专利名称：微晶体茶多酚的制作方法
技术领域：
本发明涉及茶叶提取物领域，更具体地说，是涉及一种稳定性强、纯度高的绿茶提取物。
背景技术：
茶多酚是一种从茶叶中分离提取的多酚类化合物的复合体，由30多种含酚基的物质组成，其主要成分有花色素、酚酸、黄铜和多种儿茶素。相关的研究表明，茶多酚具有如下一系列的药效(1)抗肿瘤、抗突变和防治癌症；(2)增强微血管韧性、降低血糖和血压，预防肝硬化和冠状动脉粥硬化；(3)对病原和病毒的生长有抑制作用；(4)缓和肠胃紧张，有防炎止泻和利尿作用；(5)促进微生物C的吸收、防治坏血病；(6)抗脂质过氧化，对衰老有调控效应；(7)抗解金属盐中毒和生物碱中毒。由于上述的多种药效，茶多酚常用作制备多种药物的原料。除此之外，茶多酚还可广泛用于食品的抗氧化和皮肤护理以及保健仪器等领域。目前全国有很多厂家提取茶多酚，但均为各种不同着色的粉末状，这些产品其抗氧化流活性较差，受热时易发生氧化，聚合和缩合等反应。虽然刚出品时茶多酚含量可达90％以上，但三个月过后就每个月以10％的速度氧化，因其产品自身氧化问题难以解决，所以不能做成单方制剂产品使用，只能作为食品添加剂或复型剂使用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术中存在的不足，提供一种的稳定性在十年以上，纯度在95％以上的微晶体茶多酚。
本发明微晶体茶多酚，具有如下物化性质 (1)外观浅黄色、白色、浅绿色或浅茶色； (2)性状微晶体，X-射线衍射峰D值为5.9566和3.6988； (3)纯度95％以上； (4)呈涩味易溶于水、乙醇和乙酸乙酯；耐热性稳定，小于150℃温度条件下不分解；酸性条件下不分解；有吸湿性。
茶多酚具有如下一系列的药效(1)抗肿瘤、抗突变和防治癌症；(2)增强微血管韧性、降低血糖和血压，预防肝硬化和冠状动脉粥硬化；(3)对病原和病毒的生长有抑制作用；(4)缓和肠胃紧张，有防炎止泻和利尿作用；(5)促进微生物C的吸收、防治坏血病；(6)抗脂质过氧化，对衰老有调控效应；(7)抗解金属盐中毒和生物碱中毒。现有产品为各种不同着色的粉末状，这些产品其抗氧化流活性较差，受热时易发生氧化，聚合和缩合等反应，在实践中无法实现上述多种药效。本发明是一种稳定性在十年以上，纯度在95％以上的微晶体茶多酚，可以做成单方制剂产品使用并实现上述多种药效。
本发明微晶体茶多酚，因其纯度高、稳定性强，可做成单方制品。单方制品茶多酚降脂胶囊(具体组成为50％微晶体茶多酚和50％乳糖)于高血脂患者，每日服用相当600mg微晶体茶多酚的茶多酚降脂胶囊，一至二个疗程(每疗程2个月)总胆固醇可趋于正常。
使用微晶体茶多酚经动物实验证明肝癌每日以0.645g/kg剂量灌胃给药1次，7天有效率达41.7％(P＜0.001)；肺癌每日以500mg/kg隔日给药1次，共13次，有效率达40.6(P＜0.01)。
用微晶体茶多酚对阻黄病人提供抗氧化肝保护治疗的课题研究，利用茶多酚的抗氧化功能，对抗阻塞性黄疸肝脏的脂质过氧化过程，保护肝功能，提供对阻黄病人提供抗氧化肝保护治疗的理论依据。
图1是本发明X-射线衍射图。
具体实施例方式 下面对本发明做进一步描述。
