抗5t4抗体及其用途的制作方法

专利名称：：抗5t4抗体及其用途的制作方法
技术领域：
：总的来说，本发明涉及用于诊断和/或治疗赘生性或恶性病症的抗5T4抗体和抗体/药物缀合物(即，免疫缀合物)。本发明还涉及用于制备抗5T4抗体和抗体/药物缀合物的分离的可变区核酸和多肽。
背景技术：
：高亲和力单克隆抗体的可得性已使得能够开发靶向免疫治疗。根据这种方法，治疗剂与对于限定的靶细胞群具有结合特异性的抗体偶联。已与单克隆抗体缀合的治疗剂包括细胞毒素、生物应答调节剂、酶(例如，核糖核酸酶)，凋亡诱导蛋白质和肽、和放射性同位素。抗体/细胞毒素缀合物一般称为免疫细胞毒素。与低分子量药物例如氨甲蝶呤缀合的抗体一般称为化学抗体/药物缀合物。描述为免疫调谐剂(immunomodulator)的缀合物包含生物应答调节剂例如淋巴因子、生长因子和补体激活眼镜蛇毒因子(CVF)。放射性标记的抗体包括可以用于放射治疗以及成像的放射性同位素。对肿瘤细胞进行抗体介导的药物递送可以通过使药物在正常组织中的摄入降到最低来增强药物功效。参见例如，Reff等人(2002)CancerControl9:152-66;Sie雷s(2000)CancerChemother.Pharmacol.46S叩pl:S18-22;Goldenberg(2001)Crit.Rev.Oncol.Hematol.39:195-201。MYLOTARG(吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin))是商购可得的耙向免疫治疗，其才艮据这种原理起作用并批准用于治疗老年患者中的急性髓性白血病。参见Sievers等人(1999)Blood93:3678-84。在这种情况下，把向分子是与加利车霉素(calicheamincin)缀合的抗CD33单克隆抗体。然而，在人中的靶向免疫治疗受到限制，部分原因是对于非人单克隆抗体的不良应答。使用啮齿类动物抗体的早期临床试验揭示人抗小鼠抗体(HAMA)和人抗大鼠抗体(HARA)应答，这导致快速的抗体清除。其后已开发了免疫原性较小的抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体、PRIMATIZED⑧抗体、和使用转基因小鼠或噬菌体展示文库制备的人抗体。参见Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-5;Queen等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-33;Newman等人(1992)Biotechnology(NY)10:1455-60;Green等人(1994)Nat.Genet.7:13-21;Marks等人(1991)丄Mol.Biol.222:581-97。HAMA应答的避免允许高剂量和重复剂量的施用以达到治疗应答。用于药物靶向的候选抗体包括识别癌胚抗原的抗体，即存在于胎儿细胞和赘生细胞上，并且基本上不存在于正常成人细胞中的抗原。参见例如，Magdelena"1992)J.Immunol.Methods150:133-43。5T4癌胚抗原是72kDa高度糖基化的跨膜糖蛋白，其包含42kDa非糖基化的核心(Hole等人(1988)Br.丄Cancer57:239-46，Hole等人(1990)Int.J.Cancer45:179-84;PCT国际公开号WO89/07947;美国专利号5,869,053)。5T4包括特征在于2个富含亮氨酸的重复单位(LRRs)和居间亲水区的细胞外结构域，其是用于靶向治疗的可接近位点(Myers等人(1994)J.Biol.Chem.269:9319-24)。人5T4表达于众多癌症类型中，包括膀胱、乳腺、子宫颈、子宫内膜、肺、食道、卵巢、胰腺、胃和睾丸的癌，并且基本上不存在于正常组织中，除了胎盘中的合胞体滋养层(参见，例如，Southall等人(1990)Br.J.Cancer61:89-95(5T4抗原在正常和恶性組织中的免疫组织学分布)；Mieke等人(1997)Clin.CancerRes,3:1923-1930(在结肠直肠癌患者中肺瘤细胞上的低细胞间粘附分子1表达和高5T4表达与减少的无病存活相关)；Starzynska等人(1994)Br.J.Cancer69:899-902(结肠直肠癌中5T4癌胚抗原表达的预后意义)；Starzynska等人(1992)Br.J.Cancer66:867-869(结肠直肠和胃癌中的5T4抗原的表达)；Jones等人(1990)Br.J.Cancer61:96-100(宫颈癌中的5T4抗原的表达)；Connor和Stern(199)Int.J.Cancer46:1029-1034(宫颈癌中的MHCI类表达的丧失);Ali等人(2001)OralOncology37:57-64(正常、发育异常和恶性口腔粘膜上的5T4癌胚抗原的表达模式)；PCT国际公开号WO89/07947;美国专利号5,869,053)。例如，据报道无5T4表达的組织包括肝脏、皮肤、脾、胸腺、中枢神经系统(CNS)、肾上腺和卵巢。据才艮道具有病灶性或低的5T4表达的组织包括肝脏、皮肤、脾、淋巴结、扁桃腺、甲状腺、前列腺和精嚢。5T4的弱-中等弥散表达已在肾、肺、胰腺、咽和胃肠道中得到报道。据报道具有高5T4表达的唯一组织是合胞体滋养层；5T4也不存在于正常血清或孕妇血清中(即，水平〈10ng/ml)。5T4在肿瘤中的过量表达已与疾病ii^关联，并且5T4表达的评估已提议为用于鉴定具有短期预后的患者的有用方法(Mulder等人(1997)Clin.CancerRes.3:1923-30，Naganuma等人(2002)AnticancerRes,22:1033-1038，Starzynska等人(1994)Br.丄Cancer69:899-902，Starzynska等人(1998)Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.10:479-484,Wrigley等人(1995)Int.J.Gynecol.Cancer5:269-274)。几种抗5T4抗体已得到描述，包括mAb5T4(也称为H8抗体，其识别5T4抗原的构象表位(Shaw等人(2002)Biochem.J.363:137-45，PCT国际公开号WO98/55607))，大鼠单克隆抗体(Woods等人(2002)Biochem.丄366:353-65),和称为5T4的小鼠单克隆抗体(美国专利号5,869,053)。单链抗5T4抗体，以及包括与治疗分子融合的抗5T4抗体序列的融合蛋白也已得到描述。例如，与人IgGl恒定结构域融合或与鼠类B7.1的细胞外结构域融合的抗5T4抗体序列诱导5T4表达肿瘤细胞系的细胞裂解(Myers等人(2002)CancerGeneTher.9:884-896，Shaw等人(2000)Biochim.Biophys.Acta.1524:238-246;U.S.专利申请公开号2003/0018004)。类似地，与超抗原融合的单链抗5T4抗体可以在体外刺激非小细胞肺癌细胞的T细胞依赖性细胞裂解(Forsberg等人(2001)Br.J.Cancer85:129-136)。使用PNU-214936的I期临床试验显示有限的毒性和某些抗肺瘤应答，所述PNU-214936是与突变型超抗原葡萄球菌肠细胞毒素(enterocytotoxin)A(SEA)融合的单克隆抗体5T4的鼠类Fab片段(Cheng等人(2004)J.Clin.Oncol.22(4):602-9)。作为备选治疗方法，重组5T4疫苗也^皮提议用于治疗癌症(Mulryan等人(2002)Mol.CancerTher.1:1129-37;UK专利申请公开号2,370,571和2,378,704;EP专利申请公开号EP1,160,323和1,152,060)。本发明提供了新型抗5T4抗体、抗5T4/药物繳合物、用于生产所公开的抗体和抗体/药物缀合物的方法、以及关于其诊断和治疗用途的方法。发明概述本发明提供了新型抗5T4抗体、其缀合物、和关于其^f吏用的方法。还提供了分离的抗5T4多肽和编码其的分离的核酸。本发明的抗5T4抗体包括特异性结合人5T4抗原的抗体，其中所述抗体(a)包含鼠类Al、A2或A3抗体的抗原结合结构域；(b)与鼠类Al、A2或A3抗体竟争5T4结合；(e)结合由Al、A2或A3抗体结合的5T4表位；或(d)包含(a)-(c)抗体的5T4结合片段。本发明的抗5T4抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、四聚体抗体、四价抗体、多特异性抗体、结构域特异性抗体、单结构域抗体、或融合蛋白、或鼠类单克隆抗体。例如，本发明的人源化抗5T4抗体包括这样的抗体，其包含至少一个重链可变区或至少一个轻链可变区，其中该人源化抗体或抗体片段(a)包含鼠类A1、A2或A3抗体的抗原结合结构域；(b)与鼠类Al、A2或A3抗体竟争5T4结合；(c)结合由A1、A2或A3抗体结合的5T4表位；或(d)(a)-(c)抗体的5T4结合片段。本发明的抗5T4抗体具有对于人5T4抗原至少约1x10-7M至约1xl(T12M的结合亲和力。所公开的抗5T4抗体及其缀合物还可以显示在体内靶向5T4表达细胞的特异性结合。本发明的代表性抗5T4抗体包括包含重链可变区的抗体，所述重链可变区包含(a)SEQIDNO:2的残基20-138的^J^,列；(b)与SEQIDNO:2的残基20-138至少85%等同的氨基断列；(c)SEQIDNO:6的残基19-135的氨基断列；U)与SEQIDNO:6的残基19-135至少86%等同的絲齡列；(e)SEQIDNO:10的残基20-141的氨基断列；(f)与SEQIDNO:10的残基20-141至少91%等同的#^齡列；(g)SEQIDNOs:49、51、52、54、56、77、78、81或82中的任何一个的氨基断列；(h)与SEQIDNO:51至少91%等同的氨基酸序列；(i)与SEQIDNO:54至少78%等同的氨基酸序列；(j)与SEQIDNO:77至少89%等同的氨基断列；(k)与SEQIDNO:78至少790/。等同的氨基断列；(I)与SEQIDNO:81至少80%等同的氨基齡列；或(m)与SEQIDNO:82至少78%等同的氨基齡列。本发明的代表性抗5T4抗体包括包舍轻链可变区的抗体，所述轻链可变区包含(a)SEQIDNO:4的残基21-127的氨基齡列；(b)与SEQIDNO:4的残基21-127至少94%等同的氨基,列；(c)SEQIDNO:8的残基23-130的氨基酸序列；(d)与SEQIDNO:8的残基23-130至少96%等同的#^,列；(e)SEQIDNO:12的残基21-127的氨基,列；(f)与SEQIDNO:12的残基21-127至少98%等同的#^断列；(g)SEQIDNOs:58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、79、80、83或84中的任何一个的氨基酸序列；(h)与SEQIDNO:60至少83%等同的氨基酸序列；(i)与SEQIDNO:70至少93%等同的氨基,列；(j)与SEQIDNO:76至少85%等同的M齡列；U)与SEQIDNO:76至少85%等同的氨基酸序列；(l)与SEQIDNO:79至少88%等同的氨基酸序列；(m)与SEQIDNO:80至少84%等同的^J^酸序列；(n)与SEQIDNO:83至少卯％等同的^J^酸序列；或(o)与SEQIDNO:84至少91%等同的^i^^列。例如，抗5T4抗体可以包含(a)包含SEQIDNO:2的残基20-138的氨基酸序列的重链可变区，和包含SEQIDNO:4的残基21-127的氨基酸序列的轻链可变区；(b)包含衍生自SEQIDNO:6的残基19一135的氨基,列的重链可变区，和包含衍生自SEQIDNO:8的残基23-130的M,列的轻链可变区；或(c)包含衍生自SEQIDNO:10的残基20-141的^J^酸序列的重链可变区，和包含衍生自SEQIDNO:12的残基21-127的氨基酸序列的轻链可变区。本发明的嵌合和人源化抗5T4抗体可以包含衍生自人恒定区的恒定区，例如衍生自人k轻链恒定区的人轻链恒定区，和衍生自人IgGl或人IgG4重链恒定区的人重链恒定区。本发明的代表性人源化抗5T4抗体包括这样的抗体，其包含(a)包含人抗体构架区的残基的构架区；和(b)SEQIDNO:4、8或12的轻链可变区的一个或多个CDRs，或SEQIDNO:2、6或10的重链可变区的一个或多个CDRs。例如，人抗体构架区的残基可以包含(a)DPK24亚群IV种系克隆，VkIII亚群(DPK23、DPK22、DP詣、DPK21)，或VkI亚群种系克隆(DPK9、DPKl、02、DPK7)的人抗体轻链构架区；(b)选自下述的人抗体重链构架区DP-21(VH7)、DP-54(VH3-07)、DP-47(VH3-23)、DP-53(VH-74)、DP-49(VH3-30)、DP-48(VH3-13)、DP-75、DP8(VHl-2)、DP-25、VI-2b和VI-3(VH103)、DP-15和VI-8(VH1-08)、DP-14和Vl-18(VH1-18)、DP-5和V1-24P(VH1-24)、DP-4(VH1-45)、DP-7(VH1-46)、DP-IO、DA-6和YAC-7(VH1-69)、DP-88(VHl-e)、DP画3和DA-8(VHl-f);(c)(b)的重链构架区的共有序列；或(d)与(a)-(c)的构架区至少63%等同的构架区。本发明的代表性人源化抗5T4抗体还可以包括SEQIDNOs:SEQIDNOs:2、4、6、8、10或12的2个或更多CDRs,例如SEQIDNO:4、8或12的轻链可变区的2个或所有3个CDRs，或SEQIDNO:2、6或10的重链可变区的2个或所有3个CDRs，或SEQIDNO:4、8或12的轻链可变区的一个或多个CDRs和SEQIDNO:2、6或12的重链可变区的一个或多个CDRs,或SEQIDNOs:2、4、6、8、10或12的所有CDRs。代表性嵌合和人源化抗5T4抗体包括包含重链可变区序列的抗体，所述重链可变区序列包含(a)SEQIDNO:2的残基20-138的氨基酸序列；(b)与SEQIDNO:2的残基20-138至少85%等同的氨基齡列；(c)SEQIDNO:6的残基19—135的氨基,列；(d)与SEQIDNO:6的残基19-135至少86%等同的#^齡列；(e)SEQIDNO:10的残基20-141的絲酸序列；(f)与SEQIDNO:10的残基20-141至少91%等同的氨基,列；(g)SEQIDNO:49的残基1—119的^J^崎列；(h)与SEQIDNO:49的残基1-119至少90%等同的氨基,列；或(i)图9A-9C中所示的人源化重链可变区的M,列。本发明的另外的嵌合和人源化抗5T4抗体包括包含由核酸编码的重链可变区的抗体，所述核酸包含(a)SEQIDNO:1的核苷酸58-414的核苷酸序列；(b)SEQIDNO:5的核苷酸55-405的核苷酸序列；(c)SEQIDNO:9的核苷酸58-423的核苷酸序列；(d)SEQIDNO:48的核普酸1-358的核香酸序列；(e)编码图9A-9C中所示的人源化A1、A2或A3可变区的核苷酸序列；(f)与(a)-(e)中的任何一个的核苷酸序列至少90%等同的核苷酸序列；或(g)在严格杂交条件下与(a)-(e)中的任何一个的互补物特异性杂交的核酸。代表性嵌合和人源化抗5T4抗体包括包含轻链可变区序列的抗体，所述轻链可变区序列包含(a)SEQIDNO:4的残基21-127的M酸序列；(b)与SEQIDNO:4的残基21-127至少94%等同的M酸序列；(c)SEQIDNO:8的残基23-130的絲断列；(d)与SEQIDNO:8的残基23-130至少96。/o等同的城辦列；(e)SEQIDNO:12的残基21-127的氨基酸序列；(f)与SEQlDNO:12的残基21-127至少98%等同的氨基酸序列；或(g)图9A-9C中所示的人源化Al、A2或A3轻链可变区的氨基^列。还提供的是用于药物递送的抗体/药物缀合物，其包含(a)本发明的嵌合或人源化抗5T4抗体或抗体片段；和(b)药物，其与所述抗体直接或间接结合。代表性药物包括治疗剂，例如细胞毒素、放射性同位素、免疫调谐剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促凋亡剂、化学治疗剂和治疗性核酸。细胞毒素可以是例如抗生素、微管蛋白聚合的抑制剂、烷化剂、蛋白质合成抑制剂、蛋白激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、拓朴异构酶抑制剂或酶。抗生素细胞毒素，例如加利车霉素、加利车霉素、N-乙酰-o加利车霉素或其衍生物，例如N-乙酰-口-加利车霉素二甲基酰肼，对于抗癌治疗特别有用。所公开的抗5T4抗体/药物缀合物可以包括用于使抗体与药物结合的接头。代表性接头包括4-(4'乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)、3-乙酰苯基乙酸(3誦acetylphenylacidicacid)(AcPac)、4-巯基-4-甲基-戊酸(Amide)。抗体/药物缀合物还可以包括聚乙二醇或其他试剂以增强药物掺入。关于药物向5T4表达细胞的递送，本发明提供了使细胞与抗体/药物缀合物接触的方法，所述抗体/药物缀合物包含(i)嵌合或人源化抗5T4抗体，和(ii)与人源化抗5T4抗体直接或间接结合的药物。根据所公开的方法，药物被内化至靶细胞内。治疗方法也在本文中得到公开，其包括给患有5T4阳性癌症的受试者施用治疗有效量的抗5T4抗体/药物缀合物，所述抗5T4抗体/药物缀合物包含(i)嵌合或人源化抗5T4抗体或抗体片段，和(ii)与人源化抗5T4抗体或抗体片段直接或间接结合的治疗剂。本发明的抗5T4治疗可以与任何其他已知治疗组合用于取得改善的效应。第二种治疗剂可以与抗5T4抗体/药物缀合物组合同时或以任何顺序连续施用。还提供的是编码人源化抗5T4可变区的分离的核酸，其对于生产所公开的人源化抗5T4抗体有用。编码人源化抗5T4重链可变区的代表性核酸包括(a)SEQIDNO:1的核苷酸58-414的核苷睃亭列；(b)SEQIDNO:5的核苷酸55-405的核苷酸序列；(c)SEQIDNO:9的核苷酸58-423的核苷酸序列；(d)编码SEQIDNOs:48、50、53或55中的vf壬何一个的核苷,列；(e)当查询覆盖度(querycoverage)为100%时，与SEQIDNO:50至少89%等同的核苷酸序列；(f)当查询覆盖度为100%时，与SEQIDNO:53至少82%等同的核苦酸序列；或(g)在严格杂交条件下与(a)-(d)中的任何一个的互补物特异性杂交的核酸。编码人源化抗5T4轻链可变区的代表性核酸包括(a)SEQIDNO:3的核苷酸61-381的核普酸序列；(b)SEQIDNO:7的核苷酸67-390的核苷酸序列；(c)SEQIDNO:11的核苷酸61-381的核苷酸序列；(d)编码SEQIDNOs:57、59、61、63、65、67、69、71、73或75中的4壬何一个的人源化A1、A2或A3轻链可变区的核苦酸序列；(e)当查询覆盖度为100%时，与SEQIDNO:59至少84%等同的核苷酸序列；(f)当查询覆盖度为100%时，与SEQIDNO:69至少86°/。等同的核苷酸序列；(g)当查询覆盖度为100%时，与SEQIDNO:75至少85%等同的核苷酸序列；或(h)在严格杂交条件下与(a)-(d)中的任何一个的互补物特异性杂交的核酸。附图筒述图1A-1C显示鼠类抗5T4抗体A1、A2、和A3的重链和轻链可变区的核普酸及氨基酸序列。对氨基酸序列进行注释，以通过下划线标出互补决定区(CDRs)和通过双下划线标出前导序列。图2是使用CT26/5T4细胞裂解物制备和用所指出的抗体探测的蛋白质印迹。图3A-3B是显示关于H8和Al抗体的2个独立制剂的应答曲线和结合动力学的曲线图。这些制剂基本上是等价的。图4A-4C是显示MDAMB435/5T4细胞对H8、Al、A2和A3抗体的调节的曲线图。细胞表面上的抗体水平随着时间过去而下降(图4A、4C)(实心))，而上清液中的抗体水平保持恒定(图4B、4C(空心))。MCF，平均细月包荧光；supt，上清液。图5是人月包外域5T4Fc构建体、小鼠胞外域5T4Fc构建体、和人/小鼠5T4嵌合构建体的示意图。这些构建体用于如实施例4中所述的表位作图。图6A-6B显示人源化H8和所示之每一个抗体竟争性结合人5T4胞外域Fc融合蛋白的图示结果。HuH8，人源化H8抗体；ChiAl,嵌合A1抗体；ChiAl+C67F,具有C67F突变的嵌合Al抗体；ChiA2，嵌合A2抗体；muA2，鼠类A2抗体；ChiA3，嵌合A3抗体；ChiA3+C91Y,具有C91Y突变的嵌合A3抗体；muA3，鼠类A3抗体；NoAb，无抗体(对照)。图7是显示由H8、Al、A2、和A3结合的人5T4表位的线性图。所指出的残基是由Myers等人(1994)丄Biol.Chem.269(12):9319-9324描述的5T4抗原的残基，其也可从Genbank登记号Z29083(SEQIDNO:87)获得。LRR，富含亮氨酸的重复单位。图8显示了如实施例6中所述进行的球状体(spheroid)试验的结果。与对照细胞(MDAMB435/neo)比较，使用Al和A3抗体制备的抗5T4/加利车霉素缀合物显著抑制5T4表达细胞(MDAMB435/5T4)的生长。