小鼠Kif19A蛋白编码序列的制作方法

专利名称：小鼠Kif19A蛋白编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种基因工程技术领域的蛋白编码序列，特别是一种小鼠 Kifl9A蛋白编码序列。
背景技术：
卵巢发育是个体发育中的一个重要事件，而其中的卵泡发育又是这关键中的 关键。它对于生物体的生殖发育以及后代繁衍有着极其重要的作用。目前一般认 为，卵泡发育主要经历四个时期原始卵泡阶段，初级卵泡阶段、次级卵泡阶段， 以及成熟卵泡阶段。对于啮齿动物而言，15日龄个体的卵巢中，最早的一批有腔
卵泡已经开始形成，这一阶段的卵泡发育经历着其他显著的变化如卵母细胞体
积急剧增大、颗粒细胞数目急剧增多等。此时卵泡内的细胞中进行着活跃的新陈 代谢活动，如蛋白质的合成与运输，基因的表达与调控、细胞的分裂与增生等，
大量参与细胞分裂的蛋白质因子在此阶段合成;另外伴随着卵母细胞体积的增大，
如何满足细胞内的物质运输成为一个亟待解决的问题，许多参与物质运输的蛋白 质分子也在此阶段大量表达。
Kinesin超家族(Kifs)是一类公认的细胞内动力分子，它们负责细胞内的 沿着微管方向进行的主动物质转运。Kifs蛋白的共同点是蛋白中都含有一个由 大约360个氨基酸残基构成的高度球状保守区。保守区内部含有两个特定的结构 域，分别负责水解ATP以获得物质运输所需能量以及同微管相结合的功能，这两 种功能是Kifs的体内运输功能所不可缺少的。Kifs所参与的细胞内运输是一种 广义上的运输，被输送的对象不仅包括生物大分子、囊泡、信号分子等，还包括 有丝分裂和减数分裂中的染色体。也有报道指出Kifs还参与具有正常生理功能的 纺锤体的形成。迄今为止，人们已经以神经元为研究对象，对Kifs的运输功能进 行了大量的研究。证实了一些Kifs蛋白功能的缺失会导致神经系统的紊乱及相关 疾病。如人体中Kifs编码基因的缺陷会导致神经系统的紊乱以及一些神经功能退化相关的症状，从而导致amyotrophic lateral sclerosis和Alzheimer等疾病 的产生。Kartagener综合症则被证实和Kif-3运输功能的损失有关。细胞内物质运输还是动物个体发育中的重要一环。Kifs和细胞内物质运输 有关，和动物体的发育过程有着必然的联系，然而有关Kifs蛋白和动物体发育关 系的研究却不多见，目前见诸于报道的有Morris和Scholey证实了 Kinesin II 是胚性纤毛形成所必需的，这可能与动物体早期的左右非对称形成有关。Kinesin I和几种蛋白共同参与了 oAar的mRNA的沿着微管的运输，a^ar在发育中个体 的后部参与生殖细胞的分化和腹部的形成。^Wp7也是Kifs的一员，它在Xen叩us 的早期胚胎发育中是纺锤体形成和染色体定位的必需因子。还有研究表明 Kinesin-8参与调节纺锤体中微管的长度，用Knockdown的方法干扰kinesin-8 的表达会使得纺锤体的长度增加。Kinesin II还参与Xenponus中的raRNA 运输，阻断正常的Kinsin II异三聚体的相互作用会影响到&7 mRNA的定位， ^7是TGF-e家中的成员之一，它参与胚胎中胚层的诱导发生。另外，Kinesin的 功能还表现在它能够影响dynein的循环和定位，这是dynein正常的生理功能所 必需的。《Molecular Biology of the Cell细胞分子生物学》在2005年16， 3187-3199中干燈了一篇"Functional analysis of human microtubule-based motor proteins, the kinesins and dyneins, in mitosis/cytokinesis using RNA interference (采用RNA干涉技术分析人类中基于微管相互作用的动力分子， Kinesi和Dynein在有丝分裂、细胞周期中的功能)"。文中对Kinesin-8亚家族 的成员Kifl8的缺失所导致的纺锤体功能异常现象做了详细的分析，认为KiflS 通过影响纺锤体的正常生理功能而导致细胞的有丝分裂或减数分裂功能受损，对 Kinesin-8亚家族的成员在细胞分裂中的作用做了充分肯定，也为本发明提供了 可供参考的依据。但文中并没有对Kifl9A在人类中的同源蛋白Kif 19做功能上的 分析。因此目前对于Kifl9A在细胞分裂中的作用，仅局限于通过与其它蛋白质的 对比结果对其功能做推测和假设，其具体功能尚不清楚，目前也没有见到有关 Kifl9A蛋白或其同源蛋白功能的相关报道。 发明内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，本发明公开了一种小鼠Kifl9A蛋白编码序列，对于进一步研究该在正在发育个体中差异表达有重要意义，同源 比对结果预测该基因在有丝分裂和减数分裂中发挥作用，尤其是减数分裂的结果 和生物体的生育能力息息相关，本发明可用于解释生物体不育种的相关机制，并 可指导生产实践中的不育种的改造，雌性不育种的改造在畜牧业和饲养业中有着 很大的作用，具有重要应用价值。本发明是通过以下技术方案实现的本发明所分离出的或纯化的小鼠Kifl9A基因序列以及其编码区序列，所述 的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 1中核苷酸的序列，能编码具有SEQ ID NO. 2所 示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。所述的核苷酸序列，其蛋白编码区cDNA全长为2994bp，能编码一条含997 个氨基酸的多肽。所述的核苷酸序列中的第980-1733位核苷酸片段的与SEQ ID NO. 3中的核 苷酸序列完全相同或有至少95%以上的同源性。所述的多肽包括具有SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多肽，较佳地，该多肽 是具有SEQIDNO. 2序列的多肽，该多肽属于Kinesin-8亚家族，在不同年龄组 的老鼠卵巢中差异表达，而Kinesin-8家族成员功能的缺失能阻断或妨碍细胞有 丝分裂或减数分裂中具有正常生理功能的纺锤体的形成。所述的SEQ ID NO. 1中的探针核苷酸序列，具有SEQ ID N0.3中的核苷酸 序列。在高度严禁的条件下(Northern杂交条件为68°C下杂交两小时，洗脱条 件洗脱液成分为0.1XSSC(氯化钠和柠檬酸钠溶液)与0.WSDS (十二烷基磺酸 钠)，在65°C洗脱一次，时间为15分钟)能与SEQ ID NO. 1杂交，为Kifl9A检 测用探针序列。所述的SEQIDNO. l中核苷酸的序列，该序列存在于一种载体，它包含SEQ ID N0.1中的全部核苷酸。本发明还涉及一种用上述DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。在实例 中该宿主细胞是HEK 293T细胞和L细胞。本发明中所涉及的"分离出的或纯化的"是指该DNA或片段己从天然状态下 位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的 组分分开，而且己经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。