专利名称：一种短肽及其制备方法和在诊断或治疗与pacap、vip相关疾病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有药理作用的多肽，具体涉及一种短肽及其制备 方法和在诊断或治疗与PACAP、 VIP相关疾病中的应用。
背景技术：
垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide, PACAP)是1989年发现的，由脑垂体分泌的具有重要生物学功 能的神经多肽，属于是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成员。
PACAP在动物进化过程中相当保守，脊椎动物青蛙和人的PACAP只有2 个氨基酸的差异，显示PACAP执行关键的生理学功能。PACAP及其受体 (PAC1、 VPAC1和VPAC2)在机体分布及其广泛，不仅分布于中枢神经系统、 周围神经系统，而且在非神经组织内也广泛存在，如脑、睾丸、卵巢、呼吸道、 肺、胰腺、脂肪组织等。
目前已证实PACAP具有神经递质/调质、保护神经细胞；促进激素分泌， 调节内分泌平衡；调节性腺功能和生殖细胞的产生；参与消化活动，调节能量 代谢平衡；参与调节免疫系统等生物学功能。
体内的PACAP有两种形式PACAP27和PACAP38， PACAP27是PACAP38 的N端27个氨基酸。体内PACAP在二基肽酶(dipeptidylpeptidase， IVDPP IV)的 作用下失去N端的五个氨基酸——His-Ser-Asp-Gly-Ile形成的PACAP(6—27) 和PACAP(6—38)是PACAP的拮抗剂。因此PACAP的N端五个氨基酸组成的短肽(His-Ser-Asp-Gly-Ile)对于维持PACAP的活性和功能是非常重要的。目前 尚未有用线性五肽His-Ser-Asp-Gly-Ile调控PACAP以及VIP活性的报道。
与PACAP有高度同源性的血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP) 也具有和PACAP相似的N端，而且VIP同PACAP—样都受到二基肽酶的降解从 而成为自身的拮抗剂，因此His-Ser-Asp-Gly-Ile也具有调控体内VIP活性的作 用。
然而线性五肽在体内非常不稳定，相反环肽主链呈环状结构，具有一定的 构象约束作用，其构象相对线型肽有一定的稳定性，其抗酶解能力比线型肽强， 所以可以考虑将His-Ser-Asp-Gly-Ile环化后提高其在体内的稳定性以及抗酶解 能力。目前尚未有将His-Ser-Asp-Gly-Ile环化后调控PACAP以及VIP活性的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种能有效干预体内 PACAP、 VIP等神经肽的活性，逆转PACAP(6-27)或PACAP(6-38)的拮抗功會巨， 从而协助体内的PACAP、 VIP发挥多种重要生物学功能的，构象稳定且抗酶 解能力强的短肽。
本发明的另一个目的是提供将上述短肽制成稳定性好的环七肽。 本发明的另一个目的在于提供上述环七肽的制备方法。 本发明的进一步目的在于提供上述短肽或环七肽在诊断或治疗与 PACAP、 VIP相关的疾病中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的
本发明经过大量的研究发现，短肽组氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-异亮氨酸(His-Ser-Asp-Gly-Ile)对于维持APCAP、 VIP的活性和功能是非常重要的， 然而这五肽的线性结构使得其在体内非常不稳定。为了在克服该问题，本发明 通过在该五肽的两端设计一些氨基酸或基团(如半胱氨酸或甲基)，使得生成 后的肽链为环肽结构，则不但能起到调节APCAP、 VIP活性的作用，又能保证 肽链在体内的构象稳定，以及较强的抗酶解能力。
本发明优选半胱氨酸对五肽进行环化，实现从线性多肽到环肽结构的转 换。在His-Ser-Asp-Gly-Ile的两端分别添加半胱氨酸Cys，首尾两个半胱氨酸的 巯基形成分子内二硫键，从而生成构象稳定且能有效抵抗氨肽酶和羧肽酶酶解 的环七肽。其结构式为环-(半胱氨酸-组氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-异亮氨 酸-半胱氨酸)cyclo- (Cys-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Cys)。
