专利名称：：从重组人睫状神经营养因子及其突变体中分离异构蛋白的方法
技术领域：
：本发明涉及一种从基因重组表达的蛋白中分离出异构蛋白的方法，更确切讲是从重组的人睫状神经营养因子或者其突变体中分离异构蛋白的方法。
背景技术：
：在基因重组原核表达蛋白中，常因蛋白复性问题出现一级结构完全正确，但不具生物活性的异构体。由于异构体的存在，使其生物活性受到很大的影响。因此，重组表达蛋白中异构体的分离是生物制药中需要解决的一个问题。人睫状神经营养因子(CNTF)可用于治疗普通肥胖症及糖尿病型肥胖症。基因重组表达的人睫状神经营养因子及其突变体可在大肠杆菌中高效表达，但其中存在的异构蛋白没有疗效，反而会产生抗体，影响其实际的药效。
发明内容本发明提供一种从基因重组的人睫状神经营养因子或者其突变体中分离异构蛋白的方法。本发明的方法是从重组人睫状神经营养因子及其突变体中分离异构蛋白的方法是将收集的湿菌体以h51:10(W/V)的比例加入洗涤缓冲液,制成菌体混悬液，超声破碎至菌体完全破裂、包函体溶出)，再在8000xg12000xg离心，弃去上清，将沉淀用含13mol/L尿素、0.5%TritonX-100的TE缓冲液充分洗涤，得到表达蛋白包涵体，再用含变性剂6mol/L的盐酸胍或是8mol/L的尿素的缓冲液将该包涵体充分溶解，溶解至蛋白终浓度为10.5mg/ml，得到包涵体溶解液，将包涵体溶解液用pH8.5含有0.05mol/LTris-HCl、0.5mol/L精氨酸、lmmol/L的EDTA缓冲液进行稀释复性，直至目的蛋白的终浓度小于100pg/ml,变性剂的终浓度小于lmol/L;4。C放置2448h,成为CNTF复性蛋白液，超滤浓縮后，经凝胶层析G-25柱转换至Tris缓冲液中,收集蛋白峰，再将转换了液体的CNTF复性蛋白液上QSephrose-FastFlow阴离子交换柱，去除未复性好的CNTF蛋白及杂蛋白；离子交换层析的上样缓冲液为Tris.Cl-EDTA、pH7.08.5，解离缓冲液为Tris-HClEDTA、0.10.5mol/LNaCl，再将解离收集的目的蛋白上Octyl-4FastFlow疏水层析柱去除DNA及内毒素，疏水层析的条件为A液为Tris-HCl，其pH7.08.5,含lmmol/LEDTA和0.1~0.5mol硫酸铵；B液为Tris.Cl，其pH7.08.5，含lmmol/LEDTA，用A液和B液梯度解离，收集蛋白峰后再上Superdex-75凝胶层析柱，所用缓冲液为pH7.08.0的磷酸缓冲液。本发明可以有效分离重组人睫状神经营养因子及其突变体中的异构蛋白，提高重组人睫状神经营养因子及其突变体的治疗效果，降低抗体滴度。图h两种CNTF异构体SDS-PAGE电泳图，图中1、2CNTF为流穿峰；3、4为CNTF解离峰；5为分子量标准。图2:不同CNTF异构体给药后小鼠体重的变化结果。图3:不同CNTF异构体给药后小鼠体重变化曲线。具体实施例方式重组人睫状神经营养因子(CNTF)的发酵培养及诱导表达本发明的重组CNTF全基因合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。取所合成的CNTF用发酵培养，所采用复合培养基，成份为蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、氯化钠5g/L。将发酵种子液(即CNTF)以h101:40(V/V)的比例接入发酵培养基中，控制适当的发酵培养温度、pH值、溶氧DO，进行发酵培养，每隔一小时取样测OD6Q。的值，当OD,在56时，加入异丙基-l3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，IPTG的终浓度为0.1mmol/L,诱导4小时后结束培养，将培养液4000g离心收集菌体。表达CNTF蛋白包涵体的复性与异蛋白的分离将收集的湿菌体以l:10(W/V)的比例加入洗涤缓冲液，制成菌体混悬液，超声破碎；破碎后8000xg1000xg离心，弃去上清，将沉淀用缓冲液充分洗涤，得到表达蛋白包涵体。