CMA-676,抗CD33/加利车霉素缀合物；huH8-AcBu仁CalichDMH,使用4-(4'-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)与加利车霉素缀合的人源化H8抗体；CalichDMH，未缀合的加利车霉素；Al-AcBut-CalichDMH，使用4-(4'-乙酰苯氧基)丁酸(AdBut)与加利车霉素缀合的Al抗体；A3-AcBut-Calich画H，使用4-(4'-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)与加利车霉素缀合的A3抗体。图9A-9H显示人源化Al重链可变区1版的核苷酸和M酸序列(SEQIDNOs:48—49);人源化A1重链可变区(huAlVH)1.2和2.0版的氨基^列；人源化A1轻链可变区(huAlVL)1.0、2.0和3.0版的氨基酸序列；人源化A2重链可变区1.0和2.0版(huA2VH)的M^列；人源化A2轻链可变区1.0和2.0版(huA2VL)的^ij^酸序列；人源化A3重链可变区1.0和2.0版(huA3VH)的#^酸序列；和人源化A3轻链可变区1.0和2.0版(huA3VL)的M^f列。CDRs是有下划线的。图10A-10B显示可以用于制备人源化抗5T4抗体的代表性人重链可变区构架序列。图IOA是亚群I的人重链可变区序列(SEQIDNOs:14-24)的比对和由此得出的共有构架序列(SEQIDNOs:25-27)。图10B显示了VH7和VH3亚群的人种系基因的序列(SEQIDNOs:88-93)。图11是亚群VkIII的人轻链可变区序列(SEQIDNOs:29-34)的比对。有框的序列，CDRs。图12是亚群VkI的人轻链可变区序列(SEQIDNOs:35-44)的比对。有框的序列，CDRs。图13显示VkI和VkIV亚群的另外的人种系序列，其具有可以用于制备人源化抗5T4抗体的构架区(SEQIDNOs:94-99)。图14显示可以用于制备嵌合和人源化抗5T4抗体的代表性人恒定区的氨基,列(SEQIDNOs:45—47)。图15显示全长食蟹猴(cynomologous)5T4抗原和部分黑尾绒猴5T4抗原的氨基酸序列。有下划线的序列，引导序列。对于每个序列，5T4胞外域包括氛基酸30-356。发明详述I.抗5T4抗体本发明提供了结合人5T4抗原并对于开发靶向免疫治疗有用的新型鼠类抗体。该人5T4抗原是在滋养层细胞和众多种癌细胞的表面上发现的72kDa非糖基化的磷蛋白。参见Hole等人(1988)Br.J.Cancer57:239-46,Hole等人(1990)lnt.J.Cancer45:179-184;PCT国际公开号WO89/07947;美国专利号5,869,053。本发明的鼠类抗5T4抗体命名为Al、A2和A3,并且如实施例1中所述进行制备。还提供的是衍生自Al、A2和A3并且与人5T4抗原特异性结合的抗5T4抗体。例如，本发明的抗5T4抗体包括包含来自Al、A2和A3抗体的抗原结合残基的抗体；与A1、A2或A3抗体竟争结合5T4抗原的抗体；和与A1、A2或A3抗体结合相同的5T4表位的抗体。特别地，所公开的Al、A2和A3均包含识别人5T4抗原上的独特表位的抗原结合位点。此外，这些抗体之每一个还与H8结合不同的表位，并且A1、A2和A3均不与H8抗体竟争结合人5T4。参见实施例4-5和图6-7。因此，本发明提供了与人5T4的残基30-163特异性结合的抗体(例如，A3)，与人5T4的残基224-276特异性结合的抗体(例如，Al)，和与人5T4的残基224-355特异性结合的抗体(例如，A2)。还提供的是包含由A1、A2或A3抗体结合的表位的人5T4抗原。例如，本发明提供了包含天然或全长5T4抗原的残基30-163、224-276和224-355的5T4抗体片段。所公开的抗5T4抗体的特异性结合指在包含多种不同抗原的非均质样品中抗体与人5T4抗原的优先结合。一般地，如果结合亲和力为至少约10—7M或更高，例如至少约l(T8M或更高，包括至少约l(T9M或更高，至少约IO-"M或更高，或至少约10"M或更高，那么特异性结合发生。例如，本发明的抗体与人5T4抗原的特异性结合包括在至少约1xl(T7M-约1x1(T12M的范围中的结合，例如在约1x10_8M-约1x1012M的范围内的结合，或在约1xl(T8M-约1xl(T"M的范围内的结合，或在约1x10—8M-约1xIO"0M的范围内的结合，或在约1xl(T9M-约1x10—10M的范围内的结合。特异性结合还指在给受试者施用抗体后抗5T4抗体对5T4表达细胞的选择性粑向。本发明的抗5T4抗体可以具有四聚体结构(例如，类似于天然存在的抗体)，或它们可以包含具有至少一个免疫球蛋白轻链可变区或至少一个免疫球蛋白重链区、或其5T4结合片段(例如，Fab、经修饰的Fab、F(ab')2或Fv片段)的任何其他结构。还包括的是单结构域抗体，其中一个或多个互补决定区(CDRs)(但小于所有6个CDR)构成抗原结合区域。本发明还包括嵌合抗体、人源化抗体、超人源化抗体、双抗体(diabody)、单链抗体、四价抗体、和/或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。这些抗体叙词并非互相排斥的。天然存在的抗体是约150,000道尔顿的四聚(H2L2)糖蛋白，由2条相同的轻(L)链和2条相同的重(H)链组成。2条重链通过二硫键彼此连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。轻链和重链各自进一步由氨基末端可变区和恒定区表征。可变区包括在抗体中广泛不同并且基本上决定特定抗体对于其特定抗原的结合亲和力和特异性的序列。轻链和重链的可变区对齐以形成抗原结合结构域。嵌合抗体包含来自至少2个不同物种的序列。作为一个例子，重组克隆技术可以用于包括来自非人抗体(即，在用抗原免疫的非人物种中制备的抗体)的包含抗原结合位点的可变区和衍生自人免疫球蛋白的恒定区。本发明的嵌合抗5T4抗体包括包含Al、A2和A3抗体的重链和轻链可变区的抗体，所迷可变区即是(a)具有SEQIDNO:2的残基20-138的M酸序列的重链可变区，和具有SEQIDNO:4的残基21-127的氨基酸序列的轻链可变区；(b)SEQIDNO:6的残基19-135的重链#^酸序列，和SEQIDNO:8的残基23-130的轻链4J^酸序列；和(c)SEQIDNO:10的残基20-141的重链氨基酸序列，和SEQIDNO:12的残基21_127的轻链氨基酸序列。代表性人源化抗5T4抗体可以包括如SEQIDNO:49的氨基酸1-119所示的重链可变区，或图9A-9C中所示的人源化重链可变区之任一，和同样在图9A-9C中显示的人源化轻链可变区。本发明的代表性嵌合和人源化抗5T4抗体的制备在实施例7中得到描述。本发明的抗5T4抗体还可以包含重链和/或轻链可变区，所述可变区包含衍生自或基本上类似于Al、A2或A3可变区，或基本上类似于人源化Al、A2和A3可变区的氨基酸序列。就基本上相同的重链和轻链可变区而言，该基本上相同的序列至少约90%等同于SEQIDNOs:1-12中的任何一个的可变区序列或图9A-9C中所示的人源化Al、A2和A3可变区，例如至少91%等同、或至少92%等同、或至少93%等同、或至少94%等同、或至少95。/。等同、或至少96%等同、或至少97%等同、或至少98%等同、或至少99%等同。本发明的代表性嵌合抗5T4抗体，即与5T4抗原特异性结合的抗体，还包括这样的抗体，其具有(a)如SEQIDNO:2的残基20-138、SEQIDNO:6的残基19-135、SEQIDNO:10的残基20-141所示的重链可变区^J^,列，或图9A-9C中所示的人源化Al、A2或A3重链可变区中的任何一个；(b)与SEQIDNO:2的残基20-138至少85°/。等同的重链可变区氨基断列；(c)与SEQIDNO:6的残基19-135至少86°/。等同的重链可变区氨基,列；(d)与SEQIDNO:10的残基20-141至少91。/。等同的重链可变区^t^酸序列；(e)与SEQIDNO:49的残基l-119至少卯。/。等同的重链可变区M酸序列；或(f)衍生自图9A-9C中所示的人源化Al、A2或A3可变区中的任何一个的重链可变区絲断列。与5T4抗原特异性结合的嵌合或人源化抗5T4抗体的重链可变区可以由下述核酸编码(a)包含SEQIDNO:1的核苷酸58-414、SEQIDNO:5的核苷酸55-405、SEQIDNO:9的核苷酸58-423、SEQIDNO:48的核苷酸1-358的核苷酸序列的核酸；或编码图9A-9C中所示的人源化Al、A2或A3重链可变区的核酸；(b)包含与如下核酸至少卯％等同的核苷酸序列的核酸，所述核酸包含SEQIDNO:1的核苷酸58-414、SEQIDNO:5的核普酸55-405、或SEQIDNO:9的核苷酸58-423的核苷酸序列。例如，嵌合抗5T4抗体的重链可变区可以由这样的核酸编码，所述核酸与SEQIDNO:1的核苦酸58-414至少98%等同、包含与SEQIDNO:5的核苷酸55-405至少98%等同的核苷酸序列，或包含与SEQIDNO:48的核苦酸1-358至少89%等同的核苷酸序列。嵌合抗5T4抗体的重链可变区还可以由在严格杂交条件例如于65°C0.1XSSC的最终洗涤条件下，与如下核酸的互补物特异性杂交的核酸编码，所述核酸包含SEQIDNO:1的核苷酸58-414、SEQIDNO:5的核苷酸55-405、或SEQIDNO:9的核苦酸58-423、或SEQIDNO:48的核苷酸1-358的核苷断列。本发明的代表性嵌合抗5T4抗体进一步包括这些抗体，其具有(a)如SEQIDNO:4的残基21—127、SEQIDNO:8的残基23—130、SEQIDNO:12的残基21-127所示的轻链可变区狄,列、或图9A-9C中所示的人源化A1、A2或A3轻链可变区的残基；或(b)与SEQIDNO:4的残基21-127、SEQIDNO:8的残基23—130、或SEQIDNO:12的残基21-127至少卯％等同的轻链可变区#^酸序列。例如，轻链可变区^^酸序列可以包含(a)与SEQIDNO:4的残基21-127至少94%等同的轻链可变区氨基,列；(b)与SEQIDNO:8的残基23-130至少96%等同的轻链可变区氨基酸序列；(c)与SEQIDNO:12的残基21-127至少98%等同的轻链可变区氨基酸序列；或(d)衍生自图9A-9C中所示的人源化Al、A2或A3轻链可变区中的任何一个的轻链可变区狄齡列。酸编码(a)包含SEQIDNO:3的核苷酸61-381、SEQIDNO:7的核苦酸67-3卯、SEQIDNO:11的核苷酸61-381的核苷酸序列、或编码图9A-9C中所示的人源化Al、A2或A3轻链可变区中的任何一个的核苷酸的核酸；或(b)包含与SEQ1DNO:3的核苷酸61-381、SEQIDNO:7的核苷酸67-390、或SEQII)NO:11的核苷酸61-381至少90%等同的核苷酸序列的核酸。例如，嵌合抗5T4抗体的轻链可变区可以由这样的核酸编码，其包含(a)与SEQ11)NO:3的核苷酸61-381至少97%等同的核苷酸序列；(b)与SEQIDNO:7的核苷酸67-390至少98%等同的核苷酸序列；或(c)与SEQIDNO:11的核苷酸61-381至少99%等同的核苷酸序列。与5T4抗原特异性结合的嵌合抗5T4抗体的轻链可变区还可以由在严格杂交条件例如于65°C0.1XSSC的最终洗涤条件下，与如下核酸的互补物特异性杂交的核酸编码，所述核酸包含SEQIDNO:3的核苷酸61-381、SEQIDNO:7的核苷酸67-390、或SEQIDNO:11的核苦酸61-381的核苷酸序列。人源化抗体是一类嵌合抗体，其中负责抗原结合的可变区残基(即，互补决定区的残基、缩短的互补决定区(abbreviatedCDR)、或参与抗原结合的任何其他残基)衍生自非人物种，而其余可变区残基(即，构架区的残基)和恒定区至少部分衍生自人抗体序列。人源化抗体的构架区残基和恒定区残基的一个子集可以衍生自非人来源。人源化抗体的可变区也描述为人源化的(即，人源化的轻或重链可变区)。非人物种一般是用于由抗原免疫接种的物种，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类、或其他非人哺乳动物物种。人源化抗体一般比传统嵌合抗体的免疫原性小，并且在给人施用后显示出改善的稳定性。参见例如，Benincosa等人(2000)丄Pharmacol.Exp.Ther.292:810-6;Kalofonos等人(1994)Eur，J.Cancer30A:1842-50;Subramanian等人(1998)Pediatr.Infect.Dis.丄17:110-5。互补决定区(CDRs)是参与抗原结合的抗体可变区的残基。用于标识CDRs的几种编号系统是常用的。Kabat定义基于序列变异性，Chothia定义基于结构环区域的定位。AbM定义是Kabat和Chothia方法之间的折中。根据Kabat、Chothia或AbM算法，轻链可变区的CDRs由第24和34位(CDR1-L)、第50和56位(CDR2-L)、以及第89和97位(CDR3-L)上的残基界定。根据Kabat定义，重链可变区的CDRs由在第31和35B位(CDRl-H)、第50和65位(CDR2-H)、以及第95和102位上(CDR3-H)的残基界定(根据Kabat编号)。根据Chothia定义，重链可变区的CDRs由第26和32位(CDR1-H)、第52和56位(CDR2-H)、以及第95和102位(CDR3-H)上的残基界定(根据Chothia编号)。根据AbM定义，重链可变区的CDRs由26和35B位(C1)R1-H)、第50和58位(CDR2-H)、以及第95和102位(CDR3-H)上的残基界定(根据Kabat编号)。参见Martin等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sd.USA86:9268-9272;Martin等人(1991)MethodsEnzymol.203:121-153;Ped匿n等人(1992)Imm,methods1:126;及Rees等人(1996)InSternbergM.J.E.(编辑)，ProteinStructurePrediction,OxfordUniversityPress,Oxford,第141-172页。特异性决定区(SDRs)是与抗原直接相互作用的CDRs内的残基。SDRs对应高变残基。参见(Padlan等人(1995)FASEB丄9:133-139)。构架残基是除高变或CDR残基外的抗体可变区的那些残基。构架残基可以衍生自天然存在的人抗体，例如基本上类似于A1、A2或A3抗体的构架区的人构架。还可以使用代表个体序列之间的共有序列的人工构架序列。当选择用于人源化的构架区时，在人类中广泛呈现的序列可能优于较不常见的序列。可以制备人构架受体序列的另外突变，以恢复净皮iL为涉及抗原接触的鼠类残基和/或涉及抗原结合位点的结构完整性的残基，或改善抗体表达。肽结构预测可以用于分析人源化可变重和轻链序列，以鉴定和避免由人源化设计引入的翻译后蛋白质修饰位点。如下所述，人源化抗体可以使用各种方法中的任何一种进行制备，包括互补决定区(CDRs)的镶饰(veneering)、移植、缩短的CDRs的移植、特异性决定区(SDRs)的移植、和Frankenstein装配，见下述。人源化抗体还包括楚人源化抗体，其中一个或多个变化已引入CDRs中。例如，人残基可以置换CDRs中的非人残基。这些一般方法可以与标准诱变和合成技术组合，以产生任何所需序列的抗5T4抗体。镶饰基于通过用人氨基酸序列重建抗体的溶剂可及外部的表面来减少此，镶饰抗体看起来对于人细胞比未修饰的非人抗体更不外源。参见Padlan(1991)Mol.Immunol.28:489-98。非人抗体通过鉴定非人抗体中暴露的外部构架区残基(所述残基不同于人抗体的构架区中相同位置上的那些)，并且用一般占据人抗体中的那些相同位置的M酸替换所鉴定的残基，以进行镶饰。CDRs的移植通过用供体抗体(例如，非人抗体)的CDRs替换受体抗体(例如，包含所需构架残基的人抗体或其他抗体)的一个或多个CDRs来进行。受体抗体可以基于在候选受体抗体和供体抗体之间的构架残基的相似性进行选择。例如，根据Frankenstein方法，鉴定与相关的非人抗体的各构架区具有实质上的序列同源性的人构架区，并且将非人抗体的CDRs移植到这些不同的人构架区的复合物上。同样对于制备本发明的方法有用的一个相关方法在美国专利申请公开号2003/0040606中得到描述。缩短的CDRs的移植是相关方法。缩短的CDRs包括特异性决定残基和相邻氨基酸，包括在轻链中的第27d-34位、第50-55位和第89-96位上，以及在重链中的第31-35b位、第50-58位、和第95-101位上的那些残基((Kabat等人(l987))的编号惯例))。参见(Padlan等人(1995)FASEB丄9:133-9)。特异性决定残基(SDRs)的移植基于抗体结合位点的结合特异性和亲和力由每个互补决定区(CDRs)内的最高变残基决定的理解。可以通过分析抗体-抗原复合物的三维结构的分析，并分析可得到的氨基^列数据，基于CDR内每个位置上出现的M酸残基的结构不同性，模拟序列变异性。SDRs被鉴定为是由接触残基组成的极低免疫原性的多肽序列。参见Padlan等人(1995)FASEBJ.9:133-139。一般而言，人受体构架基于其基本上类似于供体抗体的构架区，或最类似于可变区亚家族的共有序列进行选择。移植后，可以在供体和/或受体序列中进行另外的改变，以优化抗原结合、功能性、密码子使用、表达水平等，包括将非人残基引入构架区内。参见例如，PCT国际公开号WO91/09967。对于将CDRs移植到重链可变构架区上，有用的构架序列可以衍生自DP-21(VH7)、DP-54(VH3-07)、DP-47(VH3-23)、DP-53(VH-74)、DP-49(VH3-30)、DP-48(VH3-13)、DP-75、DP-8(VH1-2)、DP-25、Vl-2b和VI-3(VH1-03)、DP-15和Vl-8(VH1-08)、DP-14和Vl國18(VH1-18)、DP-5和V1-24P(VH1-24)、DP-4(VH1-45)、DP-7(VH1-46)、DP隱10、DA-6和YAC-7(VH1-69)、DP-88(VHl-e)、DP-3和DA-8(VHl-f)。包含用于人源化的构架残基的代表性重链可变区如SEQIDNOs:13-24和88-93所示。代表VH1构架残基的共有序列的代表性构架如SEQIDNOs:25-27所示。还参见图10A-10B。对于将CDRs移植到轻链可变构架区上，有用的构架序列可以衍生自DPK24亚群IV种系克隆，VkIH亚群(DPK23、1)PK22、DPK20、DPK21)，或VkI亚群种系克隆(DPK9、DPK1、02、DPK-7)。包含用于人源化的构架残基的代表性轻链可变区如SEQIDNOs:28-34、35-44和94-99所示。参见图11-14。本发明的代表性人源化抗5T4抗体包括具有非人抗5T4抗体的一个或多个CDRs的抗体，所述CDRs选自SEQIDNOs:2、6或10中的任何一个的重链可变区或SEQIDNOs:4、8或12中的任何一个的轻链可变区的CDR。例如，人源化抗5T4抗体可以包含选自SEQIDNOs:2、6或10中的任何一个的重链可变区，或SEQIDNOs:4、8或12中的任何一个的轻链可变区的CDRs中的2个或更多CDRs。人源化抗5T4抗体还可以包含含有具有SEQIDNOs:2、6或10中的任何一个的2个或3个CDRs的可变区的重链，和含有具有SEQIDNOs:4、8或12中的任何一个的2个或3个CDRs的可变区的轻链。可以构建本发明的人源化抗5T4抗体，其中第一链的可变区(即，轻链可变区或重链可变区)是人源化的，和其中第二链的可变区不是人源化的(即，在非人物种中产生的抗体的可变区)。这些抗体是称为半人源化抗体的一类人源化抗体。可以用于制备半人源化抗体的非人抗5T4抗体包括如本文所乂>开的Al、A2和A3抗体，以及PCT国际公开号WO98/55607和Forsberg等人(1997)丄Biol.Chem.272(19):124430-12436中描迷的H8抗体，或Woods等人(2002)Biochem.丄366:353-65)中描述的大鼠单克隆抗体。例如，半人源化抗5T4抗体可以包含如SEQIDNO:49的氨基酸1-119所示的重链可变区，或图9A-9C中所示的人源化A1、A2或A3重链可变区的氨基酸，和SEQIDNOs:4、8或12中的任何一个的轻链可变区。嵌合和人源化抗5T4抗体的恒定区可以衍生自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM中的任何一个、其任何同种型(例如，IgG的IgGl、IgG2、IgG3或IgG4同种型)，以及其突变形式的恒定区。人同种型的选择和同种型中的特定氨基酸的f务饰可以增强或消除宿主防御机制的激活并改变抗体生物分布。参见(Reff等人(2002)CancerControl9:152-66)。用于制备本发明的嵌合和人源化抗体的代表性恒定区如SEQII)NOs:45-47所示。还可以使用人k轻链恒定区，包括变体或突变形式。对于编码免疫球蛋白恒定区的序列的克隆，可以删除内含子序列。嵌合和人源化抗5T4抗体可以使用本领域已知的标准技术进行构建。例如，可变区可以通过使编码可变区的重叠寡核苷酸退火在一起并将其连接到包含人抗体恒定区的表达载体中进行制备。