专利名称：治疗用靶向细胞因子的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋白包含与下述细胞因子相融合 的抗体、其功能性片段和其功能性衍生物，所述的抗体及其功能性片
段或其功能性衍生物对癌胚纤连蛋白(oncofetal fibronectin; ED-B) 的胞外域或癌胚生腱蛋白(oncofetal tenascin )的至少一种胞外域具有 特异性结合亲和性，所述细胞因子选自IL-10, IL15、IL-24和GM-CSF。 本发明还涉及至少一种所述融合蛋白在制备药剂中的用途。特别是， 本发明涉及所述药剂用于治疗肿瘤或慢性炎性疾病，例如动脉粥样硬 化，关节炎和银屑病的用途。
发明相关领域
细胞因子是免疫调节蛋白，其中的一些已经在预临床和临床应用 于对抗癌症，以及干扰t曼性炎性病症和感染性疾病。
重组细胞因子的治疗潜力经常因其严重的副作用受到限制，甚至 在低浓度下也是如此，所以阻碍了在目标组织施以足够的细胞因子浓 度。最近，单克隆抗体被应用于靶向和递送细胞因子到疾病位点以提 高它们的效价，使正常组织免受毒性影响。事实上，人们已对大量的 抗体-细胞因子融合蛋白进行研究，以将其应用于癌症治疗，通常具 有良好的结果。例如，应用特异于纤连蛋白(血管发生标记物)的ED-B 域的人抗体L19递送促炎细胞因子(例如，IL-2, IL-12或TNF)到实 体瘤，有时具有显著的治疗效果[请参见Neri & Bicknell， Nat. Rev. Cancer (2005) 2: 436-446,以及WO 01/62298]。然而，当用作单独试 剂或作为与单克隆抗体的融合配体时，许多细胞因子具有临床失败的 历史。例如，重组IL-2 ( "Proleukin" ， Chiron)已被批准用于治疗具有 肾细胞癌的病人，但是对于这种适应症的应答率，典型地较低的(通 常低于20% ),并且对于其他类型的癌症甚至更低。其他细胞因子(例 如白介素-12或白介素-10,见下述)在一系列研究中没有显示出实 质的效率，其减緩了临床研究计划。这些细胞因子仍然没有批准为生(治疗慢性肉芽肿病，Genentech),其没有显示出对于其他适应症的 实质的治疗效果。
当与抗体相融合时，更是无法预知是否在治疗指数上显示显著效
果。例如，在大量的临床测试中，抗-GD2抗体-IL2融合EMD273063 并没有显示明显的治疗效果，最近的但并非最不重要的一次是针对具 有成神经细胞瘤进行的(Osenga等，Clin. Cancer Res. Mar 15; 12(6): 1750-9 (2006))。
白介素-10( IL-10)是一种由活化的单核细胞和T细胞产生的同 源二聚体细胞因子，其与炎性反应和免疫反应的调节密切相关。已详
尽描述了它作为免疫反应的阻尼器(dampener)的主要总体功能，但 是IL-10还具有刺激活性。IL-10最初被描述为细胞因子合成抑制因子 (CSIF),是小鼠Th2细胞产生的活性物质，其抑制Thl细胞的活化 和Thl细胞产生细胞因子[Fiorentino等，J. Exp. Med. 170(6): 2081-95 (1989)]。编码人IL-10的基因位于染色体1上[Kim等，J. Immunol. 148(11): 3618-23 (1992)]并且翻译出包含160个氨基酸、分子量为18.5 kDa的蛋白。人IL-10作为37kDa的非-二硫键连接同源二聚体发挥 活性[Syto等，Biochemistry 37(48): 16943-51 (1998)]。
基于其有效的体外免疫调节活性，以及已证明的在急性和慢性炎
症、自身免疫、癌症和感染性疾病的动物;漠型中的效果，IL-10已#皮 认为是大有希望用于治疗用途的候选物。Schering-Plough研发了用于 临床试验的重组人IL-lO(ilodecakin, Tenovil )。该蛋白在大肠杆菌中 生产、由161个氨基酸组成，除了氨基末端的甲硫氨酸残基之外，其 与内源性人蛋白相同。研究通过静脉内或皮下途径给予的单个或多个 剂量的IL-10的安全性，耐受性，药物代谢动力学，药效学，免疫学 和血液学效果的1期和2期临床试验已经在多种设置下，对健康自愿 者和特定的患者群体中进行[Moore等，Annu Rev. Immunol. 19: 683-765 (2001)]。然而由于所述化合物缺乏功效，临床研发已经停止。 最近，已公布的数据可至少部分地解释IL-10治疗的困境。Tilg等发 现高剂量的IL-10上调了 IFN-y和新蝶呤的生产，因此平衡了其免疫 抑制性质。该作者认为全身给药huIL-10的治疗作用受到细胞因子促 炎效应的限制，并且建议可通过不引起全身IL-10浓度的、提高的、 有效的粘膜递送方法避开这一问题[Tilg等，Gut 50(2): 191-5 (2002)]。白介素-15 (IL-15 )是包含114个氨基酸的一种4a-螺旋束家族 细胞因子的、14到15 kDa的成员。特别的，IL-15蛋白被抑制翻译 的多种控制元件转录后调节，包括5，非翻译区域(UTR)的12种上 游AUGs， 2种不常见的信号肽(具有21个氨基酸的短肽停留在细胞 内，具有48个氨基酸的长肽用于分泌)和成熟蛋白的C-末端[Bamford 等，J. Immunol., 160(9): 4418-26 (1998)]。在人和猿的IL-15之间具有 97%的序列同一性，在人和小鼠之间具有73%的序列同一性。由此， 足以保证huIL-15对猿和鼠细胞具备生物学活性。IL-15利用了两种不 同的受体和信号途径。由IL-2/15J3, Yc和IL-15Ra亚基组成的高亲和 性IL-15R系统在T和NK细胞上表达。IL-2/15R p和yc亚基共享IL-2 受体[Giri等等，EMBO J" 3(12):2822-30 (1994)]。肥大细胞对IL-15产 生应答是通过新的60到65 kDa IL-15RX亚基的受体系统，该受体系 统与IL-2受体没有共享的部分。多种组织例如胎盘、骨骼肌、肾、成 纤维细胞、上皮细胞、树突状细胞和单核细力包表达IL-15。
IL-15刺激促炎细胞因子(例如，TNFa, IL-1，IFN力的生产，活化 B细胞的增殖和Ig合成，TH1、单核细胞和淋巴因子活化的杀伤细胞 的活化，肥大细胞和T细胞的增殖，并且抑制T和B细胞的细胞凋亡。 除了提到的功能活性之外，IL-15在NK细胞的发育，存活和功能中 起关键作用[Joost J. Oppenheim 等，Cytokine Reference; 213-221， (2002)]。体内研究显示外源IL-15增强了肿瘤反应性CD8+ T细胞的抗 肿瘤活性[Fehniger等，Cytokine Growth Factor Rev.,13(2):169-83 (2002)]。
已经寺艮道了在炎性、肺瘤性疾病和自身免疫疾病，例如类风湿性 关节炎，溃疡性结肠炎，Crohn's疾病和多发性>哽化症中有异常的高 水平IL-15表达[Joost J. Oppenheim等，Cytokine Reference; 213-221， (2002)]。
由于IL-2和IL-15利用相同的受体,因此具有共同的特征。主要 的区别在于它们合成和分泌的位点。IL-2是由活化的T细胞产生，而 IL-15在上述多种组织中表达。IL-2可促进细胞凋亡和限制CD8+记忆 T-细胞存活和增殖，而IL-15帮助维持记忆CD8+群并且可抑制细胞凋 亡。起初人们认为IL-15介导与IL-2类似的生物学效应，但在基础和 临床前研究中已表明IL-15具有独特的性质，可能在癌症的免疫治疗
6中是有益的[Fehniger等，Cytokine Growth Factor Rev.， (2): 169-83 (2002)]。而且，IL-15的毒性情况(profile)与IL-2非常相似[Munger 等，Cell Immunol., 5(2):289-93 (1995)]，因此暗示了，就治疗指数而言， IL-15的耙向递送优于全身递送。
鉴定负责与IL-15受体结合的IL-15表位的研究揭示出显示激动 剂或拮抗剂性质的IL-15突变体，其可能用作治疗试剂[Bemard等，J. Biol. Chem. ， 279(23): 24313-22 (2004)]。 IL-15突变体IL画15D8S和 IL-15Q108S在CTLL-2生物测试中是无活性的，但是能够竟争性抑制 未经修饰的IL-15的生物学活性[Pettit等，J. Biol. Chem, 272(4): 2312-8 (1997)]。