将该包含体用含变性剂盐酸胍或尿素的缓冲液溶解至蛋白含量为10.5mg/ml，得到包涵体溶解液。将包涵含体溶解液用0.05mol/LTris-HCl，含0.5mol/L精氨酸、lmmol/LEDTA，pH8.5的缓冲液进行稀释复性，直至目的蛋白的终浓度小于100pg/ml，变性剂的终浓度小于lmol/L;4。C放置2448h，超滤浓缩，凝胶层析G-25柱转换至Tris缓冲液中,收集蛋白峰。将转换了液体的CNTF蛋白液上QSephrose-FastFlow阴离子交换柱，在层析时，选择合适的上样条件及解离条件，去除未复性好的CNTF蛋白及杂蛋白，再将解离收集的的目的蛋白上Octyl-4FastFlow疏水层析柱去除DNA及内毒素，收集蛋白峰后再上Superdex-75凝胶层析柱，所用缓冲液为pH7.08.0的磷酸缓冲液。收集蛋白峰即为CNTF原液，SDS-PAGE电泳分析，目的蛋白纯度可达到95%。再将上述所得CNTF原液用0.22)im的滤膜除菌过滤，加入保护剂冻干，即为CNTF成品。生物活性检定采用小鼠减重法来测定重组人CNTF突变体的抑制体重增长药效。选用体重在1820克的清洁级健康雄性昆明鼠，精确称量体重(应精确到O.lg)，按体重随机分组，每组1020只动物。同时设标准品或参考品对照组及生理盐水或其他溶媒对照组。每天将一给定剂量的重组CNTF蛋白腹腔注射小鼠，每天给药两次，给药710天。阴性对照组每日注射等体积的生理盐水或其他溶媒两次。各组试验动物于给药0日起，每天给药前称量体重一次，根据体重计算给药剂量。计算体重增长抑制率一即减重效率。CNTF异构体的鉴别采用上述纯化分离工艺时，在QSephrose-FastFlow阴离子交换柱这一步中，分别收集了流穿峰和解离峰，进行SDS-PAGE电泳，发现流穿峰主条带的位置与解离峰的CNTF蛋白条带位置一致，即两者蛋白分子量完全相同，同时它们又来自同一个表达蛋白的包涵体，因此它们可能为同种蛋白的异构体，可能是因为变性蛋白在复性过程中一部分恢复至有正确构象、具有生物活性的CNTF蛋白，一部分为未复性好的不具活性的异构蛋白。但还需通过实验来验证哪一部分为所需要的具活性的CNTF蛋白。为此，采用小鼠体重增值抑制试验来进行鉴定。实验分组对照组IO只小鼠，每天注射生理盐水；流穿峰组IO只小鼠，每天注射CNTF流穿峰蛋白60ug/kg。解离峰组IO只小鼠，每天注射CNTF解离峰蛋白60ug/kg。CNTF复性液组IO只小鼠，每天注射CNTF复性蛋白60ug/kg。实验结果给药十天后，称量小鼠体重变化值。对照组平均体重增长8.56g;流穿峰组平均体重增长8.84g;解离峰组平均体重增长2.82g;CNTF复性液组平均体重增长6.61g;受试小鼠体重变化曲线见图2。由实验结果可知解离峰为有正确构象具活性的CNTF蛋白，该蛋白具有与天然人CNTF相似的生物活性，即抑制小鼠体重增长的活性，而从流穿峰收集的CNTF异构体在给药期间同等给药剂量，不能明显抑制小鼠体重增长，CNTF复性液组为包涵体复性液，未将复性蛋白与异构体分离，是这两种CNTF异构体的混合物。因此，该组小鼠在试验期间体重增长值有所降低，但体重增长明显高于CNTF解离峰组。试验结果表明，用QSephrose-FastFlow阴离子交换柱，选择合适的纯化条件，可以将复性好的、具有天然构象的CNTF蛋白(CNTF-G)与非天然构象的CNTF蛋白(CNTF-B)分开。为进一步对以上的结论进行验证，本发明对CNTF-G与CNTF-B的免疫原性进行了比较，采用ELISA法检测免疫小鼠血清，结果如下CNTF-G效价在1:64001:25600之间；CNTF-B效价在1:1001:1600之间；由ELISA检测可知CNTF-B蛋白给药后，产生的抗体滴度是CNTF-G蛋白的1664倍，说明CNTF-B蛋白具有较强的免疫原性。这也是药效降低的主要原因。本发明还对CNTF-G与CNTF-B免疫小鼠后，产生抗体的情况进行了比较；采用常规免疫法，选用Balb/C雌性小鼠，每组10只，免疫程序如下。0周用弗氏完全佐剂，分别配制CNTF-G与CNTF-B，皮内注射，100吗/只。