专利名称：用于体外除去毒素尤其是细胞因子，特别是用于治疗患有急性器官衰竭患者的方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种净化患有急性器官衰竭患者之血液的高效方法，而且该方法可以与其它已知的血液净化方法结合使用，不会产生难题。本发明的方法尽管较好的是用于治疗急性器官衰竭，可能是与败血性休克有关或由其引起的急性器官衰竭，但本发明的方法也可以被用于改善用已知方法治疗患有慢性器官衰竭之患者的效果。
在患有器官衰竭的患者中，血液逐渐滞留大量各种通常被称为“毒素”的物质，对健康人来而言，相关器官通常能够将该毒素从血流中排除。这种毒素积累后如果不经过处理，会导致大范围的器官功能失调，最终致使患死亡，而急性综合症特征是在要除去的毒素中有高比例含量的细胞因子。
最常用的用于净化血液毒素的方法有用吸附法将血液毒素吸附在固体介质上的方法(血液及血浆灌注)、或者通过合适的半透膜对血液或血浆进行超滤的方法、或者通过膜借助于压力梯度(TMP)进行对流的方法(血流或血浆过滤)、或者用使要净化的血液或血浆与膜的一侧接触而用合适的调配洗液与其另一侧接触的渗滤法(血液透析)。
但是，所有上述方法都存在不足。血液灌注在于使血液直接穿过吸附材料的过滤器而进行渗析，因此，这种材料必须是高生物相容的。通常，这是用合适的材料涂敷吸附颗粒得以实现的，但是，这严重影响吸附颗粒的滞留毒素能力。在血浆灌注中，首先过滤血液以便分离血浆，然后用吸附材料进行渗透，尽管这种方法在一定程度上解决了灌注期间的生物相容性问题，但是，过滤期间血液粘度增加会导致严重凝结在膜上，所以，出现这种情况时，必须用阻凝剂(肝素)进行处理。
另一方面，血液及血浆过滤只是用以除去大分子量毒素，造成较多的重要损失，这必须通过向患者血液中补进灌输液进行补偿。根据于1990年3月9日申请的意大利专利申请67168-A/90，通过将滤液再生可以使上述问题部分得到解决，即通过用未涂敷的活性碳基血液灌注柱体如由意大利SORIN BIOMEDICA of Saluggia生产的DETOXIL 2TM对血液进行渗透，使血液中的中高分子量毒素被吸附，这样，就可以使用再生过的滤液，可以单独或与添加液一起作为灌输液使用。
血液透析法尤其与一种或多种上述方法结合使用是一种最有效的方法，但是，净化时间相对较长，所以，就不能适用于急性患者血液中足够量的毒素除去。特别是细胞因子除去能力相当差，所以，到目前为止，由急性器官衰竭而引起的器官功能失调只能被相对延缓，而无法被完全防止。
本发明的目的在于克服上述的缺点，使血液中所有毒素包括细胞因子得到迅速而有效地净化。
根据本发明，提供一种净化含有毒素及细胞因子之血流的方法，该方法包括超滤或血浆过滤步骤、超滤液或血浆滤液净化步骤及补偿步骤，在该补偿步骤中，将净化后的超滤液或血浆滤液加入到从超滤器或血浆过滤器下游回收的洗脱液中，本发明特征在于进行超滤或血浆过滤步骤，使要除去的细胞因子流进超滤液或血浆滤液中，通过吸附及通过吸附柱供入超滤液或血浆滤液，进行超滤液或血浆滤液净化步骤，吸附柱中的吸附材料含有未涂敷的活性碳和/或疏水或离子交换聚苯乙烯树脂，优选的是含有AMBERLITETM、AMBERCHROMTM、AMBERSORBTM。
超滤液或血浆滤液较好的是经过双吸附步聚，首先经过活性碳吸附柱吸附，然后经过填充有疏水或离子交换树脂的吸附柱吸附。
根据本发明，还提供一种净化血液、尤其是治疗患有急性器官衰竭患者的装置，该装置包括净化血流用的切入供料回路、与切入供料回路串联的超滤器或血浆滤器、用于从所说的超滤器或血浆滤器中收集超滤液或血浆滤液的收集回路、该收集回路与血浆或超滤器具有分路连接、以及与收集回路进行液动串联的过滤装置，其特征在于所说的血浆滤器或超滤器具有进入存在所说血流中任何细胞因子之超滤液或血浆滤液的通道，所说的过滤装置包括填充有活性碳的第一吸附过滤器，以及填充有疏水或离子交换聚苯乙烯树脂的位于第一过滤器下游的第二吸附过滤器。