参见例如，Harlow&Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,NewYork和美国专利号4,196,265;4,946,778;5,091,513;5,132,405;5,260,203;5,677,427;5,892,019;5,985,279;6,054,561。可以制备包含2个完整的四聚体抗体(包括同二聚体和异二聚体)的四价抗体(h4L4)，例如如PCT国际公开号WO02/096948中所述。抗体二聚体还可以通过将半胱氨酸残基(这些残基可以促进链间二硫键形成)引入抗体恒定区中、通过使用异双官能交联剂(Wolff等人(1993)CancerRes.53:2560-5)，或通过重组生产以包括双重恒定区(dualconstantregion)(Stevenson等人(1989)AnticancerDrugDes.3:219-30)而制备。本发明的抗体的抗原结合片段可以例如通过表达截短的抗体序列，或通过全长抗体的翻译后消化进行制备。本发明的抗5T4抗体，即A1、A2和A3抗体的变体，以及其嵌合和人源化形式可以容易地制备，以包括各种改变、置换、插入和缺失。例如，抗体序列可以就用于抗体表达的细胞类型中的密码子使用进行优化。为了增加抗体的血清半衰期，可以将营救性受体结合表位(如杲尚未存在的话)掺入抗体重链序列内。参见美国专利号5,739,277。增强抗体稳定性的另外修饰包括IgG4的修饰，以用脯氨酸置换第241位上的残基丝氨酸。参见Angal等人(1993)Mol.Immunol.30:105-108。其他有用的改变包括才艮据需要的置换以优化抗体与药物缀合的效率。例如，抗体可以在其羧基末端上进行修饰，以包括用于药物附着的氨基酸，例如可以添加一个或多个半胱氨酸残基。恒定区可以进行修饰以引入用于结合碳水化合物或其他结构部分的位点。本发明的抗5T4抗体的变体可以使用标准重组技术进行生产，包括定点诱变，或重组克隆。抗5T4抗体的多样库可以经由基因排列和基因转换方法在转基因非人动物中制备(美国专利公开号2003/0017534),随后使用功能试验就相关活性对其进行测试。在本发明的具体实施方案中，抗5T4变体使用用于下述的亲和力成熟方案来获得突变CDRs(Yang等人(1995)J.Mol.Biol.254:392-403)、链改组(Marks等人(1992)Biotechnology(NY)10:779-783)、使用大肠杆菌增变菌抹(Low等人(1996)丄Mol,Biol.260:359-368)、DNA改组(Patten等人(1997)Curr,Opin.Biotechnol.8:724-733)、嗟菌体展示(Thompson等人(1996)J.Mol.Biol.256:77-88)、和有性PCR(sexualPCR)(Cramcri等人(1998)Nature391:288-291)。对于免疫治疗应用，相关功能试验包括与人5T4抗原的特异性结合，抗体内在化、和当施用给携带肿瘤的动物时对肿瘤位点的靶向，见本文在下文中的描述。本发明进一步提供了表达本发明的抗5T4抗体的细胞和细胞系。代表性宿主细胞包括哺乳动物和人细胞，例如CHO细胞、HEK-293细胞、HeLa细胞、CV-1细胞和COS细胞。在将异源构建体转化到宿主细胞内后用于产生稳定细胞系的方法是本领域已知的。代表性非哺乳动物宿主细胞包括昆虫细胞(Potter等人(1993)Int.Rev.Immunol.10(2-3):103-112)。抗体还可以在转基因动物(Houdebine(2002)Curr.Opin.Biotechnol.13(6):625-629)和转基因植物(Schillberg等人(2003)CellMol.LifeSci.60(3):433-45)中进行生产。II.抗5T4核酸和多肽本发明进一步提供了编码抗5T4重链和轻链可变区的分离的核酸，和由所乂^开的核酸编码的分离的多肽。本发明的核酸和多肽包括Al、A2和A3可变区，人源化Al、A2和A3可变区及其变体的核苷酸和M酸序列。分离的核酸和多肽可以用于制备嵌合和人源化抗5T4抗体。II.A.抗5T4核酸核酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链、双链或三螺旋形式的聚合物。除非明确限制，否则核酸可以包含与参考天然核酸具有相似的性质的天然核苷酸的已知类似物。核酸包括基因、cDNAs、mRNAs和cRNAs。核酸可以进行合成，或可以源于任何生物来源，包括任何生物。用于克隆编码抗5T4抗体的核酸的代表性方法在实施例1和7中得到描述。本发明的代表性核酸包含SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11和48中的任何一个的核苷酸序列。特别地，编码A1、A2和A3重链可变区的核酸分别包含SEQIDNO:l的核苷酸58-41、SEQIDNO:5的核苦酸55-405、和SEQIDNO:9的核苷酸58-423，其分别编码具有如SEQIDNO:2的残基20-138、SEQIDNO:6的残基19-135、和SEQIDNO:10的残基20-141所示的氨基酸序列的重链可变区。编码人源化A1重链可变区的核酸包含SEQIDNO:48的核苷酸1-358。编码A1、A2和A3轻链可变区的核酸分别包含SEQIDNO:3的核脊酸61-381、SEQIDNO:7的核苦酸67-390、和SEQIDNO:11的残基61-381，其分别编码具有如SEQIDNO:4的残基21-127、SEQIDNO:8的残基23-130、和SEQIDNO:12的残基21-127所示的氨基断列的重链可变区。本发明的另外核酸包舍编码图9A-9C中所示的人源化A1、A2和A3可变区的核苷酸。本发明的核酸还可以包含与SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11和48中的任何一个基本上等同的核苷酸序列，包括与编码SEQIDNOs:1、3、5、7、9和11中的任何一个的序列的可变区至少90%等同的核苷酸序列，例如至少约91%等同或至少92%等同、例如至少约93%等同、或至少94%等同、或至少95%等同、或至少96%等同、或至少97%等同、或至少98%等同、或至少99%等同。例如，本发明的核酸可以包含(a)与SEQIDNO:1的可变区编码序列至少98%等同的核苷酸序列；(b)与SEQIDNO:3的可变区编码序列至少97%等同的核苷酸序列；(c)与SEQIDNO:5的可变区编码序列至少98%等同的核苷酸序列；(d)与SEQIDNO:7的可变区编码序列至少98%等同的核苷酸序列；(e)与SEQIDNO:11的可变区编码序列至少99%等同的核苷酸序列；或(f)与SEQIDNO:48的可变区编码序列至少89%等同的核苷#列。使用序列比较算法，使用SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11和48中的任何一个的全长可变区编码序列，或编码图9A-9H中所示的人源化Al、A2和A3可变区序列的核苷酸序列作为查询序列，如下文所描述，或通过目测检查进行序列比较，以获得最大对应性。还参见实施例1和表1,以及实施例7和表11。基本上等同的序列可以是多态性序列，即群体中的可选序列或等位基因。等位基因差异可以小至1个碱基对。基本上等同的序列还可以包含诱变的序列，包括包含沉默突变的序列。突变可以包含一个或多个残基改变，一个或多个残基的缺失，或一个或多个额外残基的插入。基本上等同的核酸还可以定义为在严格条件下，与SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11或48中的任何一个的全长；SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11或48中的任何一个的可变区编码序列的全长；或編码图9A-9H中所示的人源化Al、A2和A3可变区序列的核苦酸序列特异性杂交或基本上杂交的核酸。在核酸杂交的背景下，被比较的2个核酸序列可以命名为探针和靶。探针是参考核酸分子，靶是通常存在于一群异质核酸分子中的受试核酸分子。靶序列与受试序列同义。对于杂交研究，有用的探针与本发明的核酸分子的至少约14-40个核苷酸序列互补或极其相拟。优选地，探针包含SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11或48中的任何一个；SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11或48中的任何一个的可变区编码序列；或编码图9A-9C中所示的人源化Al、A2和A3可变区序列的核苷酸序列之14-20个核苷酸,或当需要时甚至更长，例如30、40、50、60、100、200、300或500个核苷酸或多至全长序列。此类片段可以容易地制备，例如通过片段的化学合成，通过核酸扩增技术的应用，或通过将所选择的序列引入重組载体内用于重组生产。特异性杂交指当特定核苷酸序列存在于复杂的核酸混合物(例如，总细胞DNA或RNA)中时，分子在严格条件下仅与该特定核苷酸序列结合、形成双链或杂交。取决于杂交条件的严格性，特异性杂交可以容许探针和革巴序列之间的错配。在核酸杂交实验例如DNA和RNA印迹分析的情况下，严格杂交条件和严格杂交洗涤条件是序列和环境依赖的。越长的序列在越高的温度下特异性杂交。关于核酸杂交的广泛指导在Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分第2章，Elsevier,NewYork,NewYork中可以找到。一般地，在确定的离子强度和pH下，高度严格杂交和洗涤条件选择为比特定序列的热熔解点(Tm)低约5'C。一般地，在严格条件下，探针将与其靶的子序列而不是其他序列特异性杂交。Tm是50%的耙序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。极度严格条件选择为等于特定探针的Tm。对于具有超过约100个互补残基的互补核酸的DNA或RNA印迹分冲斤，严格杂交^fr的例子是于42。C在含1mg肝素的50%甲酰胺中过夜杂交。高度严格洗涤条件的例子是于65。C在0.1XSSC中15分钟。严格洗涤条件的例子是于65°C在0.2XSSC緩沖液中15分钟。关于SSC緩沖液的描述，参见Sambrook等人，编辑(1989)MolecularCloning:ALaboratoryMa隨l，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork。通常,高度严格洗涤之前为低严格洗涤，以去除背景探针信号。对于超过约100个核苷酸的双链体，中等严格洗涤条件的例子是于45X:在1XSSC中15分钟。对于超过约100个核苷酸的双链体，低严格洗涤的例子是于40匸在4X-6XSSC中15分钟。对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)，严格条件一般涉及在pH7.0-8.3,小于约1MNa+离子的盐浓度，一般约0.01-1MNa+离子浓度(或其他盐)，和温度一般为至少约30°C。严格条件还可以由添加去稳定剂例如甲酰胺来达到。一般而言，在特定杂交试验中比就无关探针所观察到的大2倍(或更高)的信噪比指示检测到特异性杂交。序列的杂交和洗涤条件的例子探针核苷酸序列优选于50。C在7%十二烷基琉酸钠(SDS)、0.5MNal)O4、1mMEDTA中与乾核苷酸序列杂交，随后于50。C在2XSSC、0.1%SDS中洗涤；更优选地，探针和耙序列于50。C在7。/。十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中杂交，随后于50。C在1XSSC、0.1%SDS中洗涤；更优选地，探针和靼序列于50"在7%十二烷基琉酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中杂交，随后于50。C在0.5XSSC、0.1%SDS中洗涤；更优选地，探针和乾序列于50°。在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中杂交，!51^于50。C在0.1XSSC、0.1。/。SDS中洗涤；更优选地，探针和耙序列于50。C在7。/。十二烷^i^克酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、lmMEDTA中杂交，随后于65。C在0.1XSSC、0.1%SDS中洗涤。2个核酸序列基本上等同的另一表现是由核酸编码的蛋白质是基本上等同的，具有相同的总体三维结构，或是生物学功能等价物。这些术语在本文的下文中进一步定义。如果相应的蛋白质M本上等同的，则在严格条件下4皮此不杂交的核酸分子仍^^本上等同的。这可以例如在2个核苷酸序列包含被遗传密码允许的保守置换变体时发生。保守置换变体是具有简并密码子置换的核酸序列，其中一个或多个所选择的(或所有的)密码子的第3位由混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换。参见Batzer等人(1991)NuclekAcidsRes.19:5081;Ohtsuka等人(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608;及Rossolini等人(1994)Mol.CellProbes8:91-98。本发明的核酸还包括与SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、48中的任何一个或编码图9A-9C中所示的人源化Al、A2和A3可变区序列的核苷酸序列互补的核酸，以及SEQIDNOs:1、3、5、7、9、11、48、或编码图9A-9C中所示的人源化A1、A2和A3可变区序列的核苷酸序列、及其互补序列的子序列和延长序列。互补序列是包含在碱基对之间形成氢键时能够彼此配对的反向平行核苷酸序列的2个核苷酸序列。如本文所使用的，术语互补序列意指基本上互补的核苷酸序列(如可以由下文所述的相同核普酸比较法评估的)，或定义为在相对严格条件例如本文描述的那些条件下能够与所讨论的核酸区段杂交。互补核酸区段的具体例子是反义寡核香酸。子序列是包含较长的核酸序列的一个部分的核酸序列。示例性子序列是上文中描述的探针或引物。如本文所使用的，术语引物指包含所选择的核酸分子的约8个或更多脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，优选10-20个核苷酸，或更优选20-30个核苷酸的连续序列。本发明的引物涵盖具有在本发明的核酸分子上引起聚合的足够长度和适当序列的寡核苷酸。延长的序列包含掺入核酸内的另外的核苷酸(或其他类似分子)。例如，聚合酶(例如，DNA聚合酶)可以在核酸分子的3'末端上添加序列。此外，核普酸序列可以与其他DNA序列组合，例如启动子、启动子区、增强子、多腺苷酸化信号、内含子序列、另外的限制酶位点、多克隆位点、和其他编码区段。因此，本发明还提供了包含所公开的核酸的载体，包括用于重组表达的载体，其中本发明的核酸与功能启动子可操作地连接。当与核酸可操作地连接时，启动子与核酸功能组合，从而使得核酸的转录由启动子区控制和调节。载体指能够在宿主细胞中复制的核酸，例如质粒、粘津立和病毒载体。本发明的核酸可以进行克隆、合成、改变、突变或其组合。用于分离核酸的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域已知的。产生4^对改变、缺失或小插入的定点诱变也是本领域已知的。参见例如，Sambrook等人(编辑)(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork;Silhavy等人(1984)ExperimentswithGeneFusions.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork;Glover&Haines(1995)DNACloning:APracticalApproach,第2版，IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford/NewYork;A謹bel(编辑)(1995)ShortProtocolsinMolecularBiology,第3版，Wiley,NewYork。II.B.抗5T4多肽本发明还提供了分离的抗5T4多肽。多肽和蛋白质均指由肽键连接的氨基酸单链构成的化合物。代表性重链可变区多肽如SEQIDNO:2的残基20-138、SEQIDN():6的残基19-135、SEQIDNO:10的残基20-141、和SEQIDNO:49的残基1_119所示。代表性轻链可变区多肽如SEQII)NO:4的残基21-127、SEQIDNO:8的残基23-130、和SEQIDNO:12的残基21-127所示。本发明的另外多肽包含图9A-9C中所示的人源化A1、A2和A3可变区的氨基酸。本发明的另外多肽包括与所公开的抗5T4多肽基本上相似的重链和轻链可变区多肽，例如与SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12和49的可变区至少约90%等同、例如至少约91。/。等同、至少92%等同、至少93%等同、至少94%等同、至少95%等同、至少96%等同、至少97%等同、至少98%等同、或至少99%等同。可以使用序列比较算法，使用SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12和49中的任何一个的全长序列，或图9A-9C中所示的人源化A1、A2或A3可变区中的任何一个的全长序列作为查询序列，或使用其可变区序列，或通过目测检查，就最大对应性进行序列比较。本发明进一步包含由本文所公开的核酸中的任何一个编码的多肽。例如，本发明的代表性多肽包括(a)具有与SEQIDNO:2的残基20-138至少85%相似的氨基酸序列的多肽；(b)具有与SEQIDNO:4的残基21-127至少94%相似的氨基酸序列的多肽；(c)具有与SEQIDNO:6的残基19-135至少86%相似的#^#列的多肽；(d)具有与SEQIDNO:8的残基23-130至少96%相似的#^財列的多肽；(e)具有与SEQIDNO:10的残基20-141至少91%相似的氨基酸序列的多肽；(f)具有与SEQIDNO:12的残基21-127至少98%相似的氮基酸序列的多肽；和(g)具有与SEQIDNO:49的残基1-119至少90%相似的氨基酸序列的多肽。参见实施例1和表2，以及实施例7和表11。本发明的多肽可以包含天然存在的氨基酸、合成的氨基酸、遗传编码的氨基酸、非遗传编码的氨基酸、及其组合。多肽可以包括L型和D型氨代表性非遗传编码的氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸；3-氨基己二酸；P-氨基丙酸；2-氨基丁酸；4-氨基丁酸(哌啶酸)；6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基异丁酸；3-氨基异丁酸；2-M庚二酸；2,4-二氨基丁酸；锁链素；2，2'-二氨基庚二酸；2，3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羟赖氨酸；别-羟赖氨酸；3-羟脯氨酸；4-羟脯氨酸；异锁链素；另"-异亮氨酸；N-曱基甘氨酸(肌氨酸)；N-曱基异亮氨酸；N-甲基缬氨酸；正缬氨酸；正亮氨酸；和鸟氨酸。代表性衍生化的氨基酸包括例如，其中游离氨基已进行衍生以形成胺盐酸盐、对甲^璜酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离氣基可以进行衍生以形成盐、甲基和乙基酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基可以进行衍生以形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以进行衍生以形成N-im-卡基组氨酸。本发明还提供了本发明的抗5T4多肽的片段，例如构成5T4抗原结合位点的片段。还提供了比所公开的序列长的多肽序列。例如，一个或多个氨基酸可以加入抗体多肽的N末端或C末端。此类另外的氨基酸可以在各种应用中使用，包括但不限于纯化应用。制备延长的蛋白质的方法是本领域已知的。本发明的抗5T4多肽包括包含这样的氨基酸的蛋白质，所述氨基^！SEQIDNOs:2、4、6、8、10、12或49中的任何一个的保守置换变体。保守置换变体指包含其中一个或多个残基已由功能上相似的残基保守置换的氨基酸的多肽。保守置换的例子包括一个非极性(疏水)残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个非极性残基；一个极性(亲水)残基置换另一个极性残基，例如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、甘氨酸和丝氨酸之间的置换；一个碱性残基例如赖氨酸、精氨酸或組氨酸置换另一个碱性残基；或一个酸性残基例如天冬氨酸或谷氨酸置换另一个酸性残基。本发明的分离的多肽可以使用技术人员已知的各种标准技术进行纯化和表征。