靶向突变体α-螺旋束细胞因子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及经修饰的α-螺旋束细胞因子，其具有与α-螺旋束细胞因子受体降低的活性，其中所述α-螺旋束细胞因子被特异地递送至靶细胞。优选地，所述α-螺旋束细胞因子是突变体，更优选地是突变体干扰素，其对干扰素受体具有低亲和力，其中所述突变体干扰素被特异地递送至靶细胞。通过将该经修饰的α-螺旋束细胞因子与靶向部分(优选抗体)融合来实现靶向。本发明还涉及使用这样的靶向修饰的α-螺旋束细胞因子治疗疾病。优选实施方案是使用靶向突变体干扰素治疗疾病，优选病毒性疾病和肿瘤。
【专利说明】靶向突变体α-螺旋束细胞因子
【技术领域】
[0001] 本发明涉及经修饰的α-螺旋束细胞因子，其具有通过α-螺旋束细胞因子受体 的降低的活性，其中所述α-螺旋束细胞因子被特异地递送至靶细胞。优选地，所述螺 旋束细胞因子是突变体，更优选地是突变体干扰素，其对千扰素受体具有低亲和力，其中所 述突变体干扰素被特异地递送至靶细胞。通过将经修饰的 α-螺旋束细胞因子与靶向部分 (优选抗体）融合来实现靶向。本发明还涉及使用这样的经靶向修饰的α_螺旋束细胞因 子来治疗疾病。优选实施方案是使用靶向突变体干扰素治疗疾病，优选病毒性疾病和肿瘤。
【背景技术】
[0002] 细胞因子是一类在细胞间通讯中起重要作用的小分子蛋白质。可以基于其结构将 细胞因子分类，最大的一类是四股α-螺旋束家族。基于受体的使用，可以将该家族进一步 分为干扰素（IFN)和白细胞介素（IL)-2, -3, -10和-12亚家族。α螺旋束细胞因子作为 潜在的用于治疗人类疾病的生物药具有重要性；非限制性例子有，红细胞生成素被用于治 疗贫血症或红细胞缺乏症，生长激素（somatotropin)用于治疗生长素缺乏症，以及白细胞 介素 -2用于治疗癌症。
[0003] 在α -螺旋束细胞因 子中，I型IFNs属于具有重要生物学功能的细胞因子家族。 在人类中，有17种不同的I型IFNs(13a，β，ε，κ，ω)，它们通过遍在表达的、由IFNAR1 和IFNAR2两条链组成的细胞表面受体来传递信号。IFN受体复合物的组装起始几个信号转 导路径的激活，依据细胞类型，这些路径改变细胞的分化和/或功能。
[0004] 通过对几乎所有细胞类型起作用，I型IFN可以阻止生产性病毒感染。此外，它还 表现出显著的抗血管生成和促凋亡效果。I型IFNs也深度参与先天性和获得性免疫的几 个功能的调节以及骨稳态。它特别是在树突细胞和破骨细胞的激活/分化中起作用。事实 上，I型IFN系统对哺乳动物的健康至关重要。
[0005] 在小鼠中的临床前研究已确立了 I型IFN治疗病毒或肿瘤疾病的显著功效。值 得注意的是，研究发现，通过IFN治疗治愈实验性肿瘤的小鼠可免疫抵抗最初的肿瘤，表明 IFN不仅引起肿瘤排除过程，而且也打破对肿瘤的免疫耐受。基于这些研究，IFN α被批准 临床用于治疗病毒性感染和癌症。更为近来，发现ΙΡΝβ在复发缓解型多发性硬化中有效， 并也被批准用于该病况。不幸的是，常常发现IFN的临床功效令人失望，如今，其它治疗策 略例如特异的抗病毒化合物、化疗和单克隆抗体，如果可能的话，已经在很大程度上取代了 IFN的广谱应用。如今，IFN仅是HBV和HCV慢性感染和有限种类肿瘤的一线治疗选择。
[0006] 由于显著的全身性毒性和副作用，包括类流感综合症、抑郁症、肝中毒、自身免疫 疾病、甲状腺功能不全和体重下降，I型IFN在临床实践中的功效受限于无效的给药。由此， 非常值得将IFN活性仅靶向应该被IFN治疗的（例如，感染的器官或肿瘤团块）或应该被 IFN激活的（例如，免疫细胞子集）细胞群体。
[0007] 为了解决或限制细胞因子的全身性毒性，有人提议通过抗体-细胞因子融合蛋白 进行细胞因子的特异性靶向（Ortiz-Sanchez等，2008)。Rossi等（2009)详细公开了 CD20 靶向的四聚体IFNa及其在B细胞淋巴瘤治疗中的使用。然而，融合体保留了其生物学活 性，并甚至比商业的聚乙二醇化IFN活性更强，这意味着在人类治疗中不需要的副作用将 仍然会存在，并甚至更严重。本专利申请公开了作为靶向部分的抗体与野生型IFN、以及与 突变的IFN的融合体。然而，据说IFN片段应该保留其至少80%水平或甚至比野生型IFN 更高水平的内源活性。同样，在该情况下，融合体保留不需要的野生型的副作用。
[0008] 令人惊奇的是，我们发现，可以将经修饰的、对a -螺旋束细胞因子受体具有降低 的亲和力和由此具有降低的特异生物活性的a -螺旋束细胞因子与靶向部分融合，其中针 对靶细胞，生物活性被恢复，但针对不被构建体靶向的细胞，生物活性不被恢复。这样的构 建体具有技术优势，其具有较小副作用，特别是较低的全身性毒性，而保留了对抗靶细胞的 生物活性。
【发明内容】