在多肽合成中，每生成一个肽键，都需要经过官能团保护、縮合、去保护 等操作步骤，加上每一步产物的分离纯化，操作相当复杂而且费时，因此现在 多釆用固相合成法进行多肽的合成。
固相合成法有两种，即Fmoc和tBoc，由于Fmoc比tBoc存在更多优势，所 以大多又采用Fmoc法合成多肽。
本发明环七肽的合成采用固相合成法，优选Fmoc法。
本发明环七肽的合成方法包括如下步骤
(1) 以Fmoc氨基酸为原料，采用固相合成法，获得直链肽；
(2) 直链肽的环化；
(3) 用切割试剂切割脱离树脂得到粗产品，反相高效液相色谱纯化得到环 七肽。
上述步骤(1)中，固相合成法所采用的縮合剂为TBTU/HOBT/DIEA复合縮合剂；TBTU: 0-(7-偶氮苯并三氮唑-l-氧)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
HOBT: N-羟基苯并三唑；DIEA: N，N'-二异丙基乙胺；该TBTU/HOBT/DIEA
复合縮合剂为Fmoc法中常用的縮合剂，其配方以及用量均为本领域技术人员 共知的，此处的Fmoc法也是本领域的通用方法，其操作方法可参考相关教科 书。
上述步骤(2)中，直链肽的环化是剪切前在树脂上进行的，如直链 Cys-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Cys的环化就是在剪切前，对Fmoc保护的巯基进行树 脂上的氧化，从而将线性五肽转变成环七肽结构；氧化剂可以为任意一种氧化 剂，如12、 H202、 Hg"盐、K3Fe(CN)6、三氟乙酸铊T"tfa)3、氯硅烷-砜类氧化 剂或二甲基亚砜DMSO等。
上述步骤(2)， (3)中的直链肽环化，切割试剂切割以及反向高相液相色 谱RP-HPLC纯化等步骤均为本领域的常规技术。
动物实验结果表明本发明的环七肽能有效干预体内PACAP的活性，提 高PACAP介导的生物学功能，还可以与天然拮抗剂PACAP(6-27)或PACAP(6-3 8) 互补，逆转其拮抗作用，促进激动作用，提高体内PACAP对受体的激动力和 作用时效，目前还没有类似作用机制的报道。
由于血管活性肠肽VIP与PACAP具有高度同源性，并且具有相似的N端， 所以本发明的环七肽也具有调控体内VIP活性的作用。
因此，本发明的环七肽可以用于诊断以及治疗与PACAP、 VIP相关的疾病， 由于PACAP、 VIP在生物进化过程中非常保守，具有广泛而重要的生物功能， 所以本发明环七肽可能治疗的疾病覆盖神经系统、内分泌系统、消化与能量代 谢、心血管循环、生殖系统与免疫系统，如糖尿病(包括I型、II型)、肥胖、肥胖相关疾病、代谢障碍、代谢相关综合症、脑损伤、脑缺血、防止神经细胞 死亡、受损神经细胞保护及再生、抗炎、男性阳痿、性冷淡、不孕不育、女性 性功能障碍，神经痛、神经病、神经混乱、焦虑症、精神病，记忆损伤、痴呆、 认知混乱、中枢神经系统疾病、偏头痛、神经畏縮、心肌缺血、心肌梗死/纤 维化、动脉硬化、肌畏縮症、胃溃疡、高血压、内毒性休克、血栓症、视网膜 病变、心血管疾病、肾衰竭、心衰竭、肿瘤细胞凋亡、肿瘤细胞增殖等。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1. 本发明的环七肽，包括His-Ser-Asp-Gly-Ile序列，从而能够特异地调节体 内PACAP、 VIP的活性，同时也可逆转体内的PACAP(6-38)及PACAP(6-27)的拮
抗作用，具有广阔的应用前景和较高的应用价值；
2. 本发明的环七肽，采用在His-Ser-Asp-Gly-Ile序列的两端添加氨基酸或基 团，如在两端分别添加半胱氨酸，利用半胱氨酸的分子间二硫键形成环状结构， 从而保证了整个环七肽在体内构象的稳定，以及有效的抗酶解能力，也保证了 His-Ser-Asp-Gly-Ile活性肽在体内稳定地发挥其调节PACAP、 VIP的活性的功 能；
3. 本发明的环七肽采用固相合成法，最初反应物和产物都是连接在固相载 体上，因此可在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量 的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离；
4. 本发明的环七肽能够有效补偿和逆转PACAP(6-3 8)和PACAP(6-27)对 PACAP的拮抗作用，变拮抗作用为激动作用；因此可有效干预体内PACAP的 整体作用和代谢水平。目前还没有类似作用机制的报道。
5. 本发明的环七肽能够用于诊断以及治疗与PACAP、 VIP相关的疾病，鉴于PACAP、 VIP在生物进化过程非常保守，而且具有广泛而重要的生物功能，