本发明具有如下物化性质 (1)外观浅黄色、白色、浅绿色或浅茶色； (2)性状微晶体，X-射线衍射峰D值为5.9566和3.6988； (3)纯度95％以上； (4)呈涩味易溶于水、乙醇和乙酸乙酯；耐热性稳定，小于150℃温度条件下不分解；酸性条件下不分解；有吸湿性。
图1是本发明X-射线衍射图，使用仪器型号为(日本)Dmax 2500，测试条件为(Cu)40KV 100mA，测试结果如下表所示 提取本发明微晶体茶多酚的工艺方法主要包括蒸煮、丙酮吸附、回收丙酮、有机溶剂萃取、回收有机溶剂和浓缩干燥6道工序。
(1)蒸煮首先将干绿茶用无离子水在蒸煮锅中加热蒸煮，以使干绿茶中的酚基物质溶于水中，无离子水与干绿茶的重量比为2-2.5∶1，加热温度为80-100℃，加热时间为10-25分钟；然后将溶解有酚基物质的茶汤倒入垫有无纺布的过滤器中过滤，并将过滤后的茶汤泵入外循环加热器内加热，浓缩成50％的浓茶汤，加热温度为90-100℃。
(2)丙酮吸附先将工序(1)后所得的溶有酚基物质的浓茶汤和丙酮放入搅拌罐中搅拌10-20分钟，丙酮与浓茶汤的重量比为1-3∶1；待茶汤中的杂质被丙酮，吸附并聚合成团状时，倒入过滤器滤去杂质。得到具有水相和丙酮相的两相药液，其中水相中溶有酚基物质。
(3)回收丙酮将工序(2)后所得的两相药液泵入转溶离心器内加热回收丙酮，得到溶有酚基物质的水相药液，加热温度为60-70℃，加热时间为20-30分钟。
(4)醋酸乙酯萃取将工序(3)后所得的水相药液泵入萃取塔中并利用醋酸乙酯萃取出茶多酚，醋酸乙酯与水相药液的重量比为1-3∶1，萃取时间为60-90分钟。
(5)回收醋酸乙将工序(4)后所得的两相药液泵入转溶离心器内加热回收醋酸乙酯，茶多酚即转溶到水中；加热温度为60-70℃，加热时间为20-30分钟。
(6)浓缩干燥先将工序(5)后所得的水相药液送入真空浓缩罐内加热至80-90℃，以使转溶有茶多酚的水相药液浓缩成乳状液；然后再将转溶有茶多酚的乳状液送入真空干燥器加热至80-100℃，即可得到纯度在90％以上的微晶体状茶多酚产品。
以如下实验证明本发明具有多种药效 一、微晶体茶多酚对小鼠肝癌实体瘤(HepS)抑瘤作用实验 1.实验目的通过微晶体茶多酚口服给药对小鼠移植性肿瘤HepS的抑瘤实验，本发明抗肿瘤作用。
2.实验材料 2.1动物健康昆明种小鼠40只，雌雄各半，体重18-22g。由天津市药品检验所动物室提供。
2.2药品微晶体茶多酚，为浅棕色粉剂，使用时以常水溶解并微加温，制成水溶液灌胃用。由天津津龙天然保健制品有限公司提供，批号2001102。
环磷酰胺，注射用粉剂(200mg瓶装)，使用时以灭菌生理盐水溶解配制，上海华联制药有限公司生产，批号991202。
2.3瘤源小鼠可移植性肝癌(HepS)实体瘤。
3.实验方法 3.1瘤源接肿取生长良好，无坏死及液化的Hep实体瘤源，在无菌条件下用组织研磨器充分研磨后，每克组织加灭菌生理盐水4ml制成匀浆，在无菌条件下接种于每鼠右腋皮下，0.2ml/只，共接种40只。
3.2分组及给药接种瘤源后的40只小鼠，按体重随机分为4组，每组10只，雌雄各半。①空白对照组，每日每鼠灌胃生理盐水0.2ml/只；②微晶体茶多酚高剂量组，每日以0.645g/kg剂量灌胃给药1次；③微晶体茶多酚低剂量组，每日以0.43g/kg剂量灌胃给药1次；以上3组均连续给药7天。④环磷酰胺阳性药组，按50mg/kg腹腔给药，连续2天。
