适合大规模工业化生产。
具体实施方式
以下通过实施例对说明本发明进一步阐述，这些实施例不应作为本发明的限制。 实施例l:聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子(PEG—rhG-CSF)原液内毒素的去除试验
1、 用pH4. 0，浓度为10腿ol/L乙酸-乙酸钠缓冲液对琼脂糖凝胶(SP S印harose F. F)
阳离子层析柱进行平衡，至基线；
2、 取PEG-rhG-CSF原液(浓度>3mg/ml，缓冲体系10mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液， pH4.0)用步骤(1)所述的平衡缓冲液稀释3-5倍后上样，再用该平衡缓冲液平衡至基线；
3、 用pH5.2，浓度为lOmmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液对上样后的阳离子层析柱进行洗脱 8-9个柱体积，使内毒素被充分洗脱；
4、 用含有0.5mol/L NaCl的pH为5.0、浓度为10誦ol/L乙酸-乙酸钠缓冲液洗脱阳 离子层析柱，收集洗脱峰，回收PEG-rhG-CSF原液。
回收后的PEG-rhG-CSF原液中内毒素的浓度由> 10EU/3mg降至< 10EU/6mg，达到了 PEG-rhG-CSF原液的内毒素控制标准，PEG-rhG-CSF原液的回收率> 90%。 实施例2:聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子(PEG—rhG-CSF)原液内毒素的去除试验
1、 用pH5.0，浓度为1O國ol/L乙酸-乙酸钠缓冲液对琼脂糖凝胶(CMS印harose F.F)
阳离子层析柱进行平衡，至基线；
2、 取PEG-rhG-CSF原液(浓度〉3mg/ml，缓冲体系10mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液， PH4. 0)用步骤(1)所述的平衡缓冲液稀释3-5倍后上样，再用该l平衡缓冲液平衡至基线；
3、 用pH5.4，浓度为1Ommol/L乙酸-乙酸钠缓冲液对上样后的阳离子层析柱进行洗脱 8-9个柱体积，使内毒素被充分洗脱；
4、 用含有0. 5mol/L NaCl的pH为5. 0、浓度为1Ommol/L乙酸-乙酸钠缓冲液洗脱阳 离子层析柱，收集洗脱峰，回收PEG-rhG-CSF原液。
回收后的PEG-rhG-CSF原液中内毒素的浓度由> 10EU/3mg降至< 10EU/6mg，达到了 PEG-rhG-CSF原液的内毒素控制标准，PEG-rhG-CSF原液的回收率> 90%。 实施例3:重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)原液内毒素的去除试验
1、 用pH4. 0，浓度为50mmol/L Na2HP04- NaH2P04缓冲液对琼脂糖凝胶(CM S印harose F. F)
阳离子层析柱进行平衡，至基线；
2、 取rhG-CSF原液(缓冲体系:50mmol/L Na2HP04-NaH2P04缓冲液，pH5.0)上样，再
用步骤(1)所述的平衡缓冲液平衡至基线；
3、 用pH5. 5,浓度为50mmol/L Na2HP04- NaH2P04缓冲液对上样后的阳离子层析柱进行洗 脱8-9个柱体积，使内毒素被充分洗脱；
4、 用pH6. 86，浓度为50mmol/L Na2HP04- NaH2P04缓冲液洗脱，收集洗脱峰，回收rhG-CSF原液。
回收后的rhG-CSF原液中内毒素的浓度由> 10EU/300u g降至< 10EU/6mg，且rhG-CSF 原液的回收率>90%。
实施例4:重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)原液内毒素的去除试验
1、 用pH4.0，浓度为lOOmmol/L Na2HP04-柠檬酸缓冲液对琼脂糖凝胶(CM S印harose CL.6B)阳离子层析柱进行平衡，至基线；
2、 取rhG-CSF原液(缓冲体系50mraol/L Na2HP04-NaH2P(X缓冲液，pH4. 0)上样，再 用步骤(1)所述的平衡缓冲液平衡至基线；3、 用pH5.2，浓度为100mmol/L船2冊04-柠檬酸缓冲液对上样后的阳离子层析柱进行 洗脱8-9个柱体积，使内毒素被充分洗脱；
4、 用pH6. 86，浓度为50mmol/LNa2HP04-NaH2P04缓冲液洗脱，收集洗脱峰，回收rhG-CSF 原液。
回收后的rhG-CSF原液中内毒素的浓度由> 10EU/300n g降至< 10EU/6mg，且rhG-CSF 原液的回收率>90%。
实施例5:重组人白介素-11 (rhIL-11)原液内毒素的去除试验
1、 用pH7. 0，浓度为lOmmol/L Na2HP04- NaH2P04缓冲液对琼脂糖凝胶(SP S印harose B. B)
阳离子层析柱进行平衡，至基线；
2、 取rhIL-ll原液(缓冲体系10mmol/L Na2HP04- NaH2P(X缓冲液，pH7. 0)上样，再 用步骤(1)所述的平衡缓冲液平衡至基线；
3、 用pH9.0，浓度为lOmmol/L Na2HP04- NaH2P04缓冲液对上样后的阳离子层析柱洗脱 8-9个柱体积，使内毒素被充分洗脱；
4、 用含有0. 3mol/L NaCl的pH为7. 0、浓度为lOmmol/L Na2HP04-NaH2P04缓冲液洗脱， 收集洗脱峰，回收rhlL-ll原液。