因此环七肽的医用价值高，而且该环七肽通过操作简单的固相合成法即可以获
得，因此具有很广阔的市场前景。
图1为环七肽CHC的质谱图2为环七肽CHC的HPLC检测图3为环七肽CHC对血糖的瞬时影响曲线图4为环七肽CHC干预糖耐量实验的血糖浓度曲线图5为环七肽CHC干预糖耐量实验的血糖浓度积分其中，*表示？<0.01;
图6为环七肽CHC对STZ诱导的糖尿病的干预效果柱状其中，A为Buffer+生理盐水，B为STZ+生理盐水，C为STZ+PACAP38，
D为STZ+HSDGI， E为STZ+环七肽CHC， A表示PO.01 (B组vs. A组)，
承表示P0.01 (D组vs.B组，E组vs.B组)；
图7为环七肽CHC逆转PACAP(6-38)拮抗神经生长作用的柱状图； 其中，A为空白对照，B为PACAP38， C为PACAP (6-38)， D为CHC +
PACAP (6-38)， E为PACAP (6-38)+ PACAP38， F为CHC+ PACAP (6-38)+
PACAP38， A表示PO.01 (B组vs.E组)，*表示PO.01 (D组vs. C组)，**
表示PO.Ol (F组vs.E组)。
具体实施例方式
实施例1环七肽(CHC)的制备
本实施例的环七肽采用固相合成法制备，其具体步骤如下(1) 按常规Fmoc固相合成法合成线性七肽以Fmoc氨基酸为原料， 采用固相合成法，经TBTU/HOBT/DIEA复合縮合剂催化合成直链肽Cys-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Cys;
(2) 固相环化接完最后一个氨基酸后，暂不脱除最后一个氨基酸Cys的 Fmoc保护基团，加入含氧化剂I2的环化溶液(称取2.6 g I2溶于85 mL甲 醇与15 mL 二甲基甲酰胺DMF混合液中，配成0.1mol/Ll2溶液)，混匀加 入反应容器中，吹氮气反应6h，氧化一SH生成二硫键一S — S — ，成环；
(3) 按10 mL/0.5 mL/0.25 mL/0.5 mL/0.75 g的比例加入三氟乙酸TFA/ 苯甲硫醚/巯基乙醇/水/苯酚配成的切割试剂，用该切割试剂切割脱离树脂得到 粗产品，用RP-HPLC纯化该粗产品得至U环七肽cyclo-
(Cys-His-Ser-Asp画Gly-Ile画Cys)，简称CHC。
对上述环七肽进行飞行质谱MALDI-MS检测。
本实施例的环七肽采用固相合成法，避免了液相环化的二聚体或多聚体的 产生，而且反应浓度高，成本低。本实施例环七肽的分子量为732.3，产率可 以达到19%,纯化后纯度达96%以上，合成所得环七肽的质谱和HPLC检测如 图1、图2所示。
实施例2环七肽(CHC)对血糖的瞬时影响 清洁级(SPF级)NIH雄性小鼠(使用许可证号粤检证字2002—2009; 合格证号粤检证字2003A076),由第一军医大学实验动物中心提供，体重 25±5g，按体重随机分2组，每组10只，分别腹腔注射500IX g/kg CHC环七 肽和生理盐水(0.9质量％ NaCl)，在Omin， 10min， 20min， 30 min， 45min 和60mhi测定血糖，结果如图3所示，CHC环七肽具有瞬时调节血糖的活性，和PACAP的活性相吻合。
实施例3环七肽(CHC)对糖耐受的调节
清洁级(SPF级)NIH雄性小鼠，由第一军医大学实验动物中心提供，体 重25士5g，按体重随机分组，每组10只。称重，编号，禁食18h，按体重腹 腔注射1.8mmo1葡萄糖/kg+500 u g/kg环七肽CHC，以1.8mmo1葡萄糖/kg屮 生理盐水(Saline)作为对照，于Omin， 15min， 30min， 45min和60min测定 血糖浓度，血糖浓度曲线图如图4所示，同时图5为CHC环七肽干预糖耐量 实验的血糖浓度积分图，通过图4和图5可以看出环七肽CHC对糖耐量有显 著的促进作用，CHC环七肽能有效提高机体清除高糖的能力(PO.Ol)。
实施例4环七肽(CHC)对STZ诱导糖尿病小鼠的干预
清洁级昆明雄性小鼠，体重26-30克，适应性饲养5d,禁食16h后,尾部静 脉取血用血糖仪测量空腹血糖,选用血糖值小于6 mol/L的小鼠进入试验。按 体重随机分5组，每组10只小鼠，禁食16h后，腹腔注射以下五组药物
组A:拧檬酸缓冲液(Buffer)+生理盐水(0.9质量％ NaCl);
组B: 50mg/kg链脲佐菌素(STZ)十生理盐水(0.9质量％NaCl);组C:
50mg/kg STZ+500 u g/kg PACAP38;
组D: 50mg/kg STZ+500ug/kg HSDGI线性五肽(HSDGI线性五肽是
His-Ser-Asp-Gly-Ile直链肽)；