本发明中，所克隆到的与小鼠卵巢发育相关的基因名为Kifl9A。它属于 Kinesin超家族中的Kinesin-8亚家族，该亚家族中的成员多参与到细胞的有丝 分裂和减数分裂中，具体表现为影响细胞分裂中期染色体的排列、移动和在赤道 板平面的定位，还影响到纺锤体的形成及其正常的生理功能，在本发明的实施过 程中，还发现Kifl9A的在不同年龄的小鼠中的表达方式和其在卵巢内的表达定位 方式与该亚家族中其他成员完全吻合，该基因在发育期的小鼠(15日龄)卵巢中 高量表达，据此可以判定该基因可能参与同样的生理过程，对颗粒细胞的分裂增 生以及卵母细胞的成熟及细胞内的物质运输发挥着重要的生理功能。该基因的研 究成果可用于生物不育种的改造。雌性不育种的改造在畜牧业和饲养业中有着很 大的作用，如用于人类，将对避孕药开发及不孕症治疗具有应用价值。在本发明中，术语"小鼠Kifl9A蛋白(或多肽)编码序列"指编码具有小鼠 Kifl9A多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中第1-2994位核苷酸序列及其简并 序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO. l序列的编码框第1-2994位核苷酸中， 有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由 于密码子的简并性，所以与SEQIDNO. 1中第1-2994位核苷酸序列同源性低至 约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO. 1所述的序列。该术语还包括能在中度 严紧条件(Northern杂交条件为68。C下杂交两小时，洗脱条件洗脱液成分为 1X SSC(氯化钠和柠檬酸钠溶液)与0. 1% SDS (十二烷基磺酸钠)，在42°C洗脱一 次，时间为15分钟)下，更佳的在高度严紧条件下(Northern杂交条件为68°C 下杂交两小时，洗脱条件洗脱液成分为O.IXSSC(氯化钠和柠檬酸钠溶液)与 0. 1% SDS (十二垸基磺酸钠)，在65°C洗脱一次，时间为15分钟)与SEQ ID NO. 1中从核苷酸第1030-2994位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与 SEQ ID NO. 3中的核苷酸序列的同源性至少70%,较佳地至少80%,更佳地至少 90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的小鼠Kif 19A相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括若干个(通常为1-90个， 较佳地卜60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代， 以及在5，和/或3，端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为 10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，术语"小鼠Kifl9A蛋白或多肽"指具有小鼠Kifl9A蛋白活 性的SEQ ID NO. 2序列的多肽。该术语还包括具有与小鼠Kifl9A相关相同功能 的变异形式。这些变异形式包括若干个(通常为l-50个，较佳地l-30个，更佳 地1-20个，最佳地1-10个)氮基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/ 或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为IO个以内，更佳地为5个 以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常 不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通 常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括小鼠Kifl9A相关蛋白的活性片段和活 性衍生物。本发明的小鼠Kifl9A的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变 异体、天然突变体、诱导突变体、在高度严紧条件(Northern杂交条件为68°C 下杂交两小时，洗脱条件洗脱液成分为0. 1XSSC(氯化钠和柠檬酸钠溶液)/0.1% SDS (十二烷基磺酸钠)，在65。C洗脱一次，时间为15分钟)或低度的严紧条件 (Northern杂交条件为68°C下杂交两小时，洗脱条件洗脱液成分为2XSSC(氯 化钠和柠檬酸钠溶液)/0. 1% SDS (十二垸基磺酸钠)，室温洗脱一次，时间为15 分钟)下能与小鼠Kifl9A相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗小鼠 Kif 19A抗血清获得的多肽或蛋白。在本发明中，"小鼠Kifl9A保守性变异多肽"指与SEQ ID NO. 2的氨基酸 序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或 相近的氨基酸所替换而形成多肽。Identities = 895/998 (89%), Positives = 932/998 (93%), Gaps = 1/998 (0%)Query 181 VAGITEVSTINAKEIMQLLMKGNRQRTQEPTAANQTSSRSHAVLQVAVRQRSRVKN工LQE 240VAG工TEVSTINAKE工MQKLMKGNRQRTQEPTAANQTSSRSHAVLQV VRQRSRVKNILQESbjct 181 VAGITEVSTINAKEIMQLLMKGNRQRTQEPTAANQTSSRSHAVLQVTVRQRSRVKN工LQE 240Query 241 VRQGRLFMIDLAGSERASQTQNRGQRMKEGAHINRSLLALGNC工NALSDKGSNKY工ISIYRD 300Sbjct 241 VRQGRLFMIDLAGSERASQTQNRGQRMKEGAHI服SLLALGMC工NALSDKGSNKYINYRD 300Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct301301361361IAQYTSIIADLRGEIQRLK KID+Q GRGQARG+ DRGDIRHIQAEVQLHSGQ A MG421QLREQL SAF EQMDVRRRLLELEN+AMEVQIDTSRHLLT工AGW+HEKSRRALKWREE+R421481481KESYTKEDSEKDSDTG-DEPDNLjEPPEVASARENIAALVGEQKKIiRKEKLALEQRCRELR KE Y K+DSEKDSDTG D+PD LEPPEVA+ARE+IAALV EGK+LRK+KLALEGRCRELR540argrri^etlprr工gseegrev;lsl:lcrvhe]leventemgsha;llrd al朋r eavrr;l541600EQHRSLCDEI工QGQRQIIDDYNL VP+ LEELYEVYLRELEEGSLE+ATIMD+VASRALQ601660DSSLPK工TPAG +LTPDSDLESVKTLSS+AQ QN+ LPPL T+SE +HVFKA AWQ661720KSSSVPTPPPIQ+GSLVT^EAP GDSLGS INSSP+SSENLSEI LSHKERKEILT TKC721780781VKAA+RRSRALGTEGRHLLAPATERSSLSLHSLSE DDARPPG LACKRPPSPTLGHA360360420420480480539540599600659660719720779780839840Query , ISEDNLSSSTGEGPSRAVGPRGDGTGSWVRGQKKCLSKKREESLEAKRRKRRSRSFEVTG 8 99 SED肌SSSTGE PSRAVG GDGW+RGQKK L KKREESLEAKRRKRRSRSFEVTGQGLS PKTHIAGP +E +SD RMP C P+PG+RHLGKV+LPLAKVK PP+QNTG G+Query 960 SPIAVAPNQAGVSRRATRGPSLPHGSSTFGKDGRDQHN 997SPL V PN G SRRATRGP LPHG+ST GKDG +HN Sbjct 961 SPLAVPPNPGGGSRRATRGPRLPHGTSTHGKDGCSRHN 998表1 SEQ ID NO. 2与人Kif 19蛋白质或多肽序列的比对结果。Query为SEQ ID NO. 2， Sbjct为人Kifl9蛋白质序列。本发明还包括小鼠Kifl9A蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然小鼠 Kifl9A蛋白或多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修 饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导 变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还 可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然 L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸 (如e、 Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性 的多肽。修饰通常是指体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰 还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修 饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的 糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸 酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水 解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，可以将小鼠Kifl9A编码序列可操作地连于各种已知的市售表 达载体序列中，包括质粒和粘粒等，从而形成小鼠Kifl9A蛋白的相关表达载体。 所述的"可操作地连于"是指即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA 序列其他部分的活性。例如，信号肽可操作地连于多肽DNA;启动子控制序列可操作地连于编码序列；核糖体结合位点可操作地连于编码序列等。 一般，"可操作地连于"意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中，术语"宿主细胞"为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。还可用Northern印迹法技术分析小鼠Kif 19A基因产物的表达，即分析小鼠 Kif 19A的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子SEQ ID NO. 3，该分子 通常具有小鼠Kifl9A核苷酸编码序列的750个连续核苷酸，较佳地具有450-600 个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码小鼠Kifl9A相关的核酸 分子。本发明还提供了检测样品中是否存在小鼠Kifl9A相关核苷酸序列的方法， 它包括采用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。本发明中的小鼠Kifl9A相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增 法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的 有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的c丽A库或按本领域技术人员已知的常 规方法所制备的cDNA文库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常 需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在 一起。 一旦获得了相关的序列，就可以用重组法来大批量地获得该序列。通常 的方法是将该序列首先装入载体，再转入细胞，然后从增殖后的宿主细胞中分 离得到相关序列。本发明中涉及的蛋白片段还可用多肽固相合成技术或者化学合成的方法 来直接合成或者化学连接而获得。本发明中鉴定的小鼠Kifl9A在不同发育时期的小鼠的卵巢中差异性表达， 该基因在15天和40天小鼠的卵巢中的表达量最高，并且我们通过免疫荧光的方 法发现，Kifl9A主要定位于发育中的卵泡中的卵母细胞和其周围的颗粒细胞中， 这提示该基因可能在这两个时期的卵巢中的上述细胞中发挥着重要作用，而这时 期内的重要事件就是颗粒细胞的增殖和卵母细胞的体积增大，因此Kifl9A极有可 能是参与了颗粒细胞有丝分裂和卵母细胞内的物质转运。与该基因同属一个亚家 族Kinesin-8研究族的成员Kif 18被证实在人类细胞的减数分裂和正常的有丝分裂中发挥着重要作用，通过siRNA的研究手段证实了 Kifl8和细胞减数和有丝分 裂中中期染色体在赤道平面上的排布有关。阻断其正常的生理功能，会导致细胞 在分裂中期，染色体无法正常地排列到细胞的赤道平面上，阻断其功能会导致细 胞分裂的中期向后期的转换时间延长，虽然染色体也能分离，但最终细胞还是无 法完成正常的分裂。Kifl9A同属于该亚家族的成员，在一级序列上与Kifl8有着 较高的同源性。这对于本发明研究Kifl9A的生理功能提供了一个很好的参照。根 据同源性分析以及本发明的试验结果，Kifl9A与发育中的小鼠卵巢中营养与支持 细胞的增殖和和生殖细胞的减数分裂有关，其具体的功能可能在细胞核内发生， 通过与细胞分裂中的一些关键因子或步骤相互作用，如影响染色体在中期赤道板 的排列，影响细胞分裂中中期向后期的转换，影响纺锤体中微管和染色体的相互 作用等等。抑制该发明的正常的生理功能可能对会阻断生物体健康的卵巢及卵母 细胞的发育，以致影响正常生殖细胞的发生过程，因此本发明可用于改造生物不 育种的应用中。雌性不育种的改造在畜牧业和饲养业中有着很大的作用，如用于 人类，将对避孕药开发及不孕症治疗具有应用价值。


