专利名称：用清洁方法从喜树果中提取白桦脂酸等有效成分的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物有效成分的提取方法，具体涉及一种从喜树 果中提取白桦脂酸、羟基喜树碱和喜树碱的方法。
技术背景白桦脂酸是一种三萜类化合物，具有抗肿瘤细胞增长的作用，并 且在抗艾滋病方面还有许多新的作用机制，这使白桦脂酸成为很有开发前景的药物，引起了人们的广泛关注。Franoise等发现一些新的桦木酸的x-氨基链垸酸衍生物具有抗艾滋病的作用，它可以抑制在CEM4和MT-4细胞中的HIV-1发生细胞病变，并且不会影响到HIV-1 逆转录酶或蛋白酶的活性，这是目前所发现的其他抗艾滋病药物不具 备的药理活性，因此具有重要意义。目前白桦脂酸的制备方法主要有三个途径1、直接提取法。其 中Carcache Blanco Ziziphusspina等是目前此途径的主要的代表， 主要是从其他植物的树叶树枝中提取，原料消耗量大，成本高，所得到 的白桦脂酸杂质含量会比较高，且不易除去。2、 一步合成法。 一步 合成法是将桦木醇的提取和桦木酸的制备同步进行，它通过将植物浸 软而使提取和转化在一步内完成，可以用氯仿、二氯甲烷、二乙基醚、 四氢呋喃、丙酮、吡啶和DMF等有机溶剂来提取桦木醇，同时将硝酸 铁、硝酸铜、硝酸铬、硝酸锌等氧化剂附着在硅胶、氧化铝、胶岭石 K-IO等固体载体上对提取物进行氧化，最后得到白桦脂酸。此法所制得的混合物产品杂质的种类和含量很多，给分离纯化带来困难，从而 导致产率下降。3、半合成法。这种方法是从植物中提取出桦木醇， 然后由桦木醇经过一系列化学反应制得桦木酸。由于桦木醇在植物中 的含量比桦木酸高，并且经过化学合成的方法制得的桦木酸产率较高， 分离提纯也比较容易，所以这种方法得到广泛的应用。但这种方法反 应路线较长，反应条件苛刻，有异构体的产生，但路线较长，不适于大 规模生产。喜树(Camptotheca acuminate Decaisne， 简禾尔CPT)， 珙桐禾斗 (Nyssaceae)喜树属(Camptotheca)多年生植物，落叶大乔木。1966 年美国的Monroe E. wall从喜树的皮中分离出喜树碱，经肿瘤试验证 明这种色氨酸一萜烯类生物碱具有抗癌活性，从而引起人们的广泛关 注。喜树果中已经发现有20多种有特殊药效的化合物，其中就包括 有白桦脂酸。综上所述，目前提取白桦脂酸及喜树碱的方法中所使用的试剂大 多数都是毒性较大的药品，如氯仿，石油醚，甲醇等，其过程繁琐， 设备要求高，生产成本高。而从喜树果中采用清洁的方法提取白桦脂 酸的技术未见报道，尤其是能同时分离提取喜树碱，羟基喜树碱等有 效成分的方法，如果能实现这种方法，对于白桦脂酸、喜树碱和羟基 喜树碱的研究有着重要的意义，对于充分利用我国喜树资源也有着重 要意义。 发明内容本发明的目的是提供一种用清洁方法从喜树果中提取有效成分白桦脂酸、并且能同时分离得到喜树碱、羟基喜树碱等有效成分的方 法。本发明的技术方案是提供一种用清洁方法从喜树果中提取白桦 脂酸等有效成分的方法，以喜树果为原料，利用聚酰胺柱层析和乙醇 洗脱的方法提取白桦脂酸、喜树碱和羟基喜树碱。