[0009] 本发明的第一个方面是靶向构建体，其包含经修饰的a-螺旋束细胞因子和靶向 部分，其中该细胞因子的特征是对a-螺旋束细胞因子受体具有降低的亲和力。a-螺旋 束细胞因子为本领域技术人员所知，其包括但不限于心肌营养素样细胞因子NNT- 1，睫状神 经营养因子，巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞集落刺激因 子，心肌营养素 -1，红细胞生成素，FLT3配体，生长激素，干扰素 a_l，2,4,5,6,7,8,10,13， 14，16，17,21，干扰素 0，干扰素 ￥，干扰素 1^,干扰素 8，干扰素 1：1，干扰素〇-1，白细胞 介素 2, 3,4, 5,6, 7,9,10,11，12 a 链，13,15,19, 20, 21，22, 23, 24, 26,27,28A，29,31，干细 胞因子，瘦蛋白，白血病抑制因子，制瘤素 M，催乳素以及促血小板生成素。关于a-螺旋束 细胞因子的综述，见Conklin (2004)。经修饰的a -螺旋束细胞因子是指，该a -螺旋束细 胞因子已被改变从而具有改变了的对受体的亲和力，最终结果是相比于与受体正常结合的 内源野生型细胞因子，经修饰的a -螺旋束细胞因子对受体具有降低的亲和力和由此降低 的生物学活性。这样的修饰可以是降低正常野生型细胞因子的活性的修饰，或可以是增加 同源的非内源a-螺旋束细胞因子的亲和力（例如但不限于小鼠 a-螺旋束细胞因子，其 与人a-螺旋束细胞因子受体结合）。修饰可以是本领域技术人员知晓的任何降低或增加 活性的修饰，包括但不限于化学和/或酶学修饰，例如聚乙二醇化和糖基化、与其它蛋白质 融合、以及突变。优选地，这样的修饰是突变，更优选地，修饰是降低 a_螺旋束细胞因子的 亲和力的突变。本文中，降低的亲和力和由此降低的生物学活性是指，相比于与受体正常结 合的a-螺旋束细胞因子，经修饰的a-螺旋束细胞因子具有低于该a-螺旋束细胞因子 生物学活性的70%、更优选低于该a -螺旋束细胞因子生物学活性的60%、更优选低于该 a -螺旋束细胞因子生物学活性的50%、更优选低于该a -螺旋束细胞因子生物学活性的 40%、更优选低于该a -螺旋束细胞因子生物学活性的30%、更优选低于该a -螺旋束细胞 因子生物学活性的20%、最优选低于该a -螺旋束细胞因子生物学活性的10%的生物学活 性。优选地，经修饰的a-螺旋束细胞因子是野生型a-螺旋束细胞因子的突变体，其活性 与野生型a-螺旋束细胞因子相比较。可以通过本领域技术人员知晓的任何方法测定亲和 力和/或活性。优选地，通过测定和定量STAT磷酸化，测量活性。
[0010] 本发明的一个优选实施方案是靶向构建体，所述构建体包含突变体IFN和靶向部 分，该突变体IFN的特征是具有与IFN受体降低的亲和力。IFN可以是任何IFN，包括但不 限于IFNa、IFN3和ω。本文中使用的突变体IFN可以是任何具有与受体较低的亲和力 和由此较低的抗增殖活性和/或较低的抗病毒活性的突变体形式。事实上，如Piehler等 (2000)所揭示的，相对亲和力与相对抗增殖活性以及与相对抗病毒活性直接相关。可以通 过如Brecht (1993)等所描述的在流过条件（flow through conditions)下，以反射干涉光 谱法测定，相比于野生型IFN对受体的亲和力，突变体IFN对受体的亲和力。突变体可以是 点突变体、缺失或插入突变体，或它们的组合。优选地，通过活性诱变（例如，但不限于通过 聚合酶链式反应扩增进行定点诱变），获得所述突变体IFN。优选地，所述突变体IFN具有 低于野生型IFN的生物学活性70%、更优选低于野生型IFN的生物学活性60%、更优选低 于野生型IFN的生物学活性50%、更优选低于野生型IFN的生物学活性40%、更优选低于 野生型IFN的生物学活性30%、更优选低于野生型IFN的生物学活性20%、最优选低于野 生型的生物学活性10%的生物学活性，其中所述野生型IFN为突变体IFN的来源IFN(即， 其编码序列被突变来获得突变体IFN的野生型IFN)。IFN的突变体形式为本领域技术人 员所知晓。作为一个非限定性例子，Piehler等（2000)中列出了 IFNa2突变体。优选地， 所述IFN是I型IFN。更优选地，所述突变体是IFN a，更优选地，所述突变体是IFN a 2。 更优选地，所述IFN a 2突变体在区域144-154、优选在位置148,149和/或153的一个或 多个氨基酸上被突变，更优选地，所述IFN a 2突变体选自IFN a 2L153A，IFN a 2R149A和 IFN a 2M148A。最优选地，所述突变体选自IFN a 2L153A和IFN a 2R149A。
[0011] 优选地，所述受体是IFNAR2。
[0012] 优选地，所述靶向部分靶向在表达IFN受体的细胞，优选表达IFNAR2的细胞上表 达的标记物。在一个优选实施方案中，所述靶向部分针对组织特异性标记物。优选地，所述 组织是癌症组织。所述癌症可以是任何癌症，包括但不限于B细胞淋巴癌、肺癌、乳腺癌、结 肠直肠癌或前列腺癌。在另一个优选实施方案中，所述靶向部分针对选自Her2和CD20的 标记物。在另一个优选实施方案中，所述靶向部分针对病毒感染性细胞所特异的细胞表面 标记物，例如但不限于流感M2蛋白、LMP1和EBV蛋白。在另一个实施方案中，所述靶向部 分针对破骨细胞标记物，例如DC-STAMP或RANK。实际上，已知IFN-β在骨稳态中起重要作 用，其受共表达RANK和IFNAR的细胞的调节（Abraham等，2009)。在另一个实施方案中，所 述靶向部分针对在IFN可以调节活性和/或分化的免疫细胞类型的表面上特异表达的标记 物。一个实例是在树突细胞和某些免疫细胞上特异表达的标记物TOL2。