参见例如,Schroder&Lubke(1965)ThePeptides.AcademicPress,NewYork;Bodanszky(1993)PrinciplesofPeptideSynthesis,修订版，第2版，Springer-Verlag,Berlin/NewYork;AusubeK编辑)(1995)ShortProtocolsinMolecularBiology,第3版，Wiley,NewYork.II.C.核苦酸和氨基酸序列比较对于2个或更多核苷酸或蛋白质序列，术语等同或同一性百分比指当就最大对应进行比较和比对时，两个或更多个序列或子序列为相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苦酸，如使用本文公开的序列比较算法之一或通过目测检查所得的。术语基本上相同就核苷酸或蛋白质序列而言意指一个特定序列由于一个或多个缺失、置换或添加(其净效应是保留抗5T4核酸或多肽的生物学功能)而不同于天然存在的序列。对于2个或更多序列的比较，一般一个序列充当与一个或多个受试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将受试和参考序列输入计算机程序内，必要时指定子序列坐标，并选择序列算法程序参数。序列比较算法随后基于所选择的程序参数计算指定的受试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行例如Smith&Waterman(1981)Adv,Appl.Math2:482-489的局部同源性算法，Needleman&W,ch(1970)丄Mol.Biol.48:443-453的同源性比对算法，Pearson&Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-2448的相似性搜索方法，这些算法的计算机化执行(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,Madison,Wisconsin中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA),或目测检查。一般参见Ausubel(编辑)(1995)ShortProtocolsinMolecularBiology,第3版，Wiley，NewYork。用于测定序列同一性百分比和序列相似性的优选算法是BLAST算法，其在AUschul等人(1990)丄Mol.Biol.215:403-41中得到描迷。用于执行BLAST分析的软件通过美国国家生物技术信息中心(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公开获得。BLAST算法参数决定比对的敏感性和速度。对于2个核苷酸序列的比较，BLASTn缺省参数设为W=ll(字长)和E=10(期望值)，并且还包括低复杂度滤器的使用以掩蔽具有低组成复杂性的查询序列的残基。对于2个氨基酸序列的比较，BLASTp程序缺省参数设为W=3(字长)，E=10(期望值)，BLOSUM62评分矩阵的使用，空位存在罚分=11和延长罚^=1，和低复杂度滤器的使用以掩蔽具有低组成复杂性的查询序列的残基。参见实施例l。III.抗5T4抗体/药物缀合物本发明进一步提供了包含本发明的抗5T4抗体的抗体/药物缀合物。还提供了用于制备抗体/药物缀合物的方法，从而使得药物与抗体直接或间接结合。本发明的抗体/药物缀合物具有通式5T4Ab(-X-W)m，其中5T4Ab是如本文所描述的抗5T4抗体或抗体片段；接头；口、一"丄^义、、-土'W是药物；m是纯化的缀合产物的平均负荷(例如，m使得药物构成缀合物的3-10%重量)；和(-X-W)m是药物衍生物。还提供的是用于制备本发明的抗体/药物缀合物的方法。作为一个例子，式5T4Ab(-X-W)m的抗体/药物缀合物可以通过下述进行制备(a)将药物衍生物加入抗5T4抗体中，其中药物是抗5T4抗体的3-10%重量；(b)在非亲核的、蛋白质相容的、具有约7-9的pH范围的緩冲溶液中使药物衍生物和抗5T4抗体温育，以产生抗体/药物缀合物，其中溶液进一步包含(i)合适的有机共溶剂，和(ii)包含至少一种胆汁酸或其盐的一种或多种添加剂，并且其中温育在约30°C-约35。C进行约15分钟-约24小时的时间段；和(c)对步骤(b)中产生的缀合物实施层析分离过程，以分离具有3-10%重量药物负荷和具有低缀合级分(lowconjugatedfraction,LCF)的抗体/药物缀合物与未缀合的抗5T4抗体、药物衍生物和聚集的缀合物。III.A.药物药物是具有生物或可检测的活性的任何物质，例如治疗剂、可检测的标记、结合剂等、和在体内代谢成活性剂的药物前体。药物还可以是药物衍生物，其中药物已进行官能化以使得能够与本发明的抗体缀合。一般地，这些类型的缀合物称为免疫缀合物。治疗剂是可以用于治疗或预防有此需要的受试者中的病状的组合物。在本发明中有用的治疗剂包括抗癌剂，即在5T4表达细胞例如癌细胞中具有抗癌活性的试剂，所述癌细胞来自鳞状/腺瘤性肺癌(非小细胞肺癌)、浸润性乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、鳞状宫颈癌、浸润性子宫内膜腺癌、浸润性胰腺癌、卵巢癌、鳞状膀胱癌和绒毛膜癌。代表性治疗药物包括细胞毒素、放射性同位素、化学治疗剂、免疫调谐剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促凋亡剂、以及细胞生长抑制剂和细胞溶解酶(例如RNA酶)。药物还可以包括治疗性核酸，例如编码免疫调谐剂、抗血管生成剂、抗增殖剂或促凋亡剂的基因。这些药物叙词并非互相排斥的，并且因此治疗剂可以使用上文指出的术语中的一个或多个进行描述。例如，所选择的放射性同位素也是细胞毒素。治疗剂可以制备为药学上可接受的盐、酸或上述任何一种的衍生物。一般地，具有放射性同位素作为药物的缀合物称为》t射免疫缀合物，具有化学治疗剂作为药物的那些称为化学免疫缀合物。用于在免疫缀合物中使用的合适的药物的例子包括紫杉烷类(taxanes)、美登素类(maytansines)、CC曙1065和倍癌霉素类(duocarmycin)、加利车霉素和其他烯二炔类(enediynes)、和auristatins。其他例子包括抗叶酸剂、长春花生物碱和蒽环类。植物毒素、其他生物活性蛋白质、酶(即，ADEPT)、方文射性同位素、光敏剂(即，用于光动力疗法)也可以在免疫缀合物中4吏用。此外，缀合物可以4吏用二级载体(secondarycarrier)作为细胞毒素剂，例如脂质体或聚合物进行制备。术语细胞毒素一般指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞破坏的活性剂。代表性细胞毒素包括抗生素，微管蛋白聚合的抑制剂，结合并打断DNA的烷化剂，和破坏蛋白质合成或必需细胞蛋白质的功能的活性剂，所述必需细胞蛋白质例如为蛋白激酶、磷酸酶、拓朴异构酶、酶和细胞周期蛋白。代表性细胞毒素包括但不限于多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依达》匕星(idarubicin)、阿柔t匕星(adarubicin)、佐柔t匕星(zorubicin)、米托蒽酉昆(mitoxantrone)、表柔比星(epirubicin)、卡柔比星(carubicin)、诺力口霉素(nogalamycin)、美;若立尔(menogaril)、"比柔比星(pitarubicin)、戊柔比星(valmbicin)、阿糖月包苦(cytarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、曲氟尿苦(trifluridine)、安西他滨(ancitabine)、依诺他滨(enocitabine)、阿扎胞普(azacitidine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、喷司他丁(pentostatin)、溴尿苦(broxuridine)、卡培他滨(capecitabine)、克拉屈滨(cladribine)、地西他滨(decitabine)、氟尿脊(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、谷氏菌素(gougerotin)、噪呤霉素(puromycin)、替力口氟(tegafur)、塞唑羧胺核苦(tiazofurin)、阿霉素(adriamycin)、顺铂(cisplatin)、卡柏(carboplatin)、环裤酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴漆(dacarbazine)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、米托蒽醌、博来霉素(blomycin)、氮芥(mechlorethamine)、强的松(prednisone)、甲基千肼(procarbazine)、氨曱蝶呤(methotrexate)、氟尿嘧咬(flurouracils))、依托泊苦(etoposide)、泰素(taxol)、泰素类似物、铂例如顺铂和卡铂、丝裂霉素(mitomycin)、塞替派(thiotepa)、紫杉坑(taxanes)、长春新威(vincristine)、道"i若红菌素(daunorubkin)、表柔比星(epirubicin)、放线菌素(actinomycin)、authramycin、氮丝氨酸(azaserines))、博来霉素(bleomycins)、它莫西芬(tamoxifen)、依达比星(idambicin)、多拉司他汀(dolastatins)/auristatins、哈米特林(hemiasterlins)、埃斯波霉素(esperamicins)和美登类化合物(maytansinoids)。在本发明的具体实施方案中，细胞毒素是抗生素，例如加利车霉素，也称为IX-E33288复合物，例如Y-加利车霉素(Yi)或N-乙酰Y-加利车霉素。参见美国专利号4,970,198。适用于制备本发明的抗体/药物缀合物的另外的加里车霉素例子公开于美国专利号4,671,958;5,053,394;5,037,651;5,079,233;及5,108,912中，所述专利整体合并入本文。这些化合物包含曱基三硫化物，其可以与合适的硫醇反应，同时引入官能团如酰肼或对于使加利车霉素与抗5T4抗体缀合有用的其他官能团。还可以使用加利车霉素的二石克化物类似物，例如美国专利号5,606,040和5,770,710中描迷的类々乂物，所述专利整体合并入本文。对于放射治疗应用，本发明的抗5T4抗体可以包含高能量的放射性同位素。同位素可以与抗体直接结合，例如在抗体中存在的半胱氨酸残基上，或螯合剂可以用于介导抗体和放射性同位素的结合。适合于放射治疗的放射性同位素包括但不限于a-发射体、p-发射体和俄歇电子。对于诊断应用，有用的放射性同位素包括正电子发射体和7-发射体。本发明的抗5T4抗体还可以硪化，例如在抗体的酪氨酸残基上，以促进抗体的检测或疗效。可以与抗5T4抗体缀合的代表性放射性同位素包括"氟、64铜、65铜、67镓、68镓、77溴、,溴、95钌、97钌、103钌、105钌、"m*、107汞、203汞、123硤、124硪、125硖、126碘、131碘、133碘、川铟、113铟、991"铼、105铼、1()1铼、186铼、188铼、'2^碲(mtellurium)、"锝、122|11碲、1251"碲、165铥、167铥、168铥、9()钇、以及由它们衍生的氮化物或氧化物形式。其他合适的放射性同位素包括ot发射体，例如213铋、213铅和225锕。本发明的抗体/药物缀合物可以包括免疫调谐剂，即引发免疫应答，包括体液免疫应答(例如抗原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫应答(例如淋巴细胞增殖)的试剂。代表性免疫调谐剂包括细胞因子，黄嘌呤，白介素，干扰素，和生长因子(例如，TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF),和激素例如雌激素(已烯雌酚(diethylstilbestrol)、雌二醇)，雄激素(睾酮、HALOTESTIN⑧(氟甲睾酮(fluoxymesterone)))，孕激素(MEGACE(乙酸曱地孕酮(megestrolacetate))、PROVERA(乙酸曱羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate))),和皮质类固醇(强的松、地塞米松(dexamethasone)、氬4b可的+^(hydrocortisone))。在本发明中有用的免疫调谐剂还包括阻断激素对肿瘤的作用的抗激素药，和抑制细胞因子生产、下调自身抗原表达、或掩蔽MHC抗原的免疫抑制剂。代表性抗激素药包括抗雌激素药，包括例如它莫西芬、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑类、4-羟基它莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、onapnstone和托瑞米芬(toremifene);和抗雄激素药，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(kuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);和抗肾上腺素药(anti-adrenalagents)。代表性免疫抑制剂包括2-#^-6-芳基-5-取代的嘧啶类、硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺、溴隐亭(bromocrypine)、达那唑(danazol)、氨^L(dapsone)、戊二醛、针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体、环孢菌素A(cyclosporinA)、类固醇例如糖皮质类固醇、细胞因子或细胞因子受体拮抗剂(例如，抗干扰素抗体、抗1LIO抗体、抗TNFa抗体、抗IL2抗体)、链激酶、TGFJ3、雷帕霉素、T细胞受体、T细胞受体片段、和T细胞受体抗体。在本发明中有用的另外药物包括抑制血管形成的抗血管生成剂，例如法尼基转移酶抑制剂、COX-2抑制剂、VEGF抑制剂、bFGF抑制剂、类固醇硫酸酯酶抑制剂(例如，2-甲氧基雌二醇二氨基磺酸酯(2-MeOE2bisMATE))、白介素-24、凝血栓蛋白(thrombospondin)、metallospondin蛋白质、I类干扰素、白介素12、鱼精蛋白、血管他丁(angiostatin)、层粘连蛋白、内皮他丁(endostatin)和催乳激素片段。抗增殖剂和促凋亡剂包括PPAR-y激活物(例如，环戊烯酮前列腺素(cyPGs))、类视黄醇、三萜类化合物(triterpinoids)(例如，环菠萝蜜烷(cycloartane)、羽扇豆烷(lupane)、乌苏烷(ursane)、齐敦果烷(oleanane)、木检烷(friedelane)、达玛烷(dammarane)、葫芦素(cucurbitacin)和柠檬苦素类似物(limonoid)三萜类化合物)、EGF受体抑制剂(例如，HER4)、雷帕霉素、CALCmUOL⑧(1，25-二羟基胆钙化醇(维生素D))、芳香酶抑制剂(FEMARA(letrozone))、端粒末端转移酶抑制剂、铁螯合剂(例如，3-氨基吡啶-2-甲醛硫代缩氨基脲(Triapine))、凋亡蛋白(来自鸡贫血病病毒的病毒蛋白质3——VP3)、Bcl-2和Bcl-X(L)的抑制剂、TNF-a、FAS配体、TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL/Apo2L)、TNF-a/FAS配体/TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL/Apo2L)信号传导的激活物、和PI3K-Akt存活途径信号抑制剂(例如，UCN-01和格尔德霉素)。代表性化学治疗剂包括烷化剂例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯类，例如白消安(busulfan),英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙咬类(aziidines)，例如benzodopa，卡巴醌(carboquone)，meturedopa和uredopa;乙烯亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥,例如笨丁酸氮芥(chlorambucil)，蔡氮芥(chlornaphazine)，cholophosphamide，雄氮齐(estramustine)，异环裤酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechiorethamine)，氧氮芥盐酸盐,苯丙氨酸氮芥(melphalan),新氮芥(novembichin)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，〉发尼氮芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfarnide)，尿口密咬氮芥(uracilmustard);石肖基脲类(nitrosureas)，例如卡莫司汀(carmustine)，氯脲菌素(chlrozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine);抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomysins)，放线菌素，authramycin，氮丝氨酸，博来霉素，i支线菌素c(cactinomycin),加利车霉素，卡柔比星，洋红霉素(carminomycin),嗜癌素(carzinophmn)，色霉素，更生霉素，柔红霉素，地托比星(detorubicin)，6_重氮基_5-氧代丄-正亮氨酸，多柔比星，表柔比星，依索比星(esorubicin)，依达比星，发波霉素，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，培洛霉素，紫菜霉素(potfiromycin)，嘌呤霉素，三4失阿霉素(quelamycin),罗多比星(rodorubicin),链黑菌素，链脲菌素，杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex),净司他丁(zinostatin)，佐柔比星；抗代谢物，例如氨甲蝶呤和5_氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物，例如二曱叶酸(denopterin),氨甲蝶呤，蝶罗呤(pteropterin)，三曱曲沙(trimetrexate);噪呤类似物,例如氟达拉滨，6-巯噤呤，硫咪嘌呤(thiamiprine),硫鸟嘌呤；嘧。定类似物，例如安西他滨，阿扎胞苷，6-阿扎尿苷(azauridine)，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苦，二脱氧尿苷，去氧氟尿苷，依诺他滨，氟尿苷，5-EU;雄激素类，例如卡普睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolonepropionate),环石充雄醇(epitiostanol)，美雄烷(mepitiostane)，睾内西旨(tcstolactone);抗肾上腺素药，例如氨鲁米特(arninoglutethimide)，米托坦(mitotane),曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinicacid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酖胺糖苦(aldophospharnideglycoside);^SJ同戊酸；安p、f淀(amsacrine);bestrabucil;J匕生群(bisantrene);edatraxate;defofamine;矛火水寸山胺(demecolcine);地P丫酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋铵(emptiniumacetate);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓；雍基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidamine);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamol);硝氨丙吖啶(nitracrine);喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet);p比柔t匕星(pirarubicin);鬼白酸(podophyllinicacid);2画乙基酰肼；曱基苄肼；雷佐生(razoxane);西佐喃(sizofiran);锗螺胺(spirogermanium);替奴佐酸(tenuaz:onicacid);三亚胺醌(traziquone);2，2'，2'—三氯三乙胺；乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴-秦；甘露氮齐(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);派泊淡烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞普(Ara-C);环磷酰胺；噻替派；taxoids,例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-MyersSquibbOncologyofPrinceton,NewJersey)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE,Rhone-PoulencRorerofAntony,France);苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨曱蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C;米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine);米托蒽醌(novantrone);替尼泊苦(teniposide);柔红霉素；aininopterin;希罗达(xeloda);伊班膦酸盐(ibandronate);CPT-11;拓朴异构酶抑制剂RFS2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);视黄酸；埃斯波霉素；和卡培他滨。