可治疗过敏性疾病的短、干扰性核糖核酸分子的制作方法

专利名称：：可治疗过敏性疾病的短、干扰性核糖核酸分子的制作方法
技术领域：
：本发明是与过敏性疾病的治疗有关。更特定的说，是提供可经由RAN干扰(RNAinterference,RNAi)来抑制气管发炎基因表达而达成治疗过敏性疾病目的的化合物、方法及组合物。
背景技术：
：过敏性疾病盛行f大部份的已开发及开发中国家内，它一般被界定为由第I型过敏症(亦即，由lgE抗体所介导的第I型免疫反应)所引起的功能性失衡(functionaldisturbances),且病征包括花粉热、支气管型气喘、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、过敏性休克等。过敏性疾病已成为当今文明社会中一项相当严重的问题，也造成庞大的社会支出。在各种过敏病征当中，最常见的就是过敏性鼻炎。在某些情况下，过敏甚至会导致患者死亡。依据中国国立台湾大学附设医院小儿科在1994年所做的一份统计数据显示，在台北市的学生当中，过敏性鼻炎的盛行率超过33%，此数字约为气喘的3倍(约10—11%)，且每年患病的人数仍在持续攀升，其中，又以幼儿患者的人数增加最快。因此，许多研究都致力于要找到一种解决方案，希望能减轻过敏性疾病患者的经济及生理负担。近年来，随着转录后-基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing)技术的发展与应用，特别是以RNA-千扰技术作为有效剔除有机体中特定基因的工具(MelloandConte，"RevealingtheworldofRNAinterference"，(2004)Nature431，338-342;andSchererandRossi,"Approachesforthesequence_specificknockdownofmRNA，,,(2003)NatureBiotechnology,21，1457—1465〉，目前已可禾廿用此工具藉由系统化地使功能性基闵沉默，而了解细胞信号路径中各种蛋白质之间的交互作用。本案发明人在经过长期临床研究及试验后，终于找到能够在活体外或活体内，经由RNA干扰来抑制气管发炎基因表达的非编码、短RNA分子，这些鉴别出来的短RNA分子可作为一种治疗过敏或减轻气管发炎现象的药物。
发明内容本发明目的在于提供可经由短干扰性RNA分子(shortinterferenceRNA,siRNA)来抑制气管发炎相关基因表达的化合物、组合物和方法。因此，本发明特征在于小型的核糖核酸分子，例如，短、干扰性、双链或单链RNA分子；以及以这些siRNA来抑制气管发炎相关基因表达的方法。因此，本发明-方面在于提供-个或多个个siRNA分了-,其可巾.独或合并使用，通过rnar-扰来抑制气管发炎相关基因的表达，例如，^气管发炎相关的gata-3、IL-4、IL_5、IL-13或嗜伊红紊(eotaxin)基因所编码产生的蛋fU质的表达。在-实施方式中，本发明特征在于一种分离出来的双链siRNA分子，其可往下调节气管发炎相关基因的表达，如gata-3、IH、IL-5、IL-13或嗜伊红素(eotaxin)基因的表面，其中该siRNA分子包含约19至21对碱基对。在-实施方式中，本发明特征在于一种分离出来的siRNA分子，其可经由RNA千扰(醒i)而切断gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素(eotaxin)RNA，其中(a)该链siRNA分子长度约为19至21个核苷酸；且(2)该链siRNA分子包含可与该gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素RNA互补的核糖核酸序列，藉通过RNA干扰来切断该gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素RNA。在-实施方式中，本发明此分离的siRNA分子是源自小鼠，其核糖核酸序列是与选自序列编号1一15中任-核酸序列所编码产生的RNA序列彼此互补，其中序歹U编号l一3分另lj代表gata—3基因在316—336、1733—1753及1306-1324位置处的核苷酸序列；序列编号4一6分别代表IL-5基因在263-283、636-656及1166-1186位置处的核苷酸序列；序列编号7—9分别代表嗜伊红素基因在134-152、282-294及583-894位置处的核苷酸序列；序列编号10—12分别代表IL-4基因在47-67、181-201及336-356位置处的核苷酸序列；且序列编号13—15分别代表IL-13基因在100-120、154-174及238-258位置处的核苷酸序列。在另一实施方式中，本发明此分离的siRNA分子是源自人类，其核糖核酸序列是与选自序列编号31—45中任一核酸序列所编码产生的RNA序列彼此互补，其中序列编号31—33分别代表gata-3基因在537-557、1080-1100及185-205位置处的核苷酸序列；序列编号34—36分别代表IL-5基因在196-216、328-348及457-477位置处的核苷酸序列；序列编号37—39分另lj代表嗜伊红素基因在749-769、269-289及335-355位置处的核苷酸序列；序列编号40—42分别代表IL-4基丙在133-153、355-375及87-107位置处的核〖f酸序列；tl序列编9:43—45分另U代表IL—13基冈在389—409、137—157及431-451位赏处的核ff酸序列。在一实施方式中，本发明特征在于-种分离出来的siRNA分子，其具有可反制gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素RNA的活性。该siRNA分子是可介导RNA干扰现象，以便于活体外或活体内裂解gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素RNA。在一实施方式中，本发明此分离的siRNA分子是源自小鼠，其序列可与靶标基因RNA互补，且该靶标基因的核酸序列乃是任一选自序列编号1—15中的核酸序列。在另一实施方式中，本发明此分离的siRNA分子是源自人类，其序列町与靶标基因RNA互补，巨该靶标基因的核酸序列乃是任一选自序列编号31—45中的核酸序列。本发明序列不限于序列编号1—15或31—45中所示的序列。本发明一分离的siRNA分了-可包含任一可与gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素基因序列互补的序列，例如，--与约19至21个或更多个邻近gata—3、IL一4、IL一5、IL一13或嗜伊红素核昔互补的序歹ij。本发明较适合的小鼠siRNA分子的序列，是与依据本发明实施6例l一6所制备的siRNAl至ljsiRNA15至少约有80%相同，该siRNAl到siRNA15是分别由一选自序列编号1一15的靶标核酸序列所分别编码产生的。