所述方法包括以下步骤(1) 喜树果粉碎、用工业乙醇浸泡、过滤得到的澄清浸出液；(2) 浓縮澄清浸出液，避光低温保存；(3) 聚酰胺柱吸附；(4) 滴入解吸液解吸，分段收集过柱液，重结晶。步骤(1)所述的用工业乙醇浸泡是用工业乙醇浸泡过面，浸泡 5天。步骤(2)所述浓縮采用旋转蒸发器对浸出液进行浓縮。步骤(3)所述聚酰胺柱吸附是取大约5ml浓縮液上聚酰胺柱， 缓慢加入使其充分渗透进入聚酰胺柱中，液面与聚酰胺齐平。所述聚酰胺柱采用湿法装柱，是取250ml的聚酰胺置于500ml的 大烧杯中，加入95。/。的优质工业乙醇至300ml，在电热套中煮沸半小 时后取出，离心除去剩余的乙醇，再次加入95%的优质工业乙醇至 300ml再煮沸半小时，离心除去剩余乙醇装入层析柱。步骤(4)所述滴入解吸液是逐滴加入解吸液，浓縮液被聚酰胺 充分吸收后，增大加入量，最后解吸液的用量约为3倍床体积。所述解吸液是60%的乙醇水溶液。步骤(4)所述分段收集过柱液是采用三角瓶分5段依次收集并 编号，每瓶收集约50mL。 本发明的有益效果是(1) 利用聚酰胺柱层析、乙醇洗脱的方法从喜树果中提取白桦 脂酸，这是一种简单、易行、环保、有效的提取白桦脂酸的方法，是 目前有效提取白桦脂酸的最简单的方法，另外本方法还能同时分离提 取喜树碱，羟基喜树碱等有效成分，具有很好的社会效益和价值。(2) 本方法中所使用的试剂不使用毒性较大的药品，所需设备 简单，用乙醇洗脱使整个提取分离过程环保，全过程只需要用60°/0乙 醇，解吸剂用量少，即3BV可以洗脱出所有物质，物质分段明显，简 单易行，乙醇可循环使用，从而大大降低了成本而且适用于较大规模 的制备，具有较高的实用价值。(3) 本方法分离效果好，而且对其他有效成分的分离作用也很 明显，改变解吸剂，展开剂等条件的研究对此方法的后续研究工作和 充分利用我国喜树资源也有着重要意义。
图l本发明工艺流程示意2 14 28号部分试样的聚酰胺薄板在UV-1型三用紫外分析仪 下观察的照片图3 29-46号部分试样的聚酰胺薄板在UV-1型三用紫外分析仪 下观察的照片图4 47-67号部分试样的聚酰胺薄板在UV-1型三用紫外分析仪下观察的照片图5 68-91号部分试样的聚酰胺薄板在UV-1型三用紫外分析仪 下观察的照片图6 65-91组物质的试样的LC-ESI-MS7 65-91组物质的试样的LC-ESI-MS图具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步详细说明本发明。按照本方法的步骤(1) 喜树果粉碎、用工业乙醇浸泡、过滤得到的澄清浸出液；(2) 浓縮澄清浸出液，避光低温保存；(3) 聚酰胺柱吸附；(4) 滴入解吸液解吸，分段收集过柱液，重结晶。 得到产物后进行实验检测。具体操作如图l所示的工艺流程图。实施例11、 材料喜树的干种子，实验所用的聚酰胺由南开大学化工厂和台州市路 桥四甲生化塑料厂提供，分析纯和高效液相色谱纯的乙醇、甲醇和磷 酸，分析纯三乙胺。2、 实验仪器SHZ-D (III)循环水式真空泵、旋转蒸发器RE-52AA、 UV-1型 三用紫外分析仪、LQC 'DECAXP液相色谱一质谱连用仪，带电喷 雾离子源；大气压化学电离源，质量范围50 2000n， ThermoFinnign公司(美国)、北京分析仪器厂SY-5000高效液相色谱仪，C18柱。