专利名称：：黄青霉酰胺的制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用产黄青霉No.005户训'c朋柳c/!，oge"腦制备黄青霉酰胺的方法，该菌株已于2007年11月29日保藏在(中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCCM207186);本发明还涉及该化合物在保护由&02损伤的SH-SY5Y细胞方面的用途。
背景技术：
：含有[2,2，2]二环二氮杂辛烷片断的氧化吲哚生物碱已有一些文献报道，如Baiiks，R.M.，Blanchflower,S.E.,EverettJ.R.，Manger,B.R.，andReading,C.,NovelanthelminticmetabolitesfromanA戸g/肠species;theaspergillimides.>/.Jw版of.，1997，50,840-846;Polonsky,J.,Merrien,M.A.，Prange,T.，Pascard，C.andMoreau，S..Isolationandstructure(x-rayanalysis)ofmarcfortineA，anewalkaloidfromjPe/w.d///w/wro《we々W/.GCTie附.C*o;w/m.'1980，13，601-602;Wilson,B.J.,Yang,D.T.C.andHarris,T.M.，Production,isolation,andpreliminarytoxicitystudiesofbrevianamideAfromculturesof尸ewz'c!7/z'w加Vz>7'c!'caft//m.^P//.Af/cro6/o/.，1973，26，633-635;该类化合物最主要的结构特征是有一个吲哚片断组成的螺环片断和一个[2,2，2]二环的二氮杂辛垸片断。吲哚部分常有一个异戊烯基都是通过氧原子与其相连，或者是环合在吲哚的苯环片断上。这类化合物显示了许多生物活性，如抗寄生虫活性，抑制肿瘤生长活性和细胞毒性等。本发明人研究发现产黄青霉(/>em'c////"/c/w^ogemw/)No.005液体发酵产物经超声破碎后的粗提物对H202引起的神经细胞(SH-SY5Y)损伤具有保护活性，遂对其活性成分进行了研究，结果发现了一个新的具有神经细胞保护活性的黄青霉酰胺化合物(ChrysogenamideA)。
发明内容本发明旨在提供一个结构独特的具有神经细胞保护活性的新化合物。本发明的目的还在于提供一个化合物的制备方法及其在经细胞保护活性或抗老年痴呆症方面的用途。本发明首次从产黄青霉No.005c/w;ywge""附)发酵物中发现了一个新的黄青霉酰胺(ChrysogenamideA),如式I所示其结构特征是含有[2，2，2]二环二氮杂辛垸片断的氧化吲哚生物碱上述发明中的化合物是由中药肉苁蓉内生真菌产黄青霉No.005(Pe"&!7//"/c/y"oge""/w)的液体发酵物经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮为溶剂进行梯度洗脱，石油醚-丙酮3:2洗脱物，再经反相硅胶柱层析，进一步经HPLC，以甲醇-水80:20洗脱得式I化合物。本发明釆用MTT法测试了式I化合物拮抗H202引起的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡活性。实验证实，式I化合物对SH-SY5Y细胞具有保护作用。因此本发明的式I化合物可用作神经细胞保护剂。式I化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗老年痴呆症药物,用于老年痴呆症的治疗。本发明的式I化合物可通过微生物发酵培养，然后从发酵物中分离纯化而得到；也可由上述优选化合物经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I化合物的方法可采用其它任何能生产该类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可作为生产菌用于制备式I化合物。具体实施例方式在如下的实施例中所指的化合物1的化学结构分别是(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)实施例1化合物1的发酵生产及分离精制1发酵生产生产菌的发酵培养按培养微生物的常规方法，取产黄青霉No.005(Pe"z'cz7//M/nc/^犯ge"薩)(中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCCM207186))适量，接种到PDA斜面培养基上，在28'C培养箱中培养4天。取斜面培养4天的产黄青霉No.005(Pem'a7/!'柳c/iowgew廳)适量，接种到35个装有300mL培养液[培养基组成(克/升)麦芽糖20.0，甘露醇20.0,葡萄糖10.0，味精5.0，蛋白胨5.0，酵母膏3.0,pH7.0]的lOOOmL锥型瓶中，在24'C条件下静止培养30天，获得产黄青霉No.005(Pe"/ci7/i'wnc/w^ogem/附)的菌丝体和发酵液。2浸膏的获得用棉布将菌丝体和发酵液分离。将菌丝体用丙酮浸提三次，减压浓縮至不含丙酮，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓縮，得粗浸膏。发酵液减压浓縮为四分之一体积后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌丝体和发酵液的浸膏，共9.5克。