[0013] 如本文中使用的，靶向部分可以是本领域技术人员知晓的作为特异性结合蛋白 复合体的一部分的蛋白质，或任何特异性结合蛋白或蛋白片段。其包括但不限于碳水化 合物结合结构域（CBD) (Blake等，2006)、植物凝血素结合蛋白、重链抗体（hcAb)、单结构 域抗体（sdAb)、小分子抗体（minibodies) (Tramontane)等，1994)、§它源重链抗体的可变 结构域（VHH)、新抗原受体的可变结构域（VNAR)、亲和体（affibodies) (Nygren等，2〇〇8)、 alphabodies(W02010066740)、经设计的锚蛋白重复序列结构域（DARPins) (Stumpp等， 2008)、anticalins(Skerra 等，2008)、knottins(Kolmar 等，2008)和工程化 CH2 结构域（纳 米抗体；Dimitrov,2009)。优选地，所述靶向部分由单个多肽链组成，并且不被翻译后修饰。 更优选地，所述IE向部分是纳米抗体（nanobody)。
[0014] 靶向构建体可以是本领域技术人员知晓的任何靶向构建体。作为一个非限定性实 例，靶向部分可以与突变体干扰素化学连接，或其可以是重组融合蛋白。优选地，所述靶向 构建体是重组融合蛋白。靶向部分可以直接与突变体IFN融合，或其可以借助接头片段融 合。可以在突变的IFN的氨基末端或羧基末端融合靶向部分；优选地，所述靶向部分在突变 的IFN分子的最氨基末端融合。
[0015] 本发明的另一个方面是根据本发明的靶向构建体用作药物。
[0016] 本发明的另一个方面是根据本发明的靶向构建体在制造治疗癌症的药物中的用 途。
[0017] 本发明的另一个方面是根据本发明的靶向构建体在制造治疗病毒疾病的药物中 的用途。作为非限定性实例，所述病毒疾病可以是HIV感染、HBV感染或HCV感染。
[0018] 本发明的另一个方面是根据本发明的靶向构建体用于治疗癌症。
[0019] 本发明的另一个方面是根据本发明的靶向构建体用于治疗病毒疾病。作为非限定 性实例，所述病毒疾病可以是HIV感染、HBV感染或HCV感染。
[0020] 本发明的另一个方面是根据本发明的靶向构建体用于治疗涉及骨降解的疾病，例 如但不限于骨质疏松。
[0021] 本发明的另一个方面是药物组合物，其包含根据本发明的靶向构建体和合适的赋 形剂。本领域技术人员清楚，这样的药物组合物可以单独使用，或用于组合治疗，例如但不 限于与化疗组合。
[0022] 附图简述
[0023]图1 :表示纳米抗体-IFN融合蛋白的结构元件。
[0024] 图2 :所示IFN制剂在HL116细胞（图A和B)或表达鼠瘦蛋白受体（mLR)的HL116 细胞（图C和D)中诱导的萤火虫萤光素酶活性。图A和C与图B和D分别在两个独立实 验中产生。因此，仅可以进行竖向比较（图A对图C，或图B对图D)。
[0025]图3 :在表达痩蛋白受体和IFN诱导的莖火虫莖光素酶的细胞与表达IFN诱导的 海肾莖光素酶但缺乏痩蛋白受体的细胞的1 :1的共培养物中，纳米抗体-IFNa2R149A或 IFNa 2(7PM)诱导的海肾（Renilla)(浅灰色）和莖火虫（深灰色）萤光素酶活性。蛮光素 酶活性表示为3nM IFNa 2诱导的莖光素酶活性的百分比。
[0026] 图4 :经纯化的靶向mLR的构建体的活性：A.对其在表达靶标的细胞（HL116-mLR) 或缺乏靶标的细胞（HL116)上的特异性活性的定量。B.不同构建体靶向效率的计算。 [0027] 图5 :构建体4-11-IFNA2-R149A在存在和缺乏未缀合的痩蛋白受体结合性纳米抗 体时的活性。将表达mLR的HL116细胞，在存在或缺乏（对照）100倍摩尔过量的游离4-11 纳米抗体的情况下，与分别在其相应EC50浓度的IFN- a 2 (IFNA2)或融合至纳米抗体4-11 的IFNA2_R149A (纳米抗体-IFNA2-R149A)孵育6小时。
[0028] 图6 :利用痩蛋白结合纳米抗体4-10,实行突变体IFN的靶向。
[0029] 图 7 :在存在抗 IFNAR1 单克隆抗体 64G12(Benoit 等· J. Immunol. 150， 7〇7-716·1993)或抗 IFNAR2 单克隆抗体 MMHAR2(PBL Interferon Source)时，纳米抗 体-IFNa 2R149A在表达mLR的HL116细胞中诱导的萤火虫萤光素酶活性。
[0030] 图8 :4-11-IFNA2-R149A靶向表达mLR的细胞的特异性。A :对于亲本IFNA2(左上 图）或4-11-IFNA2-R149AC左下图），EMCV在HL116细胞（深灰色符号）或HL116-mLR细 胞（浅灰色符号）上的致细胞病变效应。B :上图：计算的抗病毒活性EC50 ;下图：计算的靶 向效率。