3.3解剖称重在连续给药7天后的次日，各组小鼠断颈处死，称体重后解剖，取右腋下生产的HepS瘤组织，在天平上称重记录之。各组小鼠瘤重统计处理，计算抑瘤率。
抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％ 4.实验结果 各组动物实验前后体重变化及瘤重见表。
与空白对照组比较△P＜0.05，△△P＜0.001 从上表可见微晶体茶多酚以645mg/kg和430mg/kg剂量灌胃给药，连续7天，对小鼠肝癌实体瘤的抑瘤率分别为41.7％(P＜0.001)和29.6％(P＜0.05)。
5.实验小结 给小鼠口服微晶体茶多酚剂量为645mg/kg和430mg/kg(约为LD50剂量的1/7和1/10)，连续7天，对小鼠可移植性肝癌实体瘤的抑制率为41.7％和29.6％，统计学有显著性差异，表明微晶体茶多酚对小鼠肝癌实体瘤具有抑制作用，建议重复及扩大癌谱。微晶体茶多酚645mg/kg组有2只动物死亡，联系到此组动物给药7天后平均体重下降的情况，是否为此剂量下出现一定的毒性，目前尚不能肯定，需要进一步实验观察。
二、微晶体茶多酚对小鼠Lcwis肺癌抑瘤实验 1.实验动物C57BL/6小鼠，体重为18-21克，雌雄各半，由中国医学科学院动物繁育厂提供。合格证号为0046317。
2.实验药物微晶体茶多酚，为浅棕色粉剂，使用时以常水溶解并微加温，制成水溶液灌胃用。由天津津龙天然保健制品有限公司提供，批号2001102。
环磷酰胺，注射用粉剂(200mg瓶装)，使用时以灭菌生理盐水溶解配制，上海华联制药有限公司生产，批号991202。。
3.实验方法同实体瘤。给药过程中，600mg/kg，400mg/kg两组连续给药3天后，由于动物出现毒性反应，故剂量下调为500mg/kg和300mg/kg，并由每日给药改为隔日给药，共给药10次。
4.实验结果见表。经统计学处理，大小俩剂量组P值分别小于.01和0.02，表明与对照组比较有显著性差异，说明微晶体茶多酚对小鼠Lcwis肺癌有较好的抑瘤效果。
三、微晶体茶多酚的抗氧化功能，具有对阻黄病人提供抗氧化肝保护的药效 由于微晶体茶多酚具有清除自由基和提高抗氧化酶活性的功能，我们选用微晶体茶多酚作为阻塞性黄疸功能的保护因子，试图通过实验动物阻塞性黄疸模型进行抗氧化保肝治疗，从而减少脂质过氧化过程对肝细胞的损伤，达到保肝的目的。在动物实验的基础上，对临床梗阻性黄疸病人在手术后进行为期一个月的微晶体茶多酚治疗，观察其对肝功能恢复作用。
动物实验利用大白兔为阻塞性黄疸模型，采用生化指标和肝组织病理等研究方法，探讨给予微晶体茶多酚对阻黄大白兔肝损伤保护作用的效果，并对梗阻性黄疸病人肝功能恢复的效果进行初步观察。
实验观察到，阻黄后，大白兔体内过氧化脂质增加，抗氧化防御机能破坏，表现在血清和肝脏中丙二醛(MDA)含量增加，血浆和红细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性下降、血浆中谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性下降，血清中抗氧化维生素C和维生素E减少，血清中微量元素锌、硒水平下降。肝功能受损，表现在血浆中酶的水平的增加，蛋白质合成功能下降。肝脏组织学检查，显示肝细胞坏死，超微结构的电镜检查，显示肝细胞膜结构受到破坏。实验结果说明，脂质过氧化的产生不仅影响到肝脏的功能，同时影响了肝脏的超微结构变化，最终导致肝坏死。