具体地讲，所用的树脂是一种网状芳族聚合物、大网状和/或大孔的或合成的碳质树脂如AMBERLITETM、AMBERCHROMTM、AMBERSORBTM。
本发明也涉及使用与超滤器或血浆过滤器相连的吸附过滤器，能够迅速、高效地除去血流中的细胞因子，其特征在于使用超滤器或血浆过滤器，使存在于血流中的大部分细胞因子进入与由超滤器或血浆过滤器血流对流而产生的超滤液或血浆滤液中，而且，其特征还在于将超滤液或血浆滤液供入吸附过滤器中，在该吸附过滤器中，吸附材料含有未涂覆的活性碳、疏水或离子交换聚苯乙烯树脂或它们的混合物。
以下参见附图，用实施例说明本发明若干个非限制性实施方案，其中
图1用图解法示出实施本发明装置以及用于试验本发明方法的试验回路；图2至图7表示说明使用图1回路除去超滤液中主要细胞因子的实验图表。
简略地讲，本发明是基于以下观测结果得出的，即，未涂敷的活性碳(由所说的意大利专利申请67168-A/90披露)已经证实，通过吸附作用，极有助于净化分子量主要为300-1,500道尔顿(理论上讲，活性碳的吸收光谱为100-20,000道尔顿)的一般性毒素物质(尤其是β2微球蛋白)以及以非正常量存在于患有慢性尿毒症患者体内之毒素物质的超滤液，该未涂敷的活性碳也特别适用于(尤其是与疏水和/或离子交换树脂一起)治疗急性病患者，以便能够迅速、特别是全部除去已知为细胞因子而目前又无法用任何已知的方法或装置进行除去的一类毒素。
根据分子量为上述范围的活性碳的众所周知的吸附特性，可以明显地想到，至少一部分细胞因子可以被活性碳过滤器滞留，指的是分子量为9,000至17,000道尔顿，主要为已知的细胞因子(只是IL-16具有26,000道尔顿的分子量，即远在活性碳的已知吸附范围之外)。但是，与只是捕集存在于急性病患者血流中至少一部分细胞因子不同，为了达到本发明的目的，极其重要的是尽可能快速地除去这些毒素。
到目前为止，在现有文献中还没有提出活性碳(尤其是如果有的话，就会被披露，它与树脂一起使用)也能保证足够快速地除去细胞因子，从而使急性病患者得到有效的治疗。但是，根据本发明申请人的研究人员的理解，这个难题现在已经得到解决，而且按照特定程序，通过处理急性病患者的血流，使治疗效果达到最优化。首先，进行超滤或血浆过滤，使要净化的血流与一种已知的半渗透膜即聚砜膜(PSF、SPAN)的第一侧接触，在净化过程中，采用对流维持作用在与第一侧相对的膜的第二侧上的压力梯度(TMP)，以便收集超滤液或血浆滤液的液流，关闭通向二级回路的液流，同时，除去其余的血(洗脱液)流部分。
根据本发明，采用能够使存在于进入血流中的大部分(基本上是所有的部分)细胞因子穿过膜后而进入超滤液/血浆过滤液液流中去的理化及渗透性能(孔隙度、疏水能力等)的膜进行上述步骤。然后，用所说的二级回路将含有要除去的细胞因子的超滤液/血浆滤液液流供入形成部分二级回路的过滤装置中，并按如下方式处置，使含有要除去的细胞因子的液流与活性碳颗粒即第一过滤器柱(吸附柱)的内侧接触，同时与混有碳颗粒的疏水或离子交换树脂的颗粒接触，或者较好的是与跟第一过滤器柱液压串联的第二过滤器柱(吸附柱)的内侧接触。
本发明提供的不仅是迅速除去滞留在两个吸附柱中的细胞因子，以获得本发明的目的，而且，根据意大利专利申请67168-A/90中的描述，也用于使超滤液/血浆滤液(活性碳也能滞留任何其它中分子量毒素如马尿酸、尿酸、β2微球蛋白等)进行再生，这样，可以将再生的滤液用作补灌输液，并加进来自超滤器/血浆过滤器的洗脱液中，以便形成净化的血流，再将其按已知方法回送到患者体内。