图1 DD-RT PCR结果示意图；图中Kifl9A在10天和15天的小鼠卵巢中差异表达，箭头所指处为DD-RT PCR所检测到的差异表达的Kifl9A的部分片段。图2 Kifl9A和其同源蛋白的同源性分析结果示意图；图中:对Kifl9A和小鼠中其他一些已知的Kifs蛋白保守区所做同源性分析， 结果表明Kif 19A和Kifl8A同源性较近，且都属于Kinesin-8亚家族。图3 Western Blot检测Kif 19A在HEK293T中的瞬时表达情况示意图；图中泳道1号为转染了 Kif 19A的HEK 293T细胞，泳道2号为转染了空 白对照质粒的HEK 293T细胞；在泳道1中可以检测到Kif 19A的表达；e -tubulin 用来显示两个泳道中总蛋白的上样量相同。图4、 Kifl9A在成年小鼠的不同组织中的表达谱分析；图中Kifl9A在成年小鼠的肺、卵巢中大量表达，在睾丸、肾和脑中也检 测到了痕量表达，其大小约为3.6Kb，而在心脏中没有检测到Kifl9A得表达。图5、 Kifl9A在不同年龄的小鼠卵巢中的表达示意图；图中Kifl9A在15天和40天小鼠的卵巢中表达量最高，在5天、20天和 120天中的表达量比较低。
具体实施例方式
以下结合实验室具体的试验数据对本发明的实施例作详细说明本实施例在 以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明 的保护范围不局限于下述的实施例。
本发明的实施例所涉及的序列及记号分列SEQ ID NO. 1的核苷酸序列中， 56-1032位置的核苷酸为该家族中的保守序列。SEQ ID NO. 2的序列中第14-344 中的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1中保守区域所编码的氨基酸序列。以下实施例中 未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室 手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或制造商所建议的条件。
实施例1小鼠Kif 19A基因的克隆
1、 试验动物的选择
本实施例中所涉及的试验动物包括C57BL/6以及C57BL/6XCD-1杂交鼠。
2、 组织分离
收集不同发育时期的小鼠的卵巢组织，准备提取RNA进行下步分析。这里本 实施例选择了10天，15天小鼠卵巢进行分析。
3、 RNA的提取
取收集的卵巢组织，加入约lmlTrizol试剂，与冰上进行高速匀浆 (〉3000rpm)， 3次，每次10秒左右。然后按照Trizol试剂说明书抽提卵巢总RNA。 然后用变性甲醛胶鉴定抽提的总RNA质量，通过紫外分光光度计测定RNA浓度。 获得的RNA用于后续实验。
4、 DDRT-PCR和cDNA文库的筛选
DDRT-PCR的方法参照Ziramermann和Schultz的方法，所采用的引物为 5' -GAGGATCAGC-3'和5' -T"GC-3'，实验组动物样品分别包括10天，15天 的C57BL/6老鼠的卵巢，如图1所示。
为了获得Kifl9A的全长开放阅读框(ORF)，本实施例进行了 cDNA文库的筛 选。文库构建所需的mRNA取自15天老鼠的卵巢。在cDNA合成时分别采用了 OligodT和随机六合引物来进行反转录反应。然后将得到的cDNA两端加上EcoR I接头， 并连接到AZAP表达质粒中。文库的筛选中用到32P标记的探针，用做标记探针的 片段取自DDRT-PCR中差异表达的片段。CDNA文库的筛选按照常规的方法进行。 本次实验中，本实施例一共筛选到11个阳性克隆，并分别对其进行了测序分析。 测序仪器为ABI 377测序仪(Perkin-Eltner， USA)
对测序结果的重叠区拼接,详细序列如SEQ ID NO. 1所示。然后对该序列进 行BLAST分析，结果证实在不同小鼠发育时期差异表达的片段是小鼠中新得到的 一个Kifs超家族的基因,对于该基因的功能，目前还尚未见相关报道，但亚家族 中的其他成员参与到细胞分裂过程，为正常生物体发育和繁殖所必须。
通过上述几种方法的应用，获得了候选的小鼠Kifl9A相关蛋白的全长编码 序列(SEQ ID NO. 1)。
实施例2小鼠Kif 19A基因序列的相关信息与同源性分析
本实施例中，小鼠Kif 19A开放阅读框位共2997个核苷酸，详细序列见SEQ ID No. 1.根据全长cDNA推导出的小鼠Kifl9A氨基酸序列，共997个氨基酸残基， 分子量为110kDa，等电点(pi)为9.25。详细序列见SEQ ID NO. 2。
将小鼠Kifl9A相关的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在 Non-redundant GenBank +EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBank CDS translations +PDB+ SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质水 平的同源性检索，结果发现它属于Kinesin-8亚家族，如图2所示，并发现它与 人类Kif 19基因在氨基酸水平上具有89%的同源性，如表1所示。因此，小鼠Kifl9A 与人类中Kifl9基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。Kinesin-8 亚家族的成员已被证实多参与细胞分裂过程中染色体的移动和正常纺锤体的形 成，人类中的KIfl9蛋白也具有相似的功能，Kifl9A也应具有相似的功能。
实施例3小鼠Kif 19A蛋白或多肽在HEK 293T细胞中进行真核细胞表达，以 及过量表达宿主细胞的鉴定。
l.重组表达载体的构建
根据小鼠Kifl9A的全长编码序列(SEQ ID NO. 1)，设计相应的用于该序列 扩增的引物，并分别在引物的两端引入限制性内切酶位点，限制性内切酶位点的 具体序列依据所采用的载体情况而定，以便构建表达载体。将本发明实施例1中筛选到的序列为模板，经PCR扩增，将小鼠Kifl9A基因亚克隆至中间载体(如 pUC19)进行扩增，之后进一步亚克隆到双元表达载体中，然后采用脂质体转染至 宿主细胞中。
2. 待转染细胞的准备HEK 293T细胞在转染的前一天进行传代，细胞密度 不要太大，以24小时后细胞密度能长至50-80%为宜。
3. 脂质体转染采用Invitrogen公司的Lipofectamine Reagent和Plus Reagent进行转染。具体的方法如下(本实施例中以35mm培养皿为例)