黑素瘤分化相关基因-7 ( mda-7 = IL-24 )在1990，s因其在黑素 瘤分化过程中被诱导的性质首次被鉴定出来。它是IL-10家族细胞因 子的成员。IL-24基因cDNA编码206个氨基酸23.8 kDa的蛋白。在 人细胞中，由于严重的N-糖基化，分泌的蛋白具有比细胞内蛋白(30/23 kDa)更高的分子量(40 kDa)。人IL-24与大鼠对应物(MOB-5 )的同源 性是68%，与小鼠(FISP)为69%。 IL-24有两种功能性异源二聚体 受体IL-20R1/IL画20R2和IL-22R1/IL-20R2 [Wang等，Genes Immun" 5(5):363-70 (2004)]， [Chada等，Mol. Ther" 10(6):1085画95 (2004)]。尽管 IL-20R1和IL-22R1受体链是广泛表达的，普通IL-20R2在某些非造 血组织中的受限表达暗示了 IL-24在造血系统之外的多重功效 (pleotropic ) [Wolk等，J. Immunol" 168(11): 5397-402 (2002)]。 IL-24 由单核细胞，T细胞，树突状细胞和黑素细胞表达。IL-24诱导IFNy, IL-6, TNFa, IL-l-卩和GM-CSF的分泌，显示了它作为促-Thl (pro-Thl )细胞因子的功能。IL-10(Th2细胞因子)抑制IL-24的活性。
IL-24沉积量与黑素瘤进展负相关。这些发现产生了如下^f艮说 在黑素瘤4曼入过程中mda-7的生产丧失，暗示了 IL-24作为肿瘤抑制 物的作用[Chada等，Mol. Ther" 10(6):1085画95 (2004)]。
IL-24在肿瘤中的表达可通过活化或刺激免疫辅助细胞和效应细 胞促进抗原呈递[Chada等，Mol. Ther., 10(6):1085-95 (2004)]。
大量的数据证实利用质粒载体或复制缺陷腺病毒使IL-24基因过 表达，可通过在大范围的癌症细胞中的细胞内信号途径活化导致生长 抑制和细胞凋亡的诱导。这种基因转移显示了对于正常细胞最小的毒性，同时在多种癌症细胞中诱导了有效的细胞凋亡[Sieger等，Mol. Ther. , 9(3):355-67 (2004)]。在一种1期剂量扩大临床试验中，将表达 IL-24的腺病毒构建体给予22个晚期癌症病人，导致IL-24的表达， 并且在所有胂瘤中诱导细胞凋亡，患者在治疗之后显示出CD3+CD8+ T细胞增多[Tong等，Mol. Ther., 11(1):160-72 (2005)]。 IL-24的不同基 因转移研究表明，与对照肿瘤相比，肺瘤更小并且显示出更少的血管 化，这显示了 IL-24的抗血管形成活性[Saeki等，Oncogene., 21(29): 4558-66 (2002)]。当利用腺病毒mda - 7(Ad-mda7)时，应注意将其应 用于临床环境具有潜在的缺陷首先，用Ad-Mda7离体(ex vivo )转 导由癌症患者获得的人癌症细胞，然后再将其引入癌症患者是不实际 的；第二，将Ad-Mda7肺瘤内给药以产生有效的抗肿瘤免疫反应仅适 用于局部肿瘤，而不适用于播散性肿瘤。因此，需要研发替代途径 [Miyahara等,Cancer Gene Ther. 2006]。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是包含17个氨基酸 组成的分泌序列的、141个氨基酸(小鼠)/144个氨基酸(人)的蛋 白。成熟的糖基化蛋白的表观分子量是14-33 kDa,其相当耐受变性 和蛋白水解条件。GM-CSF的体内活性通过结合于高亲和性受体而介 导，所述高亲和性受体包含GM-CSF-特异性a链，和对人而言，与IL-3 和IL-5受体共享的信号传导卩亚基[Joost J. Oppenheim等，Cytokine Reference, 899-908， 2002]。
GM-CSF是粒细胞和巨噬细胞系的主要调节物。它刺激嗜中性粒 细胞，巨噬细胞和嗜曙红细胞系之类的造血集落形成细胞的存活，增 殖和分化。另外，它维持巨核细胞和类红细胞系之类的造血集落形成 纟田月包的存活[Joost J. Oppenheim等，Cytokine Reference, 899-908， 2002]。它也是具有多重功效的、有效免疫刺激物，包括在多种细胞中 的Ag呈递扩大，提高MHC II类在单核细胞上的表达，以及T细胞 增殖的扩大[Fischer等，J. Immunol., 141(11):3882-8 (1988), Smith等， J. Immunol" 144(10):3829画34 (1990), Morrissey等，J. Immunol., 139(4):1113-9 (1987)]。
在病理学中，GM-CSF的过表达可导致炎性反应(例如，类风湿 性关节炎)，中毒性休克，失明和自身免疫，但是亚病理学水平可能 涉及在一些肺泡蛋白沉积症的例子。肺泡蛋白沉积症是一种致命的肺疾病，其中由于缺乏巨噬细胞介导的清除使得表面活性剂蛋白在肺中
聚集[Joost J. Oppenheim等，Cytokine Reference; 899-908， 2002]。
在动物模型中，用表达鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)且经另外辐射的胂瘤细胞免疫接种具有B16黑素瘤的小 鼠，通过提高肿瘤的免疫原性刺激了有效，长期持续和特定的抗肿瘤 免疫性[Dranoff等，Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 90(8):3539-43 (1993)]。另外，GM-CSF广泛用于肿瘤学以减緩化疗相关的嗜中性白 血球减少症，以及由化疗药物引起的嗜中性白血球减少症[Danova等， Haematologica.， 82(5):622-9 (1997)], [Vose 等，J. Clin. Oncol" 13(4):1023-35 (1995)]。存在一种阈值，超过了它基于GM-CSF的疫苗 不仅丧失了有效性，而且更重要地，导致体内的实质的免疫抑制。 GM-CSF的双重效应由细胞因子的全身而非局部浓度所介导[Serafini 等，Cancer Res., 64(17):6337-43 (2004)]。对人给予每天16 pg/kg的剂 量可见严重的不表J见[Joost J. Oppenheim等,Cytokine Reference; 899-908 (2002)]。
纤连蛋白是高分子量的粘性糖蛋白，其以可溶形式存在于血清和 其他体液中、以不可溶形式存在于胞外基质中。EDB是91-氨基酸 的III型同源域，无论组织重塑何时发生，其在初级转录水平通过选 择性拼接的机制插入纤连蛋白[Zardi等，Embo J. 6(8): 2337-42 (1987)]。
EDB在健康成人组织中基本上是不可^r测的。它的表达与胞外基 质的重塑和血奮发生非常相关。该域在许多侵略性肿瘤中是丰富的， 根据肿瘤类型显示出突出的血管或弥漫的基质表达模式[Carnemolla 等，J._Cell Biol. 108(3): 1139-48 (1989)]。尽管其在正常组织中非常受 限地表达和其在许多实体瘤中强烈地表达，EDB的功能似乎并非必不 可少，这是因为缺少EDB外显子的小鼠发育正常，可育并且骨裂愈 合。而且，缺少EDB外显子和p53的双敲除小鼠在存活期间与表达 EDB的动物相比未显示任何差别[Fukuda等，Cancer Res 62(19): 5603-10 (2002)]。
由于EDB序列在小鼠，大鼠，兔，狗，猴和人中是同一的，因 此鉴于天然耐受性不可能通过杂交瘤技术产生抗该域的抗体。几年前 通过噬菌体展示技术分离了抗EDB的高亲和性scFv抗体片段(L19)[Carnemolla等，Int. J. Cancer 68(3): 397-405 (1996); Neri等，Nat. Biotechnol. 15(12): 1271-5. (1997); Pini等，J. Biol. Chem. 273(34): 21769-76 (1998)]。 L19能够染色广泛的试验肿瘤模型中、人肿瘤和其 他血管生成障碍的切片上的肺瘤血管[Carnemolla等，J. Cell Biol. 108(3): 1139-48 (1989); Kaczmarek等，Int. J. Cancer 59(1): 11-6 (1994); Berndt等，Histochem. Cell Biol. 109(3): 249-55 (1998)]。 Castellani等 的研究显示L19染色III-IV级的星细胞瘤的肿瘤血管，但仅染色少于 10%的I-II级的星细胞瘤的血管，由此暗示了 EDB在这些病灶中的表 达可用于将肿瘤分级[Castellani等，Am. J. Pathol. 161(5): 1695-700 (2002)]。