可以与抗5T4抗体缀合并依照本发明的治疗方法使用的另外的治疗剂包括用于光动力疗法的光敏剂(美国专利公开号2002/0197262和美国专利号5,952,329);用于热疗法的磁性颗粒(美国专利公开号2003/0032995);结合剂，例如肽、配体、细胞粘附配体等，和药物前体例如含磷酸盐的药物前体、含硫代磷酸盐的药物前体、含石克酸盐的药物前体、含肽的药物前体、含P-内酰胺的药物前体、含取代的苯氧基乙酰胺的药物前体或含取代的苯乙酰胺的药物前体，可以转变成更具活性的无细胞毒性药物的5-氟胞嘧啶和其他5-氟胞嘧啶药物前体。对于使用抗5T4抗体的诊断方法，药物可以包含用于在体外或体内检测5T4表达细胞的存在的可检测标记。在体内可检测的放射性同位素例如可使用闪烁扫描术、磁共振成像、或超声检测的那些标记可以在临床诊断应用中使用。有用的闪烁扫描标记包括正电子发射体和Y-发射体。用于磁源成像的代表性造影剂是顺磁或超顺磁离子(例如，铁、铜、锰、铬、铒、铕、镝、钬和钆)，氧化铁颗粒，和水溶性造影剂。对于超声检测，气体或液体可以截留在作为微气泡造影剂释放的多孔无机颗粒中。对于体外检测，有用的可检测标记包括荧光团、可检测的表位或结合剂、和放射性标记。III.B.接头分子药物经由接头分子与本发明的嵌合和人源化抗5T4抗体直接或间接缀合。接头分子可以是稳定的或可水解的，由此它在进入细胞后释放。引起药物与抗体断裂的主要机制包括在溶酶体的酸性pH中水解(腙类、缩醛类和顺乌头酸酯样酰胺)，经由溶酶体酶的肽切割(组织蛋白酶和其他溶酶体酶)，和二硫化物的还原。由于用于断裂的这些不同机制，使药物与抗体连接的机制也是广泛多样的，并且可以使用任何合适的接头。优选地，缀合方法产生具有最低限度的低缀合级分(LCF，大部分未缀合的抗体级分)，即小于约10%的样品。合适的缀合搡作的一个例子依赖于酰肼和其他亲核体与由抗体上天然存在的碳水化合物氧化产生的醛的缀合。含腙缀合物可以由引入的羰基进行制备，所述羰基提供所需的药物释放性质。缀合物还可以由在一个末端上具有二辟u化物、在中间具有烷基链、并且在另一个末端上具有肼衍生物的接头进行制备。蒽环类是可以使用这种技术与抗体缀合的细胞毒素的一个例子。包含除腙外的官能团的接头也可以具有在溶酶体的酸性环境中被切割的潜力。例如，缀合物可以由包含非腙位点的硫醇反应性接头进行制备，所述位点是细胞内可断裂的，例如酯、酰胺、和缩醛/缩酮。喜树碱是可以使用这些接头进行缀合的一种细胞毒素剂。还可以使用由5-7元环酮制备的缩酮，其中缩酮的一个氧与细胞毒素剂连接而另一个氧与抗体附着的接头连接。蒽环类化合物也是可以使用这些接头的适宜细胞毒素的例子。pH敏感性接头类别的另一个例子是顺乌头酸酯，其具有与酰胺键并置的羧酸。羧酸使酸性溶酶体中的酰胺水解加速。还可以使用具有几种其他类型的结构以实现相似类型的水解速度加速的接头。美登素类化合物是可以与在C-9上附着的接头缀合的细胞毒素的例子。用于药物缀合物的另一个潜在释放方法是肽经由溶酶体酶的酶促水解。在一个例子中，肽经由酰胺键与对氨基苯甲醇连接，随后氨基曱酸酯或碳酸酯在苯曱醇和细胞毒素剂之间形成。肽的切割导致氨基苯甲基M甲酸酯或碳酸酯的崩解或自我消灭。使用这种策略的例示性细胞毒素剂包括蒽环类、紫杉烷类、丝裂霉素C和auristatins。在一个例子中，苯酚还可以通过接头而不是氨基甲酸酯的崩解得到释放。在另一种变化中，二硫化物的还原被用于起始对巯基笨甲基氨基甲酸酯或碳酸酯的崩解。与抗体缀合的许多细胞毒素剂在水中的溶解性，如果有的话，也是极低的，并且由于缀合物的聚集，这可能限制在缀合物上的药物负荷。克服这点的一种方法是给接头添加增溶基团。可以使用由PEG和二肽组成的接头制备的缀合物，包括具有与抗体连接的PEG二酸、硫羟酸、或马来酰亚胺酸，二肽间隔物，和与蒽环或倍癌霉素类似物的胺的酰胺键的那些缀合物。另一个例子是由与细胞毒素剂键合的含PEG接头的二辟u化物和与抗体键合的酰胺制备的缀合物。掺入PEG基团的方法对于克服聚集和药物负荷限制可能是有利的。对于本发明的抗体/药物缀合物制备优选的代表性接头包括下式的接头(CO-AIk1-Sp1-Ar画Sp2-歳2-C(Z1)=Q-SP)其中All^和AlP独立地是键或分支的或不分支的(C广do)亚烷基链；Sp!是键、-S-、画O-、-CONH-、曙NHCO-、-NR'-、-N(CH2CH2)2N-、或画X-Ar，-Y-(CH2)n-Z，其中X、Y和Z独立地是键、-NR'-、-S-或-O-,条件是当n-0时，Y和Z中的至少一个必须是键，且Ar'是由(d-C5)烷基、(C广Cj烷氧基、(d-C4)硫代烷氧基、卣素、硝基、-COOR，、-CONHR'、-(CH2)nCOOR'、-S(CH2)nC()OR'、-O(CH2)nCONHR，或-S(CH2)nCONHR'的1、2或3个基团任选取代的l，2-、1,3-或1，4-亚苯基，条件是当Alk'是键时，81是键；n是0-5的整数；R'是由-OH、(C,-C4)烷氧基、(d-C4)硫代烷氧基、卤素、辨基、(CrC3)二烷基氨基、或(Ci-C3)三烷基铵-A—的一个或2个基团任选取代的分支的或不分支的(CrCs)链，其中A—是完成盐的药学上可接受的阴离子；Ar是由(Cj-C6)烷基、(CrC5)烷氧基、(d-C4)硫代烷氧基、囟素、硝基、-C()OR'、-CONHR'、-O(CH2),'COOR'、-S(CH2)nCOOR，、-O(CH2)nC()NHR'或-S(CH2)nCONHR，的1、2或3个基团任选取代的1，2-、1,3-或1，4-亚苯基，其中n和R'如上文定义，或Ar是l，2-、1，3-、1，4-、1，5-、1，6-、1，7-、1,8-、2,3-、2，6-或2，7-亚萘基，或其中亚萘基或吩瘗。秦各任选地由(C广CJ烷基、(Q-C5)烷氧基、(d-C4)硫代烷氧基、囟素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2)nCOOR'、-S(CH2)nCOOR'或-S(CH2)。CONHR'的1、2、3或4个基团取代，其中n和R，如上文定义，条件是当Ar是吩瘗嗪时，SpJ是仅与氮连接的键；Sp2是键、-S-或-O-，条件是当Alk2是键时，Sp2是键；Z，是H、(C广Cs)烷基、或由(C广C5)烷基、(C,-Cs)烷氧基、(C,-C4)>5危代烷氧基、囟素、硝基、画COOR'、-ONHR'、-O(CH2)nCOOR'、画S(CH2)nCOOR'、-O(CH2)nCONHR'或-S(CH2)nCONHR，的1、2或3个基团任选取代的苯基，其中n和R'如上文定义；Sp是直链或支链二价或三价(Cj-C18)基团，二价或三价芳基或杂芳基基团，二价或三价(C3-C18)环烷基或杂环烷基基团，二价或三价芳基或杂芳基-芳基(CVQs)基团，二价或三价环烷基或杂环烷基-烷基(CrC18)基团，或二价或三价(C2-C18)不饱和的烷基基团，其中杂芳基优选是呋喃基、噻汾基、N-甲基吡咯基、吡淀基、N-曱基咪唑基、噁唑基、嘧咬基、壹啉基、异会啉基、N-甲基^唑基、氨基香豆素基、或吩嗪基，并且其中如果Sp是三价基团，那么Sp还可以由低级(C广Cs)二烷基氨基、低级(d-C5)烷氧基、羟基、或低级(d-C5)烷硫基任选取代；和Q是-NHNCO-、=NHNCS-、=NHNCONH-、二NHNCSNH-或-NHO-。优选地，Al^是分支或不分支的(d-C,o)亚烷基链，Sp'是键、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-或-NR'，其中R，如上文定义，条件是当Alk'是键时，Sp'是键；Ar是由(C广C6)烷基、(C广Cs)烷氧基、(C广C4)硫代烷氧基、卣素、硝基、-C()OR'、-CONHR'、()(CH2)nCOOR，、-S(CH2)nCOOR'、-O(CH2)。CONHR'或-S(CH2)。CONHR'的1、2或3个基团任选取代的1，2-、1，3-或1，4-亚苯基，其中n和R'如上文定义，或Ar是各自由(d-G)烷基、(d-Cs)烷氧基、(C,-C4)硫代烷氧基、卤素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-()(CH2)nC()OR，、-S(CH2)nCOOR，、-O(CH2)nCONHR，或-S(CH2)nCONHR'的1、2、3或4个基团任选取代的l，2-、l，3-、l，4-、1,5-、l，6-、l，7-、1,8-、2，3-、2,6-或2,7-亚萘基。Zi是(C广Cs)烷基、或由(C广Cs)烷基、(C广Q)烷氧基、(d-C4)硫代烷氧基、卣素、硝基、-COOR'、-CONHR'、-O(CH2)nCOOR'、-S(CH2)nCOOR'、-O(CH2)nCONHR'或-S(CH2)nCONHR的1、2或3个基团任选取代的苯基；Alk2和Sp2—起是键；且Sp和Q如紧在上文中所定义的。整体合并入本文的美国专利号5,773,001公开了可以用于加利车霉素制备的亲核药物，特别是酰肼和相关亲核体的接头。这些接头对于当药物和接头之间形成的键可水解时可以获得更佳活性的那些情况特别有用。这些接头包含2个官能团，包括(1)与抗体反应的基团(例如，羧酸)，和(2)用于与药物反应的羰基(例如，醛或酮)。羰基可以与药物上的酰肼基团反应以形成腙键。这个键是可水解的，从而允许治疗剂在与把细胞结合后从缀合物中释放。作为一个例子，抗5T4抗体可以通过下述与细胞毒性药物缀合，(1)将细胞毒性药物衍生物加入抗5T4抗体中，其中细胞毒性药物是该蛋白质性质的载体的4.5%-11%重量；(2)在非亲核的、蛋白质相容的、具有约7-9的pH范围的緩沖溶液中使细胞毒性药物衍生物和抗5T4抗体温育，以产生单体的细胞毒性药物/抗体缀合物，其中溶液还包含(a)合适的有机共溶剂，和(b)包含至少一种C6-ds羧酸或其盐的添加剂，且其中温育在约30°C-约35。C进行约15分钟-24小时的时间段；和(3)对步骤(2)中产生的缀合物实施层析分离，以使具有3%重量-10%重量的细胞毒性药物负荷和具有低于10%的低缀合级分(LCF)的单体缀合物与未缀合的抗体、细胞毒性药物衍生物和聚集的缀合物分离。步骤(3)的层析分离可以包括方法例如尺寸排阻层析法(SEC)、超滤/渗滤(diafiltration)、HPLC、FPLC或SephacrylS-200层析法。层析分离还可以通过疏水作用层析法(H1C)使用PhenylSepharose6FastFlow层析介质、ButylSepharose4FastFlow层析介质、OctylSepharose4FastFlow层析介质、ToyopearlEther-650M层析介质、Macro-Prep甲基HIC介质或Macro-Prept-ButylHIC介质来完成。用于制备抗5T4抗体/药物缀合物的代表性方法包括在共同待决的公开的美国专利申请公开号2004-082764A1和美国专利申请号10/699，874中针对CMC-544的制备描述的方法，所述专利申请整体合并入本文。缀合可以使用下述条件来进行10mg/ml抗体，8.5%(w/w)加利车霉素衍生物，37.5mM癸酸钠，9%(v/v)乙醇，50mMHEPES(N-(2-羟乙基)哌，秦-N，-U-丁磺酸))，pH8.5，32°C,1小时。疏水相互作用层析法(HIC)可以使用丁基琼脂糖FF树脂，0.65M磷酸钾加样緩冲液，0.49M磷酸钾洗涤緩冲液，和4mM磷酸钾洗脱緩冲液来进行。緩冲液更换可以通过尺寸排阻层析法、超滤/渗滤、或其他合适的方法来完成。抗体/药物缀合物可以配制在1.5%Dextran-40，0.9%蔗糖，0.01%TWEEN-80，20mMTris/50mMNaCl，pH8.0中。还可以使用包含5%蔗糖，0.01%TWEEN-80，20mMTris/10mMNaCl,pH8.0的备选配制溶液。冻干循环基于制剂进行调整。配制物的浓度可以是0.5mg缀合物/ml。每个小瓶可以包舍1mg缀合物，即2ml充填。其他充填体积可以根据需要进行准备，例如，5ml充填。其他代表性方法包括针对CMD-193描述的方法，同样在美国专利申请公开号20060002942中描述。缀合可以使用下述条件来进行10mg/ml抗体，7%(wAv)加利车霉素衍生物，lOmM脱氧胆酸盐，50mMHEPES(N-(2-羟乙基)哌嗪-N，-(4-丁磺酸))，9%(v/v)乙醇，pH8,2，32°C，l小时。反应可以用0.66M磷酸钟pH8.56稀释10倍，并且HIC可以使用丁基琼脂糖FF树脂，0.60M磷酸钾加样緩冲液和洗涤緩冲液，和20mMTris/25mMNaCl洗脱緩冲液来进行。緩冲液更换可以使用超滤/渗滤用再生纤维素膜来完成。缀合物可以用20mMTris/10niMNaClpH8.0(10置换体积(diavolmnes))进行渗滤。抗体/药物缀合物可以在5%蔗糖，0.01%TWEEN-80，20mMTris/10mMNaCl,pH8.0中进行配制。配制后的缀合物的浓度可以是lmg/ml，并且小瓶充填可以是5mg/小瓶，即5ml充填，或其他充填体积可以根据需要进行准备。在本发明的一个具体实施方案中，使用的接头是4-(4'-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)。抗体/药物缀合物通过使P-加利车霉素、y-加利车霉素或N-乙酰y-加利车霉素、或其衍生物与3-巯基-3-甲基丁酰肼、AeBut接头和本发明的抗5T4抗体反应而制备。参见例如，美国专利号5,773,001。这个接头产生在循环中基本上稳定的缀合物，每天释放估计2%的NAc-yDMH，并且此缀合物在酸性溶酶体中立即地释放NAc-yDMH。在本发明的其他实施方案中，抗体/药物缀合物使用3-乙酰苯基乙酸(AcPac)或4_巯基-4-曱基-戊酸(Amide)作为接头分子进行制备。对于》丈射性同位素缀合有用的代表性接头包括二亚乙基三胺五乙酸盐(DTPA)-异硫氰酸盐、琥珀酰亚胺基6-肼烟酸酯盐酸盐(SHNH)、和六曱基丙烯胺將(HMPAO)(Bakker等人(19卯)J.Nucl.Med.31:1501-1509，Chattopadhyay等人(2001)Nucl.Med.Biol,28:741-744,Dewanjee等人(1994)J.Nucl.Med.35:1054-63，Kreiming等人(1989)Lancet1:242-244,Sagiuchi等人(2001)Ann.Nucl.Med.15:267-270);美国专利号6,024,938)。备选地，靶向分子可以进行衍生，从而使得放射性同位素可以与其直接结合(Yoo等人(1997)J.Nud.Med.38:294-300)。橫化法也是本领域已知的，并且代表性方案可以在例如Krenning等人(1989)Lancet1:242-4和Bakker等人(1990)JNucl.Med.31:1501-9中找到。为了进一步增加每抗体/药物缀合物的药物分子数目，药物可以与聚乙二醇(PEG)缀合，包括直链或支链的聚乙二醇聚合物和单体。PEG单体具有下式-(CH2CH20)-。药物和/或肽类似物可以与PEG直接或间接(即通过合适的间隔基团例如糖)结合。PEG/抗体/药物组合物还可以包括另外的亲脂和/或亲水结构部分，以促进在体内的药物稳定性和递送至靶位点。用于制备含PEG的组合物的代表性方法可以在美国专利号6,461,603;6,309,633;及5,648,095以及其他地方找到。例如，为了增加抗体-加利车霉素缀合物中的加利车霉素的量，抗体在与加利车霉素缀合前与PEG进行缀合，例如，使用PEG-SPA、PEG-SBA或PEG-二-马来酰亚胺。使用PEG制备的抗体/药物缀合物可能显示对于耙抗原减小的结合亲和力，但由于增加的药物负荷而仍是有效的。添加剂平的聚集物的抗体/加利车霉素缀合物。许多药物包括加利车霉素的疏水性可能导致抗体/药物缀合物的聚集。为了生产具有较高的药物负荷/产量和减少的聚集的单体抗体/药物缀合物，缀合反应可以在包含(i)丙二醇作为共溶剂，和(ii)含有至少一种C6-C18羧酸的添加剂的非亲核的、蛋白质相容的緩冲溶液中进行。有用的酸包括C7-C,2酸，例如辛酸或辛酸(caprylicacid)或其盐。还可以使用丙二醇之外的其他蛋白质相容性有机共溶剂，例如乙二醇、乙醇、DMF、DMSO等。有机共溶剂中的一些或全部用于将药物转移到缀合混合物中。对于使用N-羟基琥珀酰亚胺(OSu)酯或其他类似活化的酯制备抗体/药物缀合物，有用的緩冲液包括磷酸盐緩沖盐水(PBS)和N-2-羟乙基艰，秦-N'-2-乙磺酸(HEPES緩冲液)。在缀合反应中使用的緩沖溶液应基本上缺乏游离胺和亲核体。作为另一种方法，缀合反应可以在包^k丁醇但不含另外添加剂的非亲核的、蛋白质相容的緩沖溶液中进行。参见例如，美国专利号5,712,374和5,714,586。用于缀合的另外方法和含加利车霉素的缀合物在美国专利号5，739，116和5,877,296中得到描述。用于形成单体缀合物的最佳反应条件可以通过反应变量例如温度、pH、加利车霉素衍生物输入量和添加剂浓度的变化凭经验决定。丙二醇的代表性量为总溶液体积的10%-60%，例如，10%-40%，或约30%。包含至少一种CVC,8羧酸或其盐的添加剂的代表性量为20mM-100mM，例如40mM_90mM，或约60mM-卯mM。CVd8羧酸或其盐的浓度可以增至150-300mM,而共溶剂降至1%-10°/。。在本发明的代表性实施方案中，羧酸是辛酸、癸酸、或相应的盐。例如，200mM辛酸可以与5%的丙二醇或乙醇一起使用。缀合反应可以在略微升高的温度(30-35°C)和pH(8.2-8.7)进行。抗体的浓度可以为1-15mg/ml，并且加利车霉素衍生物例如N-乙酰Y-加利车霉素1)MHAcButOSu酯的浓度可以为抗体的约4.5重量o/q-11重量％。适合于其他药物的缀合的条件可以由本领域技术人员无需过度实验进行确定。111.C.抗体/药物缀合物的纯化缀合后，单体缀合物可以通过常规方法与未缀合的反应物和/或聚集形式的缀合物分开，所述常规方法例如尺寸排阻层析法(SEC)、疏水作用层析法(HIC)、离子交换层析法(mC)或层析聚焦(CF)。纯化的缀合物是单体的，并且通常包含3重量％-10重量％的药物。抗体/药物缀合物还可以使用疏水作用层析法(HIC)进行纯化，所述mc提供超过SEC的几个优点，包括(1)有效地减少LCF含量以及聚集物的能力；(2)对大反应体积的适应；和(3)产物的最小稀释。适合于生产规模使用的高容量HIC介质包括PhenylSepharose6FastFlow层析介质，ButylSepharose4FastFlow层析介质,OctylSepharose4FastFlow层析介质，ToyopeaiiEther國650M层析介质，Macro-PrepmethylHIC介质或Macro-Prept-ButylHIC介质。超滤/渗滤还可以用于緩沖液更换。在代表性纯化方法中，执行多个步骤，包括离心细胞去除步骤、蛋白A亲和捕获步骤随后为1个或2个正交层析精制(polishing)步骤、病毒过滤步骤、以及用于浓缩和配制的切线流过滤步骤。纯化方法优选产生具有小于5%聚集物、小于20ppm蛋白质A、小于50ppm宿主细胞蛋白质、和大于50%的总回收率的产物。典型的抗5T4/加利车霉素制剂主要(~95%)包含如下缀合抗体，该抗体包含5-7摩尔加利车霉素/摩尔抗体。缀合物已在实验室规模(IO-200mg)上进行重现性制备。表示为ng加利车霉素/mg单克隆抗体的药物负荷由加利车霉素浓度(ng/mL)除以抗体浓度(mg/mL)来确定。这些值通过测量在280nm和310nm处的缀合物溶液的UV吸光度进行确定。重要的是注意，这是平均负荷，实际负荷是以此平均负荷值为中心的准高斯分布，即，某些抗体具有高于平均的负荷，而某些抗体具有低于平均的负荷。