1)将2pg左右的重组质粒溶解进100nl无血清培养液中，培养液中也不能 含有抗生素，混匀后加入5pl Plus Reagent,再次混合均匀，室温放置15分钟。 2)将5^1的Lipofectamin Reagent和95^1的无血清、无抗生素培养基(这里 采用的是DMEM+谷氨酰胺，下同)混合均匀，室温放置15分钟。3)将上述的两 种液体混合均匀，室温下放置45-60分钟。4)在DNA-PLUS-Lipofectamin复合体 形成的过程中，将待转染的细胞的培养液去除，同时换上无血清和抗生素的培养 基1. 5ml) 45-60分钟后，将上述的DNA-PLUS-Lipofectamin复合体加入到培养皿 中，轻轻混合均匀后置于37°C 5%的培养箱中培养3小时。6) 3小时后，去除细 胞，吸取培养皿中的培养液，加入正常的含有血清的(不含有抗生素)中培养。 24-48小时后对转染后的细胞进性抗生素筛选或进行瞬时表达的分析。
4. 瞬时表达分析通常采用逆转录PCR的方法或者Western免疫检测的方法。 在RT-PCR的方法中采用了一对特异性的引物来检测Kifl9A的表达情况。引物的 详细序列如下引物一 5' -GCACTGCCTTTGAAGAGTCC-3， 引物二 5， -CATCTCGGTGTTTTCCACCTC-3' 。
Western免疫检测中采用了上海生物工程公 司合成的Kifl9A抗体，如图3所示。
5. 稳定表达细胞株的筛选通常采用一些特定的抗生素用以杀死未转染的细 胞的方法，这里采用的是G418筛选的方法，所用的细胞系为L cell细胞系。通 过采用G418的筛选，最终能获得稳定表达Kif 19A的宿主细胞。
实施例4小鼠Kifl9A相关基因在成年小鼠不同组织中的表达谱分析 1、 RNA的提取取同一小鼠的不同组织进行该分析，本实施例中采取了心、 脑、卵、睾、肺、肾几种不同的组织。断颈处死小鼠后将取得的不同组织分别分 别加入lml左右Trizol试剂，进行总RNA提取，(实验参照Trizol试剂说明书)。2、 总RNA的定量:与260n i处，测定RNA的紫外光吸光度值0D260;根据10D260 二40pg/ml的公式，换算成相应的RNA浓度。
3、 甲醛变性胶电泳分离RNA: 1)取6ml25X (倍)电泳缓冲液，加入117ml 无菌水，混匀。2)称取l.lg琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化， 转入55°C水浴中。3)于通风橱中取26. 8ml甲醛，加入到55°C的凝胶溶液中， 混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的 RNA (20)xg)溶解于2XLoading Buffer中，在80°C下加热10分钟，然后立即放 在冰上。6)点样后进行电泳，电泳参数为5V/cm电压电泳2小时左右。
4、 将RNA转移到尼龙膜1)转移前先对琼脂糖胶进行处理，该过程的同时 将尼龙膜用IOXSSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同 的滤纸置20XSSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小 相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4) 转膜完成后，将尼龙膜放置于紫外交联炉中进行交联固定。
5、 探针的标记。用于标记探针的模板采用PCR扩增的方法，利用基因特异 性引物从SEQ ID N0.1中扩增得到，对PCR得到的结果进行分离纯化，得到的核 苷酸序列见 SEQ ID NO. 3 。这里采用的基因特异性引物为 5， -GCACTGCCTTTGAAGAGTCC-3， 和 5， -CATCTCGGTGTTTTCCACCTC-3，
PCR实施的方法为在20)al的反应体系中分别加入2^1 10 X buffer, 1. 6|al 25mM MgCl2， 0.4 |al dNTP(10mM each),上下游引物各0. 4pl(20-)， 2pl SEQ ID NO. 1为模板，0.3pl (5U/nl) Taq聚合酶，加水补足至2(^1; PCR扩增条件为 94°C下变性5分钟，然后为94°C lmin, 56°C lmin, 72°C lmin为一个循环，循 环扩增34次；接着为72。C 10min， 4°C 10min终止反应。对PCR扩增到的产物进 行回收后利用NEBlot Phototope Kit试剂盒对其进行标记，标记的方法参照试 剂盒的说明书。
6、 膜上杂交信号的检出1)将膜浸在5Xrapid hybrid buffer, 65°C下 预杂交0.5小时。2)将预杂交也吸处，加入10ml左右新鲜的杂交缓冲液，同时 将准备好的探针加入，于65°C杂交3小时。3)洗膜，杂交结束后，将尼龙膜置 于洗膜液I (IXSSC， 1%SDS)中，于65。C漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液 II (0. 1XSSC， 1%SDS)中于65。C漂洗3次，每次15分钟。4)曝光。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影。
Northern杂交表明；小鼠Kifl9A在成年小鼠的卵巢、肺和睾丸组织中大量 表达，其大小约为3.6Kb，在肾脏和肝脏中表达很少，心脏中几乎看不到表达，如 图4所示。该基因在小鼠的生殖器官中表达可能预示着其功能与动物体的生殖发 育有一定的关系。
实施例5小鼠Kifl9A相关基因在不同年龄组小鼠的卵巢组织中的表达差异
分析
为了获得更进一步的信息，还可以对小鼠Kifl9A相关基因在不同发育时期 小鼠卵巢中的进行表达差异分析。具体实施方法如下
1、 取材分别取5天、10天、15天、20天、40天和120天的小鼠的卵巢。 将小鼠断颈处死后取卵巢，直接进行下一步分析或液氮冻存备用。
2、 总RNA的提取。总RNA提取的方法按照常规的方法进行，具体方法参见 实施例4中的总RNA提取程序。
3、 Northern杂交的过程参见实施例4中Kifl9A表达谱分析中的相关步骤， 这里不再累述。
通过对不同年龄组小鼠的卵巢组织的Kifl9A表达情况进行分析，结果发现， 小鼠Kifl9A基因在15天的和成年的小鼠卵巢组织中表达最为显著，在10天和 20天的小鼠卵巢中痕量表达，而在老年和5天的小鼠中未见到有表达，如图5所 示。通过前面的所述可知，15天的小鼠卵巢中正经历着急剧的发育过程，包括卵 泡的发育，卵母细胞的增大以及颗粒细胞的增多，在这一过程中大量的物质被合 成，包括各种蛋白质分子和mRNA分子，Kinesin家族的成员是细胞内的运输分子， 因此Kifl9A的表达可能与该过程有关。另外15天的小鼠卵巢中颗粒细胞的数目 大量增加，这个时期内的卵巢内经历着急剧的有丝分裂过程，Kifl9A的大量表达 可能参与该过程。同时，成年小鼠卵巢中生殖细胞以及各种营养支持细胞都达到 了极盛的状态，Kif 19A的表达可能与这种状况相关。本发明涉及的序列及记号分列如下〈110〉上海交通大学<120>小鼠Kif 19A蛋白编码序列<歸3<210〉1<211>2994〈212>DNA<213>小鼠(Mus.