由于抗原的保守性，L19的靶向性能可在免疫活性同系动物模型 中进行研究。利用不同放射标记的抗体形式(scFv，小免疫蛋白/SIP和 IgG)的生物分布研究表明在肺瘤位点，优先聚集了每克组织高达20% 的注射剂量(% ID/g)的L19[Borsi等，Blood 102(13): 4384-92 (2003)]。 在利用具有1231标记的L19-双抗体的人癌症患者中的首次免疫显像 研究确了该抗体也定位于人实体瘤和转移瘤(metastases ) [Santimaria等，Clin. Cancer Res. 9(2): 571-9 (2003)]。
纤连蛋白的EDB域是血管发生的良好标记物，其在多种实体瘤 (例如，肾细胞癌，结肠直肠癌，肝细胞癌，高级星形细胞瘤，头和 颈肿瘤，膀胱癌等)中过表达，但在正常成人组织中几乎是检测不到 的(增生期的子宫内膜和卵巢中的一些血管除外)。然而，EDB在大 多数形式的乳腺癌、前列腺癌和 一 些类型的肺癌中仅仅微弱地表达， 因此引发人们寻找新的血管肿瘤抗原以将其用于使治疗用细胞因子 由抗体-介导輩巴向递送至这些瘤。
除了 EDB,癌胚生腱蛋白的胞外域已被作为治疗中感兴趣的目 标。生腱蛋白-C的剪接同种型也被考虑作为对于基于抗体的治疗策 略的耙标，特别是对于其中可检测到低水平的EDB的肿瘤类型。生 腱蛋白-C是胞外基质的糖蛋白。它包含几个纤连蛋白3型同源重复， 所述的同源重复可通过选择性剪接包含于初级转录物中，也可能缺 失，由此产生由小到大的、具有不同生物学功能的同种型。小的同种 型在几种组织中表达，相比之下生腱蛋白-C的大的同种型显示出更 受限的表达模式。其在健康成人组织中几乎是检测不到的，但在胚胎
10发生过程中表达，并且在经历组织重塑的含瘤成人组织中再次表达。
它的表达定位于多种不同肿瘤的胂瘤基质(tumor stroma )中的血管结 构周围，所述肺瘤包括乳腺癌，口腔鳞状细胞癌，肺癌，前列腺腺癌， 结肠直肠癌或星形细胞瘤和其他脑肿瘤。传统上，科学界将推定包含 所有可选择剪接的域的生腱蛋白-C的大同种型称作生腱蛋白分子， 当这些域缺失时称作生腱蛋白-C小的同种型。Carnemolla和其同事 报道了生腱蛋白C的选择性剪接域C比其他选择性剪接域显示出更受 限的表达模式。那时仍不清楚生腱蛋白C的其他选择性剪接域是否也 显示出限制性掺入生腱蛋白分子，并且是否分别评价单独的剪接域作 为靶标更适合基于抗体的治疗策略。特异于生腱蛋白-C的域Al和 D的放射标记抗体成功地应用于临床治疗神经胶质瘤和淋巴瘤。而且， 已利用基于抗生物素/生物素的预耙向(pre-targeting )方法，最近， 利用特异于生腱蛋白-C小同种型的单克隆抗体，在临床上已证实了 应用抗-生腱蛋白抗体的有效肺瘤靶向。但是，所有这些抗体都是鼠 源的，因此很可能不适于重复给予人患者，以及生物药物的研发。由 于这些原因，利用抗体噬菌体技术[PCT/EP2005/011624 of Philogen S.p.A]生产了特异于生腱蛋白-C的域A1、 C和D的人抗体。
如上所示，总的来说，将细胞因子应用于治疗领域，特别是用于 治疗肿瘤和/或炎性疾病，仍存在很大的不确定性。尽管现有技术也偶 尔有一些特异性的抗体-细胞因子融合蛋白用于靶向治疗，但鉴于结
果不可预见，仍不存在对成功的合理预期。本领域技术人员仍在猜测 关于治疗上有用的细胞因子的性质，以及其与抗体或其衍生物组合后 可能具有的效果。因此，由于结果不可预测，技术人员需要付出创造 性劳动来在许多已知的细胞因子和许多已知的靶向抗体的组合中进 行选择。
本发明的目的是提供用于治疗癌症和/或炎性疾病的新的治疗物 质，特别是用于治疗银屑病，动脉粥样硬化和关节炎，其使得治疗物 质耙向递送到疾病部位成为可能，由此也可以将药物浓缩，减少其它 健康组织的毒性负荷。
发明内容
出人意料地，发现了下述特异性组合提供了一种新的、治疗有效的融合蛋白，所述的组合为选自(a) IL國IO, (b) IL15， (c) IL-24和(d) GM-CSF的细胞因子，与耙向癌胚纤连蛋白(ED-B)的胞外域或癌胚 生腱蛋白的胞外域的抗体相融合。
因此，上述目的通过提供下述融合蛋白实现，所述融合蛋白包含 (i)对于癌胚纤连蛋白(ED-B)的胞外域或至少一种癌胚生腱 蛋白胞外域具有的特异性结合亲和性的抗体、其功能性片段或功能性 衍生物，所述抗体、其功能性片段或其功能性衍生物融合于
(ii )选自(a) IL-IO， (b) IL15， (c) IL-24和(d) GM國CSF的细胞因子， 其功能性片段及其功能性衍生物。
术语"特异性结合亲和性"理解为，在体内或体外，抗体、其功能 性片段或其功能性衍生物以显著的亲和性特异性结合于目标蛋白，而 不以显著的亲和性结合于同样存在于相同环境、相同的条件下的其他 蛋白，所述的相同环境，即测试系统或身体、器官等，所述的相同条 件指，例如pH、温度、緩冲液等。 一般利用特定目标分子和大量不 相关物质通过结合试验测试结合特异性。而且，功能性试验、免疫组 织化学和其他方法可进一步用于评价特定抗体的结合特异性。
对于基于具有特异性结合能力的抗体、其功能性片段或其功能性 衍生物的许多生物测试(例如，ELISA)，需要l微摩尔或更低的解 离常数以产生通常与特异性结合模式相关的可检测的结合信号。优选 地，用于本发明的抗体、其功能性片段或其功能性衍生物具有相应于 小于约5,优选约1或更小微摩尔(jiM)，更优选约0.1 ^M或更小，最 优选约1 nM或更小或甚至1 pM或更小的解离常数的特异性结合亲和 性。
一旦获得了目标抗原，可通过下述方式获得用于实施本发明的抗 体、其功能性片段和其功能性衍生物，即杂交瘤技术(Kohler and Milstein， Nature 256， 495-497, 1975),抗体噬菌体展示(Winter等，Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455, 1994)，核糖体展示(Schaffitzel等，J. Immunol. Methods, 231, 119-135， 1999)和迭代集落过滤筛选 (Giova画ni等，Nucleic Acids Res. 29, E27, 2001)。对于将抗体片段 化为功能性产品的典型的蛋白酶是公知的。也可应用其它的片段化技 术，只要产生的片段具有特异性的高亲和性和优选在微摩尔到皮摩尔 范围内的解离常数即可。已表明scFv形式的抗体片段靶向血管胂瘤的性能关键是依赖于
(至少以微摩尔到皮摩尔的解离常数)抗体与靶标的亲和性。例如，
特异于作为血管发生的标记物的纤连蛋白的ED-B域的、高亲和性抗 体片段scFv(L19),显示出比亲本抗体片段scFv(El)更有效地耙向 肿瘤新维管结构(neo-vasculature),所述亲本抗原抗体片段具有更低 的亲和性[Viti等，Cancer Res. 15;59(2):347-52 (1999)]。在某些例子中， 结合亲和力(例如，与某些同源二价抗体形式相关)可补偿中度的单 体结合亲和性[Nielsen等，Cancer Res., 60(22):6434-40 (2000)]。
一种靶向用途的、非常方便使用的抗体片段是单链Fv片段，其 中可变重链和可变轻链的域通过多肽接头连在一起。用于血管耙向应 用的其他抗体片段包括Fab片段、Fab2片段、小抗体(也称为小免疫 蛋白)，串联scFv-scFv融合体，以及含适当的域(例如，与免疫球 蛋白的Fc部分)的scFv融合体。对于具体抗体形式的综述，可参见 Holliger P, Hudson PJ.; Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nat Biotechnol. 2005 Sep., 23(9): 1126-36.)。
用于本发明的术语抗体的"功能性衍生物"包括任何抗体或其片 段，所述抗体或其片段已在氨基酸序列中通过例如添加，取代和/或缺 失氨基酸残基进行化学或遗传学修饰，和/或在至少 一种原子和/或功 能性化学基团上通过例如添加，缺失，重排，氧化，还原等进行化学
性、且优选具有微摩尔、^"摩尔'或皮摩尔工的范围的解离;数即可:、用 于本发明的最优选的抗体衍生物是下面更详细限定的抗体融合蛋白。 在一种优选的实施方案中，用于本发明的抗体、其片段或其功能
性衍生物选自多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体， CDR-嫁接抗体，Fv-片段，Fab-片段和Fab2-片段和抗体样结合蛋白， 例^口 affilines,才元笼蛋白 (anticalines )和适体。