本发明较适合的人类siRNA分子的序列，是与依据本发明实施例7所制备的siRNA16到siRNA30至少约有80%相同，该siRNA16到siRNA30是分别由一选自序列编号31—45的靶标核酸序列所编码产生的。在一实施方式中，本发明的siRNA分子是一种可介导活体外或活体内的RNAi活性的单链的siRNA,它包含一单链的聚核糖核苷，其序列玎与靶标基丙的RNA序列互补。该靶标基因可以是一种与气管发炎相关的基因，例如gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素基因。本发明另一方面是关于一种以短、干扰性核酸分子来抑制气管发炎相关基因(例如，gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素基肉)表达，而来治疗诸如花粉热、支气管型气喘、鼻窦炎、呼吸窘迫症状或过敏性鼻炎等过敏性疾病的药学组合物。在一实施方式中，本发明特征在于一种药学组合物，它包含本发明的siRNA分子，以及一药学可接受的载体。在一实施方式中，提供一种至少一本发明siRNA分子的表达载体(expressionvector)，它包含-部份的靶标基因，使其能容许siRNA分子被表达，以达成在活体外或活体内经由RNA干扰(RNAi)来抑制或抵销靶标基因的表达。该靶标基因可以是诸如gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素基因之类的气管发炎相关基因。在一种实施方式中，本发明特征在亍提供一种方法，其可透过将至少一siRNA分子的一表达载体引入至-一患者体内，而可治疗受诸如花粉热、支气管型气喘、鼻窦炎、呼吸窘迫症状或过敏性鼻炎等过敏性疾病之苦的患者，其中该siRNA分子包含一聚核糖核苷，其序列与一部份气管发炎相关基因RNA互补，使得该siRNA分子被表达后可经由RNA干扰(RNAi)来抑制气管发炎相关基因的表达，因而pJ"达成减轻和/或极小化患者过敏症状的目的。以下，将藉由详细实施说明及实施例来阐述本发明的其它特点、目的及优点。为让本发明的上述和其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的详细说明如下图1为在pSECT"hygro质粒及慢病毒是载体中的小鼠siRNA的示意图，其中(A)为siRNA表达匣的示意图；(B)为pSECIMhygro质粒的示意图，它包含一嘉磷塞(hydromycin)筛选位置，用以筛选出rij稳定表达siRNA分子的细胞株；及(C)为nj"表达siRNA的慢病毒载体的示意图。阁2标出在对转染有gata-3siRNA的EL-4细胞合并施用PMA(5ng/ml)和cAMP(500mM)约24小时后，其降低细胞中gata-3基因表达与经由Th2路径所释出的细胞素量的变化，其中gata-3基因与蛋白质的表达量是分别利用(A)实时PCR;和(B)西方墨点法(westernblotting)来确认；至亍经由Th2路径所释出的细胞素量则是利用(C)三明治式-酶联免疫吸附测定法(sandwich—ELISA)来测定。在此图中，「假(Mock)」-间代表转染有siRNA负控制组(购自Ambiori公司)的假诱发控制组；「PTYlinker」一词代表空载体。a**p<0.01，是相对于未经处理的控制组所作的比较；b**p<0.01，是相对于经过PMA(5ng/ml)与cAMP(500Mm)处理者所作的比较；c**p<0.01,是禾目对亍经过PMA(5ng/ml)与cAMP(500Mm)处理的假控制组所作的比较；d**P<0.01,是相对于经过PMA(5ng/ml)与cAMP(500Mra)处理的空载体组所作的比较。图3为依据本发明用来建立气喘鼠模型的一较佳实施方式中OVA流程的时间图。图4的柱状图显示依据本发明一较佳实施方式而施以gata-3siRNAs处理的BALB/c小鼠，其血浆中OVA-^—性抗体的含量，包括(A)IgE、(B)IgG-,、(C)IgG2d。图5标出实施例3.2中的小鼠BAL液中的嗜伊红性细胞亲合素的量。图6标出依据本发明一较佳实施方式而自实验动物的BAL液内取得的细胞种类。以1毫升HBSS来定出总细胞数目，且数据是以平均值JL标准偏差来表示，a**p<0.01，a*p<0.001，是相对于生理食盐水组所作的比较。图7标出依据本发明一较佳实施方式而以gata-3siRNA抑制OVA-致敏小鼠对乙醯化甲胆碱所诱发的气管超敏反应性(AHR)的效应。以全身体积描记仪来测定AHR,且数据以3次独立实验所得的Penh^h相对于Penh,.,，s的比值来表示(平均值t标转偏差)。*p<0，05，***p<0.001，是相对于负控制组所作的比较；a***p<0.001，是相对于各￡控制组所作的比较；b***p<0.001，是相对于各假诱发控制组所作的比较。图8标出在对转染有IL-5siRNA的EL-4细胞合并施用PMA(5ng/m〗)禾UcAMP(500mM)约24小时后，其降1氐细胞中IL-5基闪表达量的变化，其中IL-5基因的表达量是利用三明治式-酶联免疫吸附测定法(sandwich-ELISA)来测定。在此图中，「EL4」一词代表以PMA及cAMP处理过的EL-4细胞；「SNeg」词代表转染有pSECNeg(其内含有5小鼠任一基因无关的siRNA片段)的EL-4细胞；「Sl、S4及S7」一词代表分别转染有内含siRNA4、siRNA5及siRNA6的质粒的EL-4细胞。图9标出依据本发明一较佳实施方式而在(A)培养基或(B)转染有合成的嗜伊红性细胞亲合素siRNAs的细胞中，其嗜伊红性细胞亲合素的量，其中这些siRNAs包括siRNA7、siRNA8及siRNA9。图10标出依据本发明一较佳实施方式而以IL-5siRNA和/或嗜伊红性细胞亲合素siRNA来抑制OVA-致敏小鼠对乙醯化甲胆碱所诱发的气管超敏反应性的效应。AHR是以全身体积描记仪来测定。图ll标出依据本发明一较佳实施方式而自BAL液中收集9的细胞种类，包括(A)单核细胞(B)嗜中性细胞(C)淋巴细胞；及(D)嗜伊红性细胞。以1毫升HBSS来定出总细胞数目，且数据是以平均值IL标准偏差来表示，*p<0.01，是相对于生理食盐水组所作的比较。图12标出以ELISA试验所测得的实施例4的小鼠BAL液中(A)IL-5及(B)嗜伊红性细胞亲合素的含量。图13的柱状图显示依据本发明一较佳实施方式而施以IL-5和/或嗜伊红性细胞亲合素的siRNAs处理过的BALB/c小鼠，其血浆中OVA-专一性抗休的含量，包括(A)IgE、(B)IgG-,、(C)IgG"。图14标出依据本发明一较佳实施方式而分别以高、中及低剂鼂的siRNA5来抑制0VA-致敏小鼠对乙醯化甲胆碱所诱发的气管超敏反应性(AHR)的效应。以仝身休积描记仪来测定AHR。在此阁中，「S4低J代表以低齐IJ量siRNA5(3xl05IFU/鼠)处理过的动物，「S4中」代表以中剂量siRNA5(1.5xlObIFU/鼠)处理过的动物，「S4高」代表以高剂量siRNA5(3xlOfcIFU/鼠)处理过的动物，「SNeg」一词代表转染有pSECNeg(其内含有与小鼠任一基因无关的siRNA片段)的动物。