隨culus C57BL/6) <400>1ATGMGGACAGCGGTGACTCAMGGACCAGCMCTCATGGTGGCACTTAGGGTCCGGCCC60ATCAGCGTGGCTGAGCTGGAGGAGGGAGCTACCCTCATCGCTCACMGATGGACGAGCAG120ATGGTGGTTCTCATGGACCCMTGGAGGACCCTGACGACATTCTGCGGGCACACCGGTCC180CGGGAGMGTCATACCTCTTTGACGTGGCCTTTGACTTCACTGCCACCCAGGAGATGGTA240TATCAGGCCACCACCMGAGCCTCATCGAGGGCGTCATCTCAGGGTACMTGCCACTGTG300TTTGCCTATGGCCCTACAGGCTGTGGGMGACCTACACCATGCTGGGCACTGACCACGAG360CCAGGCATCTATGTTCGGACCCTCMTGACCTGTTCCGAGCCATCGAGGAGACCAGCMT420GACATGGMTATGAGGTGTCCATGTCCTACCTGGAGATCTACMTGAGATGATCCGGGAC■CTACTGMCCCGGCCCTGGGGTACCTGGAGCTGAGGGMGACTCCAMGGGGTGATCCAG540GTGGCCGGGATCACCGMGTGTCTACCATCMTGCGMGGAGATCATGCAGCTGCTGATG600MGGGGAACCGGCAGAGGACGCMGAGCCCACAGCTGCCAACCAGACATCCTCCCGCTCC660CACGCCGTGCTCCAGGTGGCCGTGCGTCAGCGCAGCCGGGTCMGMCATCCTCCAGGAG720GTGCGGCAGGGCCGCCTGTTTATGATTGACCTAGCTGGCTCCGAGCGTGCCTCTCAGACA780CAGMCCGGGGGCAGCGCATGMGGMGGAGCCCACATCAACCGCTCTCTGCTGGCCCTG840GGCMCTGCATCMTGCGCTGAGTGACMGGGCAGTMTAAATACATCMCTATCGGGAC900AGCAMCTCACCCGGCTCCTGAAGGATTCACTAGGCGGGAACAGCCGCACTGTGATGATT960GCCCACATCAGTCCAGCGAGCACTGCCTTTGMGAGTCCCGGMCACCCTGACCTACGCC1020GGCCGAGCCAAGMTATTAGGACTCGGGTGMGCAGMCCTGCTCAACGTCTCCTACCAC1080ATCGCTCAGTACACCAGCATCATCGCTGATCTGAGAGGCGAGATCCAGAGACTCMGTGC1140MGATCGACCAGCAGGCTGGGCGGGGTCAGGCCCGGGGCAMCTGGACAGGGGTGACATC1200CGCCACATCCMGCTGAGGTTCAGCTACACAGCGGGCAGGMGGGCCCGCGGAGATGGGA1260CAGCTTCGGGAGCMCTCATCAGCGCCTTCCACGAGCAGATGGATGTGCGCCGGCGCCTG1320CTGGAGCTGGAGMCCAGGCCATGGMGTCCAGATTGACACCTCCCGTCACCTCCTCACC1380ATCGCCGGCTGGGAGCACGAGAAGTCACGAAGGGCTCTCAAGTGGCGGGAGGAGCGMGG1440MGGAGTCCTACACCAMGAGGACAGTGAGMGGACTCGGACACAGGCGATGAGCCAGAT1500AACCTGGAGCCACCTGMGTGGCATCAGCCCGTGAAAACATCGCTGCCCTGGTGGGCGM1560CAGMGMGTTGCGCAAAGAGMGCTGGCGCTGGAGCAGCGCTGCCGAGAGCTGCGTGCG1620CGTGGCCGGCGCCTGGMGAGACGCTGCCGCGCCGCATCGGCTCGGAGGAGCAGCGCGAG1680GTGCTCAGCCTGCTGTGCCGCGTGCACGAGCTGGAGGTGGAAAACACCGAGATGCAGTCG1740CACGCTCTGCTCCGCGACAGCGCTCTGCGCCACCGCCGCGAGGCTGTGCGCCGCCTGGAG1800CAGCACCGCAGCCTCTGCGATGAGATCATCCAGGGCCAGCGGCAGATCATCGACGACTAC1860MTCTGGAGGTTCCCCGGCACCTGGAGGMCTCTACGMGTCTACCTTCGGGMCTGGAA1920GAGGGCAGCCTGGAGCGGGCCACCATCATGGACCGAGTGGCCTCCAGAGCCCTGCAGGAC1980AGCTCCTTGCCCAAAATCACTCCAGCAGGGGCCACACTGACCCCAGACTCTGACCTGGAG2040AGTGTGMGACGCTAAGTTCTGAGGCCCAGCGCCCCCAAAACMCACCCTACCCCCACTT2100GGCACAGACAGTGAGTCCTACCATGTGTTCMGGCCAGTCCCAGGGCCTGGCAGGTGMG2160AGCTCCTCTGTGCCTACTCCGCCCCCCATCCAGGTGGGCAGCCTGGTGACCCAGGAGGCC2220CCACCACAGGACAGCCTGGGCAGCCAGATCMCTCTTCCCCGGAGAGCAGCGAGMCCTG2280TCAGAGATCCTTCTGTCCCATAAAGAGAGGAMGAGATCCTGACGCGGACCMGTGTATC2340TCGGTGMGGCCGCCCAGCGGCGCTCCCGGGCCCTGGGMCGGMGGGCGCCACCTGCTG2400GCACCTGCCACAGAGCGCAGCAGCCTATCCCTGCACTCGTTGAGCGAGGCTGATGATGCT2460CGCCCACCCGGGCMCTGGCCTGCMGCGGCCGCCCAGCCCGACACTGCAGCATGCCATC2520AGCGAGGACAATCTATCTAGCAGCACAGGCGAGGGCCCCTCCAGGGCGGTAGGACCTCGA2580GGTGATGGCACTGGGTCCTGGGTGCGTGGCCAGMGAMTGCCTCAGCMAAAMGGGAG2640GAGTCACTGGMGCGMGAGGAGGMGCGGAGGTCTCGGTCCTTTGAGGTCACAGGACM2700GGGCTGTCCCGTCCCMGACACACCTACTGGGACCTCGTCCCTCCGAGGGCCTTTCAGAT2760CGCCGGATGCCGGCGTGTGGGCGGCCATCTCCTGGTGTCAGGCATCTGGGAAMGTCTCT2820CTGCCTCTGGCCMGGTCMATTTCCTCCAMCCAGMCACAGGATCTGGAMCCCTTCA2880CCCCTTCTTGTTGCCCCCMCCMGCCGGTGTTTCCCGTAGAGCTACACGTGGGCCCAGC2940CTACCCCATGGCTCMGCACCTTTGGC嵐GATGGACGCCTCCAGCATMCTGA2994<210>2<211〉997<212>PRT〈213>小鼠(Mus. musculus C57BL/6)<400>2Met Lys AspSer Gly Asp Ser Lys Asp Gin Gin Leu Met Val510Leu Arg Val Arg Pro lie Ser Val Ala Glu Leu Glu Glu Gly20 25 Thr Leu lie Ala His Lys Met Asp Glu Gin Met Val Val Leu35Asp Pro Met Glu Asp Pro Asp Asp 