[0031] 图9 :IFNa 2(图A)和纳米抗体-iFNa 2R149A(2R5A ;图B)对在其表面表达不同 数量的Her2分子（分别为10.9 X 1〇3和478 X 103)的BXPC3和BT474细胞系的特异性活 性（EC50)。图A的纵坐标比例与图B的纵坐标比例不可比。
[0032] 图10 :1R59B-IFNA2-Q124R对表达人Her2的小鼠细胞的靶向。在有或无 Her2表 达的BTG9A细胞中〇ASL2mRNA表达的定量。
[0033] 图11 :使用单链抗体将突变体IFNA2靶向表达人Her2的小鼠细胞。在有或无 Her2 表达的BTG9A细胞中ISG15mRNA表达的定量。
[0034] 图I2 :Her2磷酸化激活的控制：泳道3至6 :在使用构建体1R59B-IFNA2_Q124R以 不同浓度（泳道3至5为200pM,泳道6为2nM)和时间（泳道3 :5分钟，泳道4和6 :10分 钟，泳道5 :30分钟）处理的表达人Her2的BTG9A细胞的提取物中无磷酸化的Her2。
[0035] 泳道7和8 :用于检测人BT474细胞系中磷酸化Her2的对照。
[0036] 泳道1 :BTG9A细胞的提取物。泳道2 :表达人Her2的BTG9A细胞的提取物。
[0037] 图13 :抗ro-L2122-IFNA2-Q124R靶向内源表达KI-L2的小鼠原代细胞。活性测量 为STAT磷酸化。浅灰色区域代表TO-L2阴性细胞群体；深灰色区域代表PD-L 2阳性群体。
[0038] 图14 :122-IFNA2-Q124R体内靶向表达PD-L2的细胞。以PBS、对照构建体（与突 变体IFNA2-Q124R融合的抗GFP纳米抗体，标示为对照）或靶向突变体IFN(靶向至H)-L 2， NM22-IFN2-Q124R，标示为122-Q124R)对小鼠进行腹膜内（IP)或静脉内（IV)注射。浅灰 色区域代表PD-L2阴性细胞群体；深灰色区域代表PD-L2阳性群体。
[0039] 图15 :在小鼠中静脉注射122-IFN-Q124R后的剂量反应曲线。浅灰色区域代表 PD-L2阴性细胞群体；深灰色区域代表PD-L2阳性群体。
[0040] 图16 :靶向突变体痩蛋白诱导的瘦蛋白依赖的生长：突变体痩蛋白活性的丢失可 以在表达人TNFR1的Ba/F3细胞中救回。上图：使用H6-瘦蛋白构建体的实验；下图：使用 mleptin构建体的实验。H6表示his标签（6xhis)。
[0041] 图17 :革E向瘦蛋白构建体的结构。 实施例
[0042] 实施例的材料和方法
[0043] 纳米抗体和ScFv
[0044] 抗鼠痩蛋白受体的纳米抗体4-11描述于Zabeau等（2〇12)中和专利W0 2006/053883中。将其编码序列克隆到哺乳动物表达载体pMEI7(Takebe等，1988)中，与 Slgk引导肽、HA标签和白蛋白融合。质粒名称：pMET7SlgK-HA-4. 11-白蛋白。
[0045] 纳米抗体4-10也描述于Zabeau等（2012)中。
[0046] 抗Her2纳米抗体1R59B和2R5A描述于Vaneycken等（2011)中。将它们在pMET7 载体中与人IFNA2-Q124R和与人IFNA2-R149A融合。通过转染293T细胞产生融合蛋白。
[0047] 抗FD-L2纳米抗体122来自Johan Grooten(VIB)。将其在pMET7载体中与人 IFNA2-Q124R融合。通过转染293T细胞产生融合蛋白，使用HisPur Ni-NTA纯化试剂盒 (Pierce，Thermo Scientific)进行纯化。
[0048] 抗 TNF 纳米抗体获自 Claude Libert (VIB)。
[0049] 抗 Her2ScFv 获自 Andrea Plllckthun ('ν----?等，1"8)。将其在 ρΜΕ?7 载体中与 人IFNA2-Q124R融合。通过转染293T细胞产生融合蛋白。
[0050] 抗 GFP 对照纳米抗体获自 Katrien Van Impe (University Ghent)。
[0051] 干扰素
[0052] IFN α 2和IFNAR2亲和力分别降低10和100倍的突变体L153A与R149A已描述于 Roisman等（2001)中。将IFN编码序列克隆到ρΤ3Τ7载体（Stratagene)中，与ybbR标签 融合。质粒名称：pT 7T3ybbR-IFNa2, pT7T3ybbR-IFNa2-Ll53A，pT7T3ybbR-IFNa2_R149A。
[0053] 人IFNA2Q124R具有与鼠 IFNAR1链的高亲和力和与鼠 IFNAR2链的低亲和力 (Weber 等，1987)。
[0054] 纳米抗体-IFN融合构建体