图15标出自实施例5的小鼠BAL液中收集的细胞种类，包括争核细胞、淋巴细胞、嗜碱性细胞及嗜伊红性细胞；该实施例5的小鼠是先分别以高、中及低剂量的siRNA5处理过。以1毫升HBSS来定出总细胞数目，且数据是以平均值±标准偏差来表示，*p<0.01，**p<0.001，是相对于正控制组所作的比较。图16标出自实施例5的小鼠BAL液中收集的嗜伊红性细胞亲合素的量，该实施例5的小鼠是先分别以高、中及低剂量的siRNA5处理过。数据是以平均值L标准偏差来表示，*p<0.01，是相对于正控制组所作的比较。图17的柱状阁显示fi分别施以高、中及低剂量的siRNA5处理过的实施例5的BALB/c小鼠中，测定其血浆中OVA-专--性抗体的含量，包括(A)IgE、(B)IgG-,、(C)IgG2d。图18为人类siRNA载体的示意图，其中可在此载体的MluI与XhoI位置间插入一小段DNA(其可编码产生以欲求人类基因为靶标的一短、发夹RNA),并使用Hl激活子来促使siRNA表达，此外，此载体也含有可当作报导基因的珊瑚礁绿萤光蛋白质及可用于筛选的抗-新霉素基因。图19标出在以脂质转染剂转染(A)空载体、(B)siRNA22、(C)siRNA23或(D)siRNA24，并以G418(500wg/ml)进行筛选14天的BEAS-2B细胞中，人类嗜伊红性细胞亲合素-1siRNA的转染效率。以FACS来分析转染细胞(GFP+)的频率。图20标出在以脂质转染剂转染空载体(V)、siRNA22(SE749-)、siRNA23(SE-269)或siRNA24(SE-335)，并以TNF—a(50ng/ml)与IL一4(50ng/ml)分另廿刺激24小时或48小时的BEAS-2B细胞中，以嗜伊红性细胞亲合素-l为靶标的人类siRNA的抑制效率。以控制组细胞(以空载体转染的BEAS-2B细胞)的嗜伊红性细胞亲介素-1的农达量作为100%,*p<0.01，**p<0.001，足相对f控制组所分泌的嗜伊红性细胞亲合素-l的量所作的比较。图21标出Jurkat细胞中转染了人类siRNA后，其抑制gata-3、IL-4与IL-13的情形。将5乂105细胞培养在24孔培养盘中、并以可表达gata-3、IL-4与IL-13的shRNA的pRNAin-Hl.2/Retro质粒转染细胞约48小时，同时施以PMA(50ng/ra])和PHA(1ug/ral)的处理约48小时。将细胞转移到新的24孔培养盘中，继续施以PMA(50ng/ml)和离子霉素(ionomycin)(1ug/ml)约24小时，之后收取细胞并以RT-PCR来测定RNA的表达量。**p<0.05，是相对于个别控制组所作的比较。具体实施例方式所揭示实施例及所使用的技术名词均是为了阐述本发明而用，非用以限制本发明的范畴。本发明范畴也涵盖未揭示于此，但对参阅过本说明H之后的任-本领域熟知的现有技术本ii领域技术人员来说显而易见的实施例。本发明是有关于一种藉由使用短干扰性核糖核酸(siRNA)分子来治疗诸如花粉热、支气管型气喘、鼻窦炎、呼吸窘迫症状、异位性皮肤炎、过敏性休克或过敏性鼻炎等过敏性疾病的新颖的解决方案。申请人在此证明了核酸序列与至少一部分靶标基因(例如，气管发炎相关基因)的RNA序列互补的特定分离的短干扰性核糖核酸分子，可经由RNA干扰机制而达成切断表达出来的靶标基因RNA的目的。RNA干扰为一种具有序列专-性的方法，它是藉由在动物体内使用短r-扰性RNA(siRNA)来达到转录后-基闪沉默的y的(Fireetal.，"Potentandspecificgeneticinterferencebydoub1e-strandedRNAinC3e"0i"/a6</_/"ega/7S，，(1998)Nature391,806-811)。转录后-基因沉默法被认为是细胞在演化上保留下来的一种用来防止外来基因表达的自我防卫机制(AndrewFire，"Rna-triggeredgenesilencing"(1999)TrendsGenet.15(9)，358-363)。这类用来防止外来基闪表达的作法可能是细胞肉应病毒感染所制造的双链RNA(dsRNAs)或是跳跃基因被随机插入至宿4":基因休后而产生的细胞响应，用以专一性地摧毁同源-中-链RNA或是病毒基因体RNA。细胞中存有双链RNA(dsRNAs)这件事，会促使细胞经由目前仍不十分清楚的机制，来触发RNA千扰(RNAi)反应。在细胞内的双链RNA会促使一般称为「Dicer」的核糖核酸酶酵素被活化。已知Dicer和一般可将双链RNA处理成为习称的短f扰性RNA(siRNA)的过程有关(Bersteinetal.,"RoleforabidentateribonucleaseintheinitationstepofRNAinterference"(2001)Nature,409，363-366)。因为Dicer的作用而产生的短干扰性RNA,其通常具有约21到23个核苷的长度，且包含约19对碱基对的双链(链)结构。RNA干扰(RNAi)反应的特征是形成—内含siRNA的核酸内切酶复合物，一般称为「RNA-诱发的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)J，其可介导与该siRNA具有序歹廿同源性的单链RNA的断裂(cleavage)反应。靶标基因RNA的断裂是发生在与该双链siRNA前导序列互补区域的中间。因此，本发明的siRNA可经由与RNA转录本作用或与特定基因序列作用而来介导基因沉默，上述这些作用可导致在转录层次或转录后-层次上的基因沉默。有关RNA干扰技术的一般性综论，可参见以下MelloandConte，"RevealingtheworldofRNAinterference",(2004)Nature431，338-342:SchererandRossi,"Approachesforthesequence—specificknockdownofraRNA，，，(2003)NatureBiotechnology,21,1457-1465.因此，在-实施方式中，本发明提供—个或多个siRNA分/_，其可单独或合并作用，藉山RNA干扰来抑制一个体体内气管发炎相关基因的表达，使得诸如gata-3、IL_4、IL-5、IL-13或嗜伊红素基因之类的气ft发炎相关基闵受到抑制或延迟，藉以极小化和/或减轻该个体的发炎反应。在-实施方式中，本发明提供-种分离的双链siRNA分f，其可藉山RNA干扰来切断gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红i$基因的RNA，其中(a)该siRNA分子的每一条链长度约为19至21个核苷；且(b)该siRNA分子的一条链的核糖核酸序列与该gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素基因的RNA互补，因此可藉由RNA干扰来切断该gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素基因的RNA。