50Arg Glu Lys Ser Tyr Leu Phe Asp40lie Leu Arg Ala His Arg 55Val Ala Phe Asp Phe Thr65 70 Thr Gin Glu Met Val Tyr Gin Ala Thr Thr Lys Ser Leu lie80 85 Gly Val lie Ser Gly Tyr Asn Ala Thr Val Phe Ala Tyr Gly95 100 Thr Gly Cys Gly Lys Thr Tyr Thr Met Leu Gly Thr Asp His110 115 Pro Gly lie Tyr Val Arg Thr Leu Asn Asp Leu Phe Arg Ala125 130 Glu Glu Thr Ser Asn Asp Met Glu Tyr Glu Val Ser Met Ser140 145 Leu Glu lie Tyr Asn Glu Met lie Arg Asp Leu Leu Asn Pro155 160 Leu Gly Tyr Leu Glu Leu Arg Glu Asp Ser Lys Gly Val lie170 175 Val Ala Gly lie Thr Glu Val Ser Thr lie Asn Ala Lys Glu185 190 Met Gin Leu Leu Met Lys Gly Asn Arg Gin Arg Thr Gin Glu200 205 Thr Ala Ala Asn Gin Thr Ser Ser Arg Ser His Ala Val Leu215 220 Val Ala Val Arg Gin Arg Ser Arg Val Lys Asn lie Leu Gin230235Ala15Ala30Met45Ser60Ala75Glu90Pro105Glu120lie135Tyr150Ala165Gin180lie195Pro210Gin225Glu240Val Arg Gin Gly Arg Leu Phe Met lie Asp Leu Ala Gly Ser Glu245 250 255Arg Ala Ser Gin Thr Gin Asn Arg Gly Gin Arg Met Lys Glu Gly260 265 270Ala His lie Asn Arg Ser Leu Leu Ala Leu Gly Asn Cys lie Asn275 280 285Ala Leu Ser Asp Lys Gly Ser Asn Lys Tyr lie Asn Tyr Arg Asp290 295 300Ser Lys Leu Thr Arg Leu Leu Lys Asp Ser Leu Gly Gly Asn Ser305 310 315Arg Thr Val Met lie Ala His lie Ser Pro Ala Ser Thr Ala Phe320 325 330Glu Glu Ser Arg Asn Thr Leu Thr Tyr Ala Gly Arg Ala Lys Asn335 340 345lie Arg Thr Arg Val Lys Gin Asn Leu Leu Asn Val Ser Tyr His350 355 360lie Ala Gin Tyr Thr Ser lie lie Ala Asp Leu Arg Gly Glu lie365 370 375Gin Arg Leu Lys Cys Lys lie Asp Gin Gin Ala Gly Arg Gly Gin380 385 390Ala Arg Gly Lys Leu Asp Arg Gly Asp lie Arg His lie Gin Ala395 400 405Glu Val Gin Leu His Ser Gly Gin Glu Gly Pro Ala Glu Met Gly410 415 420Gin Leu Arg Glu Gin Leu lie Ser Ala Phe His Glu Gin Met Asp425 430 435Val Arg Arg Arg Leu Leu Glu Leu Glu Asn Gin Ala Met Glu Val440 445 450Gin lie Asp Thr Ser Arg His Leu Leu Thr lie Ala Gly Trp Glu455 460 465His Glu Lys Ser Arg Arg Ala Leu Lys Trp Arg Glu Glu Arg Arg470 475 480Lys Glu Ser Tyr Thr Lys Glu Asp Ser Glu Lys Asp Ser Asp ThrGly Asp Glu Pro Arg Glu Asn lieLys Glu Lys Leu Ala Leu Glu Gin Arg Cys Arg Glu Leu ArgArg Gly Arg Arg Glu Glu Gin ArgLeu Glu Val Glu Asn Thr Glu Met Gin Ser His Ala Leu LeuAsp Ser Ala LeuGin His Arg SerAsp Ser Asp Leu Arg Pro Gin Asn485 Asp 500 Ala 515 Ala 530 Leu 545 Glu 560 Asn 575 Arg 590 Leu 605 Tyr 620 Tyr 635 Met 650 Lys 665 Glu 680 Asn 695 Phe 710 Pro 725Asn Leu Glu Pro Pro Glu Val Ala SerAla Leu Val Gly Glu Gin Lys Lys LeuGlu Glu Thr Leu Pro Arg Arg lie GlyVal Leu Ser Leu Leu Cys Arg Val HisHis Arg Arg Glu Cys Asp Glu lielie lie Asp Asp Tyr Asn Leu Glu Val Pro Arg His Leu GluLeu Tyr Glu Val Tyr Leu Arg Glu LeuArg Ala Thr lie Met Asp Arg Val AlaSer Ser Leu Pro Lys lie Thr Pro Ala Gly Ala Thr Leu ThrThr Leu Pro ProSer Tyr His Val Phe Lys Ala Ser ProSer Ser Ser Val Pro Thr Pro Pro Pro490 Pro 505 Glu 520 Cys 535 Pro 550 Leu 565 Ser 580 Ala 595 lie 610 Pro 625 Glu 640 Ser 655 Gly 670 Leu 685 Leu 700 Arg 715 lie 730Val Arg Arg Leu Gin Gly Gin ArgGlu Gly Ser Leu Arg Ala Leu GinSer Val Lys Thr Leu Ser Ser Glu AlaGly Thr Asp Ser Ala Trp Gin Val Gin Val Gly Ser495 Ala 510 Arg 525 Ala 540 Ser 555 Glu 570 Arg 585 Glu 600 Gin 615 Glu 630 Glu 645 Asp 660 Pro 675 Gin 690 Glu 705 Lys 720 Leu 735Val Thr Gin Glu Ala Pro Pro Gin Asp Ser Leu 740 745