2周弗氏不完全佐剂，分别配制CNTF-G与CNTF-B，皮内注射，100jug/411周水剂CNTF-G，仅免疫CNTF-G组，每周加强一次，皮内注射，200吗/只。4周、12周鼠尾静脉采血，检测抗体滴度。在第四周测定时，CNTF-B已产生抗体，所以停止免疫，CNTF-G继续免疫，检测结果见表l。表1CNTF-G与CNTF-B免疫后小鼠产生抗体结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由小鼠免疫试验可知，CNTF-B蛋白产生抗体时间早，且抗体滴度很高(1:64001:12800);而CNTF-G蛋白不易产生抗体，在连续免疫3个月后，才有40%小鼠产生了抗体，且抗体效价较低(1:1001:1600)。对于治疗用生物制品，抗体的产生可以和药物发生中和反应，降低药物的疗效，所以治疗用生物药物的免疫原性是这类药物能否研发成功的关键因素，本实验通过对生产工艺的控制，使复性好的具有与天然CNTF相同活性的CNTF-G蛋白与未复性好的CNTF-B蛋白分离。通过小鼠生物活性实验、抗原性实验、免疫原性实验加以验证，说明在重组表达的CNTF蛋白中，未复性好的异构体蛋白CNTF-B是产生抗原性及免疫原性的主要因素。而且也证明了本发明的方法可以有效分离重组人睫状神经营养因子中的异构蛋白。权利要求1、从重组人睫状神经营养因子及其突变体中分离异构蛋白的方法，其特征是将收集的湿菌体以1∶5～1∶10(W/V)的比例加入洗涤缓冲液，制成菌体混悬液，超声破碎至菌体完全破裂、包涵体溶出，再在8000×g～12000×g离心，弃去上清，将沉淀用含1～3mol/L尿素、0.5％TritonX-100的TE缓冲液充分洗涤，得到表达蛋白包涵体，再用含变性剂6mol/L的盐酸胍或是8mol/L的尿素的缓冲液将该包涵体充分溶解至蛋白含量为1～0.5mg/ml，得到包涵体溶解液，将包涵体溶解液用pH8.5，0.05mol/LTris-HCl，0.5mol/L精氨酸、1mmol/LEDTA的缓冲液进行稀释复性，直至目的蛋白的终浓度小于100μg/ml，变性剂的终浓度小于1mol/L；4℃放置24～48h，成为CNTF复性蛋白液，超滤浓缩后，经凝胶层析G-25柱转换至Tris.Cl缓冲液中，收集蛋白峰，上QSephrose-FastFlow阴离子交换柱，去除未复性好的CNTF蛋白及杂蛋白；离子交换层析的上样缓冲液为pH7.0～8.5，Tris-HCl，1mmol/LEDTA，解离缓冲液为pH7.0～8.5，Tris-HCl，1mmol/LEDTA、含0.1～0.5mol/LNaCl，再将解离收集的目的蛋白上Octyl-4FastFlow疏水层析柱去除DNA及内毒素，疏水层析的条件为A液为Tris-HCl，其pH7.0～8.5，含1mmol/LEDTA和0.1～0.5mol硫酸铵；B液为Tris-HCl，其pH7.0～8.5，含1mmol/LEDTA，用A液和B液梯度解离，收集蛋白峰后再上Superdex-75凝胶层析柱，所用缓冲液为pH7.0～8.0的磷酸缓冲液，收集目的蛋白峰，即为CNTF原液。全文摘要本发明涉及一种从基因重组表达的蛋白中分离出异构蛋白的方法。本发明的方法是将收集的湿菌体在洗涤缓冲液制成菌体混悬液，经超声破碎离心，弃去上清，沉淀用含尿素、TritonX-100的TE缓冲液洗涤得到表达蛋白包涵体，再用含盐酸胍或是尿素的缓冲液将该包涵体充分溶解，将包涵体溶解液用含有Tris-HCl、精氨酸和EDTA缓冲液进行稀释复性，再放置24～48h，成为CNTF复性蛋白液，超滤浓缩后，经凝胶层析G-25柱转换至Tris缓冲液中，收集蛋白峰，再将转换了液体的CNTF复性蛋白液上QSephrose-FastFlow阴离子交换柱，去除未复性好的CNTF蛋白及杂蛋白。文档编号C07K1/36GK101113174SQ20071012613公开日2008年1月30日申请日期2007年6月12日优先权日2007年6月12日发明者卜晓萍,应莲芳,萍李,梁凌宇,琳蒋,溱谢,马亚茹,高雪峰申请人:兰州生物制品研究所