本发明分离的siRNA分子可源自小鼠或人类。明确地说，本发明分离的小鼠siRNA分子是以选自序列编号1至15的一核酸所编码产生的核糖核酸序列为靶标，其中序列编号1—3分另lJ代表gata-3基因在316-336、1733-1753及1306-1324位置处的核g1酸序列；序列编号4一6分别代表IL-5基因在263—283、636—656及1166—1186位置处的核苷酸序歹lj;序歹lj编号7—9分别代表嗜伊红素基因在134-152、282-294及583-894位置处的核苷酸序列；序列编号10—12分别代表IL-4基丙在47-67、181-201及336-356位宵处的核苷酸序列；且序列编号13—15分别代表IL-13基因在100-120、154-174及238-258位置处的核苷酸序列。本发明分离的siRNA分子可源自人类。明确地说，本发明分离的人类siRNA分子是以选自序列编号31至45的一核酸所编码产生的核糖核酸序列为靶标，其中序列编号31—33分别代表gata-3基因在537-557、1080-1100及185-205位置处的核苷酸序列；序列编号34—36分另lj代表IL-5基因在196-216、328-348及457-477位置处的核苷酸序列；序列编号37—39分别代表嗜伊红素基因在749-769、269-289及335-355位置处的核苷酸序列；序列编号40-42分另'J代表IH基因在133-153、355-375及87-107位置处的核苷酸序列；且序列编号43—45分别代表IL-13基因在389-409、137-157及43H51位置处的核苷酸序列。本发明一较佳的小鼠siRNA分子的序列是与一靶标基因RNA的序列互补，或与依据实施例1至6所述方法制成的任一选自siRNAl至ljsiRNA15(分另lj由序歹ij编号16—30来表示)的siRNA分子序列至少80%相同，这些siRNA分子是由选G序列编号1_15的任-核昔酸分f所编码产生的。序列编号1一15所代表的小鼠核苷酸序列，与序列编号16—30所代表的核糖核酸序列揭示于表1中。本发明一较佳的人类siRNA分子的序列是与一靶标基因RNA的序列互补，或与依据实施例7所述方法制成的任一选自siRNA16到siRNA30(分别由序列编号46—60来表示)的siRNA分子序列至少80%相同，这些siRNA分子是由选自序列编号31—45的任-"核苷酸分子所编码产生的。序列编号31—45所代表的小鼠核苷酸序列，与序列编号46—60所代表的核糖核酸序列揭示于表2中。本发明的siRNA分f町以是一种可介导活体外或活体内的RNAi活性的单链siRNA，包含一与靶标基因RNA序列互补的单链核糖核苷。较佳是，该siRNA是与一针对靶标基因RNAi所制成的siRNA分子序列至少80%相同，该靶标基因包含任一核酸序列，它是选自序列编号1—15或31—45中的任一序14列。该靶标基因可以是一种与气管发炎相关的基因，例如gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素基因。目前共有5种方式可用来产生与基因沉默目的相关的siRNA，这些方式包括化学合成、活体外转录、以第III型RNA酶家族中的RNA酶来切断长的双链RNA、和以及时聚合酶链反应(RT-PCR)衍生的siRNA表达匣(casettes)于细胞中进行表达。前三种方法涉及先在活体外制备好相关的siRNA，然后以月旨质体法(lipofection)、电穿孑L法(electroporation)或其它技术将所制成的siRNA引入至细胞中。后面两种方法则是依靠引入可在活细胞中表达出siRNA的DNA载体及表达匣来达成。本发明的siRNA分子是利用本发明实施例所述的RT-PCR表达匣，以选定的耙标基因作为模板所转殖出来的。或者，也"]"以卜.述本领域熟知的现有技术中常用的活体外制备法和/或化学合成法来制造。之if，将所制成的siRNA分了-放入适当的载休并传送到细胞内来进行表达。'旦成功被表达出来后，这些siRNA分f就会与靶标基丙互相作用而产生RNA干扰反应。本发明的siRNA分子可单独使用或与其它疗法合并使用，以预防或治疗诸如花粉热、支气管型气喘、鼻窦炎、呼吸窘迫症状、异位性皮肤炎、过敏性休克或过敏性鼻炎等过敏性疾病。这些siRNA分了可包含-用以传送到一个体休内的传送载休(如，微脂粒)、载/-和/或稀释物，fl它是以药学上可接受的配方形式存在。用来传送核酸分子的方法早为此领域中本领域熟知的常用的技术，其包括(但不限于)微脂粒包埋法、离子电渗法、或是将其并入到其它载剂中，如生物可分解的聚合物、凝胶、环糊精或其它蛋白类的载体。有关核酸分子传送的一般性方法可参见美闺专利第6,395,713号，其全部内容在此并入作为参考。因此，本发明另一特征是提供种药学组合物，它包含一个或多个siRNA分F在-药学pJ接受的载体中。可以任何标准方式将本发明这些siRNA分子施用于或引入至一个体体内。当欲求的使用方式为微脂粒传递机制时，如本发明实施例所使用的方式，较佳是使用的脂质转染剂(Lipofectamine)微脂粒配方，并依标准操作方式施用。本发明核糖核酸分子与组合物可以剂量配方经由口、皮肤表面、注射、吸入或喷雾方式来施用，这些剂量配方内包含本领域熟知的无毒的药学可接受的载体、佐剂和/或载体。「注射(parenterally)」一词在此包含经皮的、皮下的、血管内、肌肉内或气管内注射或灌洗技术等。可以本领域熟知的技术来制备本发明意欲用于口服、皮肤表面涂用、注射和/或吸入性用途的组合物。本发明的siRNA分子较佳是被配方成气雾性或喷雾性配方，以用r诸如雾化器(nebulizer)、计量剂量吸入器(metereddoseinhaler)、灌入器(insufflator)等类的吸入性装置中，以使气管组织町迅速地吸入本发明的核酸分子。除非另作定义，否则在此所使用的技术性或科学性名词，均釆用本领域技术人员所本领域熟知的的定义，虽然也可采用与所揭示内容相I的其它方法或材料来实施本发明，炉.以下实施例中将会揭i-"J用以实施本发明的较作材料及方法。所有曾述及的文献，其内容在此均并入作为参考。除非另作说明，否则所采用的技术均为本领域技术人员所熟知的的标准技术，至于所用的材料及方法，均为例示目的，非用以限制本发明范畴。除非另作说明，否则单数名词「一(a,an,the)」在此均涵盖其复数形式。除了在操作实施例中或另有定义之外，所有在此用来表&一成分数量的数值人小，均为--约略范围。因此，除非代表相反意涵，否则所有的数值均可视欲求的反应效果或性质来加以变化。实施例以下实施例仅供阐述本发明性质及帮助此领域中具备一般通常知识者来实施本发明之用。所揭示的实施例并非用以限制本发明的范畴。统计分析16所有本文中述及的数值是将至少3个独立试验所得数值加以平均后的平均值i标准偏差。以SPSS软件来进行单因子变异数分析(one-wayAN0VA),接着进行费雪事后检定比较(ScheffeforPosrHoccomparison),藉此来找出统计学上具明显差异的群组。若p值小于0.05,则表示该数值具最低程度的明显差异性。