根据本发明，当活性碳也与疏水树脂如含有网状芳族聚合物基质的树脂、大网状和/或大孔树脂如已知的工业制品AMBERCHROMTM(苯乙烯异丁烯酸树脂)及AMBERLITETM(共聚物二乙烯基苯-聚苯乙烯树脂)、和/或合成碳质树脂如AMBERSORBTM。所有这些树脂都由ROHM&HAAS生产和售销，通常被用于果汁及其它食品的加工，符合美国FDA标准nr21 CFR173.65，并按该标准分类为无毒，所以，这些树脂也可以用于医学目的。尽管如此，还是发现这类树脂(通常被用作色谱柱的填料或作为固定载体，作为活性物质使用)也是有效的，而且用于滞留细胞因子时则更有效，特别是按这样的比例使用，能够用这些树脂治疗急性器官衰竭综合症。
本发明中采用的树脂的颗粒大小为20-100(AMBERLITETM为250-350)微米、AMBERCHROMTM的孔隙度为100-300埃、AMBERSORBTM为30-480埃、AMBERLITETM为130-150埃。
参见图1，本发明的方法按所示回路进行试验，该方法用意大利专利申请67168-A/90所述的装置进行实施(该装置的相关内容在此并入便于参考)，用两个彼此液压串联的分离血液灌注柱简单地替换单个未涂敷活性碳柱(由SORIN Biomedica of Saluggia公司提供的DETOXIL-2TM)，并且分别装有活性碳和上述树脂的一种(或混合物)。该装置主要部分在图1回路中已经示出，它包括泵2和用于提供要净化之血流的装置，而且在实施例中示出的该装置由插入在储存器4内的支管3定位，储存器4装有预定量的治疗血液。回路1用液压法与过滤器(超滤器或血浆过滤器)5串接，该过滤器5带有过滤装置，它由半渗透膜限定，通过对流法用该过滤装置过滤血流，以便在二级回路8内部形成与回路1液压分流的超滤液/血浆滤液液流。超滤液/血浆滤液沿回路8流动，并与洗脱液流混合，沿排出管9从过滤器5流出，以便形成净化的血流，再用已知方法将该净化的血流送回到患者体内。为试验目的，在所示的实施例中，回路8和管9内的液流都排进储存器4，这样，储存器中的血液按预定时间间隔周期性地进行处理。根据本发明，二级回路8带有两个彼此液压串联的过滤器，第一个过滤器由血液灌注柱11限定，其内部装有未涂敷的活性碳，第二个过滤器由相似的灌注柱12定位，该灌注柱内装有上述树脂的一种(或多种)。取样点设定在过滤器11、12的上、下游，以便监控储存器4中血液的净化情况。如图2至图7的图表所示，越往后的图表显示的越清楚，本发明提供迅速而可靠的降低存在于储存器4中血液内的细胞因子的方法。以下用实施例说明本发明的若干个实施方案。
实施例1关于活性碳和树脂的吸附特性将表1中所列的未涂敷活性碳和树脂进行装填、预洗涤并靠重力装入由聚苯乙烯管形成的小柱(长度为2.5cm、内径为1.2cm)内，总重量为1.3g。将树脂充分洗涤，并贮存于浓度为50％的甲醇和水的溶液中。就在灌注之前，用20倍于柱体积(20体积)的无菌生理盐水溶液洗涤所形成的柱，然后调温与人血浆(10ml)一致，接着分离标准人血浆，其中含有2-2.5μCi(微居里)的125I标记的细胞因子，如TNF-α(NEN-DuPont，比活性59.2μCi/mg)、IL-1β(Amersham，比活性3000Ci/mmol)、IL-6(Amersham，比活性1100Ci/mmol)以及IL-8(Amersham，比活性2000Ci/mmol)。将未标记细胞因子加入到100ml搅拌过的血浆中，至指定浓度，具体讲，TNF-α为500pg/ml、IL-1β为20ng/ml、IL-6为50ng/ml、IL-8为20ng/ml。充分搅拌之后，用γ-闪烁计数仪记数0.2ml含有细胞因子的血浆。用图1形式的无菌单向回路分别分析每一种细胞因子，其中支路8是不存在的，而过滤器5包括按上述方法制备的(树脂或碳)柱。所用回路的基准体积装填、预洗涤，靠重力装入由聚苯乙烯管形成的小柱(长度为2.5cm，内径为1.2cm)内，总重量为1.3g。