3、 方法(1) 称取500g喜树果粉碎并用工业乙醇浸泡过面，浸泡五天， 过滤后得澄清浸出液。聚酰胺的预处理取250ml的聚酰胺置于500ml的大烧杯中， 加入95%的优质工业乙醇至300ml，在电热套中煮沸半小时后取出，* ,1、、1^土恭ilA6^ 7跪 古、/A^+n "X 。C0/一的/4^法T、11/7鹏《Qnn"1市去、她半小时，即可离心除去剩余乙醇装入层析柱，采用湿法装柱。(2) 对粉碎的喜果浸泡得出的清液浓縮，用旋转蒸发器对其进 行浓縮，浓縮至150到200mL左右，避光低温保存。(3) 取大约5ml浓縮液上聚酰胺柱，缓慢加入使其充分渗透进 入聚酰胺柱中，液面与聚酰胺齐平。(4) 浓縮液被聚酰胺充分吸收后，用60%的乙醇解吸，刚开始 解吸液逐滴加入，浓縮液被充分吸收后可以增大加入量，最后解吸液 的用量大约为3倍床体积，用三角瓶分5段收集并编号，每瓶收集约 50mL，经检测后挑选分段物重结晶得到产物。分离方法分段收集解吸液洗脱出的组分，经薄板初步检测进行分类后再通 过HPLC 、 LC-ESI-MS检测、选择性离子流色谱(SIM)检测进行进一步的测定，证实此洗脱方法能较好分离喜树果中有效成分。4、 检测方法收集的过柱液用旋转蒸发器浓縮至溶液约lmL左右，进行以下检①聚酰胺薄膜层析检测展开剂为乙醇水的体积比=3: 2的乙醇，即60%乙醇 用玻璃毛细管吸取少量从聚酰胺柱中洗出的浓縮液点板，点板时 注意要等第一滴干了后再点第二滴， 一块板点三个样，用乙醇水体 积比二3: 2的展开剂进行展开层析，展层完毕取出聚酰胺薄膜，于阴凉通风处自然干燥，待展开剂完全挥发后，在波长为254nm紫外灯下 观察，根据荧光点不同高度进行初步的分类。表l各分段收集液荧光标记瓶编号14-2829-4445-4748-6465-91☆(黄绿荧光)□(紫蓝荧光)◎(亮黄色荧 光)VVA(蓝紫荧光)VVV〇(紫白荧光)V其中 (亮黄色荧光)在聚酰胺薄板上显示是较其他荧光点迟出现，并且不在UV-1型三用紫外分析仪下观察也能在聚酰胺薄板上观察到黄斑，各个荧光点能较好地分开。UV-1型三用紫外分析仪下观察的照片组见图2 图5。图2中部 分式样即表1中"□"标记的物质；图3中部分试样即表1中"□" "◎" "△"标记的物质；图4中部分试样即表1中"△""〇"标 记的物质；图5中部分试样即表1中"〇"标记的物质。在拟定色 谱条件和聚酰胺薄板层析检测下，用45 47组试样与喜树碱标准品 对照，确定为喜树碱，分离效果好，纯度高。聚酰胺薄板层析检测下判定65 91组样品(即"〇")结晶含有少量羟基喜树碱。② HPLC色谱条件色谱柱为Zorbax (]18柱(4. 6mmX 150mm)，流 动相为{ V甲醇:V磷酸隱5m。^55:45 (混合后用三乙胺调pH3. 0 3.2) }:甲醇=9:1，检测波长360nm，流速O. 8mL/min，柱温25。C③ LC-ESI-MS检测离子化源(士)ESI;加热毛细管温度300°C;鞘气(N2)流速30流量单位(arbitrary units);辅助气(N2)流速30流量单位 (arbitrary units);喷雾电压4 kV。同时采用一级全扫描质谱及 MS/MS两种方式检测，扫描范围150 550， MS / MS的相对碰撞能为30/b 。通过LC-ESI-MS法对65-91组样品检测，结果见图6 图7，该 组样品中主要含量是分子量分别为455.6， 456.9的物质，纯度高， 物质通过与文献分子量的对比，认定是白桦脂酸。同时，用LC一ESI-MS以选择性离子扫描方式(SIM)对65-91 组样品结晶(即"〇")中羟基喜树碱进行测定，确定含有羟基喜树 碱。