组E: 50mg/kgSTZ+500ug/kgCHC环七肽。
连续注射5天，7天后测定各组的空腹血糖。
结果如图6所示与注射Buffer+生理盐水的空白对照组相比，STZ+生 理盐水组血糖显著升高(PO.Ol)，说明STZ诱导糖尿病模型成功；STZ+PACAP38组的血糖上升收到轻微抑制，但没有统计学意义；STZ+CHC环七 肽及STZ+HSDGI组均有效(PO.Ol)抑制了血糖的上升，显示CHC环七肽 和HSDGI线性肽均能抵抗STZ对胰岛细胞的损伤，而且CHC环七肽比HSDGI 线性肽的作用更好些。 实施例5环七肽(CHC)逆转PACAP(6"38)拮抗神经生长的作用
培养PC12细胞(PC-12细胞是一个常用的神经细胞株，市售)，培养液 为含5 %新生牛血清和10 %马血清的DMEM，置37 °C、体积分数为0.05 C02 培养箱中培养。
将l xl07 /L的PC 12细胞接种在涂有多聚左旋赖氨酸poly—L一lysine 的96孔塑料培养板中,每孔100 (il ,待细胞贴壁后,将细胞随机分为6组 A:空白对照； B: PACAP38;
C、 PACAP(6-38);
D、 CHC+PACAP(6-38);
E 、 PACAP (6隱3 8)+ PACAP3 8;
F 、 CHC+ PACAP (6-3 8)+ PACAP3 8 。
培养72h，观察细胞突起生长情况。规定细胞突起长度大于或等于胞体直 径1倍者，为突起生长阳性细胞。随机数150 200个细胞,计算突起生长阳 性细胞的百分比。每组数据来自两次实验。
结果如图7所示，PACAP(6-38)本身对体外培养神经细胞没有明显作用， 但CHC+PACAP(6-38)有效促进PC12突起生长(*p<0.01 )，起到和PACAP38 类似的作用，提示CHC能有效补偿PACAP(6-38)的功能。而PACAP(6-38)本身抑制PACAP38的促神经突起的作用(ApO.Ol)，但 加入CHC后，抑制作用转化为促进作用，CHC+PACAP(6-38) +PACAP38组 比PACAP38组的神经突起百分比更高(**p<0.01)。
以上结果说明CHC环七肽具有有效的补偿和逆转PACAP(6-38)作用的功
权利要求
1、一种短肽，其氨基酸序列为组氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-异亮氨酸。
2、 一种含有权利要求l所述短肽的环七肽，其结构式为环-(半胱氨酸-组 氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸)。
3、 根据权利要求2所述环七肽，其特征在于该环七肽的环化方式为第l位 半胱氨酸和第7位半胱氨酸之间形成二硫键，从而成为一个环状结构。
4、 一种制备权利要求2所述环七肽的方法，其特征在于该方法是固相合成法。
5、 权利要求l所述短肽在诊断或治疗与垂体腺苷酸环化酶激活多肽、血管 活性肠肽相关疾病中的应用。
6、 权利要求2所述环七肽在诊断或治疗与垂体腺苷酸环化酶激活多肽、血 管活性肠肽相关疾病中的应用。
7、 根据权利要求5或6所述任一项的应用，其特征在于所述疾病为糖尿病、 肥胖、肥胖相关疾病、代谢障碍、代谢相关综合症、脑损伤、脑缺血、防止神 经细胞死亡、受损神经细胞保护及再生、抗炎、男性阳痿、性冷淡、不孕不育、 女性性功能障碍、神经痛、神经病、神经混乱、焦虑症、精神病、记忆损伤、 痴呆、认知混乱、中枢神经系统疾病、偏头痛、神经畏縮、心肌缺血、心肌梗 死、心肌纤维化、动脉硬化、肌畏縮症、胃溃疡、高血压、内毒性休克、血栓 症、视网膜病变、心血管疾病、肾衰竭、心衰竭、肿瘤细胞凋亡或肿瘤细胞增 殖。
全文摘要
本发明公开一种短肽及其制备方法和在诊断或治疗与PACAP、VIP相关疾病中的应用，该短肽序列为组氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-异亮氨酸，通过在短肽的首尾添加两个半胱氨酸，两个半胱氨酸的巯基形成二硫键从而环化成环七肽。本发明的环七肽，包括His-Ser-Asp-Gly-Ile序列，从而能够特异地调节体内PACAP、VIP的活性，同时也可逆转体内的PACAP(6-38)及PACAP(6-27)的拮抗作用，具有广阔的应用前景和较高的应用价值。本发明的环七肽能够用于诊断以及治疗与PACAP、VIP相关的疾病，医用价值高，而且环七肽通过操作简单的固相合成法即可以获得，因此具有很广阔市场前景。
文档编号C07K1/20GK101434649SQ20081021988
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年12月12日
发明者余榕捷 申请人:余榕捷