3化合物的分离精制浸膏(9.5克)用氯仿-甲醇(9:l)混合溶剂溶解后，加20克200-300目硅胶(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚-丙酮为溶剂进行梯度洗脱，分为15个流份。Fr-4(26mg，石油醚-丙酮3:2洗脱物)，经多次反相硅胶柱层析(甲醇-水)，再经制备HPLC,以甲醇-水80:20洗脱得ChrysogenamideA(2.6mg)。ChrysogenamideA,淡黄色粉末，分子式为C28H37N302。&及13CNMR数据见表1。表1NMRDataforChrysogenamideA(ppminNo.13C1-NH10.36s——2—183.1,qC3一62.3，qC47.18d(7.3)123.6,CH56.90dd(7.3，7.3)120.8，CH66.94d(7.3)127.7,CH7—122.1，qC8—140.4，qC9一129.9,qC10a2.20ma39.9，CH210b2.09ma11—60.4qC12a3.32d(8.7)64.9，CH212b2.22ma—13—58.7,qC14a1.44ma20.7，CH214b1.15ma15a2.08m31.8,CH215b10.36s16a1.52m34.3，CH216b1.08m172.02m58.7，CH18—172.3,qC<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2抗老年痴呆活性的测试1实验样品及实验方法被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物ChrysogenamideA。准确称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供活性测试。细胞系及细胞的继代培养活性测试采用SH-SY5Y细胞系。用含10%PBS的DMEM培养基，在37°<:通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。细胞增殖抑制活性测试方法(MTT法)本发明采用MTT法，测试评价了被测试样品对癌细胞增殖的抑制活性。活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4,5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的甲簪(formazan)，甲簪的多少可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于formazan的量与活细胞数成正比，所以可根据吸收度求出活细胞的数目，从而了解药物对细胞的影响。活性测试时，取对数生长期的SH-SY5Y细胞，用新鲜的DMEM培养基配制成密度为每毫升5><104个细胞的细胞悬液，按每孔180uL接种于96孔板中，培养24h后加入药液20uL/孔，对每个浓度均设三个复孔，另设空白对照组和模型组。细胞在37。C、5。/。C02条件下培养4小时后，除空白对照组外，每孔加入H2O2(终浓度200yM)损伤细胞，37。C、5。/。C02条件下培养4小时后，每孔加入MTT溶液20//KPBS配置，5mg/ml)，继续培养4小时后，仔细去上清，加入DMSO200;/l/孑L，然后用酶标仪测00570/630值。按下列公式计算被测物对细胞的保护作用<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>结果评价给药组的成活率越高，样品对细胞的保护作用越强。2实验结果化合物ChrysogenamideA的神经细胞保护活性结果见说明书附图1:化合物ChrysogenamideA对H202引起的SH-SY5Y细胞的保护作用。3结论化合物ChrysogenamideA在低浓度下对神经母细胞瘤细胞具有明显的保护作用。因此,本发明的式I化合物可作为抗老年痴呆症的治疗。权利要求1.式I化合物式I2.权利要求1所述式I化合物的制备方法，其特征是发酵培养产黄青霉No.005Pem'"7/z'wwc/20^oge/i"/n(中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCCM207186),获取含有上述式I化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出式I化合物。3.权利要求2所述的制备方法，其中将所述发酵物经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮为溶剂进行梯度洗脱，石油醚-丙酮3:2的洗脱物，再经反相硅胶柱层析，进一步经制备HPLC，以甲醇-水80:20洗脱得式I化合物。4.权利要求1所述的式I化合物在保护经11202损伤的SH-SY5Y细胞中的用途。5.权利要求1所述的式I化合物在制备抗老年痴呆症药物中的用途。全文摘要本发明涉及黄青霉酰胺的制备方法和用途。本发明用从新鲜中药肉苁蓉肉质鳞茎中分离得到的产黄青霉No.005Penicilliumchrysogenum生产出黄青霉酰胺(ChrysogenamideA)。经实验证实，该化合物对H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>损伤的SH-SY5Y细胞具有显著的保护作用，有望开发成为抗老年痴呆症药物。文档编号C07D487/00GK101463036SQ20071030217公开日2009年6月24日申请日期2007年12月18日优先权日2007年12月18日发明者方玉春,朱伟明,朱天骄,林贞建,顾谦群申请人:中国海洋大学