将树脂充分洗涤，并贮存于浓度为50％的甲醇和水的溶液中。就在灌注之前，用20倍于柱体积(20体积)的无菌生理盐水溶液洗涤所形成的柱，然后调温与人血浆(10ml)一致，接着分离标准人血浆，其中含有2-2.5μCi(微居里)的125I标记的细胞因子，如TNF-α(NEN-Du Pont，比活性59.2μCi/mg)、IL-1β(Amersham，比活性3000 Ci/mmol)、IL-6(Amersham，比活性1100 Ci/mmol)以及IL-8(Amersham，比活性2000Ci/mmol)。将未标记细胞因子加入到100ml搅拌过的血浆中，至指定浓度，具体讲，TNF-α为500pg/ml、IL-1β为20ng/ml、IL-6为50ng/ml、IL-8为20ng/ml。充分搅抖之后，用γ-闪烁计数仪记数0.2ml含有细胞因子的血浆。用图1形式的无菌单向回路分别分析每一种细胞因子，其中支路8是不存在的，而过滤器5包括按上述方法制备的(树脂或碳)柱。所用回路的基准体积为5ml，经过试验柱的血液流速保持在30ml/小时。每30分钟从试验柱下游取出0.2ml等分试样，血浆试样中的游离碘的数量用高氯酸法和用上层清液放射性计数进行测量。当从柱下游取出试样中放射性每分钟周数(c.p.m.)等于基样的放射性每分钟周数时，便停止灌注，这时，就说明柱已经饱和。然后将柱与回路分开，用20体积的等渗盐水溶液进行洗涤，并使之打开。将等分试样的每种试验吸附产物放置在滤纸上干燥，秤重、并置于管中进行计数。根据下列公式，以1g的每种吸附产物为限，用ng细胞因子表示试验结果(1)[(cpm限/cpm基准)/秤量试样mg]×100其结果如表1所示。
表1
<p>实施例2在玻璃试管环流内进行过滤/吸附将于ACD中抽取的400ml鲜人血液加入到5mg脂多糖(LPS)中，于37℃下保温4小时，然后将血液进行再钙化处理，加入到5U/ml肝素(Liquemin，LaRoche，Basle，Switzerland)，如图1所示按闭合回路式进行循环。将超滤器(BELLCO S.p.A.HFT04 0.5m2聚砜膜)连接到含有抗LPS血液之储存器4的血液侧间隔区，将超滤液沿着装有130g活性碳或树脂的单一吸附柱11或12的支路8供入，经过吸附柱后，使超滤液循环进入储存器4内，主回路中的血液流速控制在200ml/分钟，每次试验的循环时间为120分钟。按不同的时间间隔即在0.5、15、30、60、90及120分钟后，从超滤器(标作“血液量”)上游取出用于测定IL-1β、TNF-α、IL-8及受体拮抗物IL-1(IL-1ra)的试样，再按0、15、30、90及120分钟的时间间隔从吸附柱(15点)上、下游再取出试样。立刻于4℃下以1000rpm离心分离血样20分钟，将回收到的血浆贮存于-80℃下，直到用商用酶联免疫吸附测定(ELISA)用具试验测定出IL-1β、TNF-α、IL-8及受体拮抗物IL-1(IL-1ra)为止。试验结果如图2至图7所示。如图所示，该类树脂与活性碳(表1)比较不仅具有较好的总细胞因子吸附作用，而且还具有更迅速地从血液电除去高细胞因子含量的能力，正如所示出的高除去百分比及极好的清除量。但是，如图2及图3所示，单独使用活性碳也具有很好的从超滤液中除去细胞因子的作用，这只限于除去TNF-α，而大部分细胞因子则被树脂类(除去量为90％，清除量为24)所吸附(图5)。因此，本发明的最好应用方式是含有双超滤液吸附，首先用活性碳吸附，然后用树脂吸附，而且根据所要吸附的各种细胞因子的量，可以选择特种树脂(或者不同类树脂的混合物)，以确保吸附柱11及12有足够长时间的使用寿命。
权利要求