[0055] 使用来自 Roche Diagnostics 的扩展高保真（Expand High Fidelity) PCR 体系， 和以下引物：正向：5' GGGGGGTCCGGACCATCACCATCACCATCACCATCACCATCACCCTGCTTCTCCCGCC TCCCCAGCATCACCTGCCAGCCCAGCMGTGATAGCCTGGMTTTATTGC3'，反向：5' CGTCTAGATCATTCCTT ACTTCTTAMC3'，从相应的pT3T7ybbR IFNa2质粒中，通过PCR合成IFN α 2,野生型和L153A 与R149A编码序列。该PCR在IFN的氨基最末端引入His标签和一系列5个脯氨酸-丙氨 酸-丝氨酸（PAS)重复。以BspEI和Xbal消化PCR产物，克隆到经BspEI-Xbal消化过的 pMET7 SlgK-HA-4. 11-白蛋白载体中，以得到 pMET7 SlgK-HA-4. U-His-PAS-ybbr-IFNA2， pMET7 SlgK-HA-4. 11-His-PAS-ybbr-IFNA2_L153A和pMET7 SlgK-HA-4. 11-His-PAS-ybbr-IFNA2-R149A。
[0056] 纳米抗体-IFN融合蛋白的生产
[0057] 在补加有10 % FCS的DMEM中生长HEK293T细胞。使用 lipofectamin(Invitrogen)，以 pMET7 SlgK-HA-4· ll-His-PAS-ybbr_IFNA2，pMET7 SlgK-HA-4. ll-His-PAS-ybbr-IFNA2-L153A，pMET7 SlgK-HA-4· ll-His-PAS-ybbr-IFNA2-R149A， pMET7SlgK-HA-2R5A-His-PAS-ybbr-IFNA2-R149A，pMET7SlgK-HA-lR59B-His-PAS-ybbr-IFNA2-Q124R,pMET7 SlgK-HA-4D5-His-PAS-ybbr-IFNA2-Q124R或pMET7 SlgK-HA-122-His -PAS-ybbr-IFNA2-Q124R进行细胞转染。转染48小时后收获培养基，保存于-20°C。
[0058] 可选地，将编码不同纳米抗体-IFN融合体的编码序列亚克隆到杆状病毒转移质 粒pBAC_3(Novagen)中。使用BacVector试剂盒（Novagen)通过昆虫细胞生产蛋白质，使 用HisPur Ni-NTA纯化试剂盒（Pierce, Thermo Scientific)和凝胶过滤将蛋白质纯化至均 质。通过在280nm处的吸收值测量蛋白质浓度。
[0059] IFN受体细胞系
[0060] HL116克隆（Uz6等· 1994)来自人HT1080细胞系。其包含由IFN诱导性6-16 启动子控制的蛮火虫萤光素酶基因。以编码鼠瘦蛋白受体的短同种型的表达载体（ΡΜΕΠ mLRsh_FLAG，Eyckerman 等，1999)和 pSV2neo (Southern 和 Berg 1982)共转染 HL116 细胞。 在含G418的培养基中分离稳定转染的克隆。在使用来自R&D的生物素化抗小鼠瘦蛋白受 体抗体BAF497和链霉亲和素 -APC (BD bioscience)，通过FACS分析鼠瘦蛋白受体的表面表 达水平后，选择克隆10。
[0061] 用 p6-16-RL --由 IFN 诱导性 6-16 启动子（来自 pl· 8gpt-5, Pellegrini 等· 1989)控制的编码海肾萤光素酶的质粒（来自pRL-null，Promega)、pBB3(Bourachot 等.1982)和鲑精DNA(Sigma)共转染HT1080细胞。在含HAT的培养基中分离稳定的经转 染的克隆。根据IFN诱导下高水平的海肾萤光素酶活性诱导，选择克隆4。
[0062]人胰腺癌 BXPC3 (Tan 等，1明6 ;ATCC :CRL 1687)和乳腺癌 BT474 (Lasfargues 等， 1979 ;ATCC :HTB-20)细胞系获自ATCC。小鼠 BTG9A细胞描述于υζ?等（1990)中。
[0063] 萤光素酶活性的测量
[0064] 通过定量HL116细胞和表达mLR的HL116克隆10中诱导的萤光素酶活性来测量 IFN特异性活性。以GraphPad Prism软件，使用非线性数据回归，计算EC50。
[0065]在6小时的IFN刺激后，使用来自Promega的萤火虫萤光素酶检测系统或双萤光 素酶报告者检测系统，在Berthold centro LB9601uminometer上测定蛮光素酶活性。
[0066]定量 RT-PCR
[0067] 通过RT-PCR，相对于GAPDH或β -肌动蛋白，定量干扰素诱导性基因6-16的表达。 以靶向或对照IFN处理细胞4小时。以Rneasy柱（Qiagen)纯化总RNA。以随机引物引导， 使用Moloney鼠白血病毒反转录酶（Invitrogen)进行反转录。如Coccia等（2004)中描 述，使用Light Cycler进行定量实时PCR(qRT-PCR)。
[0068] 对于Her2,通过定量RT-PCR，使用Light Cycler(Roche)和以下引物：〇ASL2正向： CAC-GAC-TGT-AGG-CCC-CAG-CGA ;0ASL2 反向：AGC-AGC-TGT-CTC-TCC-CCT-CCG ; β 肌动蛋白 正向：AGA-GGG-AAA-TCG-TGC-GTG-AC;0 肌动蛋白反向：CAA-TAG-TGA-TGA-CCT-GGC-CGT， 检测转染培养基中鼠 BTG9A和表达人Her2的BTG9A细胞，分析0ASL2基因的表 达相对于β-肌动蛋白基因的表达。以类似方法，使用相同的β-肌动蛋白引物 和以下引物 ISG15 引物：ISG15 正向：GAG-CTA-GAG-CCT-GCA-GCA-AT ;ISG15 反向： TTC-TGG-GCA-ATC-TGC-TTC-TT,测量 Her2 靶向细胞中 ISG 的表达。