在阻塞性黄疸时给予微晶体茶多酚治疗，血浆和肝脏中过氧化物产生明显减少，抗氧化防御系统得到了保护，肝组织病理变化较少。提示微晶体茶多酚的保护作用是通过对抗脂质过氧化物，抑制了MDA对肝细胞的毒性而实现的。临床使用微晶体茶多酚的效果，初步观察到，肝功能的恢复与MDA有相关关系，微晶体茶多酚降低了MDA的含量，当MDA减少时，肝功能随之得到恢复。
上述结果显示微晶体茶多酚对阻黄动物肝损伤，具有显著的保护作用、临床的初步观察，对肝功能恢复具有一定的效果。此实验为临床梗阻性黄疸保肝治疗提供了理论依据。
具体实验材料和方法 A.材料 1.动物采用天津医科大学实验动物科学部提供的日本大耳雄性白兔27只，体重2.4±0.25kg。实验在天津医科大学实验中心进行，采用不锈钢饲养笼，分笼喂养，自由饮水摄食。
2.微晶体茶多酚天津津龙天然保健制品有限公司提供，纯度为95％。
3.仪器荷兰ISP-II型半自动生化仪，瑞士罗氏公司COBAS-EMIRA全自动生化仪，日本岛津RF-540荧光分光光度仪，上海752-2型紫外分光光度仪。
B.方法 1.动物分组及造模方法将大白免27只，随机分为三组，每组9只。(参照朱愉主编实验动物的疾病模型操作) ①微晶体茶多酚治疗组，术前24h禁食，术前6h禁水，手术麻醉采用30％的乌拉坦，400mg/kg，氯氨12mg/kg，静脉麻醉后，常规在无菌条件下开腹，分离胆总管后，用丝线结扎。实验同期通过灌胃给予微晶体茶多酚100mh/kg/d。
②阳性对照组，手术方法同微晶体茶多酚治疗组。
③正常对照组，手术不结扎胆总管，只开腹，再予关闭。
2.造模标准(1)术后2-3天食欲减退； (2)3-4天尿色加深； (3)血清胆红素增加； (4)病理检查，肝内有胆栓。
自手术后开始，实验期二周，三组动物术后自由摄食。
3.观察项目及方法 ①各组动物分别于实验前和实验后于耳静脉取血，进行以下生化指标检查。
超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)用比色法，试剂盒由南京建成生物研究所提供，仪器采用荷兰ISP-II型半自动生化仪。
GSH-Px用DTNB法。
维生素C用2.4二硝基苯肼法。
维生素E用荧光光度法，仪器采用日本岛津RF-540荧光分光光度仪。
微量元素锌，硒用电位溶出法，铜、铁用极谱法。仪器用WPS-II型微量元素分析仪。(山东电讯七厂) 肝功能测定用瑞士罗氏公司COBAS-EMIRA全自动生化仪，指标有白蛋白、碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(GPT)、谷氨酰转肽酶(γ-GT) 前白蛋白采用比色法，试剂为上海长征试剂公司生产，仪器用752-紫外分光光度仪。内毒素测定采用耦氮显色法，做定量测定。
②肝脏组织学观察动物于实验后统一空气栓塞处死，开腹取肝既置入10％福尔马林固定，48小时后常规切片，HE染色后，光学显微镜观察。
电镜检查肝脏置入专用溶液中，即刻切片。
光镜每组送三只，电镜每组送二只。
4、统计方法 三组比较用方差分析，组间比较用t检验，组内数据用相关分析。