可以使用分析型H1C-HPLC(疏水作用高效液相层析法)测量的未缀合的抗体(低缀合级分)是几乎未缀合或完全无缀合加利车霉素的抗体群体。这个值是对抗体上的加利车霉素分布的量度，并且一般不影响给药的加利车霉素量。可以使用ELISA测量的未缀合的加利车霉素指未与抗体缀合的、以总加利车霉素的百分比表示的加利车霉素量。药物负荷试验不区分未缀合的和缀合的加利车霉素。当使用药物负荷试验时，未缀合的加利车霉素的量是无法检测或可忽略不计的，并且因此这些试验有效测量缀合的加利车霉素的量。分析型方法可以用于就人源化抗5T4加利车霉素缀合物的释放和稳定性测试进行测定。缀合物可以就同一性(IEF)、强度(总蛋白质和总加利车霉素负荷)、纯度(未缀合的加利车霉素、低缀合的抗体、聚集物含量和SDS-PAGE还原的)和免疫亲和性(抗原结合ELISA)进行评估。可以使用本领域技术人员已知的其它试验。使用这些试验，可以维持商业制备中的批次之间一致性。III.D.抗体/药物缀合物的药代动力学5T4靶向的免疫缀合物的药代动力学可以在各种动物中进行评估，并与未缀合的加利车霉素的药代动力学进行比较。例如，这可以在雌性棵鼠、雄性斯普拉格-道利(Sprague-Dawley)大鼠、和雌性食蟹猴中在单次静脉内推注施用后进行。一般抗5T4抗体的药代动力学的特征在于在各种物种中的低清除率、低分布体积、和长的表观末端半衰期。未缀合的加利车霉素衍生物的血清浓度预期低于定量界限。关于这些缀合物在单剂量毒性范围研究中的毒性谱预期类似于针对其他抗体/加利马缀合物在相当剂量时获得的毒性谱。IV.用于表征抗5T4抗体和抗体/药物缀合物的功能试验本发明进一步公开了体外和体内试验以表征抗5T4抗体的活性，包括5T4结合活性、与细胞表面上呈现的5T4抗原结合后的细胞内在化、和在受试者中对5T4表达细胞的靶向。当与细胞毒素缀合时，本发明所公开的抗体可以引发抗癌活性，包括抑制5T4表达癌细胞的生长和/或诱导5T4表达细胞的细胞死亡。本发明的抗5T4抗体可以包含一种或多种前述活性。用于检测抗5T4抗体与5T4抗原的结合的技术是本领域已知的，包括例如，如实施例2中所述的BIACORE⑧试验。另外的代表性技术包括离心、亲和层析法和其他免疫化学方法。参见例如Manson(1992)ImmunochemicalProtocols,HumanaPress,Totowa，NewJersey,UnitedStatesofAmerica;Ishikawa(1999)UltrasensitiveandRapidEnzymeImmunoassay,Elsevier,Amsterdam/NewYork。抗原结合试验可以使用分离的5T4抗原或5T4表达细胞来进行。参见实施例2。抗5T4抗体的结合特异性可以通过结合表位的定义，即参与抗原结合的残基(包括非邻近残基)的鉴定，和/或影响抗原结合的残基的定义来进一步描述。参见实施例4-5。抗5T4抗体和抗体/药物缀合物被5T4表达细胞的内在化可以通过观察随着时间的过去与5T4表达细胞的表面结合的抗体或缀合物的量的变化进行测定。用于评估抗体和抗体/药物缀合物的膜定位的代表性技术在实施例3中得到描述。功能试验还包括用于评估抗体/药物缀合物的抗癌活性的方法，例如破坏现有的癌细胞，或延迟或阻止癌细胞生长的能力。由本发明的抗体/药物缀合物耙向的癌症包括在受试者中的任何组织的原发性和转移性肿瘤和癌，包括癌和恶性血液病例如白血病和淋巴瘤。少5T4表达细胞的增殖。用于在体外快速评估细胞生长抑制的代表性方法在Jones等人(2001)丄Immunol.Methods254:85-98中得到描述。抗5T4抗体还可以包含i秀导细胞死亡的能力，例如以核DNA的降解，核变性和浓缩，膜完整性的丧失，和吞噬作用为特征的程序化细胞死亡。评估细胞的代表性试验在Hoves等人(2003)Methods31:127-34;Peng等人(2002)Chin.Med.Sci.丄17:17-21;Yasuhara等人(2003)J.Histochem.Cytochem.51:873-885中得到描述。例如，为了评估抗5T4抗体/加利马缀合物在体外的细胞毒性，MDAMB435/5T4细胞(过量表达人5T4抗原的人乳腺癌细胞)和MDAMB435/neo细胞(对照细胞)在抗体-加利车霉素缀合物或游离加利车霉素的存在下进行培养，基本上如由Boghaert等人(MO4)，Clin.CancerRes.，10:4538-4549所述的。每种试剂的细胞毒素报告为ED50(ng/ml)，这是引起细胞培养物相对于未经处理的对照发生50%减少的以缀合物或游离药物给出的加利车霉素量。培养中的细胞数目在药物暴露后使用活体染料(MTS)进行测定。还参见实施例6。抗体/加利车霉素缀合物的细胞毒性还可以使用以适合于球状体生长的方式培养的MI)AMB435/5T4和MDAMB435/neo细胞进行评估。细胞在抗体/加利车霉素缀合物或游离加利车霉素的存在下进行培养，并且在药物暴露后，测定每个球状体的大小。每种试剂在抑制球状体生长中的效率才艮告为ED50(ng/ml)，即引起^^状体生长相对于未经处理的对照发生50%抑制的以缀合物或游离药物给出的加利车霉素量。参见实施例6。为了评估抗5T4抗体/加利车霉素缀合物在体内的细胞毒性，在棵鼠中通过皮下注射MDAMB435/5T4细胞(过量表iiA5T4抗原的人乳腺癌细胞)、NCI-H157细胞(人非小细胞肺癌细胞)、PC14PE6细胞(人非小细胞肺癌细胞)或N87细胞(人胃癌细胞)，制备肿瘤。抗体/加利车霉素缀合物和对照化合物例如通过腹膜内注射，以4天为间隔，例如在第1、5和9天时给予总共3次剂量，施用于荷瘤小鼠。可测量的治疗结果包括肿瘤细胞生长的抑制。为了进一步评估抗5T4抗体/加利车霉素缀合物的靶向能力，可以使用用于非小细胞和小细胞癌的同位模型，基本上如()nn等人(2003)Clin.CancerRes.9(15):5532-5539所述。简言之，将人肺腺癌(PC14PE6)细胞注入棵鼠的尾静脉内，其随后迁移以在肺中形成肿瘤。肿瘤可以在肺实质中以实性结节出现，并引起包含悬浮的肿瘤细胞的出血性胸腔积液。对照化合物和抗体/加利车霉素缀合物例如通过在肿瘤细胞注射后第6天开始行腹膜内注射施用于荷瘤小鼠，以4天为间隔给予总共3次剂量，例如在第6、10和14天时。可测量的治疗结果包括减少的胸腔积液和增加的存活。V.抗5T4抗体和抗体/药物缀合物的使用本发明的抗5T4抗体和抗体/药物缀合物在体外和体内均可用于与5T4表达细胞相关的应用中。表达5T4的癌症包括鳞状/腺瘤性肺癌(非小细胞肺癌)、浸润性乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、鳞状宫颈癌、浸润性子宫内膜腺癌、浸润性胰腺癌、卵巢癌、鳞状膀胱癌和绒毛膜癌。5T4在支气管、乳腺、结肠、直肠、胃、子宫颈、子宫内膜、胰腺、卵巢、绒毛膜(chorium)和精囊的癌中以高水平-皮检测到。V.A.体外应用本发明提供了使用抗5T4抗体的体外方法。例如，所公开的抗体可以单独或与细胞毒素剂或特异性结合5T4阳性癌细胞的其他药物组合使用，以耗竭来自细胞样品的此类细胞。还提供了经由使5T4表达细胞与抗体/药物缀合物接触用于诱导凋亡和/或抑制细胞增殖的方法，所述抗体/药物缀合物包含与细胞毒素缀合的抗5T4抗体。代表性体外方法在上文中在"用于表征抗5T4抗体和抗体/药物缀合物的功能试验"的标题下得到描述。基于其特异性结合5T4抗原的能力，本发明的抗5T4抗体还具有在体外检测5T4阳性细胞的功用。用于检测5T4表达细胞的方法可以包括(a)制备包含细胞的生物样品；(b)使抗5T4抗体与生物样品在体外接触；和(c)检测抗5T4抗体的结合。为了促进检测，抗体可以与标记缀合。V.B.体内检测和it断本发明的抗5T4抗体还可以用于体内检测法，例如用于诊断，以提供手术中辅助、或用于剂量确定。标记的抗5T4抗体施用于受试者后，在足以发生结合的一般时间后，可以显现由抗体结合的5T4表达细胞的生物分布。所公开的诊断法可以与治疗法组合使用。此外，本发明的抗5T4抗体可以施用用于检测和治疗的双重目的。代表性非侵袭性检测法包括闪烁扫描术(例如，SPECT(单光子发射计算机断层摄影术)、PET(正电子发射断层摄影术)、y照相成像、和直线扫描)，磁共振成像(例如，常规磁共振成像、磁化传递成像(MTI)、质子磁共振波谱(MRS)、弥散加权成像(DWI)和MR功能成像(fMRI))，和超声。V.C.治疗应用本发明进一步涉及用于在受试者中诱导5T4表达癌细胞的细胞溶解的方法和组合物。本发明的抗5T4抗体/药物缀合物对于抑制癌细胞和非赘生增生性病症的细胞的生长有用，所述病症例如增生、化生、或最特别地，发育异常(关于此类异常生长病状的综述，参见DeVita，Jr.等人(2001)，Cancer:PrinciplesandPractice,第6版,LippincottWilliams&Wilkins。适合于使用抗5T4抗体/药物缀合物靶向的癌症包括在乳腺，结肠，直肠，肺，口咽，下咽，食道，胃，胰腺，肝，胆嚢，胆管，小肠，泌尿道(包括肾)、膀胱和尿道上皮，女性生殖道，子宫颈，子宫，卵巢，男性生殖道，前列腺，精嚢，睾丸，内分泌腺，甲状腺，肾上腺，垂体，皮肤，骨，软組织，血管，脑，神经，a艮，脑膜中的5T4表达原发性和转移性肺瘤。其他相关癌症是5T4表达白血病和淋巴瘤(例如，何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)，包括惰性、侵袭性、低度恶性、中度恶性或高度恶性的白血病或、淋巴瘤。特别地，5T4已知在鳞状/腺瘤性肺癌(非小细胞肺癌)、浸润性乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、鳞状宫颈癌、浸润性子宫内膜腺癌、浸润性胰腺癌、卵巢癌、鳞状膀胱癌和绒毛膜癌的细胞上表达。5T4在支气管、乳腺、结肠、直肠、胃、子宫颈、子宫内膜、胰腺、卵巢、chorium和精嚢的癌上以高水平^皮检测到。5T4抗原的细胞表面分布可以是均匀或不均匀的。在结肠直肠癌、胃癌和卵巢癌中，5T4的表达与疾病的i^艮直接相关。在乳腺癌中，观察到在转移性结节上增加的5T4染色强度，然而，5T4表达与疾病阶段不相关。这些癌症还可以表达LewisY糖抗原，包括乳腺、结肠、胃、食道、胰腺、十二指肠、肺、膀胱和肾癌以及胃和胰岛细胞神经内分泌肿瘤。参见美国专利号6,310,185。因此，待用本发明的抗5T4/药物缀合物治疗的患者可以基于生物标志的表达进行选择，所述标志包括但不限于5T4抗原升高的表达，由此导致针对富集的靶表达而不是针对肿瘤起源或组织学而选择的患者群体。耙表达可以作为细胞染色强度和染色的细胞数目的函数进行测量。例如，5T4的高表达的分类包括患者具有超过30%(即，40%、50%或60%)的细胞通过免疫组织化学5T4阳性染色在3+水平上(1-4)，而5T4的中等表达可以包括患者具有超过20%的细胞为1+至2+染色。除5T4抗原表达外的其它生物标志也可以用于患者选择，包括例如基于多药抗性(MDR)的肿瘤表征。近50%的人类癌症对化学疗法是完全抵抗的，或仅短暂应答，这之后它们不再受常用的抗癌药的影响。这种现象称为MDR，并且某些肿瘤类型固有地表现MDR，而其他的在暴露于化学疗法处理后获得MDR。药物外排泵P-糖蛋白介导与细胞毒性化学治疗剂相关的大部分MDR。可以进行癌症患者肿瘤样品中存在的MDR机制的表型和功能分析，以便将特定的肿瘤类型中的化学疗法抗性与特定MDR机制关m^来。癌症生长或异常增殖是指提示细胞内发生向更晚期的癌症形式或疾病状态的变化的许多指标中的任何一种。癌细胞或非赘生增殖性病症的细胞的生长抑制可以通过本领域已知的方法进行评估，例如延迟的肿瘤生长和转移的抑制。用于测量癌症生长的抑制的其他指标包括癌细胞存活的减少，肺瘤体积的减少或形态(例如，如使用计算机断层摄影术(CT)、超声检查或其他成像法测定的)，肺瘤脉管系统的破坏，迟发型超敏性皮肤测试中文善的性能，细胞溶解性T淋巴细胞的活性增加，肿瘤特异性抗原水平的减少。尽管不希望受任何单一一种作用模式的束繂，抗原指导的靶向以及抗5T4抗体/药物缀合物的被动靶向都可以促成抗瘤功效。抗原指导的靶向是指与对照组织(即，怀疑基本上缺乏5T4表达细胞以及施用的抗5T4/药物缀合物的结合和/或积累的组织)比较，肽或肽类似物在靶组织(即，包含5T4表达细胞和积累抗5T4/药物缀合物的预期位点的组织)中的优先移动和/或积累。抗体/药物缀合物的优先定位一般使得靶组织中的抗体/药物缀合物的量比对照组织中的抗体/药物缀合物的量大大约2倍，例如大约5倍或更大，或大约10倍或更大的量。被动耙向一般指由于脉管系统中的局部变化，抗体或抗体/药物缀合物浮皮隔绝在肿瘤位点处。例如，抗5T4/药物缀合物可以在肿瘤位点处离开脉管系统(其由于增加的VEGF生产而有孔)，与5T4表达细胞结合，并触发抗5T4/药物缀合物的内在化。肿瘤的弱的静脉和淋巴流还导致未结合的抗5T4/药物缀合物的隔绝。使用酸不稳定性接头与药物缀合的抗体可以释放药物，所述药物随后扩散进入肿瘤细胞内。被动靶向的抗瘤效应虽不是永久的，或不如由抗原指导的靶向诱导的抗瘤效应一样有效，但可促成总功效。V.D.制剂本发明的抗5T4抗体和抗5T4/药物缀合物可以容易地制备和配制以用于安全和有效的临床应用。用于施用于受试者的合适制剂包括水性的和非水性的无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂，緩冲剂，抑细菌剂，抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对幾苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞)，使制剂与预期接受者的体液等渗的溶质(例如，糖、盐和多元醇)，悬浮剂和增稠剂。合适的溶剂包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、及其混合物。制剂可以在单位剂量或多剂量容器例如密封的安瓿和小瓶中给出，并且可以贮藏于冷冻或冷冻干燥(冻干的)条件下，仅需要临在施用给受试者前添加无菌液体载体，或用于随后以适合于预期应用的同位素进行放射性标记。本发明的抗5T4抗体和抗体/药物缀合物优选如下文所述配制为有效剂量。作为一个例子，代表性抗5T4抗体或抗5T4/药物缀合物制剂包括组成为40mg/ml抗体或抗体/药物缀合物、25mM乙酸盐、150mM海藻糖、0.9%苯曱醇、0.02%聚山梨醇酯20、pH5.0的多剂量制剂，其具有在2-8'C下贮藏最低2年的保存限期。作为另一个例子，抗5T4抗体或抗5T4/药物缀合物制剂可以包含在9.0mg/ml氯化钠、7.35mg/ml二水合柠檬酸钠、0.7mg/ml聚山梨醇酯80和无菌水、pH6.5中的10mg/ml抗体或抗体/药物缀合物。用于施用于实验小鼠模型的抗5T4/加利车霉素缀合物的代表性制剂包括2pg或4jig加利车霉素(参见实施例3、4和7)，这可以相应地按比例增加以用于对人的施用。抗5T4抗体或抗体/药物缀合物的稳定冻干制剂可以通过下述来制备(a)使抗体/药物缀合物在溶液中溶解至0.5-2mg/ml的终浓度，所述溶液包含浓度1.5重量％-5重量％的冷冻保护剂、浓度0.5重量％-1.5重量o/。的聚合物填充剂、浓度O.OlM-0.1M的电解质、浓度0.005重量％-0.05重量％的溶解度促进剂、浓度5-50mM的緩冲剂(这使得溶液的最终pH为7.8-8.2)，和水；(b)将上述溶液在+5。C至+10。C温度分装到小瓶内；(c)在-35。C至-50。C的冷冻温度下冷冻溶液；(d)在20-80微米的初级干燥压力下以-l(TC至-4(TC的搁板温度对冷冻溶液实施24-78小时的初级冷冻干燥步骤；和(e)在20-80微米的干燥压力下以-10。C至十35'C的搁板温度对步骤(d)的冷冻干燥产物实施15-30小时的次级干燥步骤。对于冷冻保护剂的冻干有用的代表性冷冻保护剂包括糖醇、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、聚乙二醇、醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸、醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、甘油醛、阿拉伯糖、来苏糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨糖醇、乳糖、甘露醇、甲基a-吡喃葡萄糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡糖二酸、赤藓糖、苏糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖、神经氨酸、阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、果聚糖、岩藻多糖、角叉菜胶、半乳卡洛糖、果胶、果胶酸、直链淀粉、支链淀粉、糖原、支链淀粉、纤维素、葡聚糖、石耳素、壳多糖、琼脂糖、角蛋白、软骨素、皮肤素、透明质酸、海藻酸、黄原胶、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、甘油和季戊四醇。例如，冷冻保护剂蔗糖可以以1.5重量％的浓度4吏用，聚合物填充剂Dextran40或羟乙基淀粉40可以以().9重量％的浓度使用，在冻干溶液中使用的电解质是以0.05M的浓度存在的氯化钠，和緩冲剂緩血酸胺可以以0.02M的浓度使用。溶解度促进剂(例如表面活性剂例如聚山梨醇酯80)也可以在冻干过程期间使用。通常这种溶解度促进剂是表面活性剂。用于制备冻干制剂的代表性步骤包括在-45。C温度冷冻小瓶；对冷冻溶液在60微米的初级干燥压力下以-30。C的搁板温度实施60小时的初始冷冻干燥步骤；和对冷冻干燥产物在60微米的干燥压力下在+25。C的搁板温度实施24小时的次级干燥步骤。抗5T4抗体和抗体/药物缀合物在药学上可接受的载体中进行配制，所述载体为例如，大的緩慢代谢的大分子例如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合物氨基酸、氨基酸共聚物和失活的病毒颗粒。还可以使用药学上可接受的盐，例如矿物酸盐，例如盐酸盐、氬溴化物、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸的盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。制剂可以另外包含液体例如水、盐水、甘油和乙醇、和/或辅助物质，例如湿润剂和/或乳化剂或pH緩冲物质，可以存在于此类組合物中。此类载体使得组合物能够配制为用于由患者吞咽的片剂、丸剂、锭剂、胶嚢、液体、凝胶、糖浆剂、膏剂(slurry)和悬浮液。V.E.剂量和施用本发明的抗5T4抗体和抗5T4/药物缀合物可以肠胃外施用，例如经由血管内、皮下、腹膜内、或肌内施用。关于组合物向肺途径的递送，组合物可以作为气雾剂或粗喷雾剂施用，即，经鼻施用。鞘内、髓内或心室内施用可以用于治疗中枢神经系统(CNS)癌症和CNS相关癌症。抗5T4抗体和抗5T4/药物缀合物还可以透皮、经皮、局部、肠内、阴道内、舌下或经直肠施用。静脉内施用可能是临床中常规使用的。递送方法基于下述考虑如待治疗的病状和位点、抗体制剂的类型、和组合物的治疗效果进行选择。本发明提供了有效量的抗5T4抗体和抗5T4/药物缀合物施用于受试者，即足以引发所需的生物应答的抗ST4抗体或抗5T4/药物缀合物量。例如，当施用于具有癌症的受试者时，有效量包含足以引发抗癌活性的量，所述抗癌活性包括癌细胞的细胞溶解、癌细胞增殖的抑制、癌细胞凋亡的诱导、癌细胞抗原的减少、延迟的肿瘤生长、和/或转移的抑制。肿瘤萎缩被充分接受为功效的临床代替标志。关于功效的另一种已被充分接受的标志是无ii^存活(progression-freesurvival)。抗5T4/加利车霉素缀合物一般显示出对关键功效参数的至少25%的改善，例如中位生存、至肿瘤进展的时间、和总应答率的改善。一般地，有效剂量将是约0.01mg/m2-约50mg/m2,例如约0.1mg/m2-约20mg/m2，或约15mg/m2，所述剂量基于抗5T4抗体的量进行计算。抗5T4/药物缀合物的有效剂量还可以基于缀合药物的量进行计算。例如，用于施用于实验小鼠模型的抗5T4/加利车霉素缀合物的代表性剂量包括2fig或4ng加利车霉素，这可以相应按比例增加用于对人的施用。例如，本发明的抗5T4/加利车霉素缀合物可以每3周l次施用于人患者，持续高达6个周期。对于放射性标记的抗5T4抗体，有效剂量一般是约1mCi-约300mCi，通常约5mCi-100mCi，这取决于放射性同位素和抗体的结合亲和力。对于使用所公开的抗5T4抗体检测5T4阳性细胞，将可检测量的本发明的组合物施用于受试者，即抗5T4抗体的剂量使得可以在体外或体内确定抗体的存在。对于使用放射性同位素的闪烁扫描成像，放射性同位素的一般剂量可以包括约10(iCi-50mCi、或约100^Ci-25mCi、或约500fiCi-20mCi、或约1mCi-10mCi、或约10mCi的活性。本发明组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，以便施用有效达到所需诊断或治疗结果的组合物量。施用方案也可以进行改变。可以使用单次注射或多次注射。所选择的剂量水平和方案将依赖各种因素，包括治疗组合物的活性和稳定性(即，半衰期)、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、待检测和/或治疗的疾病或病症、以及待治疗的受试者的It康状况和先前医疗史。