对于抗体样结合蛋白的综述，可参见Binz等on engineering binding proteins from non-immunoglobulin domains in Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 10, October 2005， 12571268。术语"aptamer" 描述以高亲和性结合于多肽的核酸。适体可从不同单链RNA分子的 大库(pool)中通过选择方法例如SELEX (见例如，Jayasena, Clin. Chem., 45， p. 1628 — 1650， (1999); Klug and Famulok， M. Mol. Biol.Rep" 20, p. 97 - 107 (1994); US 5,582，981)分离。适体也可以镜像形式， 例如，作为L-核糖核普酸，合成和选择(Nolte等，Nat. Biotechnol., 14， pp.1116 — 1119， (1996); Klussmann等，Nat. Biotechnol., 14， p. 1112 -1115， (1996))。如此分离的形式具有不浮皮天然存在的核糖核酸酶降解 的优点，并且因此具有更好的稳定性。
另 一种抗体样结合蛋白和经典抗体的替代物是所谓的"蛋白支
架"，例如，基于脂笼蛋白的抗笼蛋白(Beste等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96， p. 1898 - 1903, (1999))。脂笼蛋白s例如视黄醇-结合蛋白或 胆汁三烯-结合蛋白的天然配体结合位点可通过，例如应用"组合蛋 白设计"方法，和以使它们结合选择性半抗原的方法(Skerra， Biochem. Bi叩hys. Acta, 1482， pp. 337 — 350， (2000))改变。对于其他蛋白支架， 也已知它们是抗体的替代物(Skerra, J. Mol. Recognit, 13, pp. 167 - 287, (2000)). (Hey， Trends in Biotechnology, 23， pp. 514-522， (2005))。
根据本发明，术语功能性抗体衍生物表示所述抗体的蛋白衍生替 代物，即抗体样结合蛋白，例如，特异性识别癌胚纤连蛋白或癌胚生 腱蛋白的至少一种胞外域的affilines，抗笼蛋白和适体。
概括地说，术语抗体、其功能性片段和其功能性衍生物指对癌胚 纤连蛋白或癌胚生腱蛋白的任何一种胞外域有特异性结合亲和性的 完整抗体具有相同的或类似的结合亲和性的所有物质。
对于生腱蛋白，存在大量的同种型，例如，生腱蛋白-C,生腱 蛋白-R和生腱蛋白-X。为实施本发明，生腱蛋白-C大同种型的 胞外域是作为本发明融合蛋白组成部分的抗体、其功能性片段或其功 能性衍生物的最优选靶标。
在一种优选的实施方案中，作为本发明融合蛋白组成部分的抗 体、其功能性片段或其功能性衍生物具有对于癌胚生腱蛋白-c的至 少一种胞外域，更优选生腱蛋白-C的大同种型的至少一种胞外域具 有特异性结合亲和性。
生腱蛋白-C的胞外域指域Al、 A2、 A3、 A4、 B、 C和D。已 经可获得耙向这些区域之一的大量抗体(参见Siri A.等，Different susceptibility of small and large human tenascin-C isoforms to degradation by matrix metalloproteinases. J. Biol. Chem.， Apr. 14, 1995, 270(15):8650隱4; CarnemollaB. 等 ，Identificationof a
14glioblastoma-associated tenascin-C isoform by a high affinity recombinant antibody. Am. J. Pathol. May 1999， 154(5): 1345-52; Silacci M. et al， Human monoclonal antibodies to domain C of tenascin-C selectively target solid tumors in vivo. Protein Eng. Des. Sel. Oct.2006，19(10):471画8)。
在一种更优选的实施方式中，本发明涉及融合蛋白，所述融合蛋 白包含对于生腱蛋白-C的任何一种胞外域，即Al、 A2、 A3、 A4、
B、 C和D，优选对于域A1、 C或D，更优选对于生腱蛋白-C的域
C, 具有特异性结合亲和性的抗体、其功能性片段或其功能性衍生物。
如在本发明上下文所用，术语"融合蛋白"指包括所有结合物 (conjugates),其中所述的抗体、其片段或其功能性衍生物通过例如 共价和/或非共价，例如离子键结合于细胞因子、其功能性片段和其功 能性衍生物，所述细胞因子选自(a) IL-10, (b) IL15, (c) IL-24和(d) GM-CSF。本术语包括两种结合排列，即抗体-细胞因子或细胞因子
-抗体o
术语所述细胞因子的功能性片段和其功能性衍生物基本上以类 似于所述抗体的相应术语进行解释。细胞因子的功能性片段和其衍生
如，;据;发明确定用于制备、融合"白的细胞因子、其片段和其衍生
物的功能/活性的优选试验是
可通过在鼠肥大细胞MC/9上实施增殖试验确定IL-10或其功能 性衍生物的细胞因子活性/功能。例如，在包含10% FBS, 10%大鼠 T-Stim (Becton Dickinson), 1%抗生素，2 mM谷氨酰胺和0.05 mM J3-巯 基乙醇的DMEM培养基中[Thompson-Snipes等，J. Exp. Med. 173(2): 507-10 (1991)]培养所述细胞。作为试验准备，将不含大鼠T-Stim的 100 pi培养基置于具有超低附件(ultra low attachment) (Costar 3474) 的96孔平底组织培养板的每孔中，培养板中的首行除外。200 pl重组 人(rhu )IL-10( 100 ng/ml)或等同摩尔量的待测试样品置于首行的孔中。 通过将100pl所述样品转移入该行的下一孔，并混合，由此从首行开 始沿微量滴定板制备l: 2的系列稀释物。仅仅包含100 pl的测试培 养基(无细胞因子)的一行孔作为阴性对照。然后计数并稀释MC/9 细胞至5xl05细胞/ml的浓度。为除去残留的细胞因子，用不含大鼠T-Stim的培养基通过离心，将细胞清洗两次，弃去培养基并且将细胞 重悬浮于新鲜培养基中，100 pl的所述细胞悬浮液加入96孔板的孔中 (5 x 104细胞/孔)。48 - 72小时之后，将20 pl的5 mg/ml的MTT溶 液(PBS中，经过过滤)和线粒体脱氩酶的底物加入到细胞中。4小 时后，培养板以2400 g离心IO分钟。弃去培养基并且通过添加100 pl DMSO(Fluka41641)裂解细胞。最后，培养板在570 nm下读数。每种 浓度一式三份。
例如，huIL15或其功能性衍生物的细胞因子活性/功能可通过在 细胞毒性T淋巴细胞系2 (CTLL-2)上进行测试而确定。在包含10% FBS, 1%抗生素，2mM谷氨酰胺(100x)， 1 mM丙酮酸钠(100x)和50 IiM 2-巯基乙醇(1000x)的RPMI培养基中培养所述细胞。另夕卜， CTLL-2细胞需要20 U/ml huIL-2 (Roche 1 011 456)。测试开始前大约 l周，饥饿细胞，仅仅接受10 U/ml的huIL-2。为准备该测试，向具 有超低附件超低附件(Costar 3474)的96孔平底组织培养板中加入 50 pl CTLL-2测试培养基，培养板的首行除外。100 pl重组人IL-15 标准(IO ng/ml)或等摩尔量的测试样品置于首孔中。通过从第一孔开 始，转移50pl到该行的下一孔中制备l: 2的系列稀释物。仅仅包含 50 pl测试培养基(无rhuIL-15)的一行孔作为阴性对照。计数并稀释 CTLL-2细胞至5 x 1()5细胞/ml的浓度。为除去残留的huIL-2，如下 清洗细胞在1100rpm离心细胞5分钟之后，弃去培养基，将细胞团 重悬于新鲜培养基中。这种清洗程序重复两次。50 pl的细胞悬浮液加 入每个微量滴定板孔中(5 x 104细胞/孔)并且培养板在37。C和5% C02下培养。每种测定一式三份。72小时之后，向每孔中加入20 pl的 5 mg/ml MTT (Sigma 206-069-5)溶液(在PBS中)。2到4小时之后, 培养板在2400g离心10分钟。弃去培养基，通过添加100 pl DMSO (Fluka41641)裂解细胞。然后，培养板在570nm下读数。
例如，为测试IL-24或其功能性衍生物作为细胞因子的生物学功 能/活性，可斗全查其通过PBMCi秀导次级细月包因子分泌(IL-6， TNFa和 IFN力[Caudell等，J. Immunol" 168(12):6041隱6 (2002)]。次级细胞因子 的冲企测可通过特异性ELISA(s)而进行。