建构小鼠siRNA分子及其在抑制气管发炎上的用途实施例1制造小鼠Gata-3siRNA建构物及以所获得的Gata-3siRNA来转染EL-4细胞建构小鼠Gata-3siRNA选择以下三段小鼠gata-3靶标基因序列来制造gata-3siRNAs，包括siRNAl，它是使用耙标基因在316-336位置间的序列GAAGCTCAGTATCCGCTGACG(序列编号1);siRNA2，它是使用靶标基因在1733-1753位置间的序列CCACTGAATCCGGATCCCATT(序列编号2);siRNA3，它是使用靶标基因在1306-1324位置间的序列GATGTCTAGCAAATCGAAA(序列编号3)。依据制造商的说明，以PCR-衍生的siRNA分子表达匣来合成负控制组的siRNA(商用试齐U套组是购自Ambion，Austin,Texas,USA),并将其转殖入pSEC"hygro质粒中(Ambion)。图1A与图IB中分别示出这些siRNA表达匣，以及转殖入pSECTMhygro质粒中的小鼠gata-3siRNAs。以所合成的小鼠gata-3siRNA建构物来转染EL-4细胞将购自AmericanTypeCellCulture的小鼠淋巴瘤细胞株，EL-4细胞(4"06细胞/毫升)，养在6-孔培养盘中，并以实施例1的质粒进行转染，隔天并以脂质转染剂(Lipofectamine2000，Invitrogen，Carisbad，CA,USA)进行后续处理。明确地说，室温下，让5ug内含小鼠gata-3siRNAs的pSECTMhygro质粒与9ul的脂质转染剂(Lipofectamine2000)在25分钟的期间内，于不含抗生素的DMEM中形成复合物。之后，将所形成的复合物加到培养在6-孔培养盘中的EL-4细胞，并继续培养24小时。以内含50011g/ml嘉磷塞(hydromycin)的培养基来挑选出可稳定表达小鼠gata-3siRNA分子的细胞，并将所选出的细胞转殖株培养在内含250ug/ml嘉磷塞的培养基中。可利用RT-PCR于RNA层次或利用ELISA分析试验于蛋白质层次，来侦测及确认小鼠gata-3siRNA在EL-4细胞中的转染情形。RT-PCR依据制造商的说明，以RNAbee(AMSBiotechnology,Abigdon,UK)来分离出已转染有小鼠gata-3siRNA的EL-4细胞中的总RNA。以RT-PCR来定出GATA-3和b-肌动蛋白的相对含量。RNA反转录是在最终体积为20u1下实施。反应试管中含有4ul，5倍的第一缓冲液(50mMTris-HCl，3mMMgCl2);1u1，10mM的包含4种去氧核苷的混合物；0.1M的二硫代苏糖醇(dithiothretitol):及1U1的Superscript反转录酶。将RNA与去离子水(最终体积12u1)在70°C下加热10分钟，之后在冰上冷却。将RNA样品加到反应试管中，于42'C下培育50分钟，加热到70°C并持续约IO分钟，以使全部的反转录酶变性失活，然后将其储存在—20。C下。小鼠gata—3的弓l子序歹!j为有义GAAGGCATCCAGACCCGAAAC(序列编号61)，反义ACCCATGGCGGTGACCATGC(序列编号62):小鼠肌动蛋白有义AAGGTGTGATGGTGGGAATG(序列编号63)，反义ATGGCTACGTACATGGCTGG(序列编号64)。在PCR反应混合物中加入以下成分0.5ul，2.5uM的dNTP;2.5u1的有义引子与反义引子；2.5u1的10倍的PCR缓冲液；1u1的cDNA;O.lu1的Taq聚合酶和15.9u1的去离子水。先在94'C下培育3分钟后，依下列循环将这些引子加以放大对-肌动蛋白来说，(1)94°C、30秒，(2)56'C、45秒，(3)72'C、40秒；和对GATA-3来说，(1)94'C、l分钟，(2)62'C、l分钟，(3)72C、l分钟；最后，72'C、10分钟。放大之后，对PCR产物实施电泳，它是在2%琼脂(溶于TBE缓冲液中(30mMTri-Borate，2mMEDTA，pH8.0))中、以100伏特电力实施约0.5小时。电泳完成后，以0.1ug/ml的溴化乙锭(ethidiumbromide)染色后，再以UV光显微镜观察并拍照。ELISA试验以冰冷的磷酸盐缓冲液清洗实施例1的EL-4细胞(lxl0'细胞/毫升)2次。之后，在每一培养盘中加入200u1的分解液(它包含50mMTris-HCl,196NP-40，150mMNaCl，1mMEGTA,1mM苯甲磺醯氟，1mg/mlleupeptin，pepstatinlmg/ml，NaV(h0.5M,pH7.4)。从培养盘上括下被溶解的细胞，放入小管中在4'C下培育30分钟。之后，在4'C，以14，000rpm速度下将这些小管离心约20分钟，并收集每--管的上清液。将所收集的h清液^4倍的蛋白质样品缓冲液混介(31.25mMTris-HCl，1%SDS，25%-氢硫乙醇，0.00625%溴苯酚和50%(v/v)甘油)，并煮沸约5分钟。在10%SDS-PAGE凝胶上电泳分离这些蛋白质，并将电泳分离后的蛋白质转移到PVDF膜1:。以溶fTris缓冲液(其内含0.1%Tweed)的5%牛乳来阻断反应，并与-次抗体-起培育。使用山葵过氧化酶-加标的二次抗体来标示这些蛋白质带，并侦测其所产牛的化学萤光(PerkinElmerLifeScience,Inc.,Boston,MA)，之后使其暴露在X光膜下。实施例2小鼠Gata-3siRNA对实施例1的EL-4细胞释出细胞素的影响测量实施例1中EL-4细胞所分泌的细胞素量，以便确认所建构的gata-3siRNAs抑制与过敏相关的Th2途径的细胞素基因表达。为此，经过3犬培育后，以有或无合并佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA，5ng/ml)与cAMP(500uM)处理24小日寸的力'式，来束lj激实施例1的EL-4细胞，之后收集细胞培育物的上清液并测量其中gata-3基因及其蛋白质的表达量，并依下述方式测量其所释出的细胞素(包括IL-4和IL-5)量。测量细胞素以三明治式-酶联免疫吸附测定法(sandwich-ELISA)来侦测细胞素的量。简言之，将经过NaHC0319缓冲液(pH9.6)稀释过的抗-细胞素抗体(抗-IL4或抗-IL5抗体)加到96-孔培养盘中，并在4TC下隔夜培育。隔天，在室温下于1小时的期间内，以内含3%-BSA的PBS溶液清洗培养盘3次。之后加入所欲测试的样品并在37'C反应2小时或是在4'C下反应隔夜。待反应完成后，在培养盘中加入以内含1%-BSA的PBS溶液稀释的生物素-共轭的抗-细胞素抗体，并继续在室温下培育l小时，之后加入与链霉亲和素共轭的过氧化酶，并反应1小时。最后，在每一培养孔中加入0.2毫升的酵素基质溶液(将4mg的0-苯二胺溶在20毫升的0.1M的磷酸盐-柠檬酸盐溶液中(其中含有0.001%的H202))，并静置于室温下且避光约30分钟。侦测每一培养孔在450nin下的吸光值。此三明治式-酶联免疫吸附测定法侦测IL-4和IL-5的敏感度分别为15pg/ral及20pg/ral。