1.一种净化含有毒素及细胞因子之血流的方法，该方法包括超滤或血浆过滤步骤、超滤液或血浆滤液净化步骤及补偿步骤，在该补偿步骤中，将净化后的超滤液或血浆滤液加入到从超滤器或血浆过滤器下游回收的洗脱液中，本发明特征在于进行超滤或血浆过滤步骤，使要除去的细胞因子流进超滤液或血浆滤液中，通过吸附及通过吸附柱供入超滤液或血浆滤液，进行超滤液或血浆滤液净化步骤，吸附柱中的吸附材料含有未涂敷的活性碳和/或疏水或离子交换聚苯乙烯树脂。
2.一种根据权利要求1所述的方法，其特征在于使超滤液或血浆滤液经过双吸附步骤，首先经过活性碳吸附柱吸附，然后经过填充有所说树脂类的吸附柱吸附。
3.一种根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所说的疏水树脂选自于苯乙烯异丁烯酸及共聚物二乙烯基苯聚苯乙烯类树脂。
4.一种根据上述权利要求中任何一个所述的方法，其特征在于所说的树脂类选自于合成碳质类树脂。
5.一种根据上述权利要求中任何一个所述的方法，其特征在于采用疏水合成树脂类如AMBERLITETM、AMBERCHROMTM或AMBERSORBTM。
6.一种根据上述权利要求中任何一个所述的方法，其特征在于所说的树脂类符合美国FDA标准nr21CFR173.65。
7.一种根据上述权利要求中任何一个所述的方法，其特征在于所说的树脂类具有颗粒大小为20-350微米，较好的是10-100或250-350微米，孔隙度为100-300埃。
8.一种用于净化血液一种净化血液、尤其是治疗患有急性器官衰竭患者的装置，该装置包括净化血流用的切入供料回路、与切入供料回路串联的超滤器或血浆滤器、用于从所说的超滤器或血浆滤器中收集超滤液或血浆滤液的收集回路、该收集回路与血浆或超滤器具有分路连接、以及与收集回路进行液动串联的过滤装置，其特征在于所说的血浆滤器或超滤器具有进入存在所说血流中任何细胞因子之超滤液或血浆滤液的通道，所说的过滤装置包括填充有活性碳的第一吸附过滤器，以及填充有疏水或离子交换聚苯乙烯树脂的位于第一过滤器下游的第二吸附过滤器。
9.一种根据权利要求8所述的装置，其特征在于第二过滤器中的树脂为网状芳香族聚合物、大网状和/或大孔树脂如AMBERLITETM或AMBERCHROMTM、或合成碳质树脂如AMBERSORBTM。
10.一种根据权利要求8或9所述的装置，其特征在于所说的树脂类具有颗粒大小为20-350微米，较好的是10-100或250-350微米，孔隙度为100-300埃。
11.使用与超滤器或血浆过滤器相连的吸附过滤器，能够迅速、高效地除去血流中的细胞因子，其特征在于使用超滤器或血浆过滤器，使存在于血流中的大部分细胞因子进入与由超滤器或血浆过滤器血流对流而产生的超滤液或血浆滤液中，而且，其特征还在于将超滤液或血浆滤液供入吸附过滤器中，在该吸附过滤器中，吸附材料含有未涂覆的活性碳、疏水或离子交换聚苯乙烯树脂或它们的混合物。
12.根据权利要求11所述的使用，其特征在于所述的疏水树脂类选自于苯乙烯异丁烯酸及聚合物二乙烯基苯聚苯乙烯类树脂。
13.根据权利要求11或12所述的使用，其特征在于所述的离子交换树脂选自于合成碳质类树脂。
14.根据权利要求11-13所述的任何一种使用，其特征在于疏水合成树脂类为AMBERLITETM、AMBERCHROMTM或AMBERSORBTM型。
15.根据权利要求11-14所述的任何一种使用，其特征在于所述的树脂类具有颗粒大小为20-350微米，较好的为10-100或250-350微米，孔隙度为100-300埃。
全文摘要
本发明提供进行有效除去存在于急性病患者体内细胞因子的技术，首先使要净化的血液经过超滤或血浆过滤，然后将超滤液或血浆滤液供入吸附柱内，位于吸附柱内的吸附材料是未涂敷的活性炭和/或疏水或离子交换苯乙烯树脂如AMBERLITE
文档编号A61M1/34GK1159951SQ9710070
公开日1997年9月24日 申请日期1997年2月6日 优先权日1996年2月6日
发明者玛丽·卢·拉腾, 奇罗·特塔 申请人:贝尔科公开有限公司