[0069] 抗病毒检测
[0070] 使用EMC病毒进行抗病毒检测，按Stewart (1979)中的描述，对病毒复制依赖的致 细胞病变效应进行评分。
[0071] Her2磷酸化的测量
[0072] 以 200pM 至 2nM 的 1R59B-IFNA2-Q124R 处理表达人 Her2 的 BTG9A 细胞 10 至 30 分钟。在RIPA中裂解细胞，并在7% SDS-PAGE(40u g/泳道）后，于Odyssey Fc(Licor Bioscience)上，以 western 印迹进行分析。以抗 Her2Y-P 1248(Upstate#06_229)和山羊 抗兔第二抗体 IRDye 680(Licor Bioscience#926-32221)检测磷酸-Her2。
[0073] STAT1磷酸化的测量
[0074] 使用 STAT1-PY701 (PE) (BecktonDickinston#6l2564)，按生产商指导的 PhosFlow 技术，通过FACS检测在Y701上磷酸化的STAT1。
[0075] 靶向痩蛋白构建体
[0076] 耙向瘦蛋白构建体的序列示于图17中。所示LS6是指该氨基酸突变至S或N。
[0077] 实施例1 :纳米抗体-干扰素融合蛋白
[0078] 图1显示以IFNa 2野生型或L153A和R149A突变体构建的纳米抗体-IFN融合蛋 白的不意图。
[0079] 实施例2 :纳米抗体-IFN融合蛋白的IFN活性被靶向表达鼠痩蛋白受体的细胞
[0080] 检测HL116和表达鼠瘦蛋白受体的HL116-mLR克隆10细胞中带有IFNa 2WT, IFN a 2L153A或R149A的3个纳米抗体融合蛋白。在该检测系统中也检测单独的1FN a 2， 以检查两个细胞克隆在其IFN反应性上没有不同。确实，HL116和HLll6-mLR克隆10细胞 对该IFN都同等敏感（图2A和2C，黑色符号）。然而，相较于亲本HL116细胞，在表达痩蛋 白受体的细胞中，3个纳米抗体-IFN融合蛋白的IFN活性急剧增加（图2A与图2C比较，图 2B与图2D比较）。
[0081] 我们估计，表达痩蛋白受体的细胞比亲本HL116细胞分别对纳米抗体-IFN WT、 L153A和R149A敏感10、100和 1000 倍。由于IFN突变体L153A和R149A对IFNAR2的亲和 力分别为相对于WT的0. 1和0. 01，在由IFNAR2结合位点中的突变导致的活性丢失与纳米 抗体引起的靶向效率之间存在相关性。
[0082] 为了确定纳米抗体-IFN融合蛋白的IFN活性是否仅递送至表达纳米抗体靶标的 细胞或也递送至相邻的细胞，在HL116-mLR_克隆10和ΗΤ1〇8〇-6-16海肾萤光素酶克隆4 的共培养物中检测纳米抗体-IFNa 2R149A。两种细胞都将对IFN刺激作出反应而表达蛮光 素酶活性，但是表达纳米抗体靶标的细胞将显示出蛮火虫萤光素酶活性，而缺乏痩蛋白受 体的细胞将显示出海肾萤光素酶活性。选择纳米抗体-IFNa 2R14M蛋白的稀释度为1/30， 该稀释度在携带瘦蛋白受体的细胞中诱导最大反应而在缺乏纳米抗体靶标的细胞中诱导 最小反应（见图2B和D，黑色曲线）。图3清楚显示，在用纳米抗体-IFNa 2R149A刺激共 培养物后，海肾萤光素酶活性不被诱导，表明靶向IFN活性仅被递送至表达纳米抗体所识 别的抗原的细胞上。
[0083] 通过加入到表达或不表达用于靶向的鼠痩蛋白受体的HL116中，比较野生型和两 种突变体IFN(L153A and R149A)的活性，进一步说明靶向的效率。结果清楚地显示，构建 体被靶向时，突变体的活性更高，突变体的靶向效应比野生型的大（图4A和B)。
[0084] 为了证明靶向是纳米抗体特异的，在存在或缺乏（对照）100倍摩尔过量的游离 4-11纳米抗体时，用IFN-α 2(表示为IFNA2)或融合至纳米抗体4-11的IFNA2-R149A(Nan obody-IFNA2-R149A)以其各自的EC50浓度与表达mLR的HL116细胞孵育6小时。裂解细 胞，测量IFN诱导的萤光素酶活性。如图5所示，非祀向的IFN不被游离纳米抗体抑制，而 靶向构建体则被强烈抑制，表明了靶向的特异性效果。
[0085] 靶向至瘦蛋白受体独立于受体上的表位：使用与纳米抗体4-11识别受体上不同 的结构域的抗痩蛋白受体纳米抗体4-10 (Zabeau等，2012)，利用靶向突变体IFN可以得到 类似的激活（图6)。
[0086] 实施例3 :纳米抗体-IFN融合蛋白在表达瘦蛋白受体的细胞上的IFN活性通过两 条IFN受体链介导
[0087] 为了确定纳米抗体-IFN融合蛋白的IFN活性是否需要IFN受体的激活，以 抗IFNAR1或IFNAR2的中和抗体预处理表达鼠瘦蛋白受体的HL116细胞，然后以纳米抗 体-IFNA2-R149A融合蛋白进行刺激。测量IFN诱导的萤光素酶的活性。图7显示，抗IFNAR1 和抗IFNAR2中和抗体均抑制纳米抗体-IFNA2-R149A的IFN活性。