另一种选择是测试IL-24或其功能性衍生物选择性诱导癌细胞中 的细胞凋亡的能力[Sauane等，Cancer Biol. Ther., 3(8):739-51 (2004)]。为进行本测试，可利用癌细胞，例如DU-145, PC-3, LNCaP, MDA-MB-231等。这些细胞平板接种于96孔皿中并使其在接受IL-24 处理(不同浓度，通常大约25-50 iug/ml)之前附着12小时。细胞培养 5-7天。通过MTT染色监测细胞生长和存活细胞数量。在570nm下 测量的产生的吸光度与存活细胞数量成正比。
例如，GM-CSF或其功能性衍生物的细胞因子活性/功能可通过在 鼠肥大细胞MC/9上进行增殖测试而确定(Biosource Cytokine Facts handbook)。在含10% FBS， 10%大鼠T國Stim (Becton Dickinson), 1%抗 生素，2mM谷氨酰胺和0.05mMfi-巯基乙醇的DMEM培养基中培养 所述细胞。包含10% FBS， 1%抗生素，2 mM谷氨酰胺和0.05 M J3-巯 基乙醇的RPMI培养基用作测试培养基。作为测试准备，将100pl测 试培养基置于具有超低附件的96孔平底组织培养板(Costa^ 3474)的 每孔中，首行除外。200 重组muGM-CSF(5ng/ml)或等同摩尔量的 样品置于首行的孔中。通过将100 pl样品转移入该行的下一孔，并混 合，由此从首行开始沿微量滴定板制备1: 2的系列稀释物。仅仅包 含100 pl的测试培养基(无GM-CSF )的一行孔作为阴性对照。计数 并稀释MC/9细胞至5 x 104细胞/ml的浓度。为除去残留的细胞因子， 用RPMI通过离心清洗细胞两次，弃去培养基并将其重悬浮于新鲜培 养基中，100 pl的上述细胞悬浮液加入96孔板的孔中(5 x 103细胞/ 孔)，所述孔中已经包含了富含rmuGM-CSF或GM-CSF融合蛋白的 100 pl相应培养基。48 - 72小时之后，向细胞中加入20 pl的5mg/ml 的MTT溶液(在PBS中，经过过滤)以及线粒体脱氢酶的底物。4 小时后，培养板以2400 g离心10分钟。弃去培养基并通过添加100 )il DMSO (Fluka41641)裂解细胞。最后，培养板在570 nm下读数。每种 浓度测试一式三份。
在本发明的一种优选实施方案中，本发明的融合蛋白包含具有 SEQIDNO:6所示氨基酸序列的双抗体scFvL19 (长)。
在本发明的另一优选实施方案中，本发明的融合蛋白包含具有 SEQ ID NO: 7所示氨基酸序列的双抗体L19(短)。
在一种本发明的进一步优选的实施方案中，所述融合蛋白中的抗 体、其功能性片段或其功能性衍生物对具有SEQ ID NO:8到13所示 的氨基酸序列的、选自F16(长)、F16(短)、F16(A34M)(长)、F16(A34M)(短)、Gll (长)和Gll (短)的、癌胚生腱蛋白的至少一种胞外 域具有特异性结合亲和性。
更优选地，本发明的融合蛋白中，选自L19 (长)，L19 (短)，F16 (长) F16(短)，F16(A34M)(长)，F16(A34M)(短)，Gll (长)和Gll (短)中的 成员与选自GM-CSF, IL-10， IL15和IL-24的细胞因子、其功能性片段 和其功能性衍生物相融合。
本发明的所有实施方式和方面中，优选的细胞因子是鼠或人细胞 因子，优选人细胞因子、其功能性片段或其功能性衍生物。
本发明的融合蛋白可以按下述方式排列，即使细胞因子、其功 能性片段或其功能性衍生物的N-末端或C-末端与抗体、其功能性片 段或其功能性衍生物融合。
出乎意料地，与长接头变体相比，L19，F16和Gll的短接头功能 性衍生物导致双体形成增加。而且，出乎预料地注意到，与常规的scFv F16序列相比，包含在其氨基酸序列第34位具有突变(A-〉M)的scFv F16 (长或短)[SEQ ID NOS: 10 & 1 l]的融合蛋白表现出更高的表达 率。
由于短变体的上述有益效果，本发明的融合蛋白优选其中的抗体 片段或其功能性衍生物选自L 19 (短)、F16 (短)、F16 (A34M)(短) 和Gll (短)。
包含F16(A34M)变体(长或短)的融合蛋白是更为优选，包含短 F16(A34M)变体的融合蛋白最为优选。
事实上，在本发明的一个独立的方面涉及下述融合蛋白，其包含 (i)与任何细胞因子、其功能性片段和其功能性衍生物的、对癌 胚生腱蛋白的至少一种胞外域具有特异性结合亲和性的F16(A34M) (短或长，优选短)。
在一种优选实施方案中，本发明的融合蛋白选自L19-IL-10, IL15-L19, IL-24-L19, L19-GM-CSF, L19-IL15， IL24-L19。
在另一实施方案中，本发明的融合蛋白选自具有SEQ ID NO:14-19所示的氨基酸序列的蛋白。
在另 一方面，本发明涉及本发明的融合蛋白在制备药剂中的用途。
在优选的实施方案中，本发明涉及上述融合蛋白在治疗哺乳动物，优选人，的癌症中的用途。
在另一优选实施方案中，本发明涉及上述融合蛋白在治疗哺乳动 物，优选人的炎性疾病中的用途，其中所述的炎症疾病优选慢性炎性 疾病。
优选地，所述炎性疾病选自银屑病，动脉粥样硬化，关节炎，优 选类风湿性关节炎。
本发明的另 一 方面涉及包含本发明的至少 一种融合蛋白和任选 药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本发明的药物组合物典型地包含治疗有效量的、本发明的融合蛋 白和任选的辅料，例如药学上可接受的赋形剂。所述药学组合物以药 学领域公知的方式制备。载体或赋形剂可以是可作为活性成分的载体 或介质的液体。适当的载体或赋形剂是本领域公知的，包括例如，稳
定剂、抗氧化剂、pH-调节物质，控释赋形剂。本发明的药物制剂可 适于，例如肠胃外应用，并且可以溶液等形式给予患者。
最后，本发明的另一方面涉及治疗方法，其中，给予需要其的患 者，优选是遭受癌症和/或炎性疾病的患者有效量的药物组合物。
对于遭受上述疾病或病症的受试者的治疗，本发明的融合蛋白可 以使得有效量的治疗化合物为生物可利用的任何形式或方式给药，包 括口服或肠胃外途径。例如，本发明的组合物可皮下、肌肉内、静脉 内等给药。药剂制备领域技术人员可根据选择的产品、待治疗疾病或 病症、疾病或病症的阶^殳和其他相关环境的特定性质容易地选才争适当 的纟会药开j式和方式(见,例^口 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (1990))。本发明的组合物可单独给药，或以与药 学上可接受的载体或赋形剂组合的药物制剂的形式给药，其比例和性 质通过所选择的产品的溶解性和化学性质、所选择的给药途径和标准 药物实践而确定。为了稳定性、结晶方便性，提高的溶解性等目的， 本发明的产品，为了发挥其作用可以药学上可接受的盐，例如酸加成 盐或石威加成盐的形式配制并施用。
序列表
SEQ ID NO:l所示的是人IL-IO的氨基酸序列，登录号P22301 (SwissProt); Vieira等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88(4)， 1172-1176(1991)。
MHSSALLCCLVLLTGVRASPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMK DQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLK TLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIR N
SEQ ID NO:2所示的是人IL-15的氨基酸序列，登录号P40933 (SwissProt); Grabstein等，Science 264 (5161)， 965-968 (1994)。
N雨NVISDLKK旧DLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHD TVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
SEQ ID NO:3所示的是人IL-24的氨基酸序列，登录号Q13007 (SwissProt); Jiang等，Oncogene 11 (12), 2477-2486 (1995)。
AQGQEFHFGPCQVKGWPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAES
CYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDS
AHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKL
SEQ ID NO:4所示的是人GM-CSF的氨基酸序列，登录号 P04141(SwissProt); Lee等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (13), 4360-4364 (1985)。
APARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRL
ELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPF
DCWEPVQE
SEQ ID NO:5所示的是鼠GM-CSF的氨基酸序列，登录号P01587 (SwissProt); Miyatake等，EMBO J. 4 (10), 2561-2568 (1985)。
APTRSPITVTRPWKHVEAIKEALNLLDDMPVTLNEEVEWSNEFSFKKLTCVQTRLKIFE
QGLRGNFTKLKGALNMTASYYQTYCPPTPETDCETQVTTYADFIDSLKTFLTDIPFECKK
PVQK
SEQ ID NO:6所示的是L19(长)的氨基酸序列，Viti等，Cancer Res" 59(2): 347-52 (1999)。
20EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGT TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVS SGDGSSGGSGGASTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPG QAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQG TKVEIK
(粗体字母表示14个氨基酸的接头)
SEQIDNO:7所示的是L19(短)的氨基酸序列(迄今未公开)。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGT TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVS SGSSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYAS SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK
(粗体字母表示5个氨基酸的接头)
SEQ ID NO:8所示的是F16(长)的氨基酸序列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGAS術RQAPGKGLEWVSAISGSGGS
TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVS
RGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQ
APVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPWFG
GGTKLTVLG
SEQ ID NO:9所示的是F16(短)的氨基酸序列。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGASWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGS TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVS RGSSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKN NRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPWFGGGTKLTVLG
(粗体字母表示5个氨基酸的接头)
SEQIDNO:10所示的是F16(A34M)(长)的氨基酸序列。EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGS
TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVS
RGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQ
APVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPWFG
GGTKLTVLG
(下划线的氨基酸表示A取代为M)
SEQIDNO:ll所示的是F16(A34M)(短)的氨基酸序列。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGS TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVS RGSSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKN NRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPWFGGGTKLTVLG
(下划线的氨基酸表示A取代为M，粗体字母表示5个氨基酸的接头)
SEQ ID NO:12所示的是Gll(长)的氨基酸序列。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSRMG雨RQAPGKGLE溶SAINEEGG
QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHPPHRPFDYWGQGTLV
TVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQK
PGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRP
WFGGGTKLTVLG
SEQIDNO:13所示的是Gll (短)的氨基酸序列。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSRMGWVRQAPGKGLEWVSAINEEGG
QTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHPPHRPFDYWGQGTLV
TVSRGSSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYG
KNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPWFGGGTKLTV
LG
SEQ ID NO:14所示的是融合蛋白L19(长)-huIL-10的氨基酸序列。EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGT
TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVS
SGDGSSGGSGGASTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPG
QAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQG
TKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFF
QMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGE
NLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTM
KIRN
SEQ ID N0:15所示的是融合蛋白L19(短)-huIL15的氨基酸序
列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGT
TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVS
SGSSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYAS
SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSG
SSSSGSSSSGNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVI
SLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFI
NTS
SEQ ID NO:16所示的是融合蛋白huIL15-L19 (短)的氨基酸序
列