结果示于阁2中。相较f控制组，,合并PMAcAMP二者来处理细胞后，细胞中gata-3基因(阁2A)与GATA-3蛋白质(图2B)两者的量均呈现明显抑制情形，表示gata-3RNAi可有效反制细胞中PMA-依赖型与cAMP-依赖型的基因与蛋白质表达。此外，细胞响应PMA与cAMP二者刺激所释出的IL-4与IL-5的量也会受到gata-3RNAi的抑制(图2C)。实施例3Gata-3siRNA在小鼠气喘模型中的效应3.1将gata-3RNAi转殖入慢病毒载体(LentiviralVectors)以TA转殖技术，将实施例1所述包括siRNAl、siRNA2及siRNA3之类的小鼠gata-3siRNA转殖入pGEM-T简易载体中(Promega,Madison,WI)'然后以限制酶酵素来剪接pGEM-T简易载体，其于EcoRI位置处含有siRNA。将两端带有EcoRI位置的siRNA片段转殖入pTY连接子中(图1C)。用亍本实验的慢病毒载体是由中国国立台湾大学附设医院肝病防治中心的&、V:卞博t:所ft行研发的第三代6我失活载体(self-inactivatedvector,SIV)。以磷酸钙介导的快速转染来转染HEK-293T细胞，以制造出所欲求的siRNA慢病毒载。简言之，以适量的载体质粒(包括助手建构物、病毒套质粒(envelopplasmid)、tat质粒、和慢病毒载体质粒)来共同转染HEK-293T细胞。转染后第2天，收集培育物上清液中的病毒并以超浓縮法将其浓縮33倍。用来诱导EL-4的不同病毒载体浓度为M0I=1.4。3.2将gata-3siRNA慢病毒载体应用在小鼠气喘模型中小鼠气喘模型BALB/c雌鼠是向中国国立台湾大学医学院附设动物中心(台湾，台北)购买并寄养在该处。所用实验动物的年龄在6—10周间，且每--实验所使用的小鼠年龄均大致相当。同时，动物实验的流程并获得中国国力台湾大学医学院动物委员会的认可，将简单说明于后。在第0天，以腹膜内注射卵蛋白的方式使小鼠敏感，所注射溶液的总体积为200ul,它是以4mg氢氧化铝(Alumlmuject;PierceChemical:Rockford,IL)来学L化50ug卵蛋白(ovalbumin,OVA)(第V级，SigmaChemicalCo.,StLouis,MO)后所形成的溶液。所有实验鼠都分别在第14天和第28天，再接受一次注射(它是以4mg氢氧化铝来乳化25ugOVA所制成的溶液)，来强化休内的免疫反应。负控制组的小鼠体内则是注射磷酸缓冲液(PBS)。在第35天，测量每一只小鼠体内的OVA-IgE含量。在第40天时，以气管内传输方式将实施例3.1的慢病毒siRNA(包括siRNAl、siRNA2及siRNA3，每一齐lj量为2.2x106IFU)施加到麻醉动物体内，接着在第42到44天，以鼻腔内吸入OVA(100ng)方式刺激小鼠。同时，以假病毒(mockvirus)(负控制组siRNA慢病毒载体)或正常生理食盐水来作为控制组。透过初步滴定数据(数据未示出)挑选出慢病毒剂量为lxlO5PFU。对气管内注射来说，以加装有0.61毫米(外径)聚乙烯管的导管来注射溶于50ul生理食盐水内的病毒。在第45天时，测量每一只动物的气管超敏反应性(airwayhyper-responsiveness,AHR)，同时在第46天，将每只实验动物放血牺牲后，取出其肺脏细胞做进一步分析，包括测量细21胞类型及细枝气管洗出液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)中的细胞素含量。图3绘出用于本试验的流程时间图。湖!l量0VA-专一的IgE、IgG,及IgG2A含量如上述(Leeetal.，"Constructionofsinglechaininterlukin12plasmidtotreatairwayhyperresponsivenessinananimalmodelofasthma",HumanGeneTherapy(2001)12:2065-2079)，以三明治式-酶联免疫吸附测定法来侦测对OVA具专一性的IgE和IgG,(代表经由Th2路径的反应)，及IgG^(代表经由Thl路径的反应)的量。将2ug/ml的OVA涂布在ELISA培养盘中，并在4'C下隔夜培育。以内含0.05%Tween20的PBS溶液来淸洗ELISA培养盘，添加稀释过的血清(对IgE抗体来说，稀释倍数为10倍对IgG,及IgG2A来说，稀释倍数则为100倍)到ELISA培养盘中，并在室温下培育2小时。接着加入生物素-共轭的抗-IgE、抗-IgG,、及抗-IgG2A等抗体，和碱性磷酸酶共轭的卵白素(avidin)。利用TMB缓冲液(KPLGaitherburg，MI，USA)作为基质并以连接酵素的免疫吸附分析读值机(MRX-TC,DynexTechnology,chantilly，VA,USA)来读取实验数值，以评估酵素活性。利用标准曲线所得的数值而将450nm下的读值转变为每毫升多少纳克(ng/ml)。将以知浓度纯化的IgE、IgG,及IgG"(Pharraingen，SanDiego,CA)进行一系列稀释后，可制作出标准曲线。结果示于图4中。相较于正控制组，可看出无论是以siRNA单独处理或合并处理，都会诱导产生所有对OVA具专一性的抗体(包括IgE、IgG,及IgG2A)。测量细胞素依据实施例2所述方式，以ELISA分析来测定从实施例3.2的动物体内收集到的BALF中的细胞素量。结果示于图5。可发现无论是单独或是合并施以gata-3siRNA2或gata-3siRNA3处理，实验动物体内的嗜伊红性细胞亲合素(eotaxin)含量都明显低于正控制组动物体内的量(图5)。测量BALF中的细胞类型以刘氏染色法(Leeetel.,"AdministrationofIL—12exertstherapeuticinsteadoflongtermpreventiveeffectonDerpial1ergen-inducedanimalmodelofairwayinflammation"，(1999)Immunology97:232-240)来确认从实施例3.2的动物体内收集到的BALF中的细胞类型，包括巨噬细胞、嗜伊红性白血球(eosinophils)细胞、嗜中性白血球(neutrophils)及淋巴细胞，结果示于图6。可发现无论是单独或是合并施以gata-3siRNA2或gata-3siRNA3处理过的动物，其体内嗜伊红性白血球的数量明显下降，表示实施例3.1的siRNAs可成功地抑制代表发炎现象的嗜伊红性白血球的活化。测量气管超敏反应性(AHR)以气压式全体体积描记仪(Buxco,Troy，NY)，在未受限动物身上测量AHR。简言之，将小鼠放在主腔室，并量取基准值，同时每3分钟取—平均值。经由主腔室入口以喷雾方式通入气雾状PBS或乙醯化甲胆碱(methacholine，Mch)(浓度在3.125—25mg/ml间)，每次喷雾后，毎隔3分钟取、f均读值。将每10次呼吸的读值外插，以界定出每分钟的呼吸次数。