Asn Ser Ser Pro Glu Ser Ser Glu Asn Leu Ser Glu lie 755 760
Ser His Lys Glu Arg lys Glu lie Leu Thr Arg Thr Lys
Gly s erGln lie 750
Ser Val Lys Gly Arg His
770 775 Ala Ala Gin Arg Arg Ser Arg Ala Leu Gly
785
Leu Leu Ala Pro Ala Thr
800
Leu His Ser Leu Ser Glu Ala Asp Asp 815
790 Glu 805 Ala 820
Arg Arg
Ser Ser
Pro Pro
Leu Ala Cys Ser Glu Asp
Lys Arg Pro Pro Ser Pro Thr Leu Gin His 830 835
Asn Leu Ser Ser Ser Thr Gly Glu Gly Pro 845 850 Ala Val Gly Pro Arg Gly Asp Gly Thr Gly Ser Trp Val
860 865 Gin Lys Lys Cys Leu Ser Lys Lys Arg Glu Glu Ser Leu
875 880 Lys Arg Arg lys Arg Arg Ser Arg Ser Phe Glu Val Thr
890 舰 Gly Leu Ser Arg Pro Lys Thr His Leu Leu Gly Pro Arg
905 910 Glu Gly Leu Ser Asp Arg Arg Met Pro Ala Cys Gly Arg
920 925 Pro Gly Val Arg His Leu Gly Lys Val Ser Leu Pro Leu
935 940 Val Lys Phe Pro Pro Asn Gin Asn Thr Gly Ser Gly Asn
950 955 Pro Leu Leu Val Ala Pro Asn Gin Ala Gly Val Ser Arg
965 970 Thr Arg Gly Pro Ser Leu Pro His Gly Ser Ser Thr Phe
Leu Leu
765 Cys lie
780 Thr Glu
795 Leu Ser
810 Gly Gin
825 Ala lie
840 Ser Arg
855 Arg Gly
870 Glu Ala
885 Gly Gin
900 Pro Ser
915 Pro Ser
930 Ala Lys
945 Pro Ser
恥O Arg Ala
975 Gly Lys980 985 990
Asp Gly Arg Leu Gin His Asn 995
<210>3 <211>754
<212>DNA
<213〉小鼠(Mus. musculus C57BL/6) <400>3
GCACTGCCTTTGMGAGTCCCGGMCACCCTGACCTACGC CGGCCGAGCCMGMTATTA60
GGACTCGGGTGMGCAGMCCTGCTCMCGTCTCCTACCA CATCGCTCAGTACACCAGCA120
TCATCGCTGATCTGAGAGGCGAGATCCAGAGACTCMGTG CMGATCGACCAGCAGGCTG180
GGCGGGGTCAGGCCCGGGGCAMCTGGACAGGGGTGACAT CCGCCACATCCMGCTGAGG240
TTCAGCTACACAGCGGGCAGGAAGGGCCCGCGGAGATGGG ACAGCTTCGGGAGCMCTCA300
TCAGCGCCTTCCACGAGCAGATGGATGTGCGCCGGCGCCT GCTGGAGCTGGAGMCCAGG360
CCATGGMGTCCAGATTGACACCTCCCGTCACCTCCTCAC CATCGCCGGCTGGGAGCACG420
AGMGTCACGMGGGCTCTCMGTGGCGGGAGGAGCGMG GMGGAGTCCTACACCAAAG480
AGGACAGTGAGAAGGACTCGGACACAGGCGATGAGCCAGA TMCCTGGAGCCACCTGMG540
TGGCATCAGCCCGTGAAMCATCGCTGCCCTGGTGGGCGA ACAGMGMGTTGCGC嵐G600
AGMGCTGGCGCTGGAGCAGCGCTGCCGAGAGCTGCGTGC GCGTGGCCGGCGCCTGGMG660
AGACGCTGCCGCGCCGCATCGGCTCGGAGGAGCAGCGCGA GGTGCTCAGCCTGCTGTGCC720
GCGTGCACGAGCTGGAGGTGGAAMCACCGAGAT
权利要求
1、一种小鼠Kif19A蛋白编码序列，其特征是，所分离出的或纯化的小鼠Kif19A基因序列以及其编码区序列，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中核苷酸的序列，能编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
2、 如权利要求l所述的小鼠Kifl9A蛋白编码序列，其特征是，所述的核苷 酸序列，其蛋白编码区cDNA全长为2994bp，能编码一条含997个氨基酸的多肽。
3、 如权利要求l所述的小鼠Kifl9A蛋白编码序列，其特征是，所述的核苷 酸序列中的第980-1733位核苷酸片段的与SEQ ID NO. 3中的核苷酸序列完全相 同或有至少95%以上的同源性。
4、 如权利要求l所述的小鼠Kifl9A蛋白编码序列，其特征是，所述的SEQ ID NO. l中核苷酸的序列，该序列具有SEQIDN0.3中的核苷酸序列，在Northern 杂交条件为68° C下杂交两小时，能与SEQ ID NO. 1杂交，洗脱条件洗脱液成 分为0.1X氯化钠和柠檬酸钠溶液与0.W十二垸基磺酸钠，在65° C洗脱一次， 时间为15分钟。
全文摘要
本发明涉及的是一种基因工程技术领域的小鼠Kif19A蛋白编码序列。本发明所分离出的或纯化的小鼠Kif19A基因序列以及其编码区序列，具有SEQ ID NO.1中核苷酸的序列，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。所述的SEQ ID NO.1中核苷酸的序列，该序列具有SEQ ID NO.3中的核苷酸序列能与SEQ ID NO.1杂交。所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中的核苷酸序列有至少95％以上的同源性。本发明可用于改造生物不育种的应用中。雌性不育种的改造在畜牧业和饲养业中有着很大的作用，如用于人类，将对避孕药开发及不孕症治疗具有应用价值。
文档编号C07K14/435GK101302514SQ200810038829
公开日2008年11月12日 申请日期2008年6月12日 优先权日2008年6月12日
发明者际 吴, 永 张 申请人:上海交通大学