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHD TVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSSSSGSSS
SGSSSSGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVS
SISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWG
QGTLVTVSSGSSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQA
PRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTK
VEIK
SEQ ID N0:17所示的是融合蛋白huIL24-L19 (短)的氨基酸序
列
23AQGQEFHFGPCQVKGWPQKLWEAFWAVKDTMQAQDNITSARLLQQEVLQNVSDAES
CYLVHTLLEFYLKTVFKNYHNRTVEVRTLKSFSTLANNFVLIVSQLQPSQENEMFSIRDS
AHRRFLLFRRAFKQLDVEAALTKALGEVDILLTWMQKFYKLSSSSGSSSSGSSSSGEVQ
LLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYY
ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGS
SGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRA
TGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:18所示的是融合蛋白L19(短)huGM-CSF的氨基酸序
列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGT
TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVS
SGSSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYAS
SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSG
SSSSGSSSSGAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFD
LQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKE
NLKDFLLVIPFDCWEPVQE
SEQ IDNO:19所示的是融合蛋白L19(短)-鼠GM-CSF的氨基酸 序列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGT
TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVS
SGSSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYAS
SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSG
SSSSGSSSSGAPTRSPITVTRPWKHVEAIKEALNLLDDMPVTLNEEVEWSNEFSFKKLT
CVQTRLKIFEQGLRGNFTKLKGALNMTASYYQTYCPPTPETDCETQVTTYADFIDSLKTF
LTDIPFECKKPVQK
附图
图1说明融合蛋白在129Sv小鼠中的皮下F9肿瘤中的积聚。生 物分布数据证实，相对于正常器官，所有四种融合蛋白在肿瘤中具有 更高的吸收。显示了放射标记蛋白注射24小时之后的数据A) L19-IL10, B) IL15隱L19， C) IL24-L19, D) L19-GMCSF和E) L19-IL15。图 2 关节炎小鼠的抗体-介导的近红外成像 (Near画Infrared國Imaging) 。 用 SIP(L19)曙Alexa750 (a), SIP(G11)-Alexa750 (b)或对照SIP-Alexa750 (c)注射动物。焚光标记抗 体注射24小时之后成像。箭头表示小鼠前爪2级肿胀。
图3在关节炎爪中放射标记的SIP(L19)和SIP(G11)的积聚。A栏 显示了用SIP(L19)-^I注射的小鼠的关节炎肢体。左爪分类为2级关 节炎，右爪为l级关节炎。B栏显示了应用SIP(G11)J"I进行的相同 试验。此处左爪分类为1级关节炎，右爪为2级关节炎。C栏显示了 用对照SIP-125I,即 一种不与小鼠中任何结构结合的抗体，注射的小鼠。 此处左爪分类为2级关节炎，右爪为l级关节炎。
图4说明细胞因子靶向关节炎病灶。关节炎小鼠侧尾静脉静脉内 (i.v.)注射盐水(黑圓)，于200 pl体积盐水中稀释的L19-IL2 (黑 三角，虚线)、L19-TNFa (十字，虚线)或L19-IL10(空心方框)。 如箭头所示，在关节炎发作1天之后开始注射，并且之后每隔天重复， 每只动物进行3次注射。融合蛋白的累积剂量分别为每只小鼠为20 1iglL2等价物(equivalents) , 6pgTNFa等价物，150pglL10等价 物。每天评价关节炎得分，并且表示为平均值土 SEM。爪肺胀每隔天 测量，所有4爪的平均值作为每只动物的爪厚度。显示的结果为每组 的平均值土SEM。每组由7只小鼠组成。
图5证实了 IL10耙向递送到炎症位点优于全身性施用IL10的治 疗。关节炎小鼠侧尾静脉静脉内(i.v.)注射盐水(黑圓)，200 pl 体积盐水中稀释的L19-IL10 (空心方框)或HyHellO-ILlO (十字，虚 线)。如箭头所示，注射开始于关节炎发作之后1天，然后每隔天重 复，每只动物进行3次注射。融合蛋白的累计剂量为每只小鼠150 pg 的IL10等价物。每天进行评价关节炎得分，并且表示为平均值土 SEM。 每隔天测量爪肿胀，并且所有4爪的平均值作为每只动物的爪厚度。 显示的结果为每组的平均值士SEM。每组包含6只小鼠。
图6说明用不同量的L19-GM-CSF治疗皮下(s.c. )F9肿瘤。用 60 pg的L19-GM-CSF连续4天每天静脉内(i.v.)注射证实了与盐水 (PBS)治疗组对比显著的肿瘤生长阻滞。
图7说明用L19-IL15治疗皮下(s.c. )F9肿瘤。用50 pg的L19-IL15 连续4天每天i.v.注射证实了与对照(PBS)组相比显著的肿瘤生长阻滞。
图8说明用IL24-L19治疗s.c F9肺瘤。用50 pg的IL24-L19连 续4天每天i.v.注射显示了与对照(PBS )组相比显著的肿瘤生长阻滞。
实施例
实施例1融合蛋白的制备
细胞因子通过15个氨基酸接头与scFv抗体片段的C-末端或N-末端相融合。将所产生的、前端具有重组蛋白分泌所需的分泌序列的 片段克隆入哺乳动物表达载体，融合蛋白在稳定转染的HEK293细胞 中表达。在抗原柱上通过亲和层析将构建体从培养基中纯化出来，产 量为1-2 mg/1。通过SDS-PAGE和凝胶过滤进行质量控制。
实施例2融合蛋白的制剂和给药
融合蛋白溶解于生理溶液中并静脉内给予动物。根据等电点和所 期望的储存时间将所述蛋白储存在下述的 一种緩沖液中。蛋白在-80 。C下长期储存(超过一个月)。为防止因反复的冻融循环产生的聚集， 可添加1 %的甘油和0.04%的Tween 80。
PBS(磷酸盐緩冲盐)100 mM NaCl， 30 mM Na2HP04 x 2 H20, 20 mM NaH2P04 x 2 H20， pH 7.4
K-PBS: 137 mM NaCl, 8 mM Na2HP04 x 2 H20, 2.7 mM KCl， 1.5 mM KH2P04, pH 7.4
PBS Siena: 20 mM NaCl， 6.7 mM Na2HP04 x 2 H20, 1.8 mM KCl, 133 mM甘露醇，pH6.3
TBS (Tris緩冲液)20 mM Tris, 130 mM NaCl, pH 8.2
典型地进行3-5次注射，每天或每隔日进行。剂量选择可按照 常规试验依照文献值进行。
实施例3融合蛋白在移植了皮下F9肿瘤的129Sv小鼠中的靶向功效 利用在携带皮下F9畸胎癌的129SvEv小鼠中实施的生物分布试 验评价放射性碘标记的L19-IL10制剂的体内靶向性质。静脉内给药 24小时之后观察到良好的肺瘤/器官比例(范围在7: 1到128: 1之 间)。利用在携带了皮下F9畸胎癌的129SvEv小鼠中实施的生物分布试验评价放射性碘标记的L19-IL15, IL15-L19, IL24-L19和 L19-GM-CSF制剂的体内靶向性质。皮下给药24小时之后观察到良好 的肿瘤器官比例。