[0088] 实施例4 :4-ll-IFNA2-R149A在表达鼠瘦蛋白受体的细胞中靶标特异性的诱导抗 病毒活性
[0089] 抗病毒活性是IFN反应的一个部分，牵涉几个基因的表达。因此，在使用抗瘦蛋白 受体抗体4-11实现突变体R149A IFN靶向后，控制了抗病毒活性在表达mLR的细胞上。结 果概述于图8中。活性测量为有或无瘦蛋白受体表达时HL116细胞上的致细胞病变效应。 与HL116细胞相比，在表达瘦蛋白受体的细胞上检测的4-11-IFNA2-R149A纳米抗体-IFN 融合蛋白的特异性抗病毒活性高716倍。
[0090] 实施例5 :表达Her2的细胞上IFN活性的祀向
[0091] 为了证明以上概念不限于细胞因子受体靶向，我们使用抗Her2的纳米 抗体2R5A(Vaneycken等，2011)和突变体IFNa 2R149A构建了类似的融合蛋白 (2R5A-IFNA2-R149A)。在BXPC3 (胰腺癌，来自ATCC)和BT474 (乳腺癌，来自ATCC)细胞系 中检测了该分子，并针对6-16IFN诱导性基因的诱导，与IFN-a 2(IFNA2)的活性进行比较， 所述诱导通过定量RT-PCR相对于GAPDH来测定。BXPC3和BT474细胞系在其表面表达的 Her2分子的数量不同（分别为10. 9 X 103和478 X 103,如Gaborit等（2011)所报道）。
[0092] 图9显示了针对BXPC3和BT474细胞系上IFN可诱导基因 6-16的诱导，IFNA2活 性（图A)和2R5A-IFNA2-R149A活性（图B)的EC5Q测定。图A显示，BXPC3和BT474细胞 系表现出对IFN- α 2相同的敏感性。图B显示，2R5A-IFNA2-R149A纳米抗体-IFN融合蛋白 在比BXPC3表达多40倍的Her2分子的ΒΤ474细胞系上功效强得多。
[0093] 综上，可以将使I型IFN活性靶向表达特定细胞表面抗原的细胞的概念（如在表 达鼠瘦蛋白受体的人细胞上证实对），延伸至未转染的人细胞，其中所述未转染的人细胞以 在几类乳腺癌中天然发现的水平表达来自不同结构家族的另外细胞表面分子。
[0094] 实施例6 :突变体IFNA2-Q149R靶向表达人Her2的小鼠细胞
[0095] 使用纳米抗体1R59B在1R59B-IFNA2-Q124R中，将突变体人IFNA2Q149R靶向表达 人Her2的鼠细胞。IFNA2Q124R具有与鼠 IFNAR1链的高亲和力和与鼠 IFNAR2链的低亲和 力（Weber等，1987)。由IFN引起的诱导通过RT-QPCR测量为0ASL2信使RNA的表达。结 果示于图10中。在表达Her2的细胞中清楚地存在靶向特异性诱导，而在未经转染的BTG9A 细胞中没检测到显著表达。
[0096] 当使用抗Her2的Her2特异性ScFv实现突变体IFN Q124R的靶向时，也得到了类 似的结果。在该情况下，利用ISG15信使RNA表达，测量IFN诱导。结果示于图11中。同 样，在表达Her2的细胞中可见ISG15的特异性诱导，而突变体IFN对不表达Her2的细胞具 有很小的效应。
[0097] 实施例7 :构建体1R59B-IFNA2-Q124R不激活Her2的磷酸化 [0098] 为了检查Her2的靶向是否导致Her2激活，测定了靶向细胞中Her2的磷酸化。结 果示于图12中，其清楚地显示，在1R59B-IFNA2-Q124R靶向细胞中不能检测到磷酸化的 Her2,无论处理的浓度或时间为多少。
[0099] 实施例8 :抗PD-L2Nbl22_IFNA2-Q124R构建体活性被靶向表达TO-L2的小鼠原代 细胞
[0100] 自小鼠腹膜腔分离细胞，在体外以Nbl22-IFNA2-Q124R或天然mIFNa/β处理 30分钟。对细胞进行固定、渗透化、以抗f>D-L2 (APC) (BD#560086)和STAT1-PY701 (PE) (BD#612564)的抗体进行标记，通过FACS进行分析。
[0101] PD-L2阳性细胞群占小鼠腹膜腔中总细胞群的20%。
[0102]结果示于图Π 中。从该图清楚地得知，在未处理的细胞，或在非靶向的、鼠 IFN处 理的细胞中，对于表达和不表达PD-L2的细胞，STAT1-P的峰相符。此外，可见鼠 IFN处理明 显诱导STAH-P。然而，仅对于表达PD-L2的细胞，以靶向突变体IFN处理导致了 STAH-P 发生特异迁移。
[0103] 在类似实验中分析脾细胞的IFN反应时，得到相同的结果。PD-L2阳性细胞群占小 鼠脾中总细胞群的1 %，这表明小细胞群也可以被有效地靶向。
[0104] 实施例9 :体内注射122-IFNA2-Q124R构建体仅在表达H)-L2的细胞中诱导IFN反 应
[0105] 以 PBS、NM22-IFNA2-Q124R 或与 IFNA2-Q124R 融合的对照 Nb (抗 GFP)注射（IP 或IV)小鼠。注射后30分钟，杀死小鼠，通过以PBS冲洗腹膜腔，自腹膜腔回收细胞，固定 (PhosLow 固定缓冲液 I BD#557870)，渗透化（PhosFlow Perm缓冲液 III，BD#558050)，以抗 PD-L2(APC) (BD#560086)和 STAT1_PY701(PE) (BD#612564)抗体标记，通过 FACS 进行分析。 结果示于图14中。在以PBS或对照纳米抗体处理的PD-L2阳性和阴性细胞中，STAT1-P是 一致的。然而，当小鼠被注射靶向突变体IFN时，可见STAT1-P的明显诱导（仅在PDL2阳 性细胞群中）。