以Penh来表示气管活性，同时依据Hogan等人("Aeroallergen-inducedeosinophilicinflammation,lungdamagesandairwayhyper-reactivityinmicecanoccurindependentlyofIL-4andallergen-specificimmunoglobulins",(1997)J.Clin.Invest.99:1329-1339)的实验方法，数据以3次独立实验所得的PenhMth相对于Penh,.Bs的比值来表示。结果示于图7。实验结果显示，相较亍控制组动物来说，施以siRNAl、siRNA2或siRNA3处理的动物，其由乙醯化甲胆碱所诱发的AHR现象明显受到抑制，进—步证明抑制IL-5和嗜伊红性细胞亲合素基因可有效反制过敏相关症状。实施例4以小鼠RNAi来抑制IL-5和嗜伊红性细胞亲合素的表达依据与实施例1类似的方法，挑选出适当的标的基因序列并藉以合成出IL-5和嗜伊红性细胞亲合素RNAi。简言之，选择以下三段小鼠IL-5靶标基因序列来制造IL-5siRNAs，包括siRNA4，它是使用靶标基因在263-283位置间的序列AAGAATCAAACTGTCCGTGGG(序列编号4);siRNA5，它是使用耙标基因在636-656位置间的序列AAGAAATTCCTGTAGCGCAGG(序列编号5);siRNA6，它是使用靶标基因在1166-1186位置间的序列AATCAGACTGTGCCATGACTG(序列编号6)。选择以下三段小鼠嗜伊红性细胞亲合素靶标基因序列来制造嗜伊红性细胞亲合素siRNAs,包括siRNA7，它是使用耙标基因在134-152位置间的序列CTTCCTGCTGCTTTATCAT(序列编号7);siRNA8,它是使用耙标基因在282-294位置间的序列GTGGGTCCAGGATGCCACA(序列编9:8);siRNA9，它是使用靶标基因在583-595位置间的序列CACAATGGGACGAGTTAGG(序列编号9)。依据实施例2所揭示方法，利用ELISA来侦测EL-4细胞中IL—5受至ij所选小鼠siRNAs(包括siRNA4、siRNA5禾口siRNA6)抑制的情形。阁8结果显示，无论使用任一种siRNA，均可明显抑制IL-5的基冈表込。类似的，嗜伊红性细胞亲合紊的表达，也明显受到siRNAs(包括siRNA7、siRNA8禾口siRNA9)的抑制，参见图9的结果。简肯之，将BALB/C雌鼠的初级分离肺脏细胞培育在48-孔的培养盘中，并于37'C下进行培育。之后，以包含有嗜伊红性细胞亲合素siRNAs的载体来转染所培育的肺脏细胞，接着以ELISA来侦测嗜伊红性细胞亲合素的表达。结果显示，嗜伊红性细胞亲合素与IL-4两者的表达，明显受到所合成的小鼠嗜伊红性细胞亲合素siRNAs的抑制。依据实施例3.1所揭示的方法，将针对IL-5RNAi与嗜伊红性细胞亲合素RNAi的siRNAs植入慢病毒载体中，之后再以类似方式施用到实施例3.2的气喘模型鼠k,然后依据实施例3.2的方法分别测量AHR、BALF中的细胞种类及细胞素含量。结果分别示于第10-13图中。图10绘出IL-5/嗜伊红性细胞亲合素siRNAs对于气管超敏反应性的影响。图11标出从预先以IL-5/嗜伊红性细胞亲24合素siRNAs处理过的动物的BALF中所分离出来的细胞种类，包括单核细胞(第11A图)、嗜中性白血球(第11B图)、淋巴细胞(第11C图)及嗜伊红性细胞(第IID图)。图12则标出从预先以IL-5/嗜伊红性细胞亲合素siRNAs处理过的动物的BALF中所分离出来的细胞素浓度，包括IL-5(第12A图)及嗜伊红性细胞亲合素(第12B图)。图13显示预先以IL-5/嗜伊红性细胞亲合素siRNAs处理过的动物，其血清中0VA-专一性抗体(包括IgE、IgG-,、IgG21)的量。实施例5制造与分离小鼠IL-4RNAi及IL-13RNAi，及以所制造的RNAi来抑制气管发炎依据与实施例1类似的方法，挑选出适当的标的基因序列并藉以合成出IL-4和IL-13siRNA。简言之，选择以下三段小鼠IL-4靶标基肉序列来制造IL-4siRNAs，包括siRNA10，它是使用耙标基闪在336-356位置间的序列AAGCTGCACCATGAATGAGTC(序列编9:10);siRNA11，它是使用靶标基闪在181-201位置间的序列AACACCACAGAGAGTGAGCTC(序列编号11);siRNA12,它是使用靶标基因在47-67位置间的序列AATGTACCAGGAGCCATATCC(序列编号:12)。选择以下三段小鼠IL-13耙标基因序列来制造IL-13siRNAs，包括siRNA13，它是使用靶标基因在238-256位置间的序列AATGCCATCTACAGGACCCAG(序列编号13);siRNA14，它是使用靶标基因在154-174位置间的序列AACGGCAGCATGGTATGGAGT(序列编号8);siRNA15，它是使用耙标基因在100-120位置间的序歹lj:八AGGAGCTTATTGAGGAGCTG(序列编号15)。以类似前述方法来测试所制造、分离出来的IL-4和/或IL-13siRNAs,且其测试结果再次确认这些分离的小鼠IL-4和/或IL-13siRNAs可有效地抑制IL-4和/或IL-13基因表达，以及反制与过敏相关的症状(结果未示出)。实施例6小鼠siRNA抑制气管发炎的剂量效应依据实施例3.1所揭示方法，将小鼠siRNA，特别是siRNA5(其序列与序列编号5所编码产生的RNA序列两者彼此互补)，植入慢病毒中，并将三种不同剂量的内含siRNA5的病毒载体，分别施用到实施例3.2的气喘模型鼠身上，包括高剂量(3xl(TIFU/鼠)、中剂量(1.5x108IFU/鼠)及低剂量(3xl05IFU/鼠)。依据实施例3.2所揭示方法，分别测量AHR、BALF中的细胞种类及细胞素含量。结果分别示于第14-17图中。图14绘出小鼠siRNA5对气管超敏反应的剂量效应。图15标出从预先以高、中及低剂量siRNA5处理过的动物的BALF中所分离出来的细胞种类，包括单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性细胞及嗜伊红性细胞。图16则标出从预先以以高、中及低剂量siRNA5处理过的动物的BALF中所分离出来的嗜伊红性细胞亲合素浓度。图17显示预先以高、中及低剂量siRNA5处理过的动物，其血清中OVA-专--性抗体(包括IgE、IgG-,、IgG2l)的量。结果显示所选小鼠siRNA5的任一剂量，均可有效反制与过敏相关的症状，其中又以中剂量的siRNA5的效果最明显。建构人类siRNA分子及其在抑制气管发炎上的用途实施例7分离人类siRNAs7.1建构出人类siRNAs的表达载体大致依照实施例l所述方式选择出可作为人类RNAi的靶标基因序列，不同的是在本实施例中，人类siRNA是被植入至pRNAT-Hl.1/Retro(SD1255，GenScript,NJ，USA)质粒中(图18)，并以脂质转染剂将这些可表达人类siRNA的质粒转染至A459细胞(-种人类肺泡基质表皮细胞株)或BEAS-2B细胞(一种人类支气管表皮细胞)中，转染48小时后，连续14天持续加入G418(500lig/ml)以进行筛选。