对于本发明的抗5T4抗体和抗5T4/药物缀合物，治疗有效剂量可以最初在细胞培养试验或动物模型例如啮齿类动物、兔、犬、猪和/或灵长类动物中进行估计。动物模型也可以用于测定合适的施用浓度范围和途径。此类信息随后可以用于确定在人中施用的有用剂量和途径。一般地，施用最小剂量，并在不存在剂量限制性细胞毒性的情况下升高剂量。有效量或剂量的确定和调整以及何时和如何进行此类调整的评估是医学领域的普通技术人员已知的。对于组合疗法，抗5T4抗体、抗5T4/药物缀合物、和/或另外的治疗或诊断剂可以在适合于执行预期治疗或诊断的任何时间范围内进行施用。因此，这些单一药剂可以基本上同时(即，作为单一制剂或在数分钟或数小时内)或以任何顺序连续施用。例如，这些单药剂治疗可以在彼此相隔约1年内，例如约10、8、6、4或2个月内，或4、3、2或1周内，或约5、4、3、2或1天内施用。关于制剂、剂量、施用方案和可测量的治疗结果的另外指导，参见Berkow等人(2000)TheMerckManualofMedicalInformation(Merck医学信息手册)，Merck&Co.，Inc.,WhitehouseStation,NewJersey;Ebadi(1998)CRCDeskReferenceofClinicalPharmacology(临床药理学手册).CRCPress,BocaRaton,Florida;Ge隨ro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(Remington:制药科学和实践)，LJppincott，Williams&Wilkins，Philadelphia,Pennsylvania;Katzung(2001)Basic&ClinicalPharmacology(基础和临床药理学)，LangeMedicalBooks/McGraw-HillMedicalPub.Div.,NewYork;Hardman等人(2001)Goodman&Gilman'sthePharmacologicalBasisofTherapeutics(古德曼和吉尔曼的治疗药理学基础)，TheMcGraw-HillCompanies,Columbus,Ohio;Speight&Holford(1997)Avery'sDrugTreatment:AGuidetotheProperties,Choices,TherapeuticUseandEconomicValueofDrugsinDiseaseManagement(艾弗里药物治疗有关疾病处置中药物的性质、选择、治疗应用和经济价值的指南)，Lippincott，Williams,&Wilkins,Philadelphia,Pennsylvania。V.F.组合疗法所公开的抗5T4抗体和抗5T4/药物缀合物可以作为起始治疗进行施用，或用于治疗对常规疗法无应答的病状。此外，抗5T4抗体和抗5T4/药物缀合物可以与其他疗法(例如，手术切除、放射、另外的抗癌药物等)组合使用，以由此引发加性的或增强的疗效和/或减少某些抗癌剂的肝细胞毒性。本发明的抗5T4抗体和抗5T4/药物缀合物可以与另外的药剂共施用或共配制，或配制用于与另外的药剂以任何顺序连续施用。对于组合疗法有用的代表性药剂包括上文描述为对于抗5T4/药物缀合物的制备有用的任^T药物。本发明的抗5T4抗体和抗5T4/药物缀合物也可以与其他治疗抗体和抗体/药物缀合物组合使用，包括除所公开的抗5T4抗体外的抗5T4抗体，以及靶向不同抗原的抗体和缀合物。可以单独或作为抗体/药物缀合物使用的代表性抗体包括抗-CD19抗体，抗-CD20抗体(例如，RITUXAN⑧、ZEVALI酵、BEXXAR),抗-CD22抗体，抗-CD33抗体(例如，MYLOTARG),抗-CD33抗体/药物缀合物，抗-LewisY抗体(例如,Hu3S193、Mthu3S193、AGmthu3S193),抗-HER-2抗体(例如，HERCEPTIN(曲妥珠单抗)、MDX-210、OMNITARG(帕妥珠单抗、rhuMAb2C4)),抗-CD52抗体(例如，CAMPATH)，抗-EGFR抗体(例如，ERBITUX(西妥昔单抗)，ABX-EGF(帕尼单抗))，抗-VEGF抗体(例如，AVASTIN(贝伐珠单抗))，抗-DNA/组蛋白复合物抗体(例如，ch-TNT-1/b)，抗-CEA抗体(例如，CEA-Cide、YMB-1003)hLM609，抗-CD47抗体(例如，6H9)，抗-VEGFR2(或含激酶插入结构域的受体，KDR)抗体(例如，IMC-1C11)，抗-Ep-CAM抗体(例如，ING-1),抗-FAP抗体(例如，西罗珠单抗)，抗-DR4抗体(例如，TRAIL-R)，抗-孕酮受体抗体(例如，2C5),抗-CA19.9抗体(例如，G1VAREX)和抗纤维蛋白抗体(例如，MH-1)。抗5T4抗体/药物缀合物还可以与作为治疗方案一部分的一种或多种细胞毒素组合一起施用。对于这个目的有用的细胞毒性制剂包括CHOPP(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱，强的松和曱基苄肼)；CHOP(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱和强的松)；COP(环磷酰胺，长春新碱和强的松)；CAP-BOP(环磷酰胺，多柔比星，甲基苄肼，博来霉素，长春新碱和强的松)；m-BACOD(氨曱蝶呤，博来霉素，多柔比星，环磷酰胺，长春新碱，地塞米松和甲酰四氬叶酸；ProMACE-MOPP(强的松，氨曱蝶呤，多柔比星，环磷酰胺，依托泊苷，亚叶酸，氮芥，长春新碱，强的松和曱基千肼)；ProMACE-CytaBOM(强的松，氨曱蝶呤，多柔比星，环磷酰胺，依托泊苷，亚叶酸，阿糖胞苷，博来霉素和长春新碱)；MACOP-B(氨曱蝶呤，多柔比星，环磷酰胺，长春新碱，强的松，博来霉素和亚叶酸)；MOPP(氮芥，长春新碱，强的松和甲基苄肼)；ABVD(阿霉素/多柔比星，博来霉素，长^威和达卡巴噪)；与ABV(阿霉素/多柔比星，博来霉素，长M)交替的MOPP(氮芥，长春新碱，强的松和甲基千肼)；与ABVD(阿霉素/多柔比星，博来霉素，长春碱和达卡巴溱)交替的MOPP(氮芥，长春新碱，强的松和甲基苄肼)；ChlVPP(苯丁酸氮芥，长春碱，甲基千肼，强的松)；IMVP-16(异环磷酰胺，氨曱蝶呤，依托泊苷)；MIME(丙脒腙(methyl-gag)，异环磷酰胺，氨曱蝶呤，依托泊苷)；DHAP(地塞米松，高剂量阿糖胞苷和顺铂)；ESHAP(依托泊苷，甲基强的+}龙，Hl)阿糖胞苷，和顺铂)；CEPP(B)(环磷酰胺，依托泊苷，曱基千肼，强的松和博来霉素)；CAMP(洛莫司汀，米托蒽醌，阿糖胞香和强的木>);和CVP-1(环磷酰胺，长春新碱和强的木>);DHAP(顺铂，高剂量阿糖胞苷和地塞米松)；CAP(环磷酰胺，多柔比星，顺铂)；PV(顺铂，长春喊或长春地辛)；CE(卡铂，依托泊苷)；EP(依托泊普，顺辆)；MVP(丝裂霉素，长械或长春地辛，顺柏)；PFL(顺铂，5-氟尿嘧啶，甲酰四氢叶酸)；1M(异环磷酰胺，丝裂霉素)；IE(异环磷酰胺，依托泊苷)；IP(异环磷酰胺，顺铂)；MIP(丝裂霉素，异环磷酰胺，顺铂)；ICE(异环磷酰胺，卡铂，依托泊苷)；PIE(顺铂，异环磷酰胺，依托泊苷)；Viorelbine和顺铂；卡铂和紫杉醇；CAV(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱)；CAE(环磷酰胺，多柔比星，依托泊苷)；CAVE(环磷酰胺，多柔比星，长春新碱，依托泊苷)；EP(依托泊苷，顺柏)；和CMCcV(环磷酰胺，氨甲蝶呤，洛莫司汀，长春新碱)。抗5T4抗体和抗5T4/加利车霉素缀合物可以与全身性抗癌药物或与靶向性细胞毒素例如CMD-193和SGN-15组合使用，所述全身性抗癌药物例如epithilones(BMS-247550，Epo-卯6)、紫杉烷类的重配制剂(reformulation)(Abraxane,Xyotax)、樣i管蛋白抑制剂(MST-997，TTI-237)。另外有用的抗癌药包括TAXOTERE、TARCEVA、GEMZAR(吉西他滨)、5-FU、AVASTIN⑧、ERBITLX⑧、TROVAX⑧、麻安莫单抗(anatumomabmafenat()x)、来曲唑(leti'azole)、多西他赛和蒽环类。对于组合疗法，抗5T4抗体、抗5T4/药物缀合物、和/或一种或多种另外的治疗或诊断剂可以在适合于执行预期疗法或诊断的任何时间范围内进行施用。因此，这些单一药剂可以基本上同时(即，作为单一制剂或在数分钟或数小时内)或以任何顺序连续施用。例如，这些单一药剂治疗可以在彼此约l年内施用，例如在约10、8、6、4或2个月内，或4、3、2或1周内，或约5、4、3、2或1天内。抗5T4抗体或抗5T4/加利车霉素缀合物与第二种治疗剂的组合施用优选引发比任何一种单独施用时更大的效应。实施例已包括下述实施例用于举例说明本发明的实施方式。下述实施例的某方法进行描述。这些实施例举例说明了本申请共同发明人的标准实验室实践。根据;M^开内容和本领域技术人员的一般水平，本领域技术人员将明了下述实施例仅意欲是示例性的，并且可使用众多变化、修饰和改变而不偏离本发明的范围。实施例i鼠类抗5T4抗体抗5T4抗体在小鼠中使用人5T4抗原和用于免疫接种的标准方法进行制备。产生A1、A2和A3抗体的杂交瘤细胞系通过使单个B细胞与骨髓瘤细胞融合来生产。Al、A2和A3抗5T4抗体重链和轻链可变区使用SMARTcDNA合成系统(ClontechLaboratoriesInc.ofMountainView,California)进4亍克隆，随后为PCR扩增。cDNA由从Al、A2或A3杂交瘤细胞中分离的1fig总RNA进行合成，其中使用oligo(dT)和SMARTHAoligo(ClontechLaboratoriesInc.)与POWERSCRIPTTM逆转录酶(ClontechLaboratoriesInc.)。cDNA随后通过PCR进行扩增，其中使用可与SMARTIIAoligo序列退火的引物和小鼠恒定区特异性引物(对于轻链为小鼠k,对于Al重链为小鼠IgG2a，对于A2重链为1gG2b，和对于A3重链为小鼠1gGl)与VENT⑧聚合酶(NewEnglandBiolabsInc.ofIpswich,Massachusetts)。将重链和轻链可变区PCR产物亚克隆到pED6表达栽体内，并且测定核酸序列。这种方法是有利的，因为不需要预先知道DNA序列。此外，所得到的DNA序列不会由于使用简并PCR引物而变化。Al、A2和A3重链可变区的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1的核苷酸58-414、SEQIDNO:5的核苷酸55-405、和SEQIDNO:9的核苷酸58-423所示。Al、A2和A3重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO:2的残基20—138、SEQIDNO:6的残基19—135、和SEQII)NO:10的残基20-141所示。Al、A2和A3轻链可变区的核苷酸序列分别如SEQIDNO:3的核普酸61-381、SEQII)NO:7的核苦酸67-390、和SEQIDNO:11的核香酸61-381所示。Al、A2和A3轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO:4的残基21-127、SEQIDNO:8的残基23-130、和SEQIDNO:12的残基21-127所示。还参见图IA-IC。为了评估A1、A2和A3抗5T4可变区序列的新颖性，BLASTp搜索(对于蛋白质查询序列)使用期望值二10、字长-3、低复杂度滤器、以及BLOSUM62矩阵的缺省参数、以及允许空位存在罚分-U且延长罚分二l来进行。BLASTn搜索(对于核苷酸查询序列)使用期望值=10、字长=11和低复杂度滤器的缺省参数来进行。BLAST搜索结果才艮告为按E值顺序排序的，与查询序列相关的序列列表，E值是在数据库中鉴定到的匹配事件的统计学显著性的指示物。与用于BLAST分析的可变区序列最密切相关的序列标识在表l(BLASTn)和表2(BLASTp)中。表1BLASTn分析<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>A3VH(SEQIDN():10)卯％gil2卯6050lgblAAC04511.1l抗-聚(dC)单克隆抗体重链[小家鼠lA3VL(SEQIDNO:12)97%gil2906108lgblAAC04540.1l单克隆抗体K轻链[小家鼠l实施例2鼠类抗5T4抗体的结合特异性和亲和力为了评估Al、A2和A3抗体的结合特异性和亲和力，使用固定在CM5芯片上的人5T4抗原进行BIACORE⑧分析。BIACORE⑧技术利用抗体与固定在表层上的5T4抗原结合后表层上的折射率改变。结合通过从表面折射的激光的表面等离子体共振(SPR)进行检测。信号动力学结合速率和解离速率的分析允许区分非特异性和特异性相互作用。H8抗5T4抗体用作对照。H8是在PCT国际公开号WO98/55607和Forsberg等人(1997)J.Biol.Chem.272(19):124430-12436中描述的杂交瘤产生的单克隆小鼠IgGl抗体。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>BIACORE⑧结果显示当与A2和A3抗体比较时，H8和Al抗体对于5T4具有更高的亲和力。A2是相对低亲和力的抗体。不寻常的半胱氨酸存在于Al重链可变区的残基67位和A3重链可变区的残基91位上。这些残基由苯丙氨酸(Al)或酪氨酸(A3)替换不改变抗体结合性质或表达水平。H8、A1、A2和A3抗体的结合亲和力也通过蛋白质印迹使用CT26/5T4细胞裂解物进行测定，其鉴定到经由H8、A1和A3的强结合。参见图2。H8、A1、A2和A3抗体结合表达5T4抗原的细月包的能力4吏用PC14PE6细胞的荧光激活细胞分选术(FACS)进行测定。所有抗体显示与表达5T4的PC14PE6细胞的特异性结合，然而，A2结合的水平显著低于就H8、Al和A3所观察到的结合水平。参见表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>为了评估抗体生产中潜在的变异性，测试了Al和H8的2个独立制剂。当与各自相应的制剂比较时，每种抗体的结合和动力学性质没有显著不同。参见图3A-3B。实施例35T4表达细胞对鼠类抗5T4抗体的内在化为了评估在与5T4抗原结合后抗体的内在化，作为时间的函数，测定在细胞表面上相对于在上清液中检测到的H8和Al抗体的量。使非酶促解离的(non画enzymaticallydissociated)MDAMB435/5T4细胞(人乳腺癌细胞)在4。C下暴露于抗5T4抗体1小时。将细胞洗涤并在培养基中于37'C温育4小时或24小时。使用FACS测定相对于未结合的抗体(即，存在于上清液中)，与细胞膜结合的抗体的量。5T4抗体自MDAMB435/5T4细胞表面的消失证实5T4抗原/抗体复合物在细胞表面上受到调节，这可能指示内在化和/或解离。参见图4A-4C。实施例4使用5T4嵌合体的表位作图为了鉴定A1、A2、A3和H8抗体各自结合的表位，使用(1)具有缺失或突变的序列的5T4胞外域Fc构建体，和(2)在COS-l细胞中瞬时表达的5T4嵌合构建体，进行ELISA试验。所述胞外域包括氨基端区域，2个富舍亮氨酸的重复单位，和居间的亲水区。包舍5T4胞外域和来自人IgGl的Fc恒定区的融合蛋白使用小鼠5T4(氨基酸1-361)、大鼠5T4(氨基酸1-361)、食蟹猴5T4(氨基酸1-355)、黑猩猩5T4(氨基酸1-355)、和黑尾绒猴(氨基酸1-355)进行制备。5T4嵌合构建体在图5中得到描述。结合结果概括于表5中，其指出了H8、Al、A2和A3抗体各自的特异性结合、部分结合、或结合的缺乏。人源化H8以及嵌合Al、A2和A3抗体显示出分别类似于鼠类H8、Al、A2和A3的结合性质。基于这些结果，人源化H8抗体被确定为与人5T4在残基173和252之间结合。人源化H8与在残基344上含有或不含有N连接的糖基化的5T4结合，这证实人源化H8与人5T4的结合不发生在膜近侧。Al抗体具有在残基173和252之间与人5T4的第一接触和在残基282和361之间与人5T4的第二接触。A2抗体在残基282-361之间与人5T4结合。A3抗体在残基83直到163之间结合人5T4的第一个富含亮氨酸的重复单位区域。由每个抗体结合的表位在图7中得到描述。表5使用5T4胞外域Fc融合物和人/小鼠5T4嵌合体的表位作图结果<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>(+)结合；(-)无结合；(+/-)部分结合基于对于来自人和食蟹猴的5T4胞外域观察到的不同结合，进行耙向突变以辩别参与抗体结合的残基。测定人源化H8抗体与下表6中指出的各突变5T4胞外域(即在所示位置上包括来自食蟹猴的残基的人5T4胞外域)的结合。这些结果显示人5T4抗原的残基213和214对于人源化H8所结合的表位是必需的。表6使用具有靶向突变的人5T4胞外域/Fc融合物的表位作图结果<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>(+)结合；(-)无结合；(+/-)部分结合除了直接结合试验外，使用生物素化的人源化H8抗体分别与Al、A2或A3抗体各自进行竟争结合试验。未观察到与人5T4的结合受到抑制，从而支持A1、A2和A3均各自与H8抗体结合不同的5T4表位。参见图6A-6。实施例5使用B1AC()RE⑧的表位作图H8、Al、A2和A3抗体的表位作图还使用BIACORE⑧、使用具有结合的人5T4抗原的CM5芯片来进行。芯片用H8、Al、A2或A3抗体进行饱和，并且测量第一应答。芯片随后用来自H8、Al、A2和A3抗体中的第二抗体进行饱和，并且测量第二应答。对于多次实验，芯片通过使结合的抗体在10mM甘氨酸，pH1.5中解离，随后利用緩沖液洗涤来再生。结果概括于下表7中。所显示的百分比是第二抗体与CM5芯片直接结合后测量到的应答单位除以第二抗体与经第一抗体饱和的CM5芯片结合后测量到的应答单位。这些结果显示H8、Al、A2和A3各自结合在人5T4上的不同表位。H8和A3抗体所结合的表位彼此在空间上接近，从而使得当在A3存在下分析H8的结合时与抗原的结合速率降低，并且反之亦然。使用嵌合和人源化H8、Al、A2和A3抗体获得类似结果，这些抗体如下文实施例7中所述进行制备。参见表8。表7使用BIACORE的竟争试验的结果-用第一抗体饱和后第二抗体的应答百分比<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>使用嵌合构建体(参见实施例4)和BIACORE⑧测定的表位作图研究的组合结果呈现于图7中。实施例6抗5T4/加利车霉素缀合物的功效活体染料(MTS)染色用于测定暴露于各种处理后的存活细胞的数目。MTS(非》文射性细胞增殖测定试剂盒)购自Promega(Madison、Wisconsin)并且根据制造商的说明书来使用。对于每种细胞系，建立校准曲线(2小时后细胞数目相对于光密度)以估计合适的起始种植密度。随后将细胞以750-5,000细胞/孔的密度种在96多孔皿中。在种植后立即使细胞暴露于各种浓度(O、0.01、0.05、0.1、1、10、100和500ng加利车霉素当量/ml)的加利车霉素、CMA-676和抗5T4抗体的加利车霉素缀合物。测定药物暴露96小时存活的细胞数目后，基于得自剂量应答曲线的logistic回归参数计算EDso。EDso定义为暴露于药物96小时后引起细胞数目50%减少的药物(CalichDMH)浓度。加利车霉素当量(计算当量)是作为纯物质或作为缀合物给予的加利车霉素浓度。依赖与抗体结合的加利车霉素的量(抗体药物负荷)，不同的加利车霉素当量可以指示不同的蛋白质浓度。MTS试验的结果显示于表9中。使用Al和A3抗5T4试验制备的抗体/加利车霉素缀合物实质性地减少了MDAMB435/5T4细胞的生存力。选择性值通过将缀合物的特异性活性与非特异性活性比较进行计算。即，针对5T4表达细胞的CalichDMH倍数除以针对不表达5T4的细胞的CalichDMH倍数值。当使用非特异性抗体例如hp67.6(CMA-676)时，CalichDMH倍数值大约是相同的，从而使得选择性是1。表9MTS试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>选择性H8=8;hP67.6=l;Al=93;CalichDMH，未缀合的加利车霉素huH8-AcBut-CalichDMH，使用4-(4'-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)与加利车霉素缀合的人源化H8抗体CMA-676,抗-CD33/加利车霉素缀合物Al-AcBut-CaliehDMH，使用4-(4'-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)与加利车霉素缀合的Al抗体A2-AcBut-CalichDMH，使用4-(4，-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)与加利车霉素缀合的A2抗体A3-AcBut-CalichDMH，使用4-(4'-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)与加利车霉素缀合的A3抗体抗5T4/加利车霉素缀合物的细胞毒性还使用更为近似体内细胞环境的三维球状体细胞培养物进行测定。