权利要求
1、一种用清洁方法从喜树果中提取白桦脂酸等有效成分的方法，其特征在于以喜树果为原料，利用聚酰胺柱层析和乙醇洗脱的方法提取白桦脂酸、羟基喜树碱和喜树碱。
2、 根据权利要求1所述用清洁方法从喜树果中提取白桦脂酸等有效成分的方法，其特征在于包括以下步骤(1) 喜树果粉碎、'用工业乙醇浸泡、过滤得到澄清浸出液；(2) 浓縮澄清浸出液，避光低温保存；(3) 聚酰胺柱吸附；(4) 滴入解吸液解吸，分段收集过柱液，重结晶。
3、 根据权利要求2所述用清洁方法从喜树果中提取白桦脂酸等有效成分的方法，其特征在于步骤(1)所述的用工业乙醇浸泡是用工业乙醇浸泡过面，浸泡5天。
4、 根据权利要求2所述用清洁方法从喜树果中提取白桦脂酸等 有效成分的方法，其特征在于步骤(2)所述浓縮采用旋转蒸发器对 浸出液进行浓縮。
5、 根据权利要求2所述用清洁方法从喜树果中提取白桦脂酸等 有效成分的方法，其特征在于步骤(3)所述聚酰胺柱吸附是取大约 5ml浓縮液上聚酰胺柱，缓慢加入使其充分渗透进入聚酰胺柱中，液 面与聚酰胺齐平。
6、 根据权利要求2或5所述用清洁方法从喜树果中提取白桦脂 酸等有效成分的方法，其特征在于所述聚酰胺柱采用湿法装柱，是取 250ml的聚酰胺置于500ml的大烧杯中，加入95%的优质工业乙醇至 300ml，在电热套中煮沸半小时后取出，离心除去剩余的乙醇，再次 加入95%的优质工业乙醇至300ml再煮沸半小时，离心除去剩余乙醇装入层析柱。
7、 根据权利要求2所述用清洁方法从喜树果中提取白桦脂酸等 有效成分的方法，其特征在于步骤(4)所述滴入解吸液是逐滴加入 解吸液，浓縮液被聚酰胺充分吸收后，增大加入量，解吸液的最后用 量约为3倍床体积。
8、 根据权利要求2或7所述用清洁方法从喜树果中提取白桦脂 酸等有效成分的方法，其特征在于所述解吸液是60%的乙醇水溶液。
9、 根据权利要求2所述用清洁方法从喜树果中提取白桦脂酸等 有效成分的方法，其特征在于步骤(4)所述分段收集过柱液是采用 三角瓶分段依次收集并编号，每瓶收集约50mL。
10、 根据权利要求2或9所述用清洁方法从喜树果中提取白桦脂 酸等有效成分的方法，其特征在于步骤(4)所述分段收集是分5段。
全文摘要
本发明公开了一种用清洁方法从喜树果中提取白桦脂酸、羟基喜树碱和喜树碱的方法，以喜树果为原料，利用聚酰胺柱层析和乙醇洗脱的方法提取有效成分，所需设备简单，用乙醇洗脱使整个提取分离过程环保，全过程只需要用60％乙醇，解吸剂用量少，物质分段明显，简单易行，乙醇可循环使用，从而大大降低了成本而且适用于较大规模的制备，具有较高的实用价值，具有很好的社会效益和价值，对于充分利用我国喜树资源有着重要意义。
文档编号C07D491/22GK101220036SQ200710031330
公开日2008年7月16日 申请日期2007年11月9日 优先权日2007年11月9日
发明者何洁萍, 刘展眉, 钟雪莲 申请人:仲恺农业技术学院