实施例4人单克隆抗体L19和Gll在关节炎位点的选择性聚集
利用焚光和放射性抗体检测在关节炎小鼠中研究了小抗体形式 的L19和Gll(Borsi et al., Int. J. Cancer， 102(1): 79-85 (2002))的体内耙
向性质。
对关节炎小鼠注射用近红外染料Alexa 750标记的SIP(L19), SIP(G11)或对照SIP。静脉注射24小时后，利用红外荧光成像器使动
中存在强烈、且选择性的抗体聚集(图2)。相比之下,;注射了对照 SIP的小鼠仅仅显示出微弱的荧光信号，这是由发炎肢体中渗漏的脉 管非特异性外渗的标记抗体造成的，上述用作阴性对照的所述SIP是 小鼠中非相关特异性(irrelevant specificity )的抗体。
向关节炎小鼠注射放射性标记的SIP(L19)和SIP(Gll)。 24小时之 后，处死小鼠，并且通过放射自显影法使爪子成像。在注射了 SIP(L19) 和SIP(G11)的小鼠的发炎肢体中观察到优先的放射性聚集，而在注射 了小鼠非特异性相关SIP抗体的、显示出相当等级的炎症的小鼠中没 有检测到优先的抗体聚集(图3)。
实施例5融合蛋白L19-IL10在胶原蛋白诱导的关节炎小鼠模型中的 治疗功岁文
类风湿性关节炎的最广泛应用和最著名的动物模型是在小鼠或 大鼠中的II型胶原蛋白诱导关节炎(CIA ) [Bliven等，Arthritis Rheum. 29(9): 1131-8 ((1986)]。已经报道了这种模型与人的类风湿性关节炎有 大量的共同特征，包括针对胶原蛋白的体液和细胞免疫反应、与位于 主要组织相容性基因座的基因连锁，以及一些类似的组织学表现。 Maini和Feldmann已经进4亍了大多的先驱工作，例如利用这种动物 模型研究作为用于RA的治疗策略的抗肿瘤坏死因子抗体[Williams 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(20): 9784-8 (1992); Williams等，J. Immunol. 165(12): 7240-5 (2000)]。在首次试验中，利用具有CIA的小鼠，将L19-IL10的治疗潜能 与L19-IL2和L19-TNF进行比较。盐水注射小鼠用作对照组。关节炎 发作之后第一天开始每48小时小鼠接受三次注射。与先前用于肿瘤 治疗试验的相等的累积剂量为60 pg的L19-IL2和15 pg的L19-TNF。 本试验中每只小鼠应用450 |Lig的L19-IL10，后续试验中应用抗体-IL10融合蛋白，其与先前发现的在小鼠中有活性并且无毒性的IL10 剂量一致。
L19-IL10对关节炎得分和爪肿胀上具有明确的治疗效果(见图 4)。这种效果的大小与在相同动物模型中对于TNF-中和抗体观察到 的相当。相比之下，L19-IL12和L19-TNF导致了感染肢体的快速和 显著的肿胀，其比盐水对照组更严重。接受治疗的动物没有死亡或表 现出超过15%的减重，并且第三次抗体给药之后关节炎参数未显著恶 化(图4 )。
为了证实靶向形式的IL10相对于未靶向的细胞因子的治疗有效 性，利用关节炎CIA模型研究了两种融合蛋白L19-IL10和 HyHell0-IL10。如先前试验，每组6只关节炎小鼠由关节炎发作第一 天开始每隔天注射L19-IL10， HyHellO-ILlO或盐水的进行三次治疗。 对于两种融合蛋白，给予每只小鼠的累积剂量是450 pg。如所期望的， 证实了与盐对照组相比，L19-IL10的显著治疗应答，即直到关节炎 发作后第9天(也就是最后注射后4天)均保持着低的关节炎得分和 爪肿胀。与先前在此模型中观察到的IL10的治疗活性一致，非耙向 HyHEL10-IL10融合蛋白显示了相对于盐水对照的治疗效果，然而其 不像L19-IL10的例子中那样有效(图5)。
实施例6融合蛋白L19-IL15,IL24-L19和L19-GM-CSF在移植了皮下 F9肺瘤的129Sv小鼠中的治疗功效
在首次试验中，利用具有皮下(s.c.) F9肿瘤的小鼠评价 L19-GM-CSF, L19-IL15和IL24-L19的治疗潜力。盐水注射小鼠用作
28对照组。当肺瘤已经可见和可测量时，在肿瘤细胞植入4天之后开始 每24小时小鼠接受总共四次注射。与先前用于肿瘤治疗试验相等的 累积剂量是240 pg的L19-GM-CSF, 200 pg的L19-IL15和200 pg的 IL24-L19。在这种设置下所有三种融合蛋白是非毒性的，并且与对照 组相比证实了显著的胂瘤生长阻滞(图6-8)。
权利要求
1. 融合蛋白，其包含(i)对癌胚纤连蛋白(ED-B)的胞外域或癌胚生腱蛋白的至少一种胞外域具有特异性结合亲和性的抗体、其功能性片段或其功能性衍生物，所述的抗体、其功能性片段或其功能性衍生物融合于(ii)选自(a)IL-10，(b)IL15，(c)IL-24和(d)GM-CSF、其功能性片段和其功能性衍生物的细胞因子。
2. 权利要求1的融合蛋白，其中所述抗体、其功能性片段或其功 能性衍生物选自多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、 CDR-嫁接抗体、Fv-片段、Fab-片段、Fab^片段和抗体样结合蛋白。
3. 根据权利要求1或2的融合蛋白，其中所述抗体的功能性衍生 物是具有SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列的双抗体L19(长)。
4. 根据权利要求1或2的融合蛋白，其中所述抗体的功能性衍生 物是具有SEQ ID NO:7所示的氨基序列的双抗体L19(短)。
5. 根据权利要求1或2的融合蛋白，其中对于癌胚生腱蛋白的至 少一种胞外域具有特异性结合亲和性的所述抗体、其功能性片段或其 功能性衍生物选自分别具有SEQ ID NO:8到13所示的氨基序列的 F16 (长)，F16 (短),F16 (A34M)(长)，F16 (A34M)(短),Gll (长)和 Gll C短)。
6. 根据权利要求1到5任一项的融合蛋白，其中选自L19 (长)、 L19(短)、F16(长)、F16(短)、F16 (A34M)(长)、F16 (A34M)(短)、 Gll (长)和Gll (短)的成员与选自GM-CSF、 IL-IO、 IL15和IL-24、 其功能性片段和其功能性衍生物的细胞因子相融合。
7. 根据权利要求1到6任一项的融合蛋白，其中所述细胞因子是 鼠或人细胞因子，优选人细胞因子，其功能性片段或功能性衍生物。
8. 根据权利要求1到7任一项的融合蛋白，其中所述细胞因子、 其功能性片段或其功能性衍生物以N-末端或C-末端，优选N-末端融 合于所述抗体、其功能性片段或其功能性衍生物。
9. 根据权利要求1到8任一项的融合蛋白，其中所述的抗体的片 段或其功能性衍生物选自L 19 (短)，F16 (短)，F16 (A34M)(短)和Gll (短),优选F16 (A34M)(短)。
10. 根据权利要求1到9任一项的融合蛋白，其选自L19-IL-10，IL15-L19, IL-24-L19, L19画GM-CSF, L19-IL15, IL24画L19。
11. 根据权利要求1到1任一项所述的融合蛋白，其选自具有SEQ ID NO:14-19所示的氨基酸序列的蛋白。
12. 根据权利要求1到11任一项的融合蛋白在制备药剂中的用途。
13. 根据权利要求12的用途，其用于治疗哺乳动物，优选人，中 的癌症。
14. 根据权利要求12的用途，其用于治疗哺乳动物，优选人，中 的炎性疾病，优选慢性炎性疾病。
15. 根据权利要求14的用途，其中炎性疾病选自银屑病，动脉 粥样硬化，关节炎，优选类风湿性关节炎。
16. 药物组合物，其包含至少一种根据权利要求1到11任一项的 融合蛋白和任选的药学上可接受的赋形剂。
17. 治疗方法，其中将有效量的根据权利要求16的药物组合物给 予需要的患者，优选遭受癌症和/或炎性疾病的患者。
全文摘要
本发明涉及融合蛋白，其包含对于癌胚纤连蛋白(ED-B)的胞外域或癌胚生腱蛋白的至少一种胞外域具有特异性结合亲和性的抗体、其功能性片段或功能性衍生物，所述的抗体、其功能性片段或功能性衍生物融合于选自(a)IL-10，(b)IL15，(c)IL-24和(d)GM-CSF、其功能性片段和功能性衍生物的细胞因子。本发明还涉及至少一种所述融合蛋白在制备药剂中的用途。更具体地，本发明涉及所述药剂用于治疗肿瘤或慢性炎性疾病的用途，例如动脉粥样硬化，关节炎和银屑病。
文档编号C07K14/54GK101437847SQ200780016674
公开日2009年5月20日 申请日期2007年5月8日 优先权日2006年5月8日
发明者D·内里, E·特拉克塞尔, M·卡斯帕 申请人:菲洛根有限公司