球状体基本上根据Yuhas等人(1977)CancerRes.37:3639-3643进行制备。简言之，将在5ml培养基中的105细胞种植在预先用5ml在培养基中的0.65%组织培养级琼脂(SigmaofSt.Louis，Missouri)包^L的60mm聚苯乙烯细胞培秦耻上。平皿于37。C在具5%C02的空气中温育5-6天。选择具有0.2mm直径的球状体并置于24孔多孔亚中。每个孔包含0.5ml琼脂衬垫层、1个球状体和1ml培养基覆盖层。随后使J求状体暴露于各种浓度(O、0.091、0.365、1.46、5.86、23.44、93.75和375ng加利车霉素当量/ml)的加利车霉素、CMA-676以及^f吏用Al和A3抗5T4抗体和AcBut接头制备的抗5T4/加利车霉素缀合物。两种抗5T4/加利车霉素缀合物均显著地抑制MDAMB435/5T4细胞的生长。参见图8。实施例7嵌合和人源化抗5T4抗体的制备和结合性质构建具有鼠类H8重链和轻链可变区序列以AA1gG4重链恒定区和人K轻链恒定区的嵌合H8、Al、A2和A3抗体。在Al重链可变区的第67位上存在的半胱氨酸被任选地改变成苯丙氨酸，在A3重链可变区的第91位上存在的半胱氨酸被任选地改变成酪氨酸。这些变体在SEQIDNO:2(AlVH)和SEQIDNO:10(A3VH)中示出。内含子序列的存在或不存在和半胱氨酸残基的替换不影响抗体表达。对于编码IgG恒定区的序列的克隆，任选删除内含子序列。人源化H8如PCT国际公开号WO2006/031653中所述进行制备。人源化Al抗体如下文进一步所述的通过CI)R移植进行制备。鼠类Al、A2和A3抗体的CDRs使用AbM定义进行鉴定，所述AbM定义基于序列变异性以及结构环区域的定位。一般而言，人受体构架基于下述进行选择它们基本上相似于鼠类抗体的构架区，或最类似于该可变区亚家族的共有序列。还考虑构架基因座在人中的出现情况，广泛出现的序列一般优于较不常见的序列。对人构架受体序列进行另外突变，以恢复据认为涉及抗原接触的鼠类残基和/或涉及抗原结合位点的结构完整性的残基。氨基酸序列还可以就CHO细胞的密码子偏好性进行优化并去除限制酶位点。肽结构预测程序可以用于分析人源化可变重和轻链序列，以鉴定并避免由人源化设计引入的翻译后蛋白质修饰位点。构建人源化Al重链可变区(AlVH1.0版)以包括移植到人DP-"构架区(VH7亚群，登记号CAA43346，SEQIDNO:88)上的鼠A1的CDRs，所述构架区包含构架突变(S82A)和l个回复突变(E46K)。通过去除该回复突变制备变体(AlVH1.1和1.2版)。第二人源化Al重链可变区通过将A1CDRs移植到人Dl)-54种系构架区上进行制备(AlVH2.0版)。制备六(6)个回复突变以产生A1VH2.1版。如下文进一步所述，2种Al重链可变区都保留了5T4结合性质。DP-21和DP-54构架区显示在其长度上63%的M酸序列同一性，说明可以进行众多氨基酸改变而同时保留抗体的结合特异性，包括与特定表位结合的能力。人源化Al重链可变区的相似性显示于表10中。编码人源化Al重链可变区的代表性核香酸序列如SEQIl)NOs:48、50、53和55所示。人源化Al重链可变区的代表性"i^酸序列如SEQIDN()s:49、51、52、54和56所示。还参见图9A-9B。构建人源化Al轻链可变区以包括移植到人DPK24(VKIV亚群)、DPK9(VKJI亚群)和DPK23(VKIII亚群)种系构架区上的鼠类Al的CDRs。将S67Y回复突变掺入到人源化A1轻链可变区中后，用这些构架之每一个制备的构架都显示出了5T4结合。参见下文，包括表13。DPK24构架区显示在其长度上分别与DPK9和DPK23有74%和73%的氨基#列同一性。DPK9构架区显示在其长度上与DPK23有74。/。的M酸序列同一性。人源化A1轻链可变区的相似性显示于表IO中。人源化轻链可变构架区的多种版本证实可以进行众多氨基酸改变而同时保留抗体的结合特异性，包括与特定表位结合的能力。编码人源化Al轻链可变区的代表性核苷断列如SEQlDNOs:57、59、61、63、65、67、69、71、73和75所示。人源化Al轻链可变区的代表性氨基酸序列如SEQIDNOs:58、60、62、64、66、68、70、72、74和76所示。还参见图9C-9F。<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>人源化A2和A3抗体使用类似策略进行设计。人源化A2重链可变区和人源化A2轻链可变区的代表性氨基酸序列分别如SEQIDNOs:77_78和SEQIDN()s:79-80所示。还参见图9(;。人源化A3重链可变区和人源化A3轻链可变区的代表性氨基酸序列分别如SEQII)NOs:81-82和SEQIDNOs:83—84所示。还参见图9H。为了评估人源化A1、A2和A3重链和轻链可变区的新颖性，如实施例1中所述进行BLASTn和BLASTp分析。结果呈现于表11中。<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>*查询覆盖度度=100%时图10A-10B显示可以用作构架用于制备人源化Al、A2和A3抗5T4抗体的另外重链可变区序列。图11-13显示可以用作构架用于制备人源化Al、A2和A3抗5T4抗体的另外轻链可变区序列。图14显示可以用于制备嵌合和人源化Al、A2和A3抗5T4抗体的代表性恒定区。为了评估嵌合和人源化H8、Al、A2和A3抗体的结合特异性和亲和力，使用固定在CM5芯片上的人5T4抗原进行BIACORE⑧分析。参见实施例2。关于嵌合A1、A2和A3抗体的结果显示于下表12中。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>一般而言，嵌合/人源化增加H8、Al、A2和A3对人5T4的亲和力。比较表3。结合亲和力的增加看起来主要起因于抗体和抗原较慢的解离而不是较快的结合。嵌合A2和A3抗体显示在嵌合后改善最大的结合性质。所有人源化Al重链可变区保留5T4结合性质。此外，自人源化Al重链可变区去除K46回复突变不影响5T4结合性质。人源化Al轻链可变区显示受损的5T4结合性质。使用1)PK9和DPK23构架构建的人源化Al轻链可变区比使用DPK24构架构建的人源化Al轻链可变区以更高的亲和力结合5T4。已掺入回复突变以恢复和/或优化5T4结合。用酪氨酸残基替换在第67位上的丝氨酸残基，如鼠类A1构架区中所示，完全恢复5T4抗原结合性质。参见表13。表13经由ELISA对生物素化的嵌合Al抗体与人5T4的结合的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>实施例8抗5T4抗体的物种交叉反应性测定本文所公开的抗5T4抗体的交叉物种反应性，以确定用于体内功效研究和毒理学分析的相关物种。有关结合活性与不同5TM胞外域的关联性之间的相互关系也被用于进一步描述每种抗体所结合的表位。结合试验4吏用与人lgGlFc融合的来自各个物种的5T4胞外域来进行。每个胞外域区与人5T4的同一性百分比显示于表14中。表14来自不同物种的5T4的关联性<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>包含在亲水结构域内的6氨基酸同向重复来自人、小鼠、大鼠、犬和牛的5T4的全长或部分序列先前已^Hf为Genbank登记号Z29083(人，SEQIDNO:87)、AJ012160(小鼠)、BC087011(大鼠)、XM539020(犬)和XM593502(牛)。使用mRNA和基因组序列的比对来产生黑猩猩5T4的虚拟部分序列。从食蟹猴和黑尾绒猴中分离了编码5T4蛋白质的核酸。这些另外5T4抗原的氨基酸序列显示于图15中并且也见如SEQIDNO:86(食蟹猴)和SEQIDNO:85(黑尾绒猴)所示。为了评估食蟹猴和黑尾绒猴序列的新颖性，如实施例2中所述进行BLAST分析。当使用全长黑尾绒猴5T4氨基酸序列作为查询序列时，最接近的目标序列鉴定为人5T4(Genbank登记号NP—006661.1)，具有94%的同一性(302/320个氨基酸)。这两个序列还在羧基末端上不同，其中SEQIDNO:85的氨基酸1-19未与该最接近的目标序列比对。当使用全长食蟹猴5T4氨基酸序列作为查询序列时，最接近的非虚拟目标序列被鉴定为同样来自食蟹猴的滋养层糖蛋白前体(Genbank登记号BAEO0432.1)，具有99%的同一性(364/366个氨基酸)-这些序列还在羧基末端上不同，其中SEQIDNO:86的氨基酸1-25未与该最接近的非虛拟目标序列比对。为了评估抗5T4抗体的结合，将5T4胞外域/Fc融合蛋白瞬时转染到COS-1细胞内，并且进行ELISA试验。无关的人IgG4和1gGl抗体用作对照。抗5T4抗体的交叉物种反应性概括于表15中。<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>huH8y4,具有IgG4恒定区的人源化H8抗体huH8yl，具有IgGl恒定区的人源化H8抗体ChiAly4,具有1gG4恒定区的嵌合A1抗体ChiA2y4，具有IgG4恒定区的嵌合A2抗体ChiA3了4，具有IgG4恒定区的嵌合A3抗体(+/-)，部分结合(-)，无结合权利要求1.特异性结合人5T4抗原的抗体，其中所述抗体(a)包含鼠类A1、A2或A3抗体的抗原结合结构域；(b)与鼠类A1、A2或A3抗体竞争5T4结合；(c)结合由A1、A2或A3抗体结合的5T4表位；或(d)包含(a)-(c)抗体的5T4结合片段。2.权利要求l的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、四聚体抗体、四价抗体、多特异性抗体、结构域特异性抗体、单结构域抗体或融合蛋白。3.权利要求l的抗体，其为鼠类单克隆抗体。4.权利要求l的抗体，其中所述抗体具有对于人5T4抗原至少约1xl(T7M-约1xl(T12M的结合亲和力。5.权利要求1的抗体，其中抗体在体内特异地靶向5T4表达细胞。6.权利要求1的抗体，其中重链可变区包含SEQIDNO:2的残基20—138，SEQIDNO:6的残基19-135，SEQIDNO:10的残基20-141或SEQIDNO:49的残基1-119的^J^酸序列；或人源化Al、A2或A3重链可变区的残基的氨基酸序列。7.权利要求1的抗体，其中轻链可变区包含SEQIDNO:4的残基21-127，SEQIDNO:8的残基23-130或SEQIDNO:12的残基21-127的氨基酸序列；或人源化A1、A2或A3轻链可变区的残基的M^列。8.权利要求1的抗体，其中重链可变区包含SEQIDNO:2的残基20-138的氨基酸序列，且其中轻链可变区包含SEQIDNO:4的残基21-127的#^*列。9.权利要求l的抗体，其中重链可变区包含衍生自SEQIDNO:6的残基19-135的M齡列，且其中轻链可变区包含衍生自SEQIDNO:8的残基23-130的氨基酸序列。10.权利要求l的抗体，其中重链可变区包含衍生自SEQIDNO:10的残基20-141的絲酸序歹ij，且其中轻链可变区包含衍生自SEQIDNO:12的残基21-127的M酸序列。11.权利要求2的抗体，其为嵌合或人源化抗5T4抗体。12.权利要求11的嵌合或人源化抗体，其包含衍生自人恒定区的恒定区。13.权利要求12的嵌合或人源化抗体，其中所述人轻链恒定区衍生自人k轻链恒定区。14.权利要求12的嵌合或人源化抗体或抗体片段，其中所述人重链恒定区衍生自人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区。15.权利要求14的嵌合或人源化抗体或抗体片段，其中所述人IgG4重链恒定区包含在第241位上的脯氨酸。16.权利要求ll的嵌合或人源化抗体，其中至少一条轻链或至少一条重链的可变区包含(a)含有人抗体构架区的残基的构架区；和(b)SEQIDNO:4、8或12的轻链可变区的一个或多个CDRs，或SEQIDNO:2、6或10的重链可变区的一个或多个CDRs。17.权利要求16的嵌合或人源化抗体，其中所述人残基是选自下述的人构架残基(a)选自DP-21(VH7)、DP54(VH3-07)、DP-47(VH3-23)、DP-53(VH-74)、DP-49(VH3-30)、DP48(VH3-13)、DP-75、DP画8(VH1-2)、DP画25、Vl-2b和VI-3(VH1-03)、DP-15和Vl國8(VH1-08)、DP-14和Vl-18(VH1-18)、DP-5和V1-24P(VH1-24)、DP-4(VH1-45)、DP画7(VH1-46)、DP陽IO、DA画6和YAC画7(VH1-69)、DP-88(VHl國e)、DP-3和DA-8(VHl-f)的人抗体重链构架区；(b)DPK24亚群IV种系克隆、VkIII亚群(DPK23、DPK22、DPK20、DPK21)、或VkI亚群种系克隆(DPK9、DPK1、02、DPK-7)的人抗体轻链构架区；(c)(a)的重链构架区的共有序列；或(d)与(a)_(c)的构架区至少63%等同的构架区。18.权利要求16的嵌合或人源化抗体，其包含SEQIDNOs:2、4、6、8、10或12中的任何一个的至少2个CDRs。19.权利要求18的人源化抗体，其中所述轻链包含可变区，该可变区包含SEQIDNOs:4、8或12中的任何一个的3个CI)Rs中的至少2个。20.权利要求19的人源化抗体，其中所述轻链包含可变区，该可变区包含SEQIDNOs:4、8或12中的任何一个的3个CDRs。21，权利要求16的人源化抗体，其中所述重链包含可变区，该可变区包含SEQIDNOs:2、6或10中的任何一个的3个CDRs中的至少2个。22.权利要求21的人源化抗体，其中所述重链包含可变区，该可变区包含SEQIDNOs:2、6或10中的任何一个的3个CDRs。23.4又利要求16的人源化抗体，其包含SEQIDNOs:2和4的CDRs、SEQII)NO:6和8的Cl)Rs、或SFQII)NO:10和12的Cl)Rs。24.权利要求ll的嵌合或人源化抗体，其中所述重链可变区序列包含(a)SEQIDMO:2的残基20-138的氨基酸序列；(b)与SEQIDNO:2的残基20-138至少85%等同的氨基,列；(c)SEQIDNO:6的残基19-135的氨基,列；(d)与SEQIDNO:6的残基19-135至少86%等同的氨基崎列；(e)SEQIDNO:10的残基20-141的氨基,列；(f)与SEQIDNO:10的残基20-141至少91%等同的氨基,歹寸；(g)SEQIDNOs:49、51、52、54、56、77、78、81或82中的任何一个的M酸序列；(h)与SEQIDNO:51至少91%等同的氨基,列；(i)与SEQIDNO:54至少78%等同的#^,列；(j)与SEQIDNO:77至少89%等同的氨基,列；(k)与SEQlDNO:78至少79%等同的氨基酸序列；(I)与SEQIDNO:81至少80%等同的氨基酸序列；或(m)与SEQIDNO:82至少78%等同的氨基酸序列。25.权利要求ll的嵌合或人源化抗体，其中所述轻链可变区序列包含(a)SEQIDNO:4的残基21-127的氨基断列；(b)与SEQIDNO:4的残基21-127至少94%等同的氨基齡歹寸；(c)SEQ1DN():8的残基23-130的氨基,列；(d)与SEQII)NO:8的残基23-130至少96%等同的氨基齡列；(e)SEQlDNO:12的残基21-127的氨基,列；(f)与SEQIDNO:12的残基21-127至少98%等同的#^#列；(g)SEQIDNOs:58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、79、80、83或84中的4壬何一个的氨基酸序列；(h)与SEQIDNO:60至少83%等同的氨基晚字列；(i)与SEQIDNO:70至少93%等同的氨基酸序列；(j)与SEQIDNO:76至少85%等同的氨基斷列；(k)与SEQH)NO:76至少85%等同的氨基晚亭列；(1)与SEQII)NO:79至少88%等同的氨基晚字列；(m)与SEQIDINO:80至少84%等同的氨基睃字列；(n)与SEQIDNO:83至少90%等同的氨基酸序列；或(o)与SEQIDNO:84至少91%等同的氨基,列。26.用于药物递送的抗体/药物缀合物，其包含(a)根据权利要求1的抗体；和(b)药物，其与所述抗体直接或间接结合。27.权利要求26的抗体/药物缀合物，其中所述药物是选自细胞毒素、放射性同位素、免疫调谐剂、抗血管生成剂、抗增殖剂、促凋亡剂、化学治疗剂和治疗性核酸的治疗剂。28.权利要求27的抗体/药物缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒素。29.权利要求26的抗体/药物缀合物，其中所述细胞毒素是抗生素、微管蛋白聚合的抑制剂、烷化剂、蛋白质合成抑制剂、蛋白激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、拓朴异构酶抑制剂或酶。30.权利要求27的抗体/药物缀合物，其中所述细胞毒素是抗生素。31.权利要求30的抗体/药物缀合物，其中所述抗生素是加利车霉素。32.权利要求31的抗体/药物缀合物，其中所述加利车霉素是加利车霉素的N-乙酰基衍生物或二硫化物类似物。33.权利要求32的抗体/药物缀合物，其中所口利车霉素是]\-乙酰基-，加利车霉素。34.权利要求26的抗体/药物缀合物，其中所述药物经由接头与抗体结合。35.权利要求34的抗体/药物缀合物，其中所述接头选自4-(4'-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)、3-乙酰苯基酸性酸(AcPac)、4-巯基-4-曱基-戊酸(Amide)及它们的f汙生物。36.用于将药物递送给5T4表达细胞的方法，其包括使所述细胞与抗体/药物缀合物接触，所述抗体/药物缀合物包含(i)权利要求1的抗5T4抗体，和(ii)与抗5T4抗体直接或间接结合的药物。37，权利要求36的方法，其中所述药物内化入靶细胞中。38.用于治疗具有5T4阳性癌症的受试者的方法，所述方法包括给所述受试者施用治疗有效量的抗5T4抗体/药物缀合物，所述抗5T4抗体/药物缀合物包含(i)权利要求1的抗5T4抗体，和(ii)与抗5T4抗体直接或间接结合的治疗剂。39.权利要求38的方法，其中所述抗5T4抗体/药物缀合物是抗5T4抗体/加利车霉素缀合物，所述方法进一步包括施用第二治疗剂，其中所述抗5T4/加利车霉素缀合物和所迷笫二治疗剂同时或以任何顺序相继施用。40.与人5T4表位特异性结合的抗体，所a位包含SEQIDNO:87的残基173-252和276-355，但不包含残基213-214。41.与人5T4表位特异性结合的抗体，所述表位包含SEQIDNO:87的氨基酸276-355。42.与人5T4表位特异性结合的抗体，所述表位包含SEQIDNO:87的氮基酸83-163。43.抗体，其与具有SEQIDNO:86的JL&酸序列的食蟹猴5T4特异性结合。44.分离的5T4蛋白质，其包含(a)SEQIDNO:85或86的氨基*列；或(b)与SEQIDNO:85至少95%等同的氨基晚字列。45.抗体，其特异性结合权利要求44的分离的5T4蛋白质。46.编码抗5T4重链可变区的分离的核酸，其包含(a)SEQIDNO:1的核普酸58-414的核苷酸序列；(b)SEQIDNO:5的核苷酸55-405的核苷酸序列；(c)SEQIDNO:9的核苷酸58-423的核香酸序列；(d)编码SEQIDNOs:48、50、53或55中的任何一个的核苦,列；(e)当查询覆盖度为100%时，与SEQIDNO:50有89%等同的核苷酸序列；(f)当查询覆盖度为100%时，与SEQIDNO:53有82%等同的核苦酸序列；或(g)在严格杂交条件下与(a)-U)中的任何一个的互补物特异性杂交的核酸。47，编码抗5T4轻链可变区的分离的核酸，其包含(a)SEQIDNO:3的核苷酸61-381的核苷酸序列；(b)SEQIDNO:7的核苦酸67-390的核苷酸序列；(c)SEQIDNO:11的核芬酸61-381的核苷酸序列；(d)编码SEQIDNOs:57、59、61、63、65、67、69、71、73或75中的任何一个的人源化Al、A2或A3轻链可变区的核苷酸序列；(e)当查询覆盖度为100%时，与SEQIDNO:59有84%等同的核(f)当查询覆盖度为1(K)Q/。时，与SEQIDNO:69有86%等同的核苷酸序列；(g)当查询覆盖度为100%时，与SEQn)N():75有85%等同的核苷酸序列；或(h)在严格杂交条件下与(a)-(d)中的任何一个的互补物特异性杂交的核酸。全文摘要本发明涉及抗5T4抗体、抗5T4抗体/药物缀合物以及其制备和使用的方法。文档编号C07K16/00GK101437850SQ200780016577公开日2009年5月20日申请日期2007年3月9日优先权日2006年3月10日发明者A·昆斯,D·吉尔,E·R·博格哈特,K·A·马尔奎特,K·斯莱库马尔,K·肯德克,L·齐斯提科娃,N·K·达姆尔,P·R·哈曼申请人:惠氏公司