[0106] 作为对照，在i.v.注射了不同剂量天然小鼠 IFN(10 000,100 000或1000 000单 位）的小鼠中检查了 STAT1-P,在ro-L2阳性和ro-L2阴性细胞之间未能检测到STAT1-P的 差异。
[0107] 图15显示了静脉注射Nbl22-IFNA2-Q124R构建体后的类似剂量反应曲线。即使 在64ng的最低剂量时，在表达TO-L2的细胞中也可见STAH-P的迁移。
[0108] 实施例10 :使用截短的TNFa受体，将突变体痩蛋白靶向痩蛋白受体
[0109] Ba/F3细胞在生长上依赖于IL-3。在以mLR转染后，Ba/F3细胞也用痩蛋白增殖。 与其受体具有降低的亲和力的痩蛋白突变体在诱导和维持Ba/F3-mLR细胞增殖上功效较 低。瘦蛋白突变体L86S和突变体L86N在亲和力上分别具有中度和剧烈降低，由此诱导增 殖的能力分别中度和剧烈降低。
[0110] 以缺乏其胞内结构域的人TNFa受体l(hTNFRl)对Ba/F3-mLR细胞进行另外的转 染，引入非功能性受体，该非功能性受体能够作为膜结合胞外标记物起作用。
[0111] 由瘦蛋白和抗人TNFR1纳米抗体（在此为nb96)组成的嵌合蛋白将结合到携带 mLR的细胞和携带hTNFRl的细胞。具有瘦蛋白突变体L86S和L86N的嵌合蛋白对LR的亲 和力降低，但保留了其对hTNFRl的亲和力。
[0112] 通过以表达质粒瞬时转染Hek293T细胞来制备嵌合蛋白。以0.45 μ m滤器过滤上 清，系列稀释于96孔板中用于检测。以纯化的重组痩蛋白的系列稀释液作为参照。每个孔 室中3000至10000个细胞，4或5天后，通过以XTT染色测量增殖。测量450nm处的0D值。 对于使用不同瘦蛋白构建体（见图17)的两个实验，结果示于图16中。关于两个构建体， 对于突变体构建体可见hTNFR依赖的生长刺激，而hTNFR的表达不影响以wt (非靶向）瘦 蛋白处理的细胞的生长。从这些结果中可清楚得知，靶向可以补偿突变的负效应。
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【权利要求】
1. 靶向构建体，其包含经修饰的α-螺旋束细胞因子和靶向部分，其中所述经修饰的 α-螺旋束细胞因子的特征是与α-螺旋束细胞因子受体的亲和力降低。
2. 根据权利要求1的靶向构建体，其中所述经修饰的α-螺旋束细胞因子是突变体 螺旋束细胞因子。
3. 根据权利要求1或2的靶向构建体，其中所述靶向部分靶向在表达α-螺旋束细胞 因子受体的细胞上表达的标记物。
4. 根据权利要求2的靶向构建体，其中所述突变体α-螺旋束细胞因子是突变体干扰 素。
5. 根据权利要求4的靶向构建体，其中所述靶向部分靶向在表达干扰素受体的细胞上 表达的标记物。
6. 根据权利要求5的靶向构建体，其中所述干扰素受体是IFNAR2。
7. 根据任何上述权利要求的靶向构建体，其中所述靶向部分指向组织特异性标记物。
8. 根据权利要求1-6之任一的祀向构建体，其中所述祀向部分指向选自Her2、 DC-STAMP和CD20的标记物。
9. 根据权利要求1-6之任一的靶向构建体，其中所述靶向部分指向病毒感染性细胞所 特异的细胞表面标记物。
10. 根据任何上述权利要求的靶向构建体，其中所述靶向部分为抗体。
11. 根据权利要求10的靶向构建体，其中所述抗体为纳米抗体。
12. 根据权利要求4的靶向构建体，其中突变体干扰素为突变体干扰素 α 2。
13. 根据权利要求12的靶向构建体，其中所述突变体干扰素 α 2在区域144-154的一 个或多个氨基酸上被突变。
14. 根据权利要求12的靶向构建体，其中所述突变体干扰素 α 2选自IFNa 2L153A、 IFN a 2R149A 和 IFN a 2M148A。
15. 根据权利要求1-14之任一的靶向构建体用作药物。
16. 根据权利要求1-14之任一的祀向构建体用于治疗癌症。
17. 根据权利要求1-14之任一的祀向构建体用于治疗病毒性疾病。
18. 根据权利要求1-14之任一的靶向构建体用于治疗涉及骨降解的疾病。
19. 药物组合物，其包含根据权利要求1-14之任一的靶向构建体和合适的赋形剂。
【文档编号】C07K16/32GK104245734SQ201380015170
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年1月17日 优先权日:2012年1月20日
【发明者】J·德塔韦尼耶, G·乌兹, G·卡特龙, F·保罗, J·皮勒 申请人:非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所, 国立比利时根特大学, 科学研究国家中心, 蒙彼利埃第二大学, 蒙彼利埃大学区医疗中心, 奥斯纳布吕克大学