回收后的rhIL-11原液中内毒素的浓度由> 10EU/1.5mg降至< 10EU/6mg， rhIL-ll原 液的回收率>90%。
实施例6:重组人白介素-11 (rhIL-11)原液内毒素的去除试验
1、 用pH7.0，浓度为20腿ol/L Tris-HCl缓冲液对聚苯乙烯(S0URCE30-S)阳离子层 析柱进行平衡，至基线；
2、 取rhlL-ll原液(缓冲体系:lOmraol/L Na2HP04- NaH2P04缓冲液，pH7. 0)上样，再 用步骤(1)所述的平衡缓冲液平衡至基线；
3、 用PH9.0，浓度为20mraol/L Tris-HCl缓冲液对上样后的阳离子层析柱洗脱8-9个
柱体积，使内毒素被充分洗脱；
4、 用含有0. 3mol/L NaCl的pH为7. 0、浓度为10,1/L ^2朋04-化仏 04缓冲液洗脱， 收集洗脱峰，回收rhIL-ll原液。
回收后的rhIL-11原液中内毒素的浓度由> 10EU/1.5rag降至< 10EU/6mg， rhIL-11原 液的回收率>90%。
实施例7:重组人干细胞因子(rhSCF)原液内毒素的去除试验
1、 用pH4. 0，浓度为20mmol/L Na2HP04-NaH2P04缓冲液对琼脂糖凝胶(SP S印harose H. P)
阳离子层析柱进行平衡，至基线；
2、 取rhIL-ll原液(缓冲体系20mmol/L Na2HP04- NaH2P04缓冲液，pH4. 0)上样，再
用步骤(1)所述的平衡缓冲液平衡至基线；
3、 用pH5.6，浓度为20mmol/L Na2HP04- NaH2P04缓冲液对上样后的阳离子层析柱洗脱 8-9个柱体积，使内毒素被充分洗脱；
4、 用pH为7. 0、浓度为20mmol/L Na2HP04-NaH2P04缓冲液洗脱，收集洗脱峰，回收rhSCF 原液。
回收后的rhSCF原液中内毒素的浓度由> 10EU/600p g降至< 10EU/6mg, rhSCF原液的 回收率>90%。
权利要求
1、蛋白质药物中内毒素的一步去除方法，步骤如下(1)用浓度为5mmol/L-100mmol/L、pH值为4.0-7.0的平衡缓冲液对阳离子层析柱进行平衡，至基线；(2)取蛋白质药物的原液上样后，再用步骤(1)所述的平衡缓冲液平衡，至基线；(3)用浓度为10mmol/L-100mmol/L、pH值为5.0-9.0的洗脱缓冲液对上样后的阳离子交换层析柱洗脱8-9个柱体积，至内毒素被充分洗脱；(4)用含有0.3mol/L-0.5mol/L盐的、pH为5.0-9.0的洗脱缓冲液或蛋白质药物原纯化步骤的洗脱缓冲液对步骤(3)洗脱后的阳离子交换层析柱进行洗脱，至蛋白质药物被充分洗脱，收集洗脱峰，得蛋白质药物的原液。
2、 根据权利要求1所述蛋白质药物中内毒素的一步去除方法，其特征在于步骤(1) 或(2)所述平衡缓冲液是乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或柠檬酸盐缓 冲液，浓度为10mmol/L-70mmol/L、 pH值为4. 0-6. 0。
3、 根据权利要求2所述蛋白质药物中内毒素的一步去除方法，其特征在于步骤(l) 或(2)所述平衡缓冲液是乙酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，浓度为20mmol/L-50mmol/L、 pH值为4. 0-5.0。
4、 根据权利要求l所述蛋白质药物中内毒素的一步去除方法，其特征在于所述阳 离子交换层析柱的层析介质是琼脂糖凝胶类或聚苯乙烯类；配基是羧甲基、磺丙基或磺甲 基。
5、 根据权利要求4所述蛋白质药物中内毒素的一步去除方法，其特征在于所述阳 离子交换层析柱的层析介质是SP S印harose F. F， SP S印harose H. P， SP S印harose B. B， CM S印harose F. F， CM S印harose CL-6B, S0URCE30-S之一。
6、 根据权利要求5所述蛋白质药物中内毒素的一步去除方法，其特征在于所述阳 离子交换层析柱的层析介质是SP S印harose F.F层析介质。
7、 根据权利要求1所述蛋白质药物中内毒素的一步去除方法，其特征在于步骤(3) 所述洗脱缓冲液是乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，浓度为 20mmol/L-70mmol/L， pH值为5. 2-8. 0。
8、 根据权利要求7所述蛋白质药物中内毒素的一步去除方法，其特征在于步骤(3) 所述洗脱缓冲液是乙酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，浓度为30國ol/L-50mmol/L， pH值为 5. 5—7.5。
全文摘要
本发明公开了一种简单高效的蛋白质药物中内毒素的一步去除方法，其步骤是采用阳离子交换层析柱一步去除蛋白质药物中的内毒素。本发明工艺过程简单，易于控制，蛋白质药物回收率可高达90％以上，回收的蛋白质药物的原液中内毒素的浓度降低到＜10EU/ml，达到药典规定的生产要求；且一次性处理量大，工艺稳定性强，可用于任何重组蛋白质药物的生产过程，为蛋白质药物的大规模生产提供了技术基础。
文档编号C07K1/18GK101298468SQ20071001545
公开日2008年11月5日 申请日期2007年4月30日 优先权日2007年4月30日
发明者孙丽霞, 孟丽萍, 王克波, 王希菊, 王晶翼, 艾现伟 申请人:齐鲁制药有限公司