举例来说，以3段IL-5基因序列来产生人类siRNA,包括siRNA19，它是使用靶标基因在196-216位置间的序歹lj:GGATTCCTGTTCCTGTACATA(序列编号34);siRNA20，它是使用耙标基因在328-348位置间的序列26AGAMTACATTGACGGCCAAA(序列编号35);siRNA21，它是使用耙标基因在457-477位置间的序列CTGGTTTGTTGCAGCCAAAGA(序列编号:36)。依据类似方式制造出gata-3、嗜伊红性细胞亲合素、IL-4、IL-5、及IL一13的siRNAs，包括siRNA16—30，其个另lj序歹廿示于表2中。7.2RT-PCR以GeneStrips1"杂合管(BNAture,Inc.,CAUSA)从所筛选出来转染了人类siRNA的A549细胞中萃取出mRNA。依据套组制造商提供的指引说明，以随机六元引子和Superscript1"RNAaseH—反转录酶(Invitrogen，Gaithersburg，MD，USA)来合成cDNA。以人类IL-5或嗜伊红性细胞亲合素TaqMan基因表达分析套组(AppliedBiosystems,FosterCity,CA，USA)在ABIPRISM7700扩增仪(AppliedBiosystems,FosterCity,CA，USA)L:实施RT-PCR，所得的mRNA量均先以GAPDHmRN量为标准，加以标准化(normalized)。图19绘出BEAS-2B细胞转染人类嗜伊红性细胞亲合素-1的siRNA(包括siRNA22、siRNA23及siRNA24)的效率。7.3以人类嗜伊红性细胞亲合素-1为靶标的siRNA的抑制效果经病毒转形的人类支气管表皮细胞株，BEAS-2B细胞，在施以人类TNF-a和人类IL-4刺激后，可分泌嗜伊红性细胞亲合素-1。为探査以人类嗜伊红性细胞亲合素-l为靶标的siRNA的抑制效果，分别以人类TNF-a(50ng/ml)和人类IL_4(50ng/ml)束U激转染有siRNA的BEAS-2B细胞24小时及48小时，之后，以ELISA来侦测细胞培育物上清液中的嗜伊红性细胞亲合素-1浓度。图20标出BEAS-2B细胞中以人类嗜伊红性细胞亲合素-1为靶标的siRNA的抑制效果。在施以药物刺激24小时后，在转染有人类siRNA的BEAS-2B细胞中，其嗜伊红性细胞亲合素-1的制造量(约9丄14%)，明显低于控制组(即，仅以空载体进行转染的BEAS-2B细胞)的量。在施以药物刺激48小时后，无论是转染有人类siRNA23或siRNA24的BEAS-2B细胞，其嗜伊红性细胞亲合素-1的制造量，相较于控制组，分别降低至约29i49&及55±1%。7.4以人类gata-3、IL-4或IL-13基因为耙标的siRNA的抑制效果依据实施例7.1所揭示方式，以人类siRNAs来转染Jurkat细胞，并依据实施例7.2所揭示的方法以RT-PCR来监测gata-3、IL-4或IL-13基因的表达。结果示于图21中。表1小鼠靶标基因与siRNAs的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>产业利用性本发明优点在于可提供一种过敏性疾病的新颖治疗方法，它是利用siRNA来达到反制至少--种与气管发炎相关基因(例如，gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红性细胞亲合素基因)表达的目的。本发明的siRNA、方法及药学组合物，可提高一宿主本身的免疫力，藉以抑制发炎并控制过敏的情况，因而可治疗诸如花粉热、支气管型气喘、过敏性鼻炎、呼吸窘迫症状、异位性皮肤炎及过敏性休克之类的过敏性疾病。虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。权利要求1.一种分离的单或双链短干扰性核糖核酸(siRNA)分子，其可经由RNA干扰来切断gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素基因的RNA，其中(a)该siRNA分子的每条链长度约为19至21个核苷；且(b)该siRNA分子包含一核糖核酸序列，其与该gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素基因的RNA或它的一部份序列互补，藉通过RNA干扰来切断该gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素基因的RNA。2.如权利要求1所述的siRNA分子，其中该siRNA分子包含一核糖核酸序列，其与选自序列编号1一15中的任一核酸所编码产生的RNA序列互补。3.如权利要求2所述的siRNA分子，其中该siRNA分子是源自小鼠。4.如权利要求2所述的siRNA分了-，其中该siRNA分子与任一选0siRNA1—15的分子至少80%为相同，它是与选自序列编号1一15中的任一核酸所编码产生的RNA序列互补。5.如权利要求4所述的siRNA分子，其中该siRNA分子包含一核糖核酸序列，它是选自序列编号16—30中的任一序列。6.如权利要求1所述的siRNA分子，其中该siRNA包含一核糖核酸序列，它与选自序列编号31—45中的任一核酸所编码产生的RNA序列互补。7.如权利要求6所述的siRNA分子，其中该siRNA分子是源自人类。8.如权利要求6所述的siRNA分子，其中该siRNA分子与任一选自siRNA16—30的分子至少809b为相同，它是与选自序列编号31—45中的任一核酸所编码产生的RNA序列互补。9.如权利要求8所述的siRNA分子，其中该siRNA分子包含一核糖核酸序列，它是选自序列编号46-60中的任一序列。10.—种用以治疗过敏的组合物，包含如权利要求2或6所述的siRNA分于，及…药学上可接受的载体。11.如权利要求IO所述的组合物，其中该过敏是选N花粉热、支气管型气喘、鼻窦炎、呼吸窘迫症状或过敏性鼻炎。12.—种治疗过敏的方法，包含对--个体施用一有效量的如权利要求10所述的组合物，通过抑制gata-3、IL-4、IL-5、IL-13或嗜伊红素基闵的表达来反制气管发炎现象。13.如权利要求12所述的方法，其中该过敏是选自花粉热、支气管型气喘、鼻窦炎、呼吸窘迫症状或过敏性鼻炎。全文摘要在此提供用以治疗过敏性疾病的化合物、方法及组合物。详言之，提供一种短链小片段干扰核糖核酸分子(siRNA)，其针对于一些基因，如gata-3，IL-4，IL-5，EL-13或嗜酸粒细胞趋化因子，藉通过RNA干扰机制来达到切断已表达的靶标基因RNA的目的。这样的siRNA可作为一种治疗过敏的药物，以减轻或减少个体身上的气管发炎现象。文档编号C07H21/04GK101437835SQ200780016731公开日2009年5月20日申请日期2007年5月11日优先权日2006年5月11日发明者江伯伦,黄重生申请人:厚生药业股份有限公司