实验结果 (1)实验前红细胞和红血球中三组SOD经方差分析，无显著性差异。而术后二周，阳性对照组和微晶体茶多酚治疗组都有显著性下降，但微晶体茶多酚治疗组比阳性对照组下降少，二组间且有显著性差异。(表.1) 表.1三组大白兔血浆和红细胞中SOD的变化(X±S) *与实验前比，p＜0.01#与阳性对照组比，p＜0.05 (2)血浆GXH-PX和血清MDA的变化，GSH-Px活性实验后阳性对照组有显著性下降，微晶体茶多酚治疗组和正常对照组变化不大。MDA阳性对照组和微晶体茶多酚治疗组实验后都有增加，但阳性对照组比微晶体茶多酚治疗组增加的更高。实验后，肝组织匀浆中MDA含量阳性对照组与微晶体茶多酚治疗组相比有显著性差异。(表2) 表2三组大白兔血浆中GSH-Px活性与血清中MDA的变化(X±s) *与实验前比较，p＜0.01**与对照组比较，p＜0.01#阳性对照组比，p＜0.05 (3)肝功能指标的变化 肝功能中前白蛋白与白蛋白，阳性对照组实验后较实验前降低，微晶体茶多酚治疗组和正常对照组无明显变化。(表4) 表4三组大白兔血清中前白蛋白和白蛋白的变化(X±s) *与实验前比较，p＜0.01**与正常对照组比较，p＜0.01#与阳性对照组比，p＜0.01。
(4)血清维生素E，C的变化 实验后与实验前相比阳性对照组和微晶体茶多酚治疗组维生素E，C都有减少，但阳性对照组有显著性(表5) 表5三组大白兔血清中维生素C和维生素E的变化(umol/L)(X±S) **与正常对照组比较，p＜0.01#与阳性对照组比较，p＜0.01 (5)血浆内毒素变化 实验后阳性对照组和微晶体茶多酚治疗组都有增加，但微晶体茶多酚治疗组增加较少。(表6) 表6三组大白兔血浆内毒素的变化(Eu/ml)(X±s) **与正常对照组比较，p＜0.01#与阳性对照组比较，p＜0.05 动物实验利用大白兔作为阻塞性黄疸模型，实验观察到阻塞性黄疸后，大白兔体内存在氧化应激，表现在血浆和肝脏内过氧化物的增加；抗氧化酶活性的降低；体内自身氧化功能的减弱；肝脏发生明显的病理改变。微晶体茶多酚能有效地抑制过氧化反应，保护肝脏。
在临床对梗阻性黄疸病人，术后给予微晶体茶多酚治疗，初步观察到梗阻性黄疸病人体内有氧化应激，过氧化物与肝功能损伤有关，微晶体茶多酚可以减低过氧化物水平，当过氧化物降低后，肝功能得到恢复。
权利要求
1.一种微晶体茶多酚，为干绿茶中提取物，其特征是，具有如下物化特性
(1)外观浅黄色、白色、浅绿色或浅茶色；
(2)性状微晶体，X-射线衍射峰D值为5.9566和3.6988；
(3)纯度95％以上；
(4)呈涩味易溶于水、乙醇和乙酸乙酯；耐热性稳定，小于150℃温度条件下不分解；酸性条件下不分解；有吸湿性。
全文摘要
本发明公开了一种稳定性在十年以上，纯度在95％以上的微晶体茶多酚。本发明微晶体茶多酚，具有如下物化性质(1)外观浅黄色、白色、浅绿色或浅茶色；(2)性状微晶体，X-射线衍射峰D值为5.9566和3.6988；(3)纯度95％以上；(4)呈涩味易溶于水、乙醇和乙酸乙酯；耐热性稳定，小于150℃温度条件下不分解；酸性条件下不分解；有吸湿性。本发明微晶体茶多酚，因其纯度高、稳定性强，可做成单方制品。
文档编号C07D311/00GK101130557SQ20071005943
公开日2008年2月27日 申请日期2007年8月31日 优先权日2007年8月31